Identificarea virusurilor
Produse patologice folosite pt. identificarea virusurilor
Recoltarea produselor destinate diagnosticului in boli virale:
virale: spalatura/ spalatura/secretie nazofaringiana, singe,
nazofaringiana, LCR, materii fecale, exudat sau cruste din fecale,
leziuni cutanate, etc.) trebuie facuta la cutanate, locul si timpul
potrivit. potrivit.
Aceasta inseamna cunoasterea unui minim de date privind debutul
simptomelor clinice (vechimea lor), circumstantele lor), infectiei,
infectiei, tratamentele incercate, etc. incercate, Izolarea
virusului are sanse de reusita la inceputul bolii, atc Ig M se pot
evidentia la bolii, sfirsitul primei saptamini iar seroconversia
este demonstrata numai prin compararea titrului anticorpilor din
seruri perechi ( o proba recoltata la debut, cea de-a doua in
deconvalescenta). convalescenta).
Probele destinate izolarii virusului sint transportate la
laborator in cel mai scurt timp, iar, aici, timp, iar, aici,
alegerea sistemului de cultivare depinde de suspiciunea
clinicianului privind etiologia bolii. bolii. Utilizarea unui mediu
de transport se impune ori de cite ori este previzibila intirzierea
transportului sau stocajul in laborator. laborator.
Nu trebuie omise niciodata regulile de autoprotectie si de
protectie a anturajului la recoltarea, transportul si prelucrarea
recoltarea, probelor patologice. patologice. Acestea sint
infectante si pot contamina operatorul si tot instrumentarul
folosit. folosit. Masurile de dezinfectie si de lucru in incinte
izolate trebuiesc respectate cu strictete. strictete.
SEROLOGIADiagnosticul serologic cuprinde astazi o diversitate de
tehnici care permit stabilirea grupului sau tipului de virus cu
grad diferit de sensibilitate.
SEROLOGIA
Tehnici: Tehnici: Reactia de fixare a complementului(RCF)
complementului(RCF) Imunoflorescenta(IF) Imunoflorescenta(IF)
Imunodifuzia Hemaglutinoinhibare(HI) Hemaglutinoinhibare(HI)
Seroneutralizare(SN) Seroneutralizare(SN) Radioimunodozarea(RIA)
Radioimunodozarea(RIA) Reactia imunoenzimatica (ELISA)
SEROLOGIA
Progresele tehnologice recente in serologie constand in
miniaturizarea si automatizarea tehnicilor ca si orientarea catre
tehnici rapide ( IF, ELISA, RIA) au modificat ponderea utilizarii
tehnicilor clasice ( HI, RFC, SN).
SEROLOGIA
tehnica serologica poate decela fie antigenul viral, fie
anticorpii antivirali, antivirali, iar variantele utilizate sint
extrem de diverse.
REACTIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUIRFC1. 2.
Utilizeaza 2 sisteme Ag-Ac AgAc + Ag de testat Hematii de
oaie+anticorpi anti-hematii de oaie anti+C Fixare C pe 1=>
hematii in suspensie buton (RFC+) Fixare C pe 2=> hematii lizate
(RFC-) (RFC-
A.
B.
REACTIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI
Utilitatea reactiei de fixare a complementului
- pentru serodiagnostic, cind se folosesc serodiagnostic,
baterii de Ag cunoscute si se vor titra anticorpii omologi.
omologi. RFC este inca utila pt. diagnosticul infectiilor virale
(ex.virus gripal, VRS, gripal, ECHO, rubeola) rubeola)
HEMAGLUTINO-INHIBAREA HEMAGLUTINO
Tehnica folosita pentru identificarea virusurilor hemaglutinante
(myxo- si paramyxovirusuri) myxo- paramyxovirusuri)
HEMADSORBTIE=cand virusurile hemaglutinante se HEMADSORBTIE=cand
replica celulele infectate exprima pe suprafata lor hemaglutinine.
hemaglutinine. Hematiile adera de aceste celule formand niste
rozeole. rozeole.
HEMAGLUTINO-INHIBAREA HEMAGLUTINO-
REACTII Ag-Ac CE UTILIZEAZA AgREACTANTI MARCATIRC DE
IMUNFLUORESCENTA (IF) - directa - indirecta RADIOIMUNODOZAREA (RIA)
ELISA - indirecta - sandwich
REACTIA DE IMUNOFLUORESCENTAPRINCIPIUL Prin cuplarea unei
substante fluorescente cu anticorpii se obtin anticorpi
fluorescenti, care fixandu-se pe fluorescenti, fixanduantigenul
omolog, induc complexe omolog, imunofluorescente,
imunofluorescente, observabile prin examinarea la microscopul in
lumina uv. uv.
Immunofluorescent staining of primary cultured hepatocytes from
rat infected with a recombinant adenovirus coding for GFP(Green
Fluorescent Protein). GFP auto-fluorescence (in Protein) autogreen)
and an immunofluorescence with 210-PS-1GFP (in red) 210-PS-
IMUNOFLUORESCENTA
RADIOIMUNODOZAREAPRINCIPIULMarcarea radioactiva cu I (I125), C
(C14) sau H (H3) a unuia din reactanti sau radiomarcarea unui
indicator (serul antiglobulinic) care reactioneaza (serul
antiglobulinic) cu complexul imun primar. In final se masoara
primar. radioactivitatea complexului format.
SCOP (1) Initial testari de hormoni si enzime Astazi
diagnosticul bolilor infectioase
RADIOIMUNODOZAREASCOP (2) - diagnosticul - diagnosticul -
diagnosticul - diagnosticul gripei infectiilor herpetice
infectiilor cu poxvirusuri hepatitelor cu virus B
http://4e.plantphys.net/images/ch19/wt1903a_s.png
ELISA
Principiu: Principiu:Prezenta complexelor antigen-anticorp poate
fi antigenvizualizata si cuantificata prin adaugarea in mediul de
reactie: reactie: - a conjugatului reprezentat fie de un antigen ,
fie de un anticorp cunoscut cuplat cu o enzima (peroxidaza din
hrean, fosfataza alcalina) si hrean, alcalina) - a substratului
cromogen specific enzimei de marcare
ELISA
ELISADIRECTA
ELISASANDWICH
Test rapid (identificare de ag/atc (identificare ag/ din ser,
urina, singe integral) ser, urina,
WESTERNWESTERN-BLOT
Indicatii: Indicatii: confirmarea serurilor reactive in ELISA si
IF Principiu: Principiu: Numeroase membrane sintetice pot lega
proteine suficient de puternic incit devin suport pt reactii
imunologice in faza solida. Proteinele solida. legate isi pastreaza
reactivitatea antigenica fiind accesibile anticorpilor din proba de
testat. testat.
Acest principiu a dus la dezvoltarea unor tehnici sensibile si
cu mare specificitate , numite generic imunobloturi . Curent este
folosita tehnica Western Blot, in care proteinele sint transferate
dintr-un gel de dintrelectroforeza pe o membrana suport si ulterior
reactioneaza cu anticorpii din proba. proba. Tehnica WB combina
selectivitatea electroforezei in gel cu specificitatea testelor
imunologice ceea ce permite detectarea si analizarea proteinelor
aflate in amestec. amestec. Rezultatele sint calitative.
calitative.
PCR
Tehnica de amplificare genica este o metoda extrem de sensibila
si poate decela pg AND specific in proba. proba. Tehnica de
amplificare genica a revolutionat detectia patogenilor bacterieni,
virali, bacterieni, virali, fungici si promite a aduce noi
argumente in etiologia virala a variate conditii clinice cronice.
cronice.
PCR
Este o tehnica bazata pe capacitatea ADNADN-polimerazei de a
copia o catena ADN prin elongarea catenelor complementare,
complementare, initiata de o pereche de amorse(primeri)
oligonucleotidice amorse(primeri) adecvate. adecvate. Teoretic
fiecare ciclu de reactie dubleaza cantitatea de ADN tinta.
tinta.
PCR
PCR este o reactie de amplificare exponentiala, in care dupa n
cicluri, apare de (1+ X) ori mai mult ADN tinta fata de starea
initiala, unde X=media eficientei reactiei pt fiecare ciclu.
Teoretic, in 20 de cicluri trebuie sa se produca aprox. de 1 milion
de ori mai mult ADN tinta fata de momentul initial. Practic nu se
obtina o asemenea cantitate, numai dupa mult mai mult de 20 de
cicluri.
Serologia in situatii speciale
Accident cu expunere la singe HIV HBV HCV
Serologia in situatii speciale
Bilant pretransfusional HIV HBV HCV CMV
Bilant pretransplant HIV HBV HCV CMV Toxoplasma gondii et
Treponema pallidum nu sint virusuri, dar se determina in acest caz
virusuri, CMV EBV : la donatorii de maduva HAV : la receptorii de
grefa de maduva
Bilant la femeile insarcinate Rubeola Toxoplasma gondii VIH
Syphilis Ag HBs CMV
VIDAS (Vitek Immuno Diagnostic Assay Systems )
VIDAS
Exemple teste: Rujeola IgG V. urlian IgG Rubeola IgG CMV IgG CMV
IgM Varicela Zoster IgG Rotavirus
