BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

PHÍ THỊ ĐÀO

“TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CÁC

ANALOG CỦA BENGAMIDE A VÀ E”

Chuyên ngành : Hóa hữu cơ

Mã số : 62 44 01 14

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

Hà Nội - 2018

Công trình được hoàn thành tại: Học Viện Khoa học và

Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học:

1. PGS.TS.Habil Phạm Văn Cường

2. TS. Đoàn Thị Mai Hương

Phản biện 1:

Phản biện 2:

Phản biện 3:

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến

sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’,

ngày … tháng … năm 2018

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Thi Dao Phi, Huong Doan Thi Mai, Van Hieu Tran, Bich

Ngan Truong, Tuan Anh Tran, Van Loi Vu, Van Minh Chau, Van

Cuong Pham. Design, synthesis and cytotoxicity of bengamide

analogues and their epimers. Med. Chem. Commun, 2017,8, 445-451.

2. Thi Dao Phi, Huong Doan Thi Mai, Van Hieu Tran, Van

Loi Vu, Bich Ngan Truong, Tuan Anh Tran, Van Minh Chau and

Van Cuong Pham. Synthesis of bengamide E analogues and their

cytotoxic activity. Tetrahedron Letters. 2017, 58, 1830-1833

3. Phi Thi Dao, Doan Thi Mai Huong, Le Thi Phuong, Chau Van

Minh, Pham Van Cuong. Synthesis of 8-methyl-2-O-methyl-3,5-O-(1-

methyl ethylidene)-6,7,8,9-tetradeoxy-D-gulo-6-nonenonic acid (6E)- -

lactone. Vietnam Journal of Chemistry, 2015,53 (2e), 154-157

4. Phi Thi Dao, Doan Thi Mai Huong, Vu Van Loi, Chau Van

Minh, Pham Van Cuong. Microwave-assisted synthesis of lactams from

amino acids. Vietnam Journal of Chemistry, 2015, 53 (2e), 198-201.

5. Phi Thi Dao, Vu Van Loi, Nguyen Thi Bich, Doan Thi Mai

Huong, Nguyen Hien, Chau Van Minh, Pham Van Cuong. Synthesis

of N-alkyl amino lactam derivatives. Journal of Science and

Technology, 2016, 54 (2C), 291-298.

6. Phí Thị Đào, Đoàn Thị Mai Hương, Vũ Văn Lợi, Châu Văn

Minh, Phạm Văn Cường. Nghiên cứu quy trình tổng hợp và hoạt tính

gây độc tế bào của hợp chất (2R,3R,4S,5R,6E)-3,4,5-trihydroxy-2-

methoxy-8,8-dimetyl-N-((S)-2-oxoazepan-3-yl)non-6-enamide. Tạp

chí Hóa học, 2016, 54 (6e2),62-65.

7. Phí Thị Đào, Đoàn Thị Mai Hương, Vũ Văn Lợi, Nguyên

Thị Huệ, Phạm Văn Cường. In vitro cytotoxic and antimicrobial

activities of some bengamide derivatives. Tạp chí Hóa học 2017

55(3), 342-347.

8. Giải pháp hữu ích. Phương pháp tổng hợp các dẫn xuất của

bengamit . Đã được chấp nhận đơn hợp lệ

1

I. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1. Đặt vấn đề

Các hợp chất thiên nhiên được phân lập từ các loài thực vật trên đất

liền đã được nghiên cứu từ rất lâu và đã thu được nhiều thành công. Tuy

nhiên, nghiên cứu về các hợp chất thiên nhiên biển mới chỉ được bắt đầu

từ khoảng giữa thế kỷ trước. Hiện nay, các hợp chất thiên nhiên biển

đang được biết đến như một nguồn dược liệu đầy triển vọng và nhiều các

hợp chất có hoạt tính sinh học cao với cấu trúc phức tạp đã được phát

hiện từ các loài sinh vật biển khác nhau. Khó khăn trong việc thu mẫu

lượng lớn và đòi hỏi kinh phí cao là một trong những trở ngại đối với các

nghiên cứu trong lĩnh vực hóa học các hợp chất thiên nhiên biển. Chính

bởi vậy, tổng hợp hữu cơ là phương án lựa chọn hiệu quả trong việc tạo

nguồn hoạt chất với lượng lớn hơn để phục vụ các nghiên cứu hoạt tính

sinh học, cũng như việc đảm bảo khả năng ứng dụng của chúng. Nhiều

hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên biển đóng vai trò như chất dẫn đường

để từ đó các nhà khoa học tạo ra các dẫn xuất mới có hoạt tính sinh học

cao hơn. Lớp chất bengamides được phân lập từ hải miên biển được biết

đến có hoạt tính chống ung thư rất tiềm năng. Tuy nhiên, độ kém ổn định

về mặt cấu trúc là một trong các nguyên nhân hạn chế khả năng ứng

dụng của lớp chất này. Nhằm khắc phục hạn chế này của lớp chất

bengamides, trong khuôn khổ luận án này, chúng tôi lựa chọn đề tài

nghiên cứu: “Tổng hợp và khảo sát hoạt tính sinh học các analog của

bengamide A và E”.

2. Mục tiêu của luận án

Xây dựng quy trình tổng hợp các analog của bengamide A và E,

tiến hành đánh giá hoạt tính sinh học của các analog tổng hợp được.

3. Ý nghĩa khoa học và những đóng góp mới của luận án

3.1. Ý nghĩa khoa học

- Luận án đã đóng góp tổng hợp được các analog mới của bengamide

A và E.

- Ứng dụng phương pháp chiếu xạ vi sóng trong tổng hợp hữu cơ.

3.2. Những đóng góp mới của luận án

2

Đã tổng hợp được 30 analog của bengamide A và E trong đó có

16 analog của bengamide E, 4 analog bengamide A và 10 hợp chất có

chứa flo

Đã xây dựng được quy trình tổng hợp lập thể của các analog của

bengamide A và E.

Đã sử dụng phương pháp chiếu xạ vi sóng trong phản ứng đóng

vòng nội phân tử acid amine, phản ứng bảo vệ nhóm chức amine bậc 1

và phản ứng kết nối chuỗi ketide và aminolactam giúp rút ngắn thời gian

phản ứng, nâng cao hiệu suất phản ứng.

Đã khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của các analog tổng hợp

được trên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm (Lu, NCI-H1975, A549,

MCF7, MDA-MB-231, HepG2, Hep3B, KB, HL60 và Hela) trong đó

nhiều analog thể hiện hoạt tính mạnh với IC50 < 1µM. Đã khảo sát hoạt

tính kháng vi sinh vật kiểm định của một số analog trên 7 chủng gram

(+), gram (-) và nấm men. Kết quả cho thấy một số analog cũng có hoạt

tính với chủng gram (+).

4. Bố cục của luận án

Luận án dày 153 trang với 25 bảng số liệu, 65 hình và 57 tài liệu

tham khảo được bố cục như sau:

Mở đầu: 2 trang

Chương 1: Tổng quan 32 trang

Chương 2: Thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu 64 trang

Chương 3: Kết quả và thảo luận 41 trang

Kết luận, kiến nghị: 2 trang

Ngoài ra, luận án còn có phần phụ lục gồm các phổ của các analog

bengamide tổng hợp được.

II. NỘI DUNG LUẬN ÁN

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đề cập đến ý nghĩa khoa học, tính thực tiễn, đối tượng và nhiệm vụ

nghiên cứu của luận án.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

Tổng quan gồm 32 trang, tổng kết tài liệu về các bengamide phân lập

3

từ tự nhiên. Các phương pháp tổng hợp các analog của bengamide và hoạt

tính sinh học của chúng.

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

Phương pháp nghiên cứu gồm 4 trang mô tả các phương pháp tổng

hợp hữu cơ, các phương pháp xác định cấu trúc hóa học và các phương

pháp thử hoạt tính sinh học.

Thực nghiệm gồm 64 trang mô tả chi tiết quy trình tổng hợp các analog

bengamide. Các tính chất vật lý và số liệu phổ của các chất tổng hợp được.

Chúng tôi đã đưa ra phương pháp tổng hợp các dãy chất sau:

- Tổng hợp chuỗi ketide

- Tổng hợp các dẫn suất thế N-ankyl aminolactam vòng 6 và vòng 7.

- Tổng hợp các analog của bengamide A và E

- Tổng hợp các analog bengamide chứa flo.

Đã thử hoạt tính gấy độc tế bào của 30 analog tổng hợp được trên 10 dòng

tế bào (Lu1, NCI-H1975, A549, MCF7, MDA-MB-231, HepG2, Hep3B,

KB, HL60 và Hela). Đã thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định trên 7 chủng

gram (+), gram âm (-) và nấm men.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Các nghiên cứu đã công bố về tổng hợp và đánh giá hoạt tính ức

chế tế bào ung thư đối với các analog của bengamide cho thấy sự biến

đổi cấu trúc của khung bengamide ảnh hưởng mạnh đến hoạt tính sinh

học. Đặc biệt, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sự có mặt của các nhóm

hydroxyl và cấu hình của C-3, C-4 và C-5 của chuỗi ketide đóng vai trò

đặc biệt quan trọng đối với hoạt tính gây độc tế bào của lớp chất này.

Nhằm nghiên cứu mối tương quan giữa cấu trúc – hoạt tính gây độc tế

bào của các analog bengamide, trong khuôn khổ luận án này, việc biến

đổi cấu trúc khung bengamide được thực hiện theo các hướng sau: i) thay

thế nhóm isopropyl bằng nhóm nhóm tert-butyl tạo các chất có cấu trúc

ổn định hơn do tránh được sự dịch chuyển nối đôi từ C-7/C-8 sang vị trí

C-8/C-9 (isomer hóa); ii) thay đổi cấu hình của cacbon C-2’ của vòng

4

lactam tạo các cặp đồng phân diastereomer, qua đó có thể đánh giá ảnh

hưởng của cấu hình C-2’ đến hoạt tính; iii) N-alkyl hóa nhóm amide của

vòng lactam, iv) tổng hợp một số analog với nhóm hydroxyl tại C-5’; v)

thay đổi kích cỡ vòng lactam; vi) thay thế phần olefin cuối mạch bằng

nhóm FCH2-CH(OH)- nhằm đánh giá vai trò của phần cấu trúc olefin

cuối mạch (Hình 3.1).

Hình 3.1. Định hướng các biến đổi trên khung bengamide

Quy trình tổng hợp các analog mới của bengamide được thực hiện

từ chất thương mại α-D-glucoheptonic γ-lactone và các acid amine (L-

ornithine monohydrochloride, D-ornithine monohydrochloride, L-lysine,

D-lysine và D,L-5-hydroxylysine hydrochloride) qua 3 giai đoạn chính.

3.1. Tổng hợp chuỗi ketide

Quá trình tổng hợp ketide BG5 được thực hiện với việc sử dụng

hợp chất đầu đã được thương mại hóa, α-D-glucoheptonic γ-lactone

(Hình 3.2). Phản ứng acetonide hóa tạo ra BG1 sử dụng tác nhân acetone

với xúc tác acid sulphuric cho hiệu suất là 67,8 %.

Hình 3.2. Sơ đồ phản ứng tổng hợp ketide BG5

Thủy phân chọn lọc một nhóm isopropylidene của BG2 bằng

5

acid acetic thu được hợp chất BG3 với hiệu suất phản ứng đạt 85%.

Nghiên cứu phản ứng oxy hóa cắt mạch diol với tác nhân NaIO4 trong

hỗn hợp các loại dung môi khác nhau cho thấy với việc sử dụng 1,2 eq

NaIO4 trong hỗn hợp dung môi MeCN và H2O tỷ lệ 4/1 (v/v) thu được

sản phẩm aldehyde BG4 với hiệu suất phản ứng cao nhất (91%).

Phản ứng cuối cùng là quá trình olefin hóa aldehyde BG4. Phản

ứng được nghiên cứu việc sử dụng tác nhân (P(t-Bu)3HBF4) (1,5 - 3 eq)

với sự có mặt của TEA, potassium t-butoxide ((CH3)3COK) hoặc với

NaH (1,5 eq) trong dung môi THF ở nhiệt độ phòng trong thời gian từ 3

– 24 h. Tuy nhiên các phản ứng trên đều không tạo thành sản phẩm BG5.

Phản ứng sau đó được thực hiện thành công theo phương pháp của Takai

(Takai reaction) với việc sử dụng tác nhân 1,1-diiodo-2,2

dimethylpropane và CrCl2. Kết quả nghiên cứu cho thấy, phản ứng sử

dụng tác nhân 1,1-diiodo-2,2 dimethylpropane từ hãng Aldrich, hợp chất

ketide BG5 tạo thành với hiệu suất cao nhất đạt 45%. Trong khi đó, hợp

chất ketide BG5 thu được với hiệu suất cao hơn nhiều (73%), khi phản

ứng được thực hiện với tác nhân 1,1-diiodo-2,2 dimethylpropane tự tổng

hợp. Cơ chế của phản ứng oxi hóa cắt mạch BG3 và sự hình thành BG5

từ BG4 với việc sử dụng phản ứng Takai được trình bày trong hình dưới

đây.

Hình 3.3: Cơ chế phản ứng tổng hợp BG5

6

Theo đó, trong phản ứng oxi hóa với NaIO4 thì mức oxi hóa của

iodine chuyển từ +7 (NaIO4) xuống +5 (NaIO3). Đối với phản ứng tổng

hợp olefin theo Takai, đây là sự kết hợp giữa các aldehyde và

dihaloalkan geminal để tạo thành olefin. Trong phản ứng này Cr (II) đã

bị oxy hóa thành Cr (III) khi thay thế cả hai nguyên tử halogen. Các

geminal carbodianion hình thành phản ứng với aldehyde tạo thành anken.

Công thức cấu tạo của các chất được xác định dựa vào số liệu phổ

MS, 1H-NMR, 13C-NMR.và so sánh với tài liệu đã được công bố.

3.2. Phản ứng tổng hợp các hợp chất 2-amino lactam

3.2.1. Phản ứng tổng hợp các chất BG6a-b và BG14a-b

Cấu trúc vòng α-amino lactam tồn tại trong nhiều hợp chất thể

hiện hoạt tính sinh học cao. Do đó việc tổng hợp α-amino lactam đã thu

hút sự chú ý của nhiều nhóm nghiên cứu. Điển hình là việc tổng hợp α-

aminocaprolactam từ L-lysine. Theo công trình công bố của G.Pifferi và

cộng sự, phản ứng đóng vòng tạo BG14a từ L-lysine trong điều kiện đun

khuấy thông thường cho hiệu suất đạt 95% với thời gian thực hiện phản

ứng là 48 h. Trong một nghiên cứu khác, Blade-Front công bố quy trình

tổng hợp BG14a đạt hiệu suất 70% trong thời gian ngắn hơn (20 h) với

việc sử dụng tác nhân Al2O3 trong hỗn hợp toluene/pyridine. Ngoài ra,

phản ứng tổng hợp BG14a từ L-lysine còn được thực hiện trong điều

kiện nhiệt độ và áp suất cao với hiệu suất sản phẩm đạt 88%.

Để khắc phục những nhược điểm sử dụng tác nhân đắt tiền, độc

hại, thời gian thực hiện phản ứng dài hoặc thực hiện phản ứng trong điều

kiện nhiệt độ và áp suất cao, chúng tôi đã nghiên cứu phản ứng đóng

vòng nội phân tử các acid amine với sự trợ giúp của vi sóng. Theo đó,

hợp chất α-aminocaprolactam (BG14a) đạt hiệu suất 79% từ L-lysine với

điều kiện phản ứng được thực hiện trong ethylene glycone dưới chiếu xạ

của vi sóng ở 284 W trong vòng 1 h. Trong khi đó, hiệu suất BG14a tạo

thành thấp hơn (48%) nếu thực hiện phản ứng trong dung môi butanol.

Áp dụng điều kiện phản ứng tương tự, hợp chất BG14b được tổng hợp

với hiệu suất 82% từ D-lysine. Đối với việc tổng hợp các hợp chất amino

lactam vòng 6 cạnh BG6a và BG6b, dưới sự chiếu xạ của vi sóng ở 284

7

W trong khoảng thời gian 60 phút trong ethylene glycol với sự có mặt của

pyridine đạt hiệu suất 55,6%. Khi thay thế pyridine bằng dung dịch

NaHCO3 10% và thực hiện phản ứng tương tự với sự trợ giúp của vi

sóng, hợp chất amino lactam BG6a thu được đạt hiệu suất 78%. Áp dụng

quy trình tương tự, hợp chất amino lactam BG6b được tổng hợp với hiệu

suất 72% từ D-ornithine hydrochloride.

3.2.2. Phản ứng tổng hợp các chất rac-BG22a và rac- BG22b

(i): dd NaHCO3 10%, ethylen glycon, pyridine, MW, 284W, 1h

(ii): (Boc)2O (1eq), TEA, THF, H2O, rt, 3h

Do các đồng phân quang học của 5-hydroxylysine không còn được

thương mại hóa, nên các đồng phân 6-hydroxycaprolactam được điều chế

từ hỗn hợp racemic của 2 đồng phân diastereomer của hợp chất 5-

hydroxylysine. Theo đó, phản ứng đóng vòng nội phân tử của hỗn hợp

D,L-5-hydroxylysine hydrochloride được thực hiện với sự chiếu xạ vi

sóng ở công suất 284 W trong thời gian 60 phút tạo thành hỗn hợp

racemic của 2 đồng phân diastereomer rac-BG22a và rac-BG22b. Hỗn

hợp sản phẩm được tinh chế trên cột silica gel với hệ dung môi

acetone/H2O/NH4OH tỷ lệ 9/1/0,1 thu được các hợp chất racemic rac-

BG22a (53%, Rf = 0,49) và rac-BG22b (39%, Rf = 0,34). Do không thể

xác định trực tiếp cấu hình tương đối tại C-3 và C-6 của rac-BG22a và

rac-BG22b, nên các hợp chất này được chuyển hóa thành dẫn xuất N-

Boc nhằm so sánh với dữ liệu phổ NMR đã được công bố. Phản ứng của

từng hợp chất rac-BG22a và rac-BG22b với tác nhân Boc2O được thực

hiện trong hỗn hợp dung môi THF/H2O với sự có mặt của TEA tạo ra các

8

hợp chất rac-BG23a và rac-BG23b tương ứng. So sánh với dữ liệu phổ

NMR đã công bố cho thấy rac-BG23a có cấu hình 3,6-trans (3S*,6S*).

Như vậy cấu hình 3,6-cis (3S*,6R*) được xác định cho hợp chất rac-

BG23b. Từ đó cho phép xác định cấu hình 3,6-trans (3S*,6S*) và 3,6-cis

(3S*,6R*) tương ứng cho các hợp chất rac-BG22a và rac-BG22b.

3.2.3. Phản ứng tổng hợp các N-ankylaminolactam

3.2.3.1. Phản ứng bảo vệ nhóm chức amine của các 2-aminolactam

Để bảo vệ nhóm chức amine bậc 1, các hợp chất 3-aminolactam

được cho phản ứng với anhydride phthalic. Phản ứng giữa BG6a và

anhydride phthalic được thực hiện trong acid acetic ở nhiệt độ 100 oC

trong 6 giờ thu được hợp chất BG7a với hiệu suất thấp (30%). Sau đó

thực hiện phản ứng với sự trợ giúp của vi sóng hợp chất BG7a thu được

với hiệu suất cao hơn (53%) và thời gian ngắn hơn (1 giờ). Sử dụng điều

kiện phản ứng tương tự dưới sự chiếu xạ vi sóng, nhóm amine của các

hợp chất BG6b, BG14a và BG14b cũng được bảo vệ, thu được các hợp

chất BG7b, BG15a và BG15b với hiệu suất trong khoảng 52 – 57%.

a) anhydride phthalic, CH3COOH, rây phân tử 4Ǻ, MW, 284 W, 1 h

3.2.3.2. Phản ứng N-alkyl hóa các hợp chất.

Sau khi bảo vệ nhóm amine bậc 1, phản ứng alkyl hóa được thực

hiện lần lượt với các tác nhân alkylhalogen, (bromomethyl)cyclohexane,

benzyl bromide và cinnamyl bromide. Hợp chất BG7a được lựa chọn cho

việc nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện phản ứng. Phản ứng giữa BG7a và

(bromomethyl)cyclohexane, benzyl bromide hoặc cinnamyl bromide

không tạo ra sản phẩm N-alkyl mong muốn khi sử dụng các tác nhân kiềm

9

như K2CO3, KOH hay NaH trong các dung môi DMF hoặc THF. Tuy nhiên,

khi phản ứng được thực hiện trong dung môi DMSO, sự hình thành các sàn

phẩm N-alkyl mong muốn BG8a-BG10a đã được ghi nhận. Kết quả cho

thấy việc sử dụng dung môi DMSO và tỷ lệ tác nhân KOH (2 eq), K2CO3 (2

eq) và KI (1 eq) ở nhiệt độ 50 – 60 oC cho hiệu suất phản ứng cao nhất. Sử

dụng điều kiện phản ứng tương tự, các hợp chất N-alkyl khác đã đuợc tổng

hợp với hiệu suất 45 - 55%.

(a) (bromomethyl)cyclohexane hoặc (bromomethyl)benzene hoặc cinnamyl

bromide, DMSO, KOH, K2CO3, KI, 23h; (b) hydrazine, MeCN, 1h.

Cuối cùng, nhóm bảo vệ được loại bỏ thông qua việc xử lý các hợp

chất BG8a – BG10a, BG8b – BG10b, BG16a – BG18a, BG16b –

BG18b với dung dịch hydrazine trong dung môi acetonitrile ở nhiệt độ

phòng thu được các N-ankylaminolactam tương ứng, BG11a-13a,

BG11b-13b, BG19a-21a và BG19b-21b.

3.3. Tổng hợp các analog của bengamide E

Quá trình tổng hợp các bengamide được tiến hành thông qua

phản ứng kết hợp giữa phần ketide và các aminolactam. Thực tế, quá

trình phản ứng mở vòng lactone của ketide BG5 đã được nghiên cứu và

công bố trước đây. Theo đó, David D. Xu và cộng sự đã nghiên cứu tối

ưu hóa phản ứng của BG5 và amine LAF-A. Các tác giả nhận thấy,

trong điều kiện sử dụng tác nhân sodium 2- ethyl hexanoate trong dung

môi THF ở nhiệt độ phòng, sản phẩm LAF-B tạo thành với hiệu suất từ

85 – 92% sau 20 giờ.

10

Hình 3.9. Phản ứng kết hợp của BG5 và LAF-A do David công bố

Phương pháp của David D. Xu và cộng sự có ưu điểm là sử dụng

tác nhân rẻ tiền, điều kiện êm dịu, tuy nhiên thời gian phản ứng kéo dài

(15 - 20 giờ). Trong khuôn khổ luận án này, chúng tôi đã tiến hành

nghiên cứu sự trợ giúp của vi sóng nhằm rút ngắn thời gian phản ứng.

Phản ứng giữa BG5 và BG6a được sử dụng để nghiên cứu tối ưu hóa

điều kiện phản ứng. Theo đó, với việc sử dụng sodium 2- ethyl hexanoate

trong dung môi THF hoặc 1,4-dioxane, ở nhiệt độ từ 50 – 100 oC, trong

10 đến 24 giờ, hiệu suất sản phẩm BG24a thu được từ 50 – 58%. Trong

khi đó, dưới sự chiếu xạ của vi sóng, thời gian phản ứng được rút ngắn

đáng kể và hiệu suất sản phẩm BG24a thu được đạt 87%. Như vậy có thể

thấy, phản ứng giữa BG5 và BG6a đạt được hiệu suất cao nhất khi sử

dụng 1,2 – 1,5 eq sodium 2- ethyl hexanoate, dưới chiếu xạ vi sóng tại

100 W trong 1 giờ.

Bảng 3.7. Điều kiện phản ứng tổng hợp BG24a

Dung môi sodium 2-

ethyl hexanoate

MW Nhiệt độ Thời gian

Hiệu suất

1,4-dioxane

2 eq - 100 oC 10h 50%

1,4-dioxane

1,5 eq - 100 oC 10h 50%

THF 1,5 eq - 50-60 oC 24h 58% THF 1,5 eq 284 W >100 oC 30 phút 55%

11

Dung môi sodium 2-

ethyl hexanoate

MW Nhiệt độ Thời gian

Hiệu suất

THF 1,5 eq 100 W 50-60 oC 1h 87% THF 1,2 eq 100 W 50-60 oC 1h 87%

THF 1 eq 100 W 50-60 oC 1h 80%

Sử dụng điều kiện phản ứng tương tự như quá trình tổng hợp BG24a,

các sản phẩm BG24b, BG25a – BG31a và BG25b – BG31b cũng được

tổng hợp. Hiệu suất phản ứng của các hợp chất này thu được trong

khoảng 64 – 95%.

Cấu trúc của các sản phẩm BG24a - BG31a, BG24b - BG31b,

đã được khẳng định bằng phân tích dữ liệu phổ MS và NMR. Chẳng hạn

đối với hợp chất BG24a, pic ion giả phân tử ở m/z 421 [M+Na]+ được

quan sát thấy trên phổ ESI-MS. Mặt khác, phổ 13C-NMR và DEPT của

BG24a cho tín hiệu của 20 nguyên tử cacbon trong đó có 2 nhóm

cacbonyl ở C 171,1 (C-1´), 170,5 (C-1), 1 nhóm methoxy ở C 59,8 (C-

12), 2 nhóm metin sp2, 3 nhóm methylene, 5 nhóm metin sp3, 5 nhóm

methyl và 2 cacbon bậc 4.

12

Hình 3.12. Phổ 13C-NMR giãn rộng của hợp chất BG24a

Trên phổ 1H-NMR của BG24a xuất hiện tín hiệu của 5 nhóm

methyl ở H 1,03 (9H, s, Me-9,10,11), 1,47 (3H, s, Me-15), 1,49 (3H, s,

Me-16), 2 proton olefin ở H 5,77 (1H, dd, J = 0,5; 16,0 Hz, H-7), 5,55

(1H, dd, J = 7,0; 16,0 Hz, H-6) và 1 nhóm methoxy ở H 3,46 (3H, s).

Hơn nữa, tín hiệu của 1 nhóm NH được ghi nhận ở H 7,32 (1H, d, J =

5,5 Hz, NH-13), 1 nhóm metin ở H 4,33 (1H, m, H-2´), 1 nhóm

methylen liên kết với nitơ ở H 3,36 (3H, m, CH2-5´ và OH) và 4 nhóm

oxymetin nằm trong khoảng H 3,91- 4,25 cũng được quan sát thấy trên

phổ 1H-NMR. Ngoài ra, trên phổ 1H-NMR cũng cho tín hiệu của 4 proton

nằm trong khoảng H 1,57-2,57 được xác định thuộc về 2 nhóm

methylene nhờ phân tích phổ HSQC.

Hình 3.13. Phổ 1H-NMR giãn rộng của hợp chất BG24a

13

Như vậy có thể thấy, các tín hiệu thu được từ phổ 1D-NMR hoàn

toàn phù hợp với cấu trúc hóa học của BG24a. Hơn nữa, sự gắn kết của

phần ketide với aminolactam thông qua liên kết C-1/N-13 được khẳng

định từ tương tác của H-2´ ở H 4,33 với nhóm cacbonyl C-1 tại C 171,1

trên phổ HMBC.

Hình 3.14. Một số tương tác chính trên phổ COSY và HMBC

của chất BG24a

Giai đoạn cuối cùng trong quy trình tổng hợp các analog

bengamide là loại bỏ nhóm bảo vệ acetonide. Quá trình phân tách nhóm

acetonide được thực hiện trong môi trường acid TFA ở nhiệt độ 0 oC

trong thời gian 1,5 h cho hiệu suất phản ứng đạt 35 - 69%.

Bảng 3.9. Phản ứng loại bỏ nhóm acetonide

Cấu trúc của các analogue của bengamide 32a-b – 39a-b đã

được khẳng định bằng các phương pháp phổ. Phổ khối lượng thu được

trên phổ HRESI-MS của các hợp chất này hoàn toàn phù hợp với công

14

thức phân tử dự kiến. Ngoài ra, trên phổ 1D NMR của các các analogue

32a-b – 39a-b, không còn các tín hiệu của nhóm acetal so với các hợp

chất acetonide tương ứng. Đồng thời cấu trúc hóa học của các analogue

32a-b – 39a-b còn được chứng minh bằng phổ NMR 2 chiều.

Hinh 3.18. Phổ 13C-NMR của chât BG32a

Hinh 3.19. Phổ 1H-NMR của chât BG32a

Hinh 3.19. Phổ 1H-NMR của chât BG32a

15

3.4. Tổng hợp các analog của bengamide A

(a):MW,100W, 120 mn, 1,4-dioxan, sodiun-2 ethylhexanoate

Áp dụng quy trình phản ứng mở vòng lactone của ketide BG5

với các aminolactam dưới điều kiện chiếu xạ vi sóng như được trình bày

ở phần trên, các acetonide BG40a-d cũng đã được tổng hợp. Hợp chất

BG5 khi được cho phản ứng với hỗn hợp racemic rac-BG22a (3S*,6S*)

tạo thành 2 đồng phần diastereomer BG40a và BG40b. Hai đồng phần

diastereomer BG40a và BG40b được phân tách bằng sắc ký lớp mỏng

điều chế. Cấu trúc hóa học của các hợp chất BG40a-d được khẳng định

thông qua các phân tích phổ, đặc biệt phổ NMR. Sự hình thành liên kết

amide giữa chuỗi ketide và phần aminolactam được chứng minh bởi

tương tác của cacbonyl C-1 với proton H-2’, và tương tác của proton

amide (NH-13) với C-1 và C-1’ trên phổ HMBC.

So sánh dữ liệu phổ NMR và độ quay cực với hợp chất

bengamide Y [13], cho phép xác định cấu hình 2’S,5’S cho hợp chất

BG40a. Như vậy cấu hình 2’R,5’R được gán cho hợp chất BG40b.

16

Tương tự, phản ứng giữa BG5 với hợp chất hỗn hợp racemic rac-BG22b

(3S*,6S*) thu được 2 đồng phần diastereomer BG40c và BG40d, sau khi

được phân tách bằng sắc ký lớp mỏng điều chế. Cấu hình 2’S,5’R được

xác định cho BG40c và cấu hình 2’R,5’S cho BG40d dựa vào so sánh dữ

liệu phổ NMR và độ quay cực với công bố trước đây.

Hình 3.39. Một số tương tác chính trên phổ COSY và HMBC của BG40a

Tương tự các analog bengamide E, các analog của bengamide A

được tổng hợp thông qua phản ứng loại bỏ nhóm bảo vệ acetonide của

các hợp chất BG40a-d trong dung môi THF với sự có mặt của TFA ở

nhiệt độ 0 – 5 oC trong thời gian 2 h. So sánh dữ liệu phổ NMR của các

sản phẩm BG41a-d với các hợp chất acetonide BG40a-d cho thấy mất đi

tín hiệu của 2 nhóm methyl và 1 cacbon bậc 4 điều này chứng tỏ nhóm

acetonide đã được loại bỏ.

17

3.5. Phản ứng tổng hợp các analog bengamide chứa flo

Để hiểu rõ vai trò của phần olefinic cuối mạch đối với hoạt tính

của lớp chất bengamide, trong hướng nghiên cứu tiếp theo chúng tôi đã

tiến hành tổng hợp và khảo sát hoạt tính sinh học của các analogue trong

đó phần olefinic cuối mạch được thay thế bằng nhóm CH(OH)-CH2F.

Quy trình tổng hợp các analoge này được thực hiện như miêu tả trong

hình 3.45.

Hình 3.45: Sơ đồ tổng hợp các analog bengamide chứa flo.

Quá trình điều chế các analoge có chứa flo được thực hiện

trước tiên bằng phản ứng flo hóa hợp chất BG3 với tác nhân

diethylaminosulfur trifluoride (DAST) ở nhiệt độ phòng cho phép thu

được dẫn xuất flo BG3F với hiệu xuất 42%. Trong điều kiện phản ứng

này, quá trình flo hóa xảy ra chọn lọc tại nhóm hydroxyl bậc 1.

Cấu trúc của sản phẩm tạo thành BG3F được khẳng định qua

phân tích các dữ liệu phổ. Phổ khối lượng phân giải cao (HRESI-MS)

cho pic ion giả phân tử [M-H]- tại m/z 263,0928 phù hợp với công thức

dự kiến C11H16FO6 của BG3F. Ngoài ra, sự hiện diện của flo trong cấu

trúc của BG3F, còn được thể hiện qua các tín hiệu kép được gây ra bởi

18

tương tác với nguyên tử flo của C-7 [δC 83,7 (d, JC-F = 166,25 Hz)], C-6

[δC 68,6 (d, 2J C-F = 18,75 Hz)] và C-5 [67,0 (d, 3J C-F = 6,25 Hz)].

Dẫn xuất flo BG3F sau đó được cho phản ứng với các

aminolactams đã điều chế ở trên, trong sự có mặt của sodium 2-

ethylhexanoate dưới điều kiện chiếu xạ vi sóng ở 100 W, trong thời gian

1 giờ thu được các hợp chất mở vòng lactone tương ứng. Cấu trúc hóa

học của các sản phẩm mở vòng cũng đã được khẳng định bằng các

phương pháp phổ, đặc biệt phổ HMBC. Trong đó, sự gắn kết của vòng

aminolactam và chuỗi polyketide được minh chứng qua tương tác của C-

1, C-2 và C2’ với proton NH của nhóm amide hình thành.

Hình 3.50. Một số tương tác chính trên phổ HMBC, COSY của chất

BG4Fa và BG4Fb

Tương tự như đối với quá trình loại bỏ nhóm acetonide trong

tổng hợp các analogue bengamide A được trình bày ở phần trên, phản

ứng loại nhóm bảo vệ acetonide của hợp chất BG4Fa được thực hiện với

tác nhân acid TFA, dung môi THF ở điều kiện nhiệt độ 0oC đến nhiệt độ

19

phòng. Tuy nhiên, trong điều kiện phản ứng này, hợp chất đầu bị phân

hủy và không thu được sản phẩm mong muốn. Các nghiên cứu của chúng

tôi sau đó cho thấy rằng sử dụng tác nhân acid HCl 1N đối với việc loại

bảo acetonide của hợp chất BG4Fa cho phép thu được sản phẩm momg

muốn. Theo đó, sản phẩm BG4Fa thu được với hiệu suất 33 – 50% dưới

điều kiện sử dụng HCl 1N trong dung môi THF với thời gian 24 giờ.

Trong khi đó, khi sử dụng dung môi MeOH thay cho THF, sản phẩm

BG4Fa thu được với hiệu suất cao hơn (58 – 66%) và thời gian ngắn hơn

(5 giờ). Có thể thấy, việc sử dụng dung dịch HCl 1N trong dung môi

MeOH là phù hợp hơn đối với phản ứng loại bỏ nhóm acetonide của dãy

analogue bengamide có chứa flo.

3.6. Hoạt tính sinh học của các hợp chất tổng hợp được

3.6.1. Hoạt tính gây độc tế bào

Các analog bengamide đã tổng hợp, được thử hoạt tính đối với 6

dòng tế bào ung thư (KB, HepG-2, LU-1, MCF-7, HL-60 và Hela). Kết

quả cho thấy các analog có cấu hình C-2´R phi tự nhiên thể hiện hoạt tính

tốt hơn các epimer C-2´S là các dẫn xuất có cấu hình giống các hợp chất

phân lập được từ tự nhiên (Bảng 3.13 ). Các analog có vòng aminolactam

là vòng 7 hầu như thể hiện hiện hoạt tính tốt hơn các analog vòng 6 cùng

loại. Đối với 6 dòng tế bào ung thư thử nghiệm, các hợp chất thể hiện

hoạt tính mạnh hơn trên 4 dòng tế bào ung thư biểu mô KB, ung thư phổi

20

LU-1, ung thư gan HepG-2 và ung thư vú MCF-7 so với 2 dòng tế bào

ung thư còn lại là tế bào ung thư máu HL-60 và ung thư cổ tử cung Hela.

Chín hợp chất, BG34b, BG35a, BG35b, BG36b, BG37b, BG38a,

BG38b, BG39a và BG39b thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với cả 6

dòng tế bào ung thư thử nghiệm. Đặc biệt, hợp chất BG36b thể hiện khả

năng ức chế mạnh đối với 6 dòng tế bào ung thư KB, HepG-2, LU-1,

MCF-7, HL-60 và Hela với giá trị IC50 lần lượt là 1,1; 1,1; 0,5; 0,2; 5,4

và 2,3 µM. Mặt khác, hợp chất BG36a và BG36b thể hiện hoạt tính ức

chế chọn lọc đối với dòng tế bào ung thư vú MCF-7 với giá trị IC50 lần

lượt là 1,3 và 0,2 µM, trong khi hợp chất BG37b và BG38b ức chế chọn

lọc đối với 3 dòng tế bào ung thư KB, HepG-2 và LU-1 với giá trị IC50

nằm trong khoảng 0,3-1,1 µM. Ngoài ra, hợp chất BG39a và BG39b thể

hiện hoạt tính chọn lọc đối với 2 dòng tế bào ung thư KB và HepG-2 với

với giá trị IC50 nằm trong khoảng 0,4-1,9 µM.

Bảng 3.13. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của analog bengamide tổng hợp

Analog IC50 (µM)

KB HepG-2 Lu-1 MCF-7 HL-60 Hela

BG32a 22,1 >50 13,8 >50 >50 >50

BG32b 11,1 22,0 2,6 >50 >50 >50

BG33a 8,2 11,8 12,7 20,1 >50 >50

BG33b 2,4 6,6 2,6 8,8 >50 >50

BG34a 2,9 11,3 7,5 17,8 >50 39,7

BG34b 4,4 12,0 2,7 20,4 29,0 19,7

BG35a 2,3 6,6 5,8 4,3 36,8 36,8

BG35b 1,7 2,4 2,3 15,1 21,5 16,1

21

Analog IC50 (µM)

KB HepG-2 Lu-1 MCF-7 HL-60 Hela

BG36a 21,0 21,1 4,3 1,3 >50 >50

BG36b 1,1 1,1 0,5 0,2 5,3 2,1

BG37a 11,8 >50 17,1 >50 >50 >50

BG37b 0,4 1,0 0,3 10,4 19,5 39,1

BG38a 5,7 4,8 7,7 32,5 45,6 41,5

BG38b 1,0 1,9 1,1 8,6 10,6 16,2

BG39a 1,9 1,5 23,6 4,9 13,4 26,9

BG39b 1,1 0,4 25,1 2,7 8,9 9,5

BG41a 19,8 >50 10,0 >50 >50 >50

BG41b 5,1 21,3 17,2 >50 12,1 15,4

BG41c >50 >50 23,4 23,4 >50 >50

BG41d 23,7 >50 36,3 >50 >50 >50

BGF5a >50 >50 >50 >50 >50 >50

BGF5a >50 >50 >50 >50 >50 >50

Elipticine 1,2 1,6 1,2 2,4 2,0 1,6

Chất đối chứng dương: Elipticine

Các hợp chất có nhóm OH ở vị trí 5´ thể hiện hoạt tính thấp hơn

các analog không chứa chóm OH trên vòng lactam. Trong số các hợp

chất này, hai hợp chất BG41a và BG41b thể hiện hoạt tính đáng kể

tương ứng đối với tế bào ung thư Lu-1 và KB. Hai hợp chất còn lại

không thể hiện hoạt tính đáng kể trên cả 6 dòng tế bào ung thư thử

nghiệm.

Mặt khác, hai hợp chất chứa flo BG5Fa-b không thể hiện hoạt

tính đối với 6 dòng tế bào ung thư thử nghiệm. Hơn nữa, các hợp chất

22

chứa flo còn lại (BG7Fa-b, BG9Fa-b, BG11Fa-b, BG13Fa-b) cũng đã

được thử nghiệm đối với sáu dòng tế bào ung thư khác là ung thư phổi

NCI-H1299, A549, ung thư vú MCF-7, MDA-MB-231, ung thư gan

Hep3B và ung thư cổ tử cung Hela. Tuy nhiên, tất cả các hợp chất này

đều không thể hiện hoạt tính. Điều này cho thấy phần cấu trúc olefin cuối

mạch ketide trong lớp chất bengamide dường như đóng vai trò quan

trọng đối với hoạt tính gây độc tế bào.

Ngoài ra, để hiểu rõ hơn sự ảnh hưởng của tính linh hoạt của

chuỗi ketide và của các nhóm hydroxy tự do tại C-3, C-4 và C-5 đến hoạt

tính gây độc tế bào, một số hợp chất acetonid BG24a-b, BG28a-b và

BG31a-b cũng đã được thử hoạt tính đối với sáu dòng tế bào ung thư

KB, HepG-2, LU-1, MCF-7, HL-60 và Hela.. Tuy nhiên, hầu hết các hợp

chất này đều không thể hiện hoạt tính hoặc kém hơn nhiều so với các

analog tương ứng đã được bỏ bảo vệ acetonid. Điều này có thể được giả

thiết là do sự có mặt của nhóm acetonide nên hạn chế sự quay tự do của

liên kết C-3/C-4/C-5, qua đó làm hạn chế tính linh hoạt của chuỗi

polyketide, đồng thời hai nhóm hydroxyl tại C-3 và C-5 không còn ở

trạng thái tự do. Điều này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu đã công bố

trước đây của nhóm tác giả Xu W. và cộng sự về vai trò của các nhóm

hydroxyl tại C-3, C-4 và C-5. Theo đó, một trong các yếu tố quan trọng

góp phần tạo ra hoạt tính của lớp chất bengamide đó là khả năng liên kết

tạo phức của bengamide với enzyme Methionine aminopeptidase thông

các liên kết tạo phức của 3 nhóm hydroxyl tại C-3, C-4 và C-5 của chuỗi

polyketide với các ion kim loại của phân tử protein Methionine

aminopeptidase.

3.6.2.Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Một số analog bengamide được lựa chọn thử hoạt tính kháng vi sinh

vật kiểm định đối với 3 chủng Gram (+) (Enterococcus faecalis,

23

Staphylococcus aureus, Bacillus cereus), 3 chủng Gram (-) (Escherichia

coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica) và 1 chủng nấm

(Candida albicans).

Bảng 3.12. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật của một số analog

Analog Gram (+) MIC (µg/ml) Gram (-) MIC (µg/ml) Nấm men

E.faecalis S.aureus B.cereus E.Coli P.aeruginosa S. enterica C.albicans

BG32a 64 128 32 - - - 128

BG34b 128 256 32 - - - 256

BG35b 32 64 4 - - - 64

BG37a 64 - 32 - - - 128

BG37b - - - - - - -

BG38a 128 - 64 - - - 256

BG38b 64 32 4 - - - 128

BG39a - - - - - - -

BG39b 32 16 4 - - - 64

S 256 256 128 32 256 128 -

T 4 16 64 8 256 256 -

K 128 4 8 128 64 16 -

C - - - - - - 32

Chất đối chứng dương: S: Steptomycin; T: Tetramycin; K: Kanamycin; C:

Cyclohexamide; (-): không có hoạt tính

KẾT LUẬN

Với việc sử dụng các phương pháp tổng hợp hữu cơ khác nhau,

30 analog của bengamide đã được tổng hợp. Trong đó có 16 analog của

bengamide E, 4 analog bengamide A và 10 hợp chất có chứa flo. Trong

quá trình tổng hợp các hợp chất này, các bước phản ứng đã được nghiên

cứu tối ưu hóa so với các phương pháp đã công bố trước đây. Cụ thể, ứng

dụng chiếu xạ vi sóng lần đầu tiên được thực hiện giúp rút ngắn thời gian

và nâng cao hiệu suất phản ứng trong các phản ứng sau:

+ Phản ứng tổng hợp các aminolactam từ các acid amine tương ứng.

+ Phản ứng bảo vệ nhóm amine bậc 1 với anhdric phthalic

24

+ Phản ứng kết hợp aminolactam với chuỗi polyketide thông qua quá

trình mở vòng lactone

Các hợp chất tổng hợp được đã được đánh giá hoạt tính gây độc

tế bào trên 10 dòng tế bào ung thư. Kết quả cho thấy 20 hợp chất thể hiện

hoạt tính đối với 1 số dòng tế bào ung thư thử nghiệm. Trong đó một số

hợp chất có hoạt tính mạnh với IC50 < 1µM. Kết quả thử hoạt tính kháng

vi sinh vật kiểm định trên 6 chủng vi khuẩn và 1 chủng nấm cho thấy một

số hợp chất có hoạt tính tốt đối với chủng Gram (+). Ngoài ra, các hợp

chất BG35b và BG39b còn thể hiện hoạt tính tốt với chủng nấm. Đây là

nghiên cứu đầu tiên về hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp

chất thuộc lớp chất bengamide.

Đánh giá mối tương quan cấu trúc – hoạt tính cho thấy, các hợp

chất có cấu hình C-2´R thể hiện hoạt tính tốt hơn cấu hình C-2´S. Cho

đến nay các hợp chất bengamide được phân lập từ tự nhiên đều có cấu

hình C-2´S. Đây là lần đầu tiên các analog bengamide với cấu hình C-2´R

được tổng hợp và khảo sát hoạt tính sinh học. Việc phát hiện các đồng

phân diastereomer với cấu hình C-2´R có hoạt tính cao hơn các đồng

phân diastereomer với cấu hình C-2´S tương ứng là điều rất thú vị, tạo cơ

sở cho các định hướng nghiên cứu tiếp theo nhằm tìm kiếm các hợp chất

có hoạt tính sinh học cao hơn thuộc lớp chất này.

Quá trình thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào cho thấy, các

analog chứa flo không thể hiện hoạt tính đối với các dòng tế bào ung thư

thử nghiệm. Đồng thời các hợp chất chứa nhóm bảo vệ acetonide với cấu

trúc cứng tại C-3/C-4/C-5 có hoạt tính kém hơn nhiều so với các hợp

chất tương ứng có chứa 3 nhóm hydroxyl tự do tại C-3, C-4 và C-5. Điều

này cho thấy phần cấu trúc olefin cuối mạch và nhóm tert-butyl, sự có

mặt của 3 nhóm hydroxyl tự do tại C-3, C-4 và C-5 và tính linh động của

các liên kết C-3/C-4/C-5 đóng vai trò quan trọng đối với hoạt tính gây

độc tế bào của lớp chất bengamide.