LIETUVOS VETERINARIJOS AKADEMIJA GYVULININKYSTĖS TECHNOLOGIJOS

FAKULTETAS GYVŪNŲ VEISIMO IR GENETIKOS KATEDRA

K.Janušausko gyvūnų genetikos laboratorija

Laura Riaubaitė

GALVIJŲ PROLAKTINO GENO POLIMORFIZMO TYRIMAI LIETUVOS PIENINIŲ GALVIJŲ POPULIACIJOJE

Magistro darbas

Darbo vadovas: doc.dr.Ilona Miceikienė

Kaunas, 2005 m

2

Magistro darbas atliktas 2003 – 2005 metais Lietuvos veterinarijos

akademijoje, Gyvūnų veisimo ir genetikos katedroje, K.Janušausko gyvūnų

genetikos laboratorijoje.

Magistro darbą paruošė: Laura Riaubaitė (v., pavardė) (parašas)

Magistro darbo vadovas: doc.dr.Ilona Miceikienė

(LVA, Gyvūnų veisimo ir genetikos katedra) (parašas)

Recenzentas: dr.SauliusTušas (LVA, Gyvulininkystės katedra)

(parašas)

3

TURINYS

SANTRUMPŲ SĄRAŠAS 4 ĮVADAS 5 1. LITERATŪROS APŽVALGA 8 1.1 Genetinio polimorfizmo apibūdinimas 8 1.2 Kazeino genai 9

1.2.1 αs1-kazeino genas 9 1.2.2 αs2-kazeino genas 10

1.2.3 β-kazeino genas 11 1.2.4 κ-kazeino genas 12

1.3 α-laktoglobulino genas 13 1.4 β-laktoglobulino genas 14 1.5 Augimo hormono genas (GH) 16 1.6 STAT5 genai 17 1.7 DGAT1 genas 18 1.8 Pieno produkcijos kiekybinių požymių lokusai (QTL) 19 1.9 Prolaktino genas 20

1.9.1 Genetinis pagrindimas 20 1.9.2 Prolaktino hormono struktūra, funkcijos ir veikimo mechanizmas 20

2. TYRIMŲ METODAI IR MEDŽIAGA 24 2.1 Tyrimų medžiaga 24 2.2 DNR skyrimas 25

2.2.1 DNR skyrimas iš plauko svogūnėlio ląstelių 25 2.2.2 DNR skyrimas iš kraujo. Chloroforminis - fenolinis metodas 25

2.3 DNR švarumo ir koncentracijos nustatymas 26 2.4 Polimerazės grandininė reakcija (PGR) 26 2.5 Karpymas fermentais ir elektroforezė 27 2.6 Prolaktino geno variantų ištyrimas 28 2.7 Statistinė analizė 29 3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS 31 4. IŠVADOS 37 5. SUMMARY 39 6. LITERATŪROS SĄRAŠAS 40 7. PRIEDAI 46

4

Santrumpų sąrašas

bp – bazių pora

CN - kazeinas

DNR – dezoksiribonukleininė rūgštis

GH – augimo hormonas

LA – laktoalbuminas

LB – Lietuvos baltnugariai

LG – laktoglobulinas

LJ – Lietuvos juodmargiai

LŠ – Lietuvos šėmi

LŽ – Lietuvos žalieji

MAS - selekcija genetinių markerių pagalba

PGR – polimerazinė grandininė reakcija

PRL – prolaktino genas

QTL – kiekybinių požymių DNR lokusai

RFLP – restrikcinių fragmentų ilgio polimorfizmas

5

Įvadas

Pieno gamyba yra viena iš sudėtingiausių žemės ūkio gamybos šakų. Pieno ūkio

pelningumą apsprendžia daugybė veiksnių. Neveltui Jungtinių Amerikos valstijų fermeriai

mėgsta sakyti, kad gaminant pieną smulkmenų nėra. Bet kurio sudėtingos pieno gamybos

technologijos elemento ignoravimas mažina gamybos pelningumą.

Svarbiausieji veiksniai apsprendžiantys pieno gamybos ekonominį efektyvumą yra:

• gyvulių genetinis potencialas;

• pašarai ir šėrimas;

• laikymo ir priežiūros technologijos.

Atskirų šių elementų reikšmė nevienoda. Daugelio autorių duomenimis didžiausią įtaką

karvių pieno produkcijai turi pašarai ir šėrimas. Jie įtakoja apie 50 – 60 procentų, genetiniams

faktoriams tenka apie 25 – 27 procentai, o likusi dalis tenka laikymo ir priežiūros

technologijoms.

Yra žinoma, kad gyvulių produktyvumo bei kiti ūkiniai požymiai, tokie kaip pieno

kiekis, pieno sudėtis, pieno riebalų bei baltymų kiekis ir cheminė sudėtis, pieno tinkamumas

perdirbti bei atskiriems pieno produktams gaminti, pieno atleidimo greitis melžimo metu,

veršelių augimo sparta, mėsingumas ir kiti, yra paveldimi iš kartos į kartą, o jų formavimąsi bei

funkcines savybes lemia genai. Žinoma, jog pieno kokybę bei kiekį didele dalimi lemia šėrimo,

laikymo, melžimo technologijos bei daugelis kitų veiksnių, tačiau netgi sudarius optimalias

minėtas sąlygas, ta produktyvumo dalis, kuri priklauso nuo paveldimų gyvulio savybių, lieka

nepakitusi.

Vienas iš būdų per trumpesnį laiką pasiekti šiuos tikslus yra naujų biotechnologinių

metodų, pavyzdžiui, genetinių žymeklių MAS (Marker-Assisted Selection), diegimas ir taikymas

selekcijoje. Genetiniai žymekliai – tai genai susiję, su kiekybiniais ir kokybiniais požymiais, jų

grupės arba DNR grandinės fragmentai, leidžiantys nustatyti požymių kintamumo pobūdį ir

paveldėjimo dėsningumus

Kiekybinių požymių, tokių kaip reprodukcinės savybės, augimo greitis, priesvoriai,

pieningumas, pieno baltymų ir riebalų kiekis bei procentinės išraiškos priklauso nuo genų,

esančių atskirose chromosomų vietose – lokusuose, veiklos. Kiekybinių požymių paveldėjimas

yra nenutrūkstamas ir pasižymi laipsnišku pasireiškimu nuo silpniausio iki maksimalaus, kuris

pastebimas pas atskirus individus ar net visoje populiacijoje.

6

Kiekybinių požymių paveldėjimas iš esmės yra nulemtas polimerinių (poligeninių) genų

veiklos, tai yra vienodu ar panašiu poveikiu daugelio dominantinių nepriklausomų arba daugelio

alelinių genų į tam tikrą požymį. Kuo daugiau genų porų lemia vieno ar kelių kiekybinių

požymių pasireiškimą, tuo rečiau pasitaiko individai su maksimaliai išreikštu požymiu. Kuo

daugiau polimerinių genų įeina į genotipą, tuo daugiau genotipų klasių pasireiškia įvairiose

kartose ir tuo mažiau įmanoma sulaukti pageidaujamo požymio maksimalaus pasireiškimo.

Tiriant žemės ūkio gyvulių genomą, susiduriama su kiekybinių požymių kintamumo

problema. Todėl, norint išvengti laukiamo požymio nepageidaujamo variavimo ir didinant

selekcijos efektyvumą, yra tikslinga atlikti QTL (kiekybinių požymių DNR lokusų) analizę

žemės ūkio gyvulių genome. Nustačius QTL (chromosomoje esantį žinomą kiekybinių požymių)

lokusą, kuriame esančio geno aleliai tam tikroje būklėje lemia vieno ar kelių kiekybinių požymių

pasireiškimą, atsiranda galimybės nuosekliau vykdyti kryptingą žemės ūkio gyvulių atranką

pagal pageidaujamą kiekybinį požymį ir galima tikėtis maksimalaus laukiamo požymio

pasireiškimo.

7

Darbo tikslas

• Prolaktino geno polimorfizmo bei skirtingų alelių paplitimo ištyrimas Lietuvos galvijų

(LŽ, LJ, LB, LŠ) veislėse

• Prolaktino geno įtakos pieno produkcijai ištyrimas

Darbo uždaviniai

• Įdiegti galvijų prolaktino geno tyrimo metodiką LVA K.Janušausko Gyvūnų genetikos

laboratorijoje

• Ištirti prolaktino geno polimorfizmą LŽ, LJ, LB ir LŠ galvijų veislėse molekuliniu PGR-

RFLP tyrimo metodu

• Nustatyti prolaktino geno alelių ir genotipų dažnį LŽ, LJ, LB ir LŠ galvijų veislėse

• Sudaryti tiriamos galvijų populiacijos pieno produkcijos rodiklių duomenų bazę

• Ištirti prolaktino geno įtaką pieno kiekiui, riebumui bei baltymingumui

Darbo naujumas

• LVA gyvūnų genetikos laboratorijoje įdiegta galvijų prolaktino geno ištyrimo metodika

• Pirmą kartą ištirtas prolaktino geno polimorfizmas bei jo variantų paplitimas Lietuvos

galvijų veislėse.

Praktinis pritaikymas

• Prolaktino genas gali būti naudojamas selekcijos procese kaip veislinių gyvulių

pieningumo genetinio potencialo gerinimo kriterijus

• Vykdant selekciją prolaktino geno polimorfizmo atžvilgiu galima smarkiai paspartinti

selekcijos procesą.

8

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Genetinio polimorfizmo apibūdinimas

Terminas „genetinis polimorfizmas“ apibūdina faktą, kad požymis turi dvi ar daugiau

formų, kurias genetiškai nulemia aleliai. Homozigotiniai individai elektroforogramoje turi tik

vieną variantą kiekvienam požymiui, kai tuo tarpu heterozigotiniai – abu variantus, tad

apskaičiuoti genų pasikartojimus populiacijoje nesunku.

Genetinis polimorfizmas yra labai svarbus taikomosiose srityse, tokiose kaip

zootechniniai mokslai ir ypač pienininkystė. Tyrimais siekiama išaiškinti galimas asociacijas tarp

genetinių variantų ir charakteringų produkcijai požymių, reprodukcijos efektyvumą ir galvijų

adaptacijos galimybes, o taip pat nustatyti galimą įtaką pieno kiekiui, sudėčiai, maistingosioms

bei technologinėms savybėms (Russo V. ir Mariani P., 1978).

Yra atrasta visa eilė genų, kurie įtakoja pieno kiekį, pieno baltymų ir riebalų kiekį, pieno

baltymų kokybinę sudėtį – tai kazeinų genai, β laktoglobulinas, prolaktino genas, GH (augimo

hormono) genas, Stat5 genas.

Pavyzdžiui, į pieno sudėtį įeinantys pagrindiniai pieno baltymai – kazeinas (CN),

laktoalbuminas (LA) ir laktoglobulinas (LG) pasižymi polimorfiškumu, tai yra kiekvienas iš

šių baltymų turi po keletą ar netgi keliolika skirtingų struktūrinių atmainų. Yra nustatyta, kad

prolaktino polimorfizmą lemiantis genas turi įtakos tokiems kiekybiniams požymiams, kaip

pieno, pieno baltymų ir riebalų kiekis. Tokių genų išaiškinimas galvijų genome leidžia

vykdyti kryptingą galvijų selekciją pagal pieno kokybę ir jo perdirbamąsias savybes bei gauti

palikuonis, turinčius didžiausią pageidaujamo požymio pasireiškimo laipsnį.

9

1.2 Kazeinų genai

1 paveikslas. 6-ta galvijų chromosoma, kurioje lokalizuoti pieno baltymo kazeino

genai

Kazeinas (CN) sudaro 80% bendro baltymų kiekio piene ir apie 2.5% visų sudėtinių

pieno dalių, t.y. jo piene yra apie 5 kartus daugiau negu kitų pieno baltymų. Kazeinas – labai

sudėtingas baltymas. Į jo sudėtį įeina daug įvairių nepakeičiamų aminorūgščių (valino,

cistino, metionino, leucino, lizino, prolino, oksiprolino, histidino ir kt.), todėl jis pilnavertis

baltymas. Kazeinas, veikiamas šliužo fermento, chimozino, pepsino arba įvairių fermentinių

preparatų, turi savybę susitraukti. Ši savybė panaudojama gaminat rūgščius pieno produktus –

varškę, varškės ir fermentinius sūrius.

Kazeinas gali būti keturių tipų: kapa kazeinas (κ-CN), beta kazeinas (β-CN ), alfa S1

(αs1-CN) ir alfa S2 (αs2-CN), o aleliniai genai lemia vienokią ar kitokią struktūrinę atmainą

turinčio baltymo tipo formavimąsi. Daugelio tyrimų pagalba yra nustatyta, kad skirtingos

atmainos netgi to paties tipo baltymai lemia ne tik pieno kokybinę sudėtį, bet ir pieno

tinkamumą technologiniam perdirbimui.

1.2.1 α s1-kazeino genas

Genas lokalizuotas 6 galvijų chromosomoje. Yra sutinkama net 9 šio geno variantai.

Labiausiai paplitęs αs1-kazeino variantas yra B, esantis visose veislėse 90-95% dažnumu, o

kartais ir 100%; tik kai kuriose veislėse, tokiose kaip Džersių, Guernsay, Normandų, Italijos

žalųjų, Reggiana ir Modenesų dažnumas kiek mažesnis (75-85%), teikiant pirmenybę C

10

variantui. Pas zebu ir jakus, atvirkščiai, alelis C dominuoja prieš B, su maždaug 90%

dažnumo pirmajame ir maždaug 63% pastarajame (Srosclaude F., Mahe M.F. ir kt., 1976).

Stebina tai, kad C variantas yra dažnas Švedijos Holšteinų veislėje (Lunden A. ir kt., 1997).

αs1-Cn D variantas nėra labai dažnas, tačiau, po Flamande (Grosclaude F. ir kt., 1966),

taip pat buvo pastebėtas Danijos žalųjų ir Lenkijos žalųjų (MichalakW. 1969), Džersių

(Corradini C. 1969), Italijos žalųjų (Russo V. ir Mariani P. 1971; Mariani P. 1987), Reggiana

(Mariani P. ir Russo V. 1971), Podolijos (Chianese L. ir kt., 1988) ir kitose Italijos veislėse.

Taip pat A alelis, po atradimo Holšteinų-fryzų veislėse, buvo aptiktas ir Danijos žalųjų

(Larsen B. ir kt., 1986), Kostromos (Petrushko S.A., 1970), kitose Fryzų veislėse (Petrushko

S.A., 1970; Corradini C., 1970; Bianchini F. ir kt., 1973), bei neseniai Vokietijos fryzų tarpe

(Erhardt G. 1993).

αs1-Cn G alelis buvo taip pat pastebėtas kitose italų veislėse, tokiose kaip Agerolese ir

Modicana (Rando A. ir kt., 1993; Rando A. ir kt., 1995; Marletta D. ir kt., 1996), bei neseniai

Reggiana, Italijos žalmargių, Sarda ir Bruna-Sarda veislėse (Dovoli R. ir kt., 1998).

Lietuvos galvijų tarpe αs1-CN B alelis buvo rastas labai dideliu dažniu , kuris

įvairavo nuo 0,888 (LJ) iki 0,989 (LŽ) visose keturiose (LB, LŠ, LŽ, LJ) tirtose populiacijose.

αs1-CN C alelis buvo rastas visose keturiose populiacijose labai mažu dažniu. αs1-CN A, D, ir

F aleliai nebuvo rasti nė vienoje tirtoje populiacijoje (Baltrėnaitė L., 2003; Malevičiūtė J. ir kt.,

2003, Pečiulaitienė N. ir kt., 2003).

αs1-CN BB genotipas buvo dideliu dažniu rastas visose keturiose populiacijose. BC

genotipas αs1-CN buvo rastas mažu dažniu taip pat visose keturiose Lietuvos galvijų veislėse

ir įvairavo nuo 2,13% (LŽ) iki 22,44% (LJ) (Baltrėnaitė L., 2003; Malevičiūtė J. ir kt., 2003,

Pečiulaitienė N. ir kt., 2003).

1.2.2 α s2-kazeino genas

Genas lokalizuotas 6 galvijų chromosomoje. αs2-CN atveju žinomi tik keturi variantai:

pirmą polimorfizmo atvejį 1976 m. Grosclaude ir kt. aptiko nepalietiškame B. taurus ir B.

indicus populiacijose; šiose veislėse rasti tiek A, tiek ir B variantai. Tame pačiame darbe

Grosclaude ir kt. pastebėjo trečiojo varianto (C) atradimą mongolų jake. αs2-CN C būdingas

B. grunniens, kai tuo tarpu B variantas niekada nebuvo aptiktas šioje veislėje Pirmasis B

varianto buvimą Vakarų B. taurus veislėse įrodė Chianese ir kt., radęs šį alelį Podolės

11

galvijuose. Tolesni tyrimai, turėję atrasti amino rūgščių pasikeitimas, kuris atskyrė B variantą

nuo A, atlikti nebuvo; αs2-CN B lieka necharakterizuotu variantu.

Paskutinis aptiktas variantas, αs2-CN D, rastas dviejose prancūzų galvijų veislėse

(Grosclaude F ir kt., 1976; Grosclaude F., ir kt.1978) D alelis taip pat rastas kai kuriose

vokiečių veislėse (Erhardt G., 1993) bei Suomijos airšyrų (Ikonen T. ir kt., 1996) veislėje.

Lietuvos galvijų tarpe labiausiai paplitęs αs2-CN A alelis buvo rastas dažniu,

įvairuojančiu nuo 0,890 (LŽ) iki 1,000 (LJ) visose Lietuvos galvijų veislėse. Šiame lokuse

polimorfiškos buvo tik trys tirtos veislės. Lietuvos juodmargių populiacijoje αs2-CN D alelis

nebuvo rastas (Baltrėnaitė L. 2003; Malevičiūtė J. ir kt., 2003, Pečiulaitienė N. ir kt., 2003).

αs2-CN didžiausiu dažniu buvo rastas homozigotinis AA genotipas. AD

genotipas nebuvo rastas Lietuvos juodmargių populiacijoje. DD genotipas buvo rastas tik

Lietuvos žalųjų veislėje. αs2-CN lokuse Lietuvos juodmargiai galvijai yra monomorfiški

(Baltrėnaitė L. 2003; Malevičiūtė J. ir kt., 2003, Pečiulaitienė N. ir kt., 2003).

1.2.3 β-kazeino genas

Genas lokalizuotas 6-oje galvijų chromosomoje. Yra sutinkama net 16 šio geno

variantų. A1 ir A2 yra labiausiai paplitę β-kazeino variantai; daugumoje veislių kiek labiau

paplitęs pastarasis. B variantas taip pat labai išplitęs, tačiau paprastai kiek mažiau nei A1 ir

A2. Normandų ir Džersių veislės turi didžiausias β-kazeino dažnumo vertes (30-45%), po jų

seka Montbeliarde, Italijos žalųjų, Reggiana. Modenese ir Italijos žalmargių (10-25%);

daugumoje veislių paplitimas yra beveik 10%. Taip pat β-kazeinas C yra gan paplitęs, tačiau

mažiau nei B variantas bei mažesniu dažnumu; jake ir zebu C variantas dar nebuvo aptiktas.

β-kazeinas A3 nėra įprastas variantas, bet itin retai buvo randamas keliose veislėse:

Italijos fryzų (Di Stasio L., 1983) ir Vokietijos fryzų, Džersių ir kitose vokiečių veislėse

(Erhardt G., 1993) Simentalų (Seibert B. ir kt., 1987) ir Alpių pilkųjų (Di Stasio L. ir kt.,

1979). Kiti β-CN variantai reti ir buvo aptikti tik vienoje veislėje, išskyrus β-CN F, kurį rado

taip pat ir Italijos fryzų veislėje.

Lietuvos galvijų tarpe β-CN A1 ir A2 aleliai buvo rasti visose keturiose Lietuvos

galvijų populiacijose panašiu dažniu. β-CN retai sutinkamas B alelis buvo aptiktas keturiose

veislėse labai mažu dažniu. C alelis nebuvo rastas nei vienoje tirtų veislių (Baltrėnaitė L. 2003;

Malevičiūtė J. ir kt., 2003, Pečiulaitienė N. ir kt., 2003).

12

Homozigotinis A1A1 β-CN genotipas buvo dažniausiai sutinkamas Lietuvos žalųjų

populiacijoje. Labiausiai pageidaujamas genotipas A2A2 įtakojantis didesnį primilžį

didžiausiu dažniu rastas Lietuvos baltnugarių ir Lietuvos juodmargių galvijų tarpe. Lietuvos

šėmų galvijų tarpe dažniausiai sutinkamas A1A2 genotipas (Baltrėnaitė L. 2003; Malevičiūtė J.

ir kt., 2003, Pečiulaitienė N. ir kt., 2003).

1.2.4 κ-kazeino genas

Genas lokalizuotas 6-oje galvijų chromosomoje. Yra sutinkama 13 šio geno variantų.

Labiausiai išplitę κ-kazeino aleliai yra A ir B, esantys visose veislėse kintančiu dažnumu. A

variantas vyrauja Fryzų, Airšyrų, Danijos žalųjų ir Indijos zebu veislėse; Airijos Kerry

veislėje jo dažnumas siekia beveik 93% (Murphy R.F. ir kt., 1969). B variantas vyrauja

Džersių, Normandų ir Afrikos zebu. Galvijų veislėse aiškiai vyrauja B variantas (Russo V. ir

kt., 1978).

κ-kazeinas C, nors mažiau paplitęs, buvo rastas daugelyje veislių. Be Grey Alpine ir

Italijos žalųjų, jis buvo aptiktas Vokietijos simentalų (Seibert B. ir kt., 1987), Vokietijos

Fleckvieh (Erhardt G. ir kt.,1989), Murnau-Werdenfelser (Krause I. ir kt., 1988) ir Holšteinų-

žalųjų (Bovenhuis H. ir kt., 1991) veislėse.

κ-kazeinas C, nors ir nelaikomas dažnai pasitaikančiu variantu, buvo rastas dideliu

dažnumu (apie 30%) Suomijos airšyrų veislėje; neseniai šį variantą taip pat aptiko ir Italijos

žalųjų ir fryzų veislėse (Murphy RF. ir kt., 1969; Caroli A. ir kt., 2000).

Lietuvos galvijų tarpe κ CN abu aleliai ir A, labiausiai paplitęs visose veislėse, ir B,

labiausiai pageidaujamas, buvo rasti visose keturiose Lietuvos galvijų veislėse. Retesni κ CN

C ir G aleliai nebuvo rasti nei vienoje tirtoje populiacijoje. Retai sutinkamas κ CN E alelis

buvo rastas labai mažu dažniu (Baltrėnaitė L. 2003; Malevičiūtė J. ir kt., 2003, Pečiulaitienė N.

ir kt., 2003).

κ CN AA ir AB genotipai buvo rasti visose tirtose Lietuvos galvijų veislėse, vidutiniu

dažniu. AE ir BE genotipai rasti nedideliu dažniu visose populiacijose. κ CN BB genotipas,

kuris labiausiai įtakoja pieno perdirbamąsias savybes, rastas gana dideliu t.y. 11,37% dažniu

Lietuvos baltnugarių galvijų veislėje ir visai nerastas Lietuvos juodmargių (Baltrėnaitė L.

2003; Malevičiūtė J. ir kt., 2003, Pečiulaitienė N. ir kt., 2003).

Kapa kazeino (κ-CN) B alelis lemia didelį bendrą, o ypač kazeino tipo, baltymų kiekį

piene, didesnę sūrių bei varškės gamybos išeigą, nes gerina pieno sutraukinimo savybes bei

pieno sausųjų medžiagų panaudojimą gaminant varškę. Nustatyta, kad iš karvių, turinčių BB

13

genotipą kapa kazeino atžvilgiu, to paties pieno kiekio galima pagaminti apie 10% daugiau

varškės, nei iš karvių, turinčių AA genotipą. Taip pat kieti sūriai, pagaminti iš tokio pieno,

pasižymi geresne konsistencija ir kompozicija. Praktika rodo, kad kietų sūrių gamybai

labiausiai tinka pienas gautas iš karvių, turinčių būtent BB genotipą ir iš tokio pieno galima

pagaminti 6% daugiau sūrio. Tuo tarpu karvės, turinčios AA genotipą, pasižymi didesniu

pieningumu. Teigiamą poveikį pieno baltymų ir riebalų kiekiui turi alfa S1 kazeino (αs1-CN)

BC genotipas, tuo tarpu BB genotipą turinčios karvės yra pieningesnės. Beta kazeino (β-CN )

B alelis didina kazeino tipo baltymų kiekį piene, gerina pieno sutraukinimo savybes bei sūrių

gamybos išeigą.

1.3 α-laktoalbumino genas

2 paveikslas. 5-ta galvijų chromosoma, kurioje lokalizuotas α-laktoalbumino

genas Genas lokalizuotas 5-oje galvijų chromosomoje. Yra žinomi 3 genetiniai variantai.

α-laktoalbuminas yra sudėtinė dalis laktozės sintetato, fermento, dėl kurio sintetinama

laktozė paskutinėje stadijoje, kurios metu gliukozė susiejama su galaktoze.

Pirmą kartą α-LA A buvimą B. taurus veislėje įrodė Osterhoff ir Pretorius (1966),

kurie rado šį alelį europietiškose veislėse, atvežtose iš Pietų Afrikos. Bettini ir Masina,

remdamiesi α-LA A alelių pasitaikymu veislėse, auginamose Pietų Italijoje (kaip Podolijos

galvijai), o taip pat kai kuriais anatominiais panašumais tarp šių veislių ir zebu, pasiūlė

filogenetinės tokių veislių kilmės iš B. indicus versiją. Bell ir kt. (1962), Bali (banteng)

galvijuose (B. javanicus) rado trečią α-LA variantą, pavadintą C. Iki šiol nėra įrodytas šio

14

alelio buvimas nei B. taurus, nei B. indicus. Pastarojo varianto yra žinomas amino rūgščių

pasikeitimas (Bell ir kt., 1981), bet ne jų vieta.

Lietuvos galvijų tarpe iš dviejų žinomų α-LA A ir B alelių tik B variantas buvo rastas

visose keturiose veislėse dažniu 1,000. α-LA buvo rastas visose veislėse tik BB genotipas

(Baltrėnaitė L. 2003; Malevičiūtė J. ir kt., 2003, Pečiulaitienė N. ir kt., 2003).

1.4 β-laktoglobulino genas

3 paveikslas. 11-ta galvijų chromosoma, kurioje lokalizuotas β-laktoglobulino

genas Genas lokalizuotas 11-oje galvijų chromosomoje. Yra žinoma 12 genetinių geno

variantų.

Laktoglobulinas (globulinas) sudaro apie 6% visų pieno baltymų ir 0,1% visų pieno

sudėtinių dalių. Karvei apsiveršiavus, pirmosiose krekenose pieno globulino yra gana daug 8

– 15% visų pieno sudedamųjų dalių. Laktoglobulino sudėtyje yra imuninių medžiagų, kurios

būtinos tik ką atvestam veršeliui. Laktoglobulinas, kaitinant pieną aukštesnėje nei 75 O C

temperatūroje yra sutraukiamas ir iškrenta baltomis nuosėdomis (Bendikas P. ir kt., 1998).

β-laktoglobulinas yra pagrindinis išrūgų baltymas karvių piene. Po Palmerio

kristalizacijos 1934 m. (Palmer A.H., 1934) daugelį metų naudotas kaip baltymo modelis

struktūriniams ir fermentiniams tyrimams, susijusiais su denatūrizacija bei sąsaja tarp jonų ir

baltymų. Biologinės šio baltymo funkcijos vis dar nėra gerai žinomos; jis galėtų dalyvauti

fosfato metabolizme pieno liaukoje bei retinolio ir riebiųjų rūgščių pernešime virškinimo

trakte (Farrell H.M. ir kt., 1971; Hill J.P. ir kt., 1997).

15

Beta laktoglobulino (β-LG) AA genotipą turinčios karvės pasižymi dideliu

pieningumu. Beta laktoglobulino (β-LG) B alelis lemia kazeino baltymų kiekio padidėjimą

piene, kadangi kazeinai ir yra baltymai, kurie sutraukinami gaminant sūrį, todėl kuo daugiau

piene yra kazeino baltymo, tuo daugiau sūrio galima pagaminti iš to paties kiekio pieno.

Tyrimais nustatyta, kad beta laktoglobulino (β-LG) BB genotipą turinčių karvių piene kazeino

kiekis yra 3% didesnis nei AA genotipą turinčių karvių piene, todėl iš BB genotipą turinčių

karvių tokio paties kiekio pieno galima pagaminti 2% daugiau gaminamo produkto.

β-laktoglobulinas yra pagrindinis išrūgų baltymas karvių piene.β-laktoglobulino A ir B

variantai paplitę visose veislėse; B vyrauja kai kuriose europietiškose veislėse, tokiose kaip

Airšyrų, Šorthornų, Danijos žalųjų, bei Azijos ir Afrikos zebu (85-95%), o taip pat Italijos

mėsinių galvijų veislėse (70-80%). Fryzų ir keliose kitose veislėse abi alelės pasitaiko tuo

pačiu dažnumu. β-LG A ir B alelių buvimą labai mažu dažnumu B. grunniens veislėje

pastebėjo Grosclaude ir kt. (1976). Autorių nuomone, šį faktą galima interpretuoti kaip veislių

kryžminimo su B. taurus rezultatą. Šiuos du alelius aptiko ir Lozovaya Pamiro jake

(Lozovaya G.S., 1973).

β-LG C nėra dažnai sutinkama alelis, aptikta tik Australijos džersių (Bell K., 1964) ir

Vokietijos džersių (Erhardt G., 1993). Šis alelis dar pastebėta Kubiečių zebu (Perez-Beato O.,

1979) ir Pamiro jake.

β-LG D, tuo tarpu, pastebėtas keliose kitose veislėse: Danijos džersių (Larsen B. ir kt.,

1986), Lenkijos simentalų (Michalak W., 1967), Italijos žalųjų (Russo V. ir kt.,1971; Mariani

P. ir kt., 1987) Reggiana (Mariani P.ir kt., 1971), Modenese (Russo V. ir kt., 1972), Modicana

(Bettini T.M. ir kt., 1972), Rendena (Mariani P. ir kt.,1975), Vokietijos simentalų (Seibert B.

ir kt., 1987).

β-LG E, F ir G variantai iki šiol pastebėti tik Bali (banteng) galvijuose (B. javanicus).

Kiti β-laktoglobulino aleliai yra reti ir buvo aptikti tik vienoje veislėje.

Lietuvos galvijų tarpe labiausiai pageidaujamas β-LG B alelis buvo rastas visose

populiacijose ir įvairavo nuo 0,540 (LŠ) iki 0,922 (LŽ). C alelis labai mažu dažniu (0,007)

buvo rastas tik Lietuvos žalųjų veislėje. D variantas nebuvo rastas nė vienoje veislėje

(Baltrėnaitė L. 2003; Malevičiūtė J. ir kt., 2003, Pečiulaitienė N. ir kt., 2003).

β-LG BB genotipas Lietuvos žalųjų populiacijoje rastas labai dideliu dažniu (85,10%).

BC genotipas rastas tik Lietuvos žalųjų populiacijoje, o AA genotipas visose tirtose veislėse

(Baltrėnaitė L. 2003; Malevičiūtė J. ir kt., 2003, Pečiulaitienė N. ir kt., 2003).

16

1.5 Augimo hormono genas (GH)

4 paveikslas. 19-ta galvijų chromosoma, kurioje lokalizuotas augimo hormono

(GH) genas

Galvijų augimo hormonas (somatotropinas) yra proteino hormonas, sekretuojamas

hipofizio liaukinėje dalyje. Šis hormonas aktyvina laktaciją. Manoma, kad jis didina pieno

gamybai reikalingų medžiagų – gliukozės, aminorūgščių ir riebalų rūgščių kiekį kraujyje. Jei

augimo hormono pakanka, šias medžiagas pieno liaukos lengvai pasisavina (Praškevičius A.

ir kt., 2003). Šis genas yra galvijų 19-oje chromosomoje; susideda iš 5 egzonų ir yra atskirtas

4 intronais (Gordon ir kt., 1990). Genas yra sudarytas iš 190 arba 191 amino rūgščių, turinčių

Ala arba Phe N gale (Wood ir kt., 1989). Dėl alelinio polimorfizmo leucino arba valino amino

rūgštis gali atsirasti 126 (127) bST pozicijoje (Seavey ir kt., 1971). L/V polimorfizmas turi

alelinę charakteristiką, nukleotidų C→G pasikeitimas kodone CTG, esančiame GH V egzono

pradžioje 127 proteino pozicijoje Val keičia Leu. Geno GH polimorfiniai variantai gali būti

potencialūs galvijų produkcijos požymių potencialūs markeriai. Pavyzdžiui didesnis pieno

kiekis buvo pastebėtas pas Holšteinų Fryzų karves turinčias GH LL genotipą, lyginant su LV

ar VV genotipais (Zwierzchowski L. 2000). Simentalų buliai turintys LV genotipą pasižymėjo

didesniu mėsingumu lyginant su LL ir VV homozigotais (Schlee P. ir kt., 1994). Šešios

polimorfinės sritys buvo nustatytos promotoriaus regione, kurios pagrinde yra taškinės DNR

mutacijos. Kai kurios iš jų persidengia potencialiose vietose sujungdamos transkripcijos

faktorius, dalyvaujančius GH geno transkripcijoje (Hetch ir Geldermann, 1996). Be to 3 bp

delecija (-35AAG-33) buvo aptikta promotoriaus regione (išsidėsčiusi 9 nukleotiduose

17

viršutinėje TATAAA dalyje). GH geno 5‘ regionas apima reguliuojančias sekas, kurios

kontroliuoja geno ekspresiją ir sąveikauja su eile transkripcijos faktorių (Crone ir kt., 1990).

Keletas polimorfizmų buvo aptikta GH gene. Cowan ir kt., 1989 ir Hilbert ir kt., 1989

aptiko MspI restrikcinės endonukleazės polimorfizmą, kuris lokalizuotas GH 3 introne 1547

pozicijoje. Hoj ir kt., 1993 ir Lee ir kt., 1993 ištyrė, jog GH(Msp-) alelė dažniau pasitaikė karvių

linijose, kurios pasižymėjo dideliu pieno riebumu. Panašūs rezultatai buvo gauti ir Falaki ir kt.

1996, kuris įrodė, GH(Msp-) alelės sąryšį su didesniu pieno riebalų kiekiu Holšteinų-Fryzų

karvėse. Pagal Lagziel ir kt. 1996-99 tyrimus heterozogotinės karvės davė pieno su didesniu

proteinų kiekiu negu homozigotiniai individai. Skirtingi rezultatai buvo pateikti Yao ir kt.

1996 GH(Msp+) alelė turėjo teigiamos įtakos pieno kiekiui (+300 kg), riebalams (+8 kg) ir

proteinams (+7 kg). Dybus 2002 tirdamas Lenkijos juodmargius galvijus nustatė, jog GH

geną turinčios homozigotinės karvės davė daugiausiai pieno, tuo tarpu heterozigotinės karvės

pasižymėjo didesniu pieno riebalų kiekiu nei homozigotinės.

1.6 STAT 5 A ir STAT 5 B genai

STAT5 yra dviejose formose – A ir B, kurios skiriasi keliomis amino rūgštimis,

proteino molekulės karboksilo gale. Abi formos yra koduojamos atskirais genais. Galvijų 19-

oje chromosomoje STAT5A ir STAT5B genai yra lokalizuoti arti vienas kito 40 Kb atstume.

Yra žinomi vos keli STAT5A geno nukleotidų sekos polimorfizmo atvejai (Flisikowski K.,

2003). Signalų pernešėjai ir transkripcijos aktyvatoriai (STAT-ai) yra 7-ių transkripcijos

faktorių šeima, kurie tarpininkauja įvairių peptidinių hormonų ir ląstelėse esančių citokinų

veiklą. STAT5 taip pat yra žinomas, kaip pagrindinis augimo hormono (GH) ir prolaktino

(PRL) veiklos mediatorius. STAT5 pirmą kartą buvo identifikuotas pieno liaukose ir pradžioje

buvo žinomas, kaip pieno liaukų faktorius – MGF (mammary gland factor). STAT5 yra

prolaktino viduląstelinis mediatorius, kurio veikiamas jis aktyvuoja pieno proteino genų

transkripciją ir genų ekspresiją pieno liaukos epitelio ląstelėse. Dėl to STAT5 polimorfizmas

gali įtakoti pieno proteino genų ekspresiją laike laktacijos ir pieninių galvijų pieno

produkcijos požymius.

18

1.7 DGAT1 genas

Genas DGAT1 - diacetilglicerolio aciltransferazė, lokalizuotas galvijų 14

chromosomoje netoli mkrosatelito ILSTS039. Manoma, kad šis genas įtakoja laktaciją ir

riebalų metabolizmą. DGAT1 geno K232A polimorfinis (arba ILSTS039 geno 225) alelės

didina riebalų koncentraciją.

5 paveikslas. 14 galvijų chromosoma, kurioje lokalizuotas DGAT1 genas

Izraelio Holšteinų galvijų populiacijoje ILSTS039 mikrosatelito 225 alelės dažnumas

buvo 11% bulių-motinų tarpe, 12% karvių tarpe ir 16,8 % bulių tarpe. Efektai susiję su 225

alele išanalizuotoje visoje populiacijoje buvo panašus efektams, dukterų analizės modelyje.

Alelės K232A dažnumas (DGAT1 genas), kuris padidino riebalų koncentraciją buvo 8,9%

karvių tarpe ir 15,5% bulių tarpe.

1 lentelė. ILTS039 dukterų analizės modelyje mikrosatelito ryšys su

produktyvumo savybėmis

Markeris ILTS039

Tėvas 2283 3241

Informatyvių dukterų

skaičius

201 260

Pienas (kg) -187c -92

Riebalai(kg) 4,5a 7,0d

Baltymai(kg) -0,4 -0,8

Riebalai(%) 0,100d 0,094d

Baltymai(%) 0,049d 0,019a

a P 0.05, b P 0.01, c P 0.001, d P 0.0001

19

Markerio ILSTS039 alelė 225, ir DGAT1 alelė K232A, buvo susieti su pieno

produkcijos mažėjimu ir padidėjimu pieno riebalų, riebalų bei baltymų procentu. Kiekybinių

požymių lokusų efektas buvo artimas kodominantiniam. Pokyčio efektas buvo 0,16% riebalų.

Daugelis tyrinėjimų parodė, kad individualus QTL gali būti aptiktas ir komercinių

pieninių galvijų populiacijose genetinių markerių pagalba (Weller ir kt., 1990). Keletas tyrimų

Ron ir kitų (1998) parodė, kad QTL glaudžiai susijęs su pieno-riebalų koncentracija, rastas

Izraelio ir JAV Holšteinų pieninių galvijų populiacijose. Lokusas taip pat buvo rastas ir

išskirtas Olandijos Holšteinų populiacijoje (Coppieters ir kt., 1998) ir Vokietijos pieninių

galvijų populiacijoje (Looft ir kt., 2001). Grisart ir kiti (2002) genotipavo 1818 Olandijos

Holšteinų bulius ir 529 Naujosios Zelandijos Holšteinų karves radus šį polimorfizmą.

1.8 Pieno produkcijos kiekybinių požymių lokusai (QTL)

Išanalizavus Holšteinų populiaciją pagal 246 genetinius markerius buvo aptikta visa

eilė kiekybinių požymių lokusų, įtakojančių pieno kiekį, riebumą, baltymingumą bei

somatinių ląstelių kiekį.

2 lentelė. Kiekybinių požymių įtakojančių pieno produkciją lokusai

Chromosomos Vieta Požymiai 3 0,00 Baltymai(%) 6 0,38 Pienas 0,00 Riebalai (%) 0,08 Baltymai (%)

20 0,28 Riebalai (%) 0,30 Baltymai (%) 1 0,00 Baltymai 2 0,44 Riebalai (%) 3 0,06 Pienas 0,22 Baltymai(%) 6 0,84 Somatinės ląstelės 9 0,90 Pienas 0,86 Riebalai 0,90 Baltymai

13 1,04 Somatinės ląstelės 17 1,16 Pienas 0,00 Pienas 1,16 Baltymai 0,00 Baltymai

23 0,62 Riebalai 26 0,78 Somatinės ląstelės 28 0,52 Riebalai (%) 0,44 Baltymai (%)

20

Statistiškai patikimas QTL poveikis pieno požymiams buvo aptiktas 3, 6 ir 20 chromosomose.

Papildomai QTL manoma yra 1, 2, 9, 17, 23 ir 28 chromosomose. Trys QTL veikiantys

somatines ląsteles buvo aptikti 6, 13, 26 chromosomose ir šeši papildomi QTL buvo pateikti

5, 11, 15, 16, 19 ir 21 chromosomose (Boichard D ir kt., 1997).

1.9 Prolaktino genas

1.9.1 Genetinis pagrindimas

Prolaktino genas yra 10 kb dydžio, susideda iš 5 egzonų ir 4 intronų (Dybus A. ir kt.,

2002), bei lokalizuotas galvijų 23 chromosomoje (Dybus A. ir kt., 2002).

Tyli A-G mutacija, 3-e egzone 103 amino rūgšties sukelia polimorfizmą RsaI vietoje

(Lewin H.A. ir kt., 1992). Chung ir kt.. (1996) įrodė, kad PRL – RsaI lokusas pas pieninius

galvijus turėjo reikšmingos įtakos pieno kiekiui ir pieno riebalų procentui.

6 paveikslas. 23 galvijų chromosoma, kurioje lokalizuotas prolaktino genas

1.9.2 Prolaktino hormono struktūra, funkcijos ir veikimo mechanizmas

Prolaktinas – tai peptidinis hormonas sudarytas iš 199 aminorūgščių, kurį išskiria

hipofizis. Jis skatina pieno sekreciją, pieno liaukų augimą. Prolaktino veikimą sustiprina

posmegeninės liaukos augimo hormonas. Keisdamas ląstelių fermentinį aktyvumą, jis

stimuliuoja sekreciją (Dybus A. ir kt., 2002). Prolaktinas veikia kartu su kortizonu ir insulinu,

kad stimuliuoti genų transkripciją, kurie koduoja pieno baltymus. Taip pat prolaktinas

aktyvina ir pieno riebalų, ir angliavandenių biosintezę.

21

7 paveikslas. Prolaktino hormono struktūra

Prolaktino hormonas atsakingas ne tik už pieno sekreciją, pieno liaukų augimą, bet ir

palaiko laktaciją (Tucker, 1981; Collier ir kt., 1984).

Prolaktinas veikia į pieno liaukas. Jis jungiasi prie pieno liaukų ląstelėse esančių

receptorių ir aktyvina adenilatciklazės sistemą.

• Prolaktinas gyvulio lytinio brendimo metu skatina pieno liaukų augimą ir

ląstelių vešėjimą bei brendimą.

• Skatina pieno baltymų – kazeino ir laktalbumino, biosintezę.

• Padeda atsirasti pienui ir palaiko laktaciją.

• Prolaktinas aktyvina pieno riebalų ir angliavandenių biosintezę, sulaiko

vandenį ir elektrolitus.

• Slopina liutropino sekrecija ir ovuliacija.

Prolaktino sekreciją kontroliuoja prolaktoliberinas ir dopaminas. Dopaminas veikia

smegenų funkcijas, visų pirma moduliuodamas kitų neuromediatorių poveikį. Dopaminas

22

slopina prolaktino sintezę. Prolaktino receptorius yra plačiai išreikštas laisvomis ląstelėmis ir

kai kurie limfocitai sintetina ir išskiria prolaktiną. Prolaktinas gali veikti kaip autokrino ar

parakrino laisvo aktyvumo moduliatorius (Praškevičius A. ir kt., 2003).

8 paveikslas. Prolaktino sekrecija

Dopaminas, sąveikaudamas su hipofizės ląstelėse esančiais receptoriais, sumažina

cAMP (ciklinis adenozinmonofosfatas) koncentraciją. Sumažėjus prolaktino sekrecijai

nuslopinama prolaktino geno transkripcija. Prolaktino sekreciją skatina progesteronas,

estrogenai, endorfinai, taip pat miegas, stresas ir lytiniai santykiai bei spenelių dirginimas

maitinimo metu (Praškevičius A. ir kt., 2003). Hipotaliamas veikia hipofizę, kuri išskiria

folikulą stimuliuojantį hormoną FSH. Šis hormonas brandina folikulą, kuris gamina

estrogeną. Hipotaliamas perduoda signalą hipofiziui, o pastarasis liepia kiaušidėms gaminti.

Prolaktino perteklius gali būti dėl neurotransmiterio dopamino trūkumo, kuris yra natūralus

prolaktino antagonistas. Prolaktiną dar reguliuoja skydliaukę stimuliuojantis hormonas (TSH);

taip pat luteinizuojantis ir folikulus stimuliuojantis hormonai (LH ir FSH), pastarieji du yra

lytines liaukas stimuliuojantys hormonai.

Apibendrinimas. Galvijų genotipavimui yra naudojami specifiniai sintetiniai markeriai,

kurie atpažįsta ir nustato tokių požymių kaip pieningumas, riebalų ir baltymų kiekis piene,

atsparumas mastitams pagal somatinių ląstelių kiekį alelius, tačiau mažiau žinoma genų, , kurie

susiję su reprodukcinėmis savybėmis. Specifiniai genetiniai markeriai, tikslingai naudojant

juos gyvulių genotipavime, gerokai padidina selekcijos efektyvumą, kadangi jų pagalba galima

vykdyti atranką vieno ar net kelių požymių, kurių pasireiškimą lemia vienas ar keli sukibę genai.

Hipotaliamas Dopaminas

STOP

Hipofizis Prolaktinas

Estrogenai

Stimuliuojantys faktoriai

23

Šis QTL nustatymo metodas vadinamas MAS (marker-assisted selection) (Lien S., Alestrom P.

ir kt., 1992).

Yra atrasta visa eilė genų, kurie įtakoja pieno kiekį, pieno baltymų ir riebalų kiekį, pieno

baltymų kokybinę sudėtį – tai kazeinų genai, β laktoglobulinas, prolaktino genas, GH (augimo

hormonas) genas, Stat5a. Tyrimų rezultatai rodo, kad nauja genams identifikuoti pagrįsta

technologija leidžia ištirti gyvulio genotipą, nustatyti šiuos genus, ir selekcijos procese

panaudoti juos kaip genetinius žymeklius.

24

2. TYRIMŲ METODAI IR MEDŽIAGA 2.1 Tyrimų medžiaga:

Tyrimų schema

Prolaktino geno (PRL) variantų ištyrimas LJ, LŽ,

LB, LŠ galvijų veislėse

Produktyvumo duomenų bazės suformavimas

Pieno kiekiui PRL geno įtakos ištyrimas

Pieno riebalams

Pieno baltymams

Tyrimų metodai

1) DNR 2) Polimerazinė 3) Restrikcinių

skyrimas: grandininė reakcija fragmentų ilgio (RFIP)

- Iš šerių (PGR) metodas

- Iš kraujo - prolaktino (PRL) genui - PRL- restriktazė

padauginti RsaI

4) Elektroforezė 5) Dažymas etidžio 6) Mėginių

agarozės gelyje bromidu genotipavimas

Mėginiai buvo paimti iš 11 LŠ (5 karvių, 6 bulių), 36 LJ, (30 karvių, 6 bulių), 18 LB

(16 karvių, 2 bulių), ir 26 LŽ (20 karvių, 6 bulių), negiminingų bulių ir karvių.

25

Kraujas buvo imamas iš jungo venos į vienkartinius vakuminius sterilius

mėgintuvėlius (Venoject) su konservantu K3 EDTA.

Šeriai (10-15 vnt.) buvo pešami iš ausų, su svogūnėliais, dedami į vienkartinius

plastikinius maišelius.

Bulių DNR mėginiai buvo naudojami iš K. Janušausko gyvūnų genetikos

laboratorijoje, esančio DNR banko (Prieduose surašyti visi duomenys apie tirtus gyvulius, bei

naudota įranga, instrumentus ir reagentus atliekant tiriamąjį darbą).

2.2 DNR skyrimas

2.2.1 DNR skyrimas iš plauko svogūnėlio ląstelių:

Nukerpami 4-5 plaukų svogūnėliai ir patalpinami į mėgintuvėlius. Paruošiamas

lizavimo mišinys (proteinazė K:lizavimo buferis = 1:5). Mėgintuvėlio turinys užpilamas

lizavimo mišiniu (vienam pavyzdžiui imama 50 µl buferio ir 10 µl proteinazės K).

Mėgintuvėliai 30s. maišomi maišyklės “Vortex” pagalba. Centrifuguojami 10s. 13 500

aps./min. greičiu. Pavyzdžiai per naktį inkubuojami 56oC temperatūroje.

Po naktinės inkubacijos pavyzdžiai 10 min. pakaitinami 94oC temperatūroje ir atšaldomi

iki kambario temperatūros. Centrifuguojami 10s. 13 500 aps./min. greičiu.

2.2.2 DNR skyrimas iš kraujo. Chloroforminis - fenolinis metodas

Į mėgintuvėlius įpilama po 10 ml kraujo ir po 30 ml buferio A. Mėgintuvėlių turinys

sumaišomas vartant. Mėgintuvėliai 30 min. inkubuojami ledo vonioje. Kas 5-10 min.

mėgintuvėlių turinys sumaišomas vartant. Centrifuguojama 10 min. 4oC temperatūroje 3000

aps./min. greičiu. Nupilamas skystis ir paliekamos tik nuosėdos. Ant nuosėdų užpilama 10ml

buferio A ir gerai išmaišoma pipete. Centrifuguojama 10 min. 4oC temperatūroje 3000

aps./min. greičiu. Nupilamas paviršiuje esantis skystis. Ant nuosėdų užpilama 10 ml 0.15M

KCl ir gerai išmaišoma pipete. Centrifuguojama 10 min.4oC temperatūroje 3000 aps./min.

greičiu. Nupilamas paviršiuje esantis skystis. Ant nuosėdų užpilama 10 ml 0.15M KCl ir gerai

išmaišoma pipete. Centrifuguojama 10 min. 4oC temperatūroje 3000 aps./min.greičiu.

Nupilamas paviršiuje esantis skystis. Ant nuosėdų užpilama 5ml buferio B, 500 ml 10% SDS,

15 ml proteinazės K ir gerai išmaišoma pipete. Inkubuojama per naktį 37oC (arba 2 val 55oC)

temperatūroje.

Po inkubacijos užpilama 1,4 ml 6M NaCl tirpalo ir mėginiai 15s maišomi maišyklės

“Vortex” pagalba arba stipriai supurtomi rankiniu būdu. I mėgintuvėlius pilama 4 ml

26

chloroformo ir mėginiai vėl maišomi, kol susidaro balta vienalytė masė. Centrifuguojama 20

min. 22oC temperatūroje 4000 aps./min. greičiu. Iš centrifugos mėginiai išimami atsargiai,

kad nesusimaišytų susidarę sluoksniai. Pipete atsargiai nusiurbiamas viršutinis sluoksnis,

(kuriame yra DNR), perpilamas į kitus mėgintuvėlius, ir užpilamas tokiu pat kiekiu 99% etilo

spirito. Mėgintuvėliai sandariai uždengiami ir turinys išmaišomas vartant. Mėginius galima

palikti nakčiai –20oC temperatūroje. Iškritusi DNR išimama kilpelės pagalba, perplaunama 70

% spirite ir perkeliama į mėgintuvėlius, kuriuose yra po 100 ml dejonizuoto H2O.

Mėgintuvėliai paliekami nakčiai šaldytuve arba purtyklėje, kad DNR visiškai ištirptų.

2.3 DNR švarumo ir koncentracijos nustatymas

Genominės DNR kiekis ir grynumas nustatomas spektrofotometrinio metodo pagalba.

Tam tikslui paruošiama 100 µl skiestos DNR tirpalo: imama 10 µl koncentruotos DNR ir

skiedžiama 90 µl distiliuotu vandeniu. DNR kiekis nustatomas išmatuojant skiesto tirpalo

optinį tankį (OD) prie 260nm bangos ilgio. Kai OD = 1, tai 1 ml tirpalo yra 50 µg dvigrandės

DNR.

DNR kokybė įvertinama išmatavus skiesto tirpalo optinius tankius prie 260 ir 280 nm

bangos ilgių. Švarumą rodo santykis OD260/OD280. Švarių DNR tirpalų santykis yra 1.8-2.0.

Jei tirpale yra baltymų ar fenolio priemaišų, šis santykis bus mažesnis nei nurodyta. Baltymų

koncentracija neturi viršyti 0.5 mg/ml ribos. Jei tirpale priemaišų yra daugiau, reikia atlikti

pakartotinį genominės DNR valymą.

Šiuo metu laboratorijose naudojami spektrofotometrai iš karto nustato ir apskaičiuoja

tiek DNR, tiek baltymų koncentraciją tirpale.

2.4 Polimerazės grandininė reakcija (PGR)

Polimerazės grandininė reakcija yra metodas, pavadintas pagal DNR polimerazę,

fermentą, vykdantį DNR replikaciją ląstelėje. Tai yra nukleino rūgščių sintezės in vitro

metodas, kuriuo laboratoriniame mėgintuvėlyje gali būti specifiškai padauginti (amplifikuoti)

atskiri DNR fragmentai. PGR metodas yra labai jautrus, todėl padauginti pasirinkta DNR

atkarpa gali sudaryti netgi vieną milijoninę bendro DNR pavyzdžio dalį. Tai reiškia, kad,

naudojant PGR galima amplifikuoti net ir vienintelį pasirinktą geną.

27

Prolaktino geno pradmenys:

Pirminis (5‘ –CGAGTCCTTATGAGCTTGATTCTT-3‘)

Atvirkštinis (5‘ –GCCTTCCAGAAGTCGTTTGTTTTC-3‘)

Mišinys PGR reakcijai:

PGR komponentai: Vienai reakcijai atlikti (μl)Geros kokybės dejonizuotas vanduo ddH2O

4,9

Buferis 10xPCR (be MgCl2) 2,5 MgCl2 (konc. 50mM) 1,5 dNTP miksas (2mM) 2,5 Pirminis pradmuo (darbinė konc. 10pmol)

1,1

Atvirkštinis pradmuo (darbinė konc. 10pmol)

1,25

BSA 0,25 Taq polymerazė (1vnt./μl) aktyvumo

1

PGR mišinio pasiruošimą reikia pradėti nuo vandens, o toliau sekantys

komponentai. Supilama 10 μl genominė DNR ir 15 μl PGR reakcijos mišinio į vieną

mėgintuvėlį. Galutinis mišinio kiekis 25 μl. Supylus visus komponentus, gautas mišinys gerai

išmaišomas ir nucentrifuguojamas. PGR atliekama automatiniame amplifikatoriuje. PGR

ciklai kartojasi 30 kartų.

PGR sąlygos:

94 OC, 3 min (pirminė denatūracija)

30 ciklų:

94 OC, 30s (denatūracija)

59 OC, 40s (oligonukleotidų prisijungimas)

72 OC, 20s (DNR grandinėlės sintezė)

Sintezės užbaigimui: 72 OC, 5 min

Laikyti: 4 OC.

2.5 Karpymas fermentais ir elektroforezė 10 μl PGR produkto karpoma su 10 μl restrikcinio mišinio (ddH2O-7,5 μl, 10x Mbuf.

2 μl, RsaI 0,5 μl). Paliekama termostate nakčiai (15h) 37°C.

28

Karpytas PGR produktas frakcionuojamas 4 % agarozės gelyje, 100V, 35 min. DNR

elektroforezė atliekama horizontaliame 0,65-3,0 % agarozės gelyje. Pagaminti 4,0 % agarozės

gelį, reikia 2 g agarozės miltelių ištirpinti 100 ml 1x TAE buferyje kaitinant ir maišant tol, kol

tirpalas pasidaro skaidrus ir vientisos konsistencijos. Vėstant, indas su ištirpinta agaroze

maišomas atsargiai, kad nesusidarytų oro burbulai. Iki 70 - 65 OC atvėsintą agarozę greitai, bet

tolygiai supilame į paruoštą formą. Po to, į gelį įstatome „šukutes“ ir formą palikti 30 min

kambario temperatūroje, kad gelis sustingtų. Sustingus geliui, atsargiai ištraukti „šukutes“.

Prieš įvedant DNR mėginius į susiformavusius „šulinėlius“, gelį reikia įstatyti į elektroforezės

vonelę, užpildytą 1xTAE buferiu taip, kad šis apsemtų gelį. Į kiekvieną šulinėlį įvesti po DNR

mėginį, sumaišytą su bromfenolio mėlio dažais (7,0-10,0 DNR mėginio + 3,0 μl dažo).

Elektroforezė vykdoma leidžiant elektros srovę per gelį, ko poveikyje DNR fragmentai juda

nuo katodo link teigiamo poliaus – anodo. Fragmentų judėjimo greitis gelyje priklauso nuo jų

dydžio: mažesni fragmentai juda greičiau, didesni – lėčiau. Atsižvelgiant į gelio dydį ir DNR

fragmentų molekulinę masę, elektroforezė vykdoma 30 – 60 min., esant 70 – 110 V įtampai.

Nudažome etidžio bromido tirpalu, elektroforezės metu išfrakcionuotus DNR mėginius:

a) iš elektroforezės formos išimamas agarozės gelis

b) į dažymo vonelę įpilti 300 ml dist. H2O ir 30 μl etidžio bromido tirpalo (10mg/ml).

Galutinė dažų koncentracija – 0,5 μl/ml.

c) gelį panardinti į paruoštus etidžio bromido dažus.

d) gelį gerai nuskalauti dist. H2O taip,kad neliktų etidžio bromido dažų liekanų.

e) rezultatus įvertinti UV šviesoje. Dažymo metu DNR ir etidžio bromidas sudaro

ultravioletinėje šviesoje fluorescuojantį kompleksą.

Gelis dažomas etidžio bromido tirpale 15-20 min. ir analizuojamas UV šviesoje

(bangos ilgis 300 nm).

2.6 Prolaktino geno variantų ištyrimas

Gautas PGR produktas yra 156 bp.

DNR fragmentų dydis po karpymo restrikciniu fermentu RsaI priklauso nuo galvijų prolaktino

geno alelių.

AA – 156 bp AB - 156 bp 82 bp 74 bp BB - 82 bp 74 bp

29

AA AB BB 74bp 82bp 156bp ▬▬ ▬▬

2.7 Statistinė analizė

Geno dažnumai kiekvienoje veislėje ir visoje populiacijoje buvo apskaičiuoti

tiesioginiu genų skaičiavimo metodu. Skaičiavimai atlikti su statistiniu R – paketu

(Gentlemen R. ir kt., 1997).

Genotipų dažnis p apskaičiuojamas pagal formulę

1) p=Nn

n – atskiro genotipo individų skaičius

N – tirtų individų skaičius

Alelių dažnis apskaičiuojamas pagal formulę

2) p= N

nn2

2 21 +

3) q=N

nn2

2 23 +

n1 ir n3 – homozigotinių individų skaičius

n2 - heterozigotinių individų skaičius

N - tirtų individų skaičius

Faktinis heterozigotiškumas apskaičiuojamas pagal formulę

4) ho=Nn2 (ho – observed)

n2 - heterozigotinių individų skaičius

N - tirtų individų skaičius

30

Numatomas heterozigotiškumas apskaičiuojamas pagal formulę

5) he=1-(p2+q2) (he – expacted)

p ir q – alelių dažniai

ho< he reiškia heterozigotiškumo trūkumą

Nukrypimas nuo Hardy-Weinbergo dėsnio buvo patikrintas Fis fiksacijos indeksu (Nei,

1987) naudojant formulę (he – ho)/he. Skirtumai tarp genotipų dažnumų buvo patikrinti

naudojant x2 analizę pagal Nei (1987).

Lietuvos pieninių galvijų populiacijoje, siekiant įvertinti prolaktino geno įtaką pieno

kiekiui ir pieno sudėtinėms dalims buvo atlikta daugiafaktorinė dispersinė analizė (ANOVA).

Pagal tiesinį mišrų modelį paskaičiuota genetinių veiksnių įtaka pieno kiekiui ir

sudėčiai Lietuvos pieninių galvijų populiacijoje:

Pieno kiekis ijklmn = μ + prolaktinas + veislė1 + laktacijan + e ijklmn

Riebalai procentais ijklmn = μ + prolaktinas + veislė1 + laktacijan + e ijklmn

Riebalai, kg ijklmn = μ + prolaktinas + veislė1 + laktacijan + e ijklmn

Riebalai, procentais ijklmn = μ + prolaktinas + veislė1 + laktacijan + e ijklmn

Baltymai, kg ijklmn = μ + prolaktinas + veislė1 + laktacijan + e ijklmn

31

3. TYRIMŲ REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

Yra atrasta visa eilė genų , kurie įtakoja pieno kiekį, pieno baltymų ir riebalų kiekį,

pieno baltymų kokybinę sudėtį. Genai susiję su pieno produkcija buvo išstudijuoti daugelyje

veislių, siekiant rasti skirtumus tarp veislių ar veislių grupių (Aschaffenburg ir kt., 1965;

Baker ir kt., 1980; Poli ir kt., 1992; Boland ir kt., 1992; Velmala ir kt., 1993; Medjugorac ir

kt., 1994). Skirtumai buvo nustatyti genų polimorfizmo pagrindu.

Prolaktino geno polimorfizmą tyriame keturiose Lietuvos galvijų veislėse. Buvo ištirta

91 negiminingas galvijas – 71 karvė ir 20 bulių, atstovaujančių keturias Lietuvos pieninių

galvijų veisles – 11 Lietuvos šėmų galvijų, 36 Lietuvos juodmargių, 18 Lietuvos baltnugarių

ir 26 Lietuvos žalųjų galvijų.

3 lentelė. Prolaktino (PRL) genotipų dažniai Lietuvos šėmų, Lietuvos

baltnugarių, Lietuvos žalųjų ir Lietuvos juodmargių veislėse

Veislė

genotipai

Lietuvos baltnugariai

Lietuvos šėmi

Lietuvos žalieji

Lietuvos juodmargiai

Visoje

populiacijoje

AA 0,94 0,91 0,62 0,71 0,75

AB 0,06 0,09 0,37 0,21 0,18

BB 0,00 0,00 0,01 0,08 0,07

Prolaktino geno AA genotipas buvo labiausiai dažnas visose ištirtose veislėse (0,62 –

0,94), AB (0,06 – 0,37). Mažiausiai pasikartojantis buvo BB genotipas (0,00 – 0,08). Lietuvos

baltnugarių ir Lietuvos šėmų galvijų tarpe BB genotipas visai nerastas. 75% tirtos

populiacijos turėjo AA genotipą, 18% tirtos populiacijos turi genotipą AB ir 7% BB genotipą.

4 lentelė. Prolaktino geno alelių dažniai Lietuvos šėmų, Lietuvos baltnugarių,

Lietuvos žalųjų ir Lietuvos juodmargių veislėse

Veislė

Aleliai

Lietuvos baltnugariai

Lietuvos šėmi

Lietuvos žalieji

Lietuvos juodmargiai

Visoje

populiacijoje

A 0,97 0,95 0,77 0,80 0,87

B 0,03 0,05 0,23 0,20 0,13

32

Prolaktino geno A alelis didžiausiu dažniu (0,97) rastas Lietuvos baltnugarių veislėje,

mažiausiu (0,77) – Lietuvos žalųjų galvijų tarpe. Visoje populiacijoje A alelio dažnis labai

aukštas – 0,87, tuo tarpu B tik 0,13, t.y. 87% populiacijos individų turi A alelį, o 13% turi B

alelį.

Gauti rezultatai koreliuoja su kitų mokslininkų rezultatais. Aukštas PRL geno A alelio

(0,95) dažnumas Holšteinuose buvo Chrenek ir kt. (1998) bei Mitra ir kt. (1980), Chung ir kt.

(1996) – 0,80 ir 0,73. Lenkijos žalųjų tarpe.

A alelis rastas 0,87 dažniu Lenkijos žalųjų tarpe (Kopenčny ir kt., 2004), Bohemijos

žalųjų tarpe 0,62 dažniu (Kopenčny ir kt., 2004), Rusijos airšyrų 0,86 dažniu (Udina I.G.,

2000), Gorbatov žalųjų tarpe 0,92 dažniu (Udina I.G., 2000), Šveicarijos žalųjų – 0,61 dažniu

(Udina I.G., 2000), Argentinos Holšteinų tarpe – 0,87 (Ng-Kuai-Hang ir kt., 1984),

Argentinos Kreole – 0,96 (Ng-Kuai-Hang irk t., 1984).

5 lentelė. Prolaktino geno alelių ir genotipų polimorfizmo tyrimas bulių ir karvių

tarpe

Lietuvos balnugariai Lietuvos šėmi Lietuvos

juodmargiai Lietuvos

žalieji Visoje tirtoje populiacijoje

Veislė

Aleliai, genotipai karvės buliai karvės buliai karvės buliai karvės buliai karvės buliai

A 1,00 0,7 1,0 0,9 0,8 0,5 0,7 0,7 0,9 0,7

B 0 0,3 0 0,1 0,2 0,5 0,3 0,3 0,1 0,3

AA 1,00 0,5 1,0 0,83 0,76 0,40 0,60 0,67 0,84 0,60

AB 0 0,5 0 0,17 0,17 0,40 0,35 0,17 0,13 0,31

BB 0 0 0 0 0,07 0,20 0,05 0,17 0,03 0,09

Ištyrus prolaktino geno alelių polimorfizmą karvių ir bulių tarpe A alelės dažnis

didesnis rastas karvių tarpe (0,9) nei bulių (0,7), bet lyginant A ir B alelių dažnius ir karvių ir

bulių tarpe A alelis rastas ženkliai didesniu dažniu.

Įvertinus prolaktino geno lokuso heterozigotiškumą visoje populiacijoje buvo rastas

nežymus jo trūkumas. Vidutinė rasta prolaktino geno heterozigotiškumo reikšmė (Ho=0,19)

buvo truputį mažesnė už numatomą reikšmę (He=0,26), bet nebuvo rastas nukrypimas nuo

Hardi-Veinbergo dėsnio.

Produktyvumo analizei buvo panaudoti Lietuvos pieninių veislių karvių kontrolės

2001 – 2004 metų produktyvumo rodikliai iš VĮ „Kaimo verslo plėtros ir informacijos

centras“.

33

6 lentelė. Pieninių veislių karvių pieno produkcijos rodikliai

Veislė Laktacijų

skaičius

Pienas

kg

Riebalai

%

Riebalai

kg

Baltymai

%

Baltymai

kg

LJ 65 4927

± 201

4,09

± 0,82

205,63

± 9,45

3,19

± 0,33

158,26

± 6,83

LŽ 102 3785

± 115

4,32

± 0,67

164,36

± 6,02

3,39

± 0,33

128,54

± 4,09

Vidutiniškai 167 4356

± 158

4,20

± 0,74

184,99

± 7,7

3,29

± 0,33

143,40

± 5,46

Vidutinis pieno primilžis tirtoje populiacijoje buvo 4356 kg, riebalų 4,20%, baltymų

3,29%.

Daugiafaktorinės analizės būdu buvo įvertinta genetinių faktorių – prolaktino

genotipo, veislės ir laktacijos įtaka pieno produkcinėm savybėms t.y. pieno kiekiui, riebalams

ir baltymams.

7 lentelė. Prolaktino geno polimorfizmo įtaka pieno produkcinėms savybėms

Lietuvos pieninių galvijų populiacijoje

Genetiniai

veiksniai

Klasių

skaičius

Pienas

kg

Riebalai

%

Riebalai

kg

Baltymai

%

Baltymai

kg

Prolaktinas 3 4,98% ** 12,12% *** 5,26% ** 6,49% *** 6,77% ***

Veislė 2 14,00% *** 3,15% 8,22% *** 9,54% *** 8,86% ***

Laktacija 11 13% ** 5,58% 14,67% ** 3,58% 17,80% ***

*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001

Prolaktino genotipas statistiškai reikšmingai įtakojo visas pieno produkcines savybes.

Jis įtakojo 4,98% (p<0,01) pieno kiekio genetinės įvairovės, 12,12% (p<0,001) pieno riebumo

genetinės įvairovės, 5,26% (p<0,01) pieno riebalų kiekio, 6,49% (p<0,001) baltymingumo ir

6,77% (p<0,001) baltymų kiekio genetinės įvairovės.

34

Lietuvos pieninių galvijų populiacijoje buvo analizuota prolaktino geno 3 genotipų

įtaka pieno kiekiui, riebalų ir baltymų kiekiui bei procentui. 8 lentelėje pateikti 41 karvės 167

laktacijų pieno kiekio ir sudėtinių dalių vidurkiai pagal prolaktino geno genotipus.

8 lentelė. Karvių pieno produkcijos savybių nuokrypiai su skirtingais prolaktino

geno genotipais

Prolaktino

geno genotipai

n Pienas

kg

Riebalai

%

Riebalai

kg

Baltymai

%

Baltymai

kg

AA 101 4431

± 154

4,41

± 0,07

189,20

± 7,28

3,38

± 0,34

145,85

± 4,91

AB 56 4113

± 175

4,01

± 0,08

173,74

± 8,15

3,27

± 0,04

136,14

± 6,03

BB 10 3111

± 368

3,66

± 0,14

124,4

± 16,7

3,06

± 0,06

94,8

± 10,6

9 lentelė. Pieno kiekio nuokrypiai su skirtingais PRL genotipais

Genotipas AA AB BB

AA 0 -265 -1348**

AB -265 0 -1083*

BB -1348** -1083* 0

*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001

Buvo nustatyti reikšmingi skirtumai tarp karvių su skirtingais PRL genotipais

(p<0.01). Karvės turinčios AA ir AB aleles pasižymėjo didesniu pieno kiekiu: (+1348 kg ir

+1083 kg atitinkamai) negu BB individai. Chung ir kt. (1996) teigė, kad karvės su PRL

genotipo AA alele davė didesnę pieno produkciją negu BB individai. Tokius pat rezultatus

gavo ir lenkų mokslininkai (Dybus A. 2002), kai karvės su AA genotipu davė 768 kg daugiau

pieno nei BB genotipu (p<0.01).

35

10 lentelė. Pieno riebalų % nuokrypiai su skirtingais PRL genotipais

Genotipas AA AB BB

AA 0 -0,38** -0,76**

AB -0,38** 0 -0,38**

BB -0,76** -0,38** 0

*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001

Karvės turinčios AA genotipą davė 0,76% riebesnį pieną nei BB genotipo (p<0,01), o

turinčios AB genotipą 0,38% nei BB. Chung ir kt. teigė, kad karvės turinčios AA aleles davė

pieno riebalų procentą didesnį, negu BB karvės(Chung ir kt., 1996).

11. lentelė. Pieno riebalų kiekio nuokrypiai su skirtingais PRL genotipais

Genotipas AA AB BB

AA 0 -11,92 -67,21**

AB -11,92 0 -55,29*

BB -67,21** -55,29* 0

*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001

Karvės turinčios AA ir AB aleles pasižymėjo didesniu pieno riebalų kiekiu +67,21 kg

(p<0,01) ir +55,29 kg (p<0,05) negu BB individai.

12 lentelė. Pieno baltymingumo % nuokrypiai su skirtingais PRL genotipais

Genotipas AA AB BB

AA 0 -0,16* -0,31**

AB -0,16* 0 -0,15

BB -0,31** -0,15 0

*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001

36

Karvės, turinčios AA genotipą pasižymėjo didesniu pieno baltymingumu +0,31%,

(p<0,01) nei karvės turinčios BB genotipą, karvių su AB genotipu pieno baltymingumas

procentais viršijo BB genotipo karvių pieno baltymingumą +0,16% (p<0,05).

13 lentelė. Pieno baltymų kiekio nuokrypiai su skirtingais PRL genotipais

Genotipas AA AB BB

AA 0 -7,36 -52,80***

AB -7,36 0 -45,43**

BB -52,80*** -45,43** 0

*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001

Karvės turinčios AA ir AB genotipus, pasižymėjo didesniu pieno baltymų kiekiu

+52,8 kg (p<0,01) +45,43 kg ((p<0,01) negu BB individai.

Galvijų veislių charakterizavimas pagal prolaktino geno įvairovę gali būti panaudotas,

kuriant selekcines programas, sudarant kryžminimo schemas, identifikuojant gyvulius,

bioįvairovės ir filogenetinės analizės tikslais.

Prolaktino geno polimorfizmo identifikavimas gali būti ekonomiškai svarbus kriterijus

formuojant pieninias bandas, ir gali būti ateityje naudojamas kaip papildomas selekcijos

kriterijus pieno kiekiui, sudėčiai ir technologinėms savybėms galvijų selekcijos programose

įvertinti.

Genetinių žymeklių panaudojimas žemės ūkio gyvulių selekcijoje atveria galimybes

įvertinti gyvulį iš vidaus ir pilnai panaudoti jame slypinčias naudingas ūkines savybes.

Genetiniai žymekliai gali būti naudojami tiek vieno geno, tiek genų grupės lemiamo požymio

ar požymių grupės identifikavimui. Dar vienas genetinių žymeklių panaudojimo selekcijoje

privalumas yra tas, kad šis gyvulių vertinimo būdas yra patikimas, nereikalaujantis didelių

ekonominių bei, svarbiausia, laiko sąnaudų, leidžia jauname amžiuje išaiškinti genus,

kontroliuojančius selekcinę ir technologinę auginamų gyvulių vertę, įvertinti žemės ūkio

gyvulių genetinį kintamumą ir genetinių defektų paplitimą bei suteikia galimybę laiku

išvengti nepageidaujamų požymių pasireiškimo. Genetinių žymeklių panaudojimas

selekcijoje gali labai paspartinti selekcijos procesą, pagerinti žemės ūkio produkcijos kokybę,

sumažinti jos gamybos savikainą bei padaryti produkciją konkurentabilę užsienio rinkose.

37

4. IŠVADOS

• Pirmą kartą prolaktino geno polimorfizmas buvo tirtas Lietuvos pieninių galvijų

veislėse.

• Visose keturiose tirtose veislėse (LJ, LŽ, LB, LŠ) didžiausiu dažniu (0,62 – 0,94) buvo

rastas AA genotipas bei A alelis (0,77 – 0,97).

• Rastas prolaktino geno lokuso mažesnis heterozigotiškumas nei prognozuojamas, rodo

viduveislinį genetinės įvairovės sumažėjimą vykstant atrankai pageidaujamo

homozigotinio genotipo atžvilgiu.

• Rasta prolaktino geno AA genotipo reikšminga įtaka pieno produkcinėms savybėms

sudaro selekcijos galimybes šio genotipo atžvilgiu Lietuvos pieninių galvijų

populiacijoje.

38

PADĖKA

Dėkoju vadovei doc. dr. Ilonai Miceikienei taip pat doktorantei Linai Baltrėnaitei už

pagalbą įsisavinant genetikos laboratorijoje molekulinės genetikos metodus bei atliekant

tyrimus, Sigitai už pagalbą atliekant statistinę duomenų analizę, Laurynui bei reprodukcijos

laboratorijos darbuotojams už pagalbą imant mėginius tyrimams bei visiems geranoriškai

padėjusiems, kad šis kūrinys išvystų pasaulį.

39

5. SUMMARY

Master Laura Riaubaitė

Topic of Master thesis Investigations of cattle prolactin gene polymorphism in Lithuanian

dairy cattle

Master‘s work

Tutor of M. Sc. thesis Assoc. prof. Ilona Miceikiene

Lithuanian Veterinary Academy, Department of Animal Breeding and Genetics, K.

Janušauskas Laboratory of Animal Genetics.

Master‘s work accomplished in the year 2003 – 2004, volume of Master work 51 paginal, 13

tables and 8 pictures.

Summary. Object of work. 1. Investigation of prolactin gene polymorphism and distribution

of different alleles at Lithuanian cattle breeds (Lithuanian Red, Lithuanian Light Grey,

Lithuanian White Backed, Lithuanian Black and White). 2 Investigation of prolactin (PRL)

gene influence to milk production.

Tasks of work. 1. Introduce cattle prolactin gene research methodology at K. Janušauskas

Laboratory of Animal Genetics, LVA. 2. Investigate prolactin gene polymorphism at LR,

LBW, LWB, LLG cattle breeds by molecular PCR-RFLP method. 3. Determine frequency of

prolactin gene alleles and genotypes at LR, LBW, LWB, LLG cattle breeds. 4. Compose data

base for dairy production of investigative cattle population. 5. Investigate influence of

prolactin gene to milk yield, fat and proteins.

Research methodology. 1. DNA extraction from: blood and hair roots. 2. PCR to amplify

PRL gene. 3. RFLP method-PRL – enzyme RsaI. 3. Electrophoresis in agarose gel. 4.

Staining with Etidium bromide. 5. Genotyping.

Results. The following DNA restriction fragments were obtained for the PRL-RsaI

polymorphism: 82 and 74 bp for the BB genotype, 156, 82 and 74 bp for the AB and 156 bp

for the AA genotype. The AA genotype was found most frequent in all breeds (0.06 – 0.94),

followed by the AB (0.06 – 0.37). The least frequent was the BB genotype (0.00 – 0.08).

Prolactin gene A allele was found most frequent (0.97) at Lithuanian Light Grey, the least

frequent (0.77) - at Lithuanian red cattle breed.

Conclusions. First-time prolactin gene was investigated at Lithuanian cattle breeds. At the

LR, LBW, LWB, LLG higher frequency (0.62 – 0.94) was found AA genotype and A allele

(0.77 – 0.97). Prolactin gene AA genotype has significant effect on all milk production traits.

40

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1 Aschaffenburg, R. and Thymann, M.1965. Simultaneous phenotyping procedure for

the principal proteins of cow’s milk. J.Dairy Sci. 48: 1524-1526.

2 Baltrėnaitė L. Pieno baltymų polimorfizmas: Genetinių variantų aptikimas ir išplitimas

Lietuvos galvijų veislėse, Magistrantūros baigiamasis darbas 2003.

3 Baker, C.M.A. and Manwell, C. 1980. Chemical classification of cattle. . Anim. Blood

Groups Biochem. Genet. 11: 127-150.

4 Bell K., Hopper K.E., McKenzie H.A. - Bovine a-Lactalbumin C and as1-, β- and k-

Caseins of Bali (Banteng) Cattle, Bos (Bibos) javanicus. "Australian Journal

Biological Sciences", 1981. 34, 149-159.

5 Bell K. One-dimensional starch-gel electrophoresis of bovine skim-milk. "Nature",

1962. 195, 705-706.

6 Bendikas P., Gaidžiūnienė N., Jeninas E. Gyvulininkystės pagrindai. V.

Presvika 1998 m.

7 Bettini T.M., Masina P. Proteine e polimorfismo proteico del latte vaccino.

"ProduzioneAnimale", 1972. 11, 107-126.

8 Bianchini F., Crimella C., Rognoni G., Carenzi C. Distribuzione delle varianti

genetiche di caseina del latte nella popolazione bovina Frisona delle provincie di

Milano, Cremona e Mantova. "Proceedings Societa Italiana delle Scienze Veterinarie",

1973. 27, 526-535.

9 Boichard D., Bishop M.D. Detection of QTLs influencing milk production and

mastitis resistance with a granddaughter design in Holstein cattle, 1997.

10 Bovenhuis H., van Harendonk J.A.M. Estimation of milk protein gene frequencies in

cngssbred cattle by maximum likelihood. "Journal of Dairy Science", 1991. 74, 2728-

2736.

11 Caroli A., Bolla P., Budelli E., Barbieri G., Leone P. Effect of k-casein E allele on

clotfing aptitude of Italian Friesian milk. "Zootecnica e Nutrizione Animale", 2000. in

preparation.

12 Chianese L., Di Luccia A., Mauriello R., Ferrara L, Zehender G., Addeo F.

Polimorfismo biochimico delle proteine del latte in bovine di razza Podolica.

"Zootecnica e Nutrizione Animale", 1988. 14, 189-197.

13 Chrenek P., Vasicek D., Bauerova M., Bulla J., 1998 – Simultaneous analysis of

bovine growth hormone and prolactin alleles by multiplex PCR and RFLP. Czech

41

Journal of A Chung E.R., Rhim T.J., Han S.K., 1996 – Associatios between PCR-

RFLP markers of growth hormone and prolactin genes and production traits in dairy

cattle. Korean Journal of Animal Science 38, 321-336.nimal Science 43, 53-55.

14 Chung E.R., Rhim T.J., Han S.K., 1996 – Associatios between PCR-RFLP markers of

growth hormone and prolactin genes and production traits in dairy cattle. Korean

Journal of Animal Science 38, 321-336.

15 Collier, R.J., McNamara, J.P., Wallace, C.R. and Dehoff, M.H. 1984. A review on

endocrine regulation of metabolism during lactation. J. Anim. Sci. 59: 495-510.

16 Coppieters, W., J. Riquet, J.-J. Arranz, P. Berzi, N. Cambisano, B. Grisart, L. Karim,

F. Marcq, I. Moreau, C. Nezer, P. Simon, P. Vanmanshoven, D. Wagenaar, and M.

Georges. 1998. A QTL with major effect on milk yield and composition maps to

bovine Chromosome 14. Mammal. Genome 9:540–544.

17 Corradini C. Distribution of the genetic variants of as1-, β- and k-casein in milk from

Jersey cows in the Netherlands. "Netherlands Milk Dairy Journal", 1969. 23, 79-82.

18 Davoli R., Dall'Olio S., Mile J., Russo V. Diffusione dell'allele G di as1-caseina in

razze bovine allevate in Italia. "Proceedings Societa Italiana delle Scienze

Veterinarie", Silvi Marina (TE), Italy, 1998. 52, 493-494.

19 Di Stasio L. Indagine genetica sulle razze bovine Modicana e Cinisara mediante

I'analisi dei sistemi proteici del latte. "Rivista di Zootecnia e Veterinaria", 1983. 11

(1), 70-74.

20 Di Stasio L., Merlin P. Polimorfismi biochimici del latte nella razza bovina Grigio

Alpina. "Rivista di Zootecnia e Veterinaria", 1979. 7(2), 64-67.

21 Dybus A. 2002. Associations of growth hormone (GH) and prolactin (PRL) genes

polymorphisms with milk production traits in Polish-and-White cattle.

22 Dybus A., Kmiec M. 2002. Polymorphism of the growth hormone gene in Limousine

cattle. Czech J. Anim. Sci. 47 (2).

23 Erhardt G. Allete frequencies of milk proteins in German cattle breeds and

demonstration of as2-casein variants by isoelectric focusing. "Archiv fur Tierzucht,

Dummerstorf", 1993. 36, 145-152.

24 Erhardt G. k-Kaseine in Rindermilch - Nachweis eines weiteren Allels (k-CnE) in

verschiedenen Rassen. "Journal of Animal Breeding and Genetics", 1989. 106, 225-

231.

25 Farrell H.M. Jr, Thompson M.P. Biological significance of milk protein

polymorphism. "Journal of Dairy Science", 1971. 54. 1219-1228.

42

26 Flisikowski K., Zwierzchowski L. 2003. Polymerase chain reaction-heteroduplex

(PCR-HD) polymorphism within the bovine STAT5A gene.

27 Grisart, B., W. Coppieters, F. Farnir, L. Karim, C. Ford, P. Berzi, N. Cambisano, M.

Mni, S. Reid, P. Simon, R. Spelman, M. Georges, and R. Snell. 2002. Positional

candidate cloning of a QTL in dairy cattle: Identification of a missense mutation in the

bovine DGAT1 gene with major effect on milk yield and composition. Genome Res.

12:222–231.

28 Grosclaude F., Pujolle J., Gamier J., Ribadeau-Dumas B. Mise en evidence de deux

variants supplementaires des proteines du lait de vache: as1-CnD et LgD. "Annales de

Biologie Animale, Biochimie et Biophysique", 1966. 6, 215-222.

29 Grosclaude F., Mahe M.F., Mercier J.C., Bonnemaire J., Teissier J.H. Polymorphisme

des lactoproteines de Bovines Nepalais. II. Polymorphisme des caseines "as-

mineures"; le locus as2-Cn est-il lie aux loci as1-Cn, β-Cn et k-Cn? "Annales de

Genetique et de Selection Animale", 1976. 8,481-491.

30 Grosclaude F., Joudrier P., Mahe M.F. Polymorphisme de la caseine as2 bovine:

etroite liason du locus as2-Cn avec les loci as1-Cn, β-Cn et k-Cn; mise en evidence

d'une deletion dans le variant as2-CnD. "Annales de Genetique et de Selection

Animale", 1978. 10, 313-327.

31 Grosclaude P., Mahe M.F., Accolas J.P. Note sur le polymorphisme genetique des

lactoproteines de bovins et de yaks Mongols. "Annales de Genetique et de Selection

Animale", 1982. 14, 545-550.

32 Hill J.P., Thresher W.C., Boland M.J., Creamer L.K., Anema S.G., Manderson G.,

Otter D.E., Paterson G.R., Lowe R., Burr R.G., Motion R.L., Winkelman A.,

Wickham B. The polymorphism of the milk protein β-lactoglobulin. A review. In

"Milk Composition, Production and Biotechnology", Eds. Welch R.A.S. et al., CAB

International, Wallingford, UK, 1997. 173-213.

33 lkonen T., Ruottinen 0., Erhardt G., Ojala M. Allele frequencies of the major milk

proteins in the Finnish Ayrshire and detection of a new k-casein variant. "Animal

Genetics", 1996. 27, 179-181.

34 Krause I., Buchberger J., WeiB G., Klostermeyer H. Screening methods for genetic

variants of milk proteins. In "Milk Proteins: nutritional, clinical, functional and

technological aspects", / Eds. C.A. Barth and E. Schlimme, Steinkopff Verlag

Darmstadt, Germany, 1988. 171-173.

43

35 Kopenčy M., Nebola M., Dvorak J. (2004) Growth hormone and prolactin genes in

gene reserves in Czech republic and Poland.

36 Larsen B., Thymann M. Studies on milk protein polymorphism in Danish cattle and

the bovine. Sequence complete. "European Journal of Biochemistry", 1986. 23, 41-51.

37 Leone P., Scaltriti V., Sangalli S., Caroli A., Pagnacco G. Polimorfismo della k-

caseina nei bovini: identificazione dell'allele E in torelli di razza Bruna e Frisona

Italiana. "Proceedings IVth National Congress Biodiversity, Alghero, Italy, 8-11

September". 1998.

38 Lewin H.A., Schmitt, K., Hubert, R., van Eijk, M.J.T. and Arnheim, N. (1992). Close

linkage between bovine prolactin and BoLA-DRB3 genes: genetic mapping in cattle

by single sperm typing. Genomics 13: 44-48.

39 Lien S., Alestrom P., Klungland H., Rogne S. Detection of β-CN allele by

amplification created restiction sitis. Animal Genetics, 23, 1992.

40 Lozovaya G.S. Genetic variation in haemoglobin, transferrin and β-lactoglobulin types

in yaks from the Pamirs. "Tsitologiya i Genetika", 1973. 7(2), 158-160.

41 Looft, C., N. Reinsch, C. Karall-Albrecht, S. Paul, M. Brink, H. Thomsen, G.

Brockmann, C. Kuhn, M. Schwerin, and E. Kalm. 2001. A mammary gland EST

showing linkage disequilibrium to a milk production QTL on bovine Chromosome 14.

Mammal. Genome 12:646–650.

42 Lunden A., Nilsson M., Janson L. Marked effect of β-lactoglobulin polymorphism on

the ratio of casein to total protein in milk. "Journal of Dairy Science", 1997. 80, 2996-

3005.

43 Malevičiūtė J., Baltrėnaitė L., Pečiulienė N., Miceikienė I. Genetinių žymeklių

panaudojimas gyvulių selekcijoje, 2003.

44 Mariani P. II polimorfismo genetico delle caseine in vacche di razza Bruna: frequenza

della variante C al locus k-Cn. "Annali Facolta di Medicina Veterinaria, Universita di

Parma", 1987. 7, 317- 332.

45 Marletta D., Rando A., Senese C., Mariani P., D'Urso G. Identificazione dell'allele

quantitative as1-Cn G in bovini di razza Modicana. "Proceedings Societa Italiana delle

Scienze Veterinarie", Perugia, Italy, 1996. 50, 461-462.

46 Mariani P., Russo V. Distribuzione delle varianti genetiche delle caseine e della beta-

lattoglobulina nelle vacche di razza Reggiana. "Rivista di Zootecnia", 1971. 44, 310-

321.

44

47 Mariani P., Russo V. Varianti genetiche delle proteine del latte nella razza Rendena.

"Rivista di Zootecnia e Veterinaria", 1975. 3(4), 345-348.

48 Medjugorac, I., Kustermann, W., Lazar, P., Russ, I. and Pirchner, F. (1994). Marker

derived phylogeny of European cattle supports demic expansion of agriculture. Anim.

Genet. 25: 19-27.

49 Michalak W. Anomalous electrophoretic pattern of milk proteins. "Journal of Dairy

Science", 1967. 50, 1319-1320.

50 Michalak W. Hereditary polymorphism of milk proteins in some breeds of cattle

raised in Poland. II.. "Biuletyn Zaktadu Hodowli Doswiadczalnej Zwierzat. pol. Akad.

Nauk., Warsaw", 1969. 15, 89-111.

51 Murphy R.F., Downey W.K. Milk protein polymorphism in the Kerry breed of cattle.

"Journal of Dairy Science", 1969. 52, 1113-1115.

52 Ng-Kuai-Hang, K.F., Hayes, J.F., Moxley, J.E. and Morandes, H.G. (1984).

Association of genetic variants of casein and milk serum proteins with milk, fat and

protein production by dairy cattle. J. Dairy Sci. 67: 835-842.

53 Osterhoff D.R., Pretorius A.M.G. Inherited biochemical polymorphism in milk

proteins. "Proceedings South African Society of Animal Production", 1966. 5, 166-

173.

54 Perez-Beato 0. Presencia de la variante C del locus β-Lg en el cebu de Cuba. "Revista

de Salud Animal", 1979. 1(1), 101-103.

55 Palmer A.H. The preparation of crystalline globulin from the albumin fraction of

cow's milk. "Journal of Biological Chemistry", 1934. 104, 359-372.

56 Petrushko S.A. Polymorphism of bovine as1-caseins and some aspects of its use in

selection. In "Voprosy Genetiki i Selektsii", 1970. 147-154.

57 Praškevičius A., Ivanovienė L., Stasiūnienė N., Burneckienė J., Rodovičius H.,

Lukoševičius L., Kondratas D. BIOCHEMIJA 2003. Kaunas

58 Poli, M.A. and Antonini, A.G. (1992). Genetics structure of milk proteins in

Argentinean Holstein and Argentinean Creole Cattle. Hereditas 115: 177-182.

59 Rando A., Ramunno L., Di Gregorio P., Fiorella A., Davoli R., Masina P.

Localizzazione di siti polimorfi nella regione di DNA che contiene il gene della

caseina as1 di bovino. "Proceedings Associazione Scientifica di Produzione Animale",

Bologna, Italy, 1993. 10, 617-620.

45

60 Rando A., Mariani P., Fiorella A., Di Gregorio P., Ramunno L., Masina P. Un allele

quantitative della caseina as1 di bovino. "Proceedings Associazione Scientifica di

Produzione Animale", Grado, Italy, 1995. 11, 175-176.

61 Ron, M., D. W. Heyen, J. I. Weller, M. Band, E. Feldmesser, H. Pasternak, Y. Da, G.

R. Wiggans, P. M. Vanraden, E. Ezra, and H. A. Lewin. 1998. Detection and analysis

of a locus affecting milk concentration in the US and Israeli dairy cattle populations.

Proc. 6th World Congr. Genet. Appl. Livest. Prod. Armidale, Australia. 26:422–425.

62 Russo V., Mariani P. Polimorfismo delle proteine del latte e relazioni tra varianti

genetiche e caratteristiche di interesse zootecnico, tecnologico e caseario. Rivista di

Zootecnia eVeterinaria. 1978. 6(5, 6), 289-304, 365-379.

63 Russo V., Mariani P. Polimorfismo genetico delle proteine del latte nelle vacche di

razza Bruna Alpina. "Scienza e Tecnica Lattiero-Casearia", 1971. 22, 167-183.

64 Russo V., Mariani P. Polimorfismo genetico delle caseine e della β-lattoglobulina

nella razza bovina Modenese. "Rivista di Zootecnia", 1972. 45, 43-51.

65 Seibert B., Erhardt G., Senft B. Detection of a new k-casein variant in cow's milk.

"Animal Genetics", 1987. 18, 269-272.

66 Schlee P., Graml R., Rottman O., Pirchner F. 1994. Joural of Animal Breeding and

Genetics.

67 Srosclaude F., Mahe M.F., Mercier J.C., Bonnemaire J., Teissier J.H. Polymorphisme

des lactoproteines de Bovines Nepalais. I. Mise en evidence, chez le yak, et

caracterisation biochimique de deux nouveaux variants: β-Lactoglobuline Dyak et

caseine as1-E. "Annales de Genetique et de Selection Animale", 1976. 8, 461-479.

68 Tucker, H.A. (1981). Physiological control of mammary growth, lactogenesis and

lactation. J. Dairy Sci. 4: 1403-1421.

69 Udina I.G., Turkova S.O., Kostyuchenko M.V., Lebedeva L.A., ir Sulimova G.E.

(2000). Polymorphism of Bovine Prolactin Gene: Microsatellites, PCR_RFLP.

70 Velmala, R., M ysaari, E.A. and M -Tanila, A. (1993). Molecular genetic

polymorphism at the α-casein and β-lactoglobulin loci in Finnish dairy bulls. Agric.

Sci. Finl. 2: 431-435.

71 Weller, J. I., Y. Kashi, and M. Soller. 1990. Power of "daughter" and "granddaughter"

designs for genetic mapping of quantitative traits in dairy cattle using genetic markers.

J. Dairy Sci. 73:2525–2537

46

72 Zwierzchowski L. 2000. Milk protein genes – regulation of expression and value for

biotechnology. Polish Academy of Science Institute of Genetics and Animal Breeding,

Jastrzębiec.

47

7. PRIEDAI

1 Priedas. Duomenys apie tirtus gyvulius Gyvulio numeris

Lytis Veislė Genotipas Laikytojas

LJ4425 B Juodmargis BB Kauno VĮ LJ4419 B Juodmargis AB Kauno VĮ LJ4374 B Juodmargis AA Kauno VĮ LJ4373 B Juodmargis AA Kauno VĮ LJ4448 B Juodmargis AB Vilniaus VĮ 2190 (2615) K Juodmargė AA LVA PMBC 2444 (4032) K Juodmargė AA LVA PMBC 2459 (4106) K Juodmargė AA LVA PMBC 2450 (4040) K Juodmargė AA LVA PMBC 2370 (3948) K Juodmargė AA LVA PMBC 2283 (3633) K Juodmargė AA LVA PMBC 2618 (4263) K Juodmargė AA LVA PMBC 2662 (4315) K Juodmargė AB LVA PMBC 2314 (3799) K Juodmargė AB LVA PMBC 2374 (3955) K Juodmargė AA LVA PMBC 2261 (3560) K Juodmargė AA LVA PMBC 2768 (4452) K Juodmargė BB LVA PMBC 2668 (4323) K Juodmargė AA LVA PMBC 2208 (3133) K Juodmargė AA LVA PMBC 2596 (4233) K Juodmargė AA LVA PMBC 2348 (3893) K Juodmargė AB LVA PMBC 2672 (4327) K Juodmargė AB LVA PMBC 2797 (4484) K Juodmargė AA LVA PMBC 2275 (3607) K Juodmargė BB LVA PMBC 5163 (4618) K Juodmargė AA LVA PMBC 1166872 K Juodmargė AB ŽŪB “Bernatonys” 1166881 K Juodmargė AA ŽŪB “Bernatonys” 1166873 K Juodmargė AA ŽŪB “Bernatonys” 1166975 K Juodmargė AA ŽŪB “Bernatonys” 1166253 K Juodmargė AA ŽŪB “Bernatonys” 1166874 K Juodmargė AA ŽŪB “Bernatonys” 1166896 K Juodmargė AA ŽŪB “Bernatonys” 1166912 K Juodmargė AA ŽŪB “Bernatonys” 1166868 K Juodmargė AA ŽŪB “Bernatonys” LŽ3627 B Žalasis AB Vilniaus VĮ LT 738 B Žalasis AA Šiaulių VĮ LT 125 B Žalasis BB Šiaulių VĮ LT 222 B Žalasis AA Šiaulių VĮ LT 731 B Žalasis AA Šiaulių VĮ 3590 B Žalasis AA Šiaulių VĮ 21021397 K Žaloji AB ŽŪB “Atžalynas” 21021793 K Žaloji AB ŽŪB “Atžalynas” 21021943 K Žaloji AA ŽŪB “Atžalynas” 21021364 K Žaloji AA ŽŪB “Atžalynas”

48

21021507 K Žaloji AA ŽŪB “Atžalynas” 21021597 K Žaloji AB ŽŪB “Atžalynas” 21021404 K Žaloji AA ŽŪB “Atžalynas” 21021402 K Žaloji AB ŽŪB “Atžalynas” 21021708 K Žaloji AA ŽŪB “Atžalynas” 21021344 K Žaloji AB ŽŪB “Atžalynas” 21021781 K Žaloji BB ŽŪB “Atžalynas” 21021221 K Žaloji AB ŽŪB “Atžalynas” 21021777 K Žaloji AB ŽŪB “Atžalynas” 21021780 K Žaloji AA ŽŪB “Atžalynas” 1388600 K Žaloji AA ŽŪB “Žibertonys” 1388560 K Žaloji AA ŽŪB “Žibertonys” 1388561 K Žaloji AA ŽŪB “Žibertonys” 1388556 K Žaloji AA ŽŪB “Žibertonys” 1388585 K Žaloji AA ŽŪB “Žibertonys” 1388573 K Žaloji AA ŽŪB “Žibertonys” B Baltnugaris AB LVA PMBC 1464117 B Baltnugaris AA Vilniaus VĮ 1464114 K Baltnugarė AA R. Jaskevičius, Prienai 1462728 K Baltnugarė AA Balčiūnas, Birštonas 1167690 K Baltnugarė AA J. Virgaitienė, Kaunas 1501048 K Baltnugarė AA J. Liutkus 1494975 K Baltnugarė AA V. Goštautienė, Prienai 1835501 K Baltnugarė AA N. Vyšniauskienė, Prienai 1494923 K Baltnugarė AA G. Kazakevičius, Raseiniai 1494950 K Baltnugarė AA P. Budrys, Raseiniai 1835500 K Baltnugarė AA G. Kazakevičius, Raseiniai 1501059 K Baltnugarė AA G. Kazakevičius, Raseiniai 02077135 K Baltnugarė AA LVA PMBC 01917602 K Baltnugarė AA LVA PMBC 02325297 K Baltnugarė AA LVA PMBC 01160886 K Baltnugarė AA LVA PMBC 02324018 K Baltnugarė AA LVA PMBC 02326922 K Baltnugarė AA LVA PMBC B Šėmis AA LVA PMBC 1457971 K Šėma AA J. Belkevičius, Prienai 1457963 K Šėma AA J. Belkevičius, Prienai B Šėmis AA J. Belkevičius, Prienai B Šėmis AA J. Belkevičius, Prienai 24011315 K Šėma AA Žiobienė, Prienai LJ 4363 B Šėmis AA Vilniaus VĮ LJ 4351 B Šėmis AB Vilniaus VĮ LJ 4362 B Šėmis AA Vilniaus VĮ 02328061 K Šėma AA LVA PMBC 02328074 K Šėma AA LVA PMBC

49

2 Priedas. Įranga, instrumentai ir reagentai

Elektroforezės aparatai

Gelio elektroforezės aparatas GNA-100 Švedija

Maitinimo šaltinis GPS 200/400 Švedija

Elektroforezės maitinimo šaltinis EC 135 E-C Aparatų įmonė, JAV

Midicell® Primo gelio sistema E-C Aparatų įmonė, JAV

EC 330 ir 360

DNR termocikleriai

GeneAmp® PGR sistema 2700 AB Applied Biosystems

Centrifugos

Nanofuga JAV

Mikro-Kentauro Centrifuga SANYO, Jungtinė Karalystė

Centrifuga D 5445 Ependorfo AG, Vokietija

Universali 32R Hettich Centrifuga WTB BINDER, Vokietija

Maišytuvai

Minikratytuvas MS1 IKA, JAV

Sūkurinis maišytuvas-2 Prolab Oriola

Kita įranga

II RNR/DNR koncentracijos matuoklis Farmacija Biotech, Švedija

Mini-Transiluminatorius 2000 BIO RAD, JAV

Termo maišiklis 1,5 ml Ependorfas AG, Vokietija

Sartorius Basicplus Sartorius AG, Vokietija

pH – mV Meter (pH 5380 Wissenschaftlich-Technische

Werkstaetten GmbH, Vokietija

Termostatas WTB BINDER, Vokietija

Šaldytuvas Snaigė C 290 „Snaigė“, Lietuva

Mikrobangų krosnelė R234 Sharp elektronika GmbH, Vokietija

50

Pipetės, antgaliukai, mėgintuvėliai

Suomiška pipetė Digital MCP Labsystems, Suomija

Suomiškas antgaliukas sterilus filtras Labsystems, Suomija

Ependorfo Research® (reguliuojamas) Ependorfas AG, Vokietija

Ependorfo antgaliukai Ependorfas AG, Vokietija

Mikro Test mėgintuvėlis: 0,5 ml; 1,5 ml; 0,2 ml Ependorfas AG, Vokietija

50 ml Falcon® mėgintuvėliai Ependorfas AG, Vokietija

EDTA antikoagulianto vakuntaineris Venoject, Belgija

REAGENTAI

Chemikalai

Etidžio Bromidas CON Laboratorija, JAV

Trisas Farmacija Biotech., Švedija

Boro rūgštis PlusOne Farmacija Biotech., Švedija

EDTA PlusOne Farmacija Biotech., Švedija

Top VisionTM LE GQ Agarozė MBI Fermentas, Lietuva

6x Loading Dye tirpalas MBI Fermentas, Lietuva

Trisas Sigma. JAV

EDTA, dinatrio druska Sigma. JAV

NH4Cl Sigma. JAV

KHCO3 Sigma. JAV

KCl Sigma. JAV

Natrio dodecilsulfatas Roth, Vokietija

Chloroformas G.R. Lachema, Čekijos Respublika

NaCl, biotechnologijos rūšis Amresco, JAV

Amonio persulfatas, ACD rūšis Amresco, JAV

Fenolio prisotintas tirpalas Amresco, JAV

100 % (grynas) etanolis vaistinė

Fermentai

GeneRulerTM 100 bp DNR Ladder Plus MBI Fermentas, Lietuva

Proteinazė K MBI Fermentas, Lietuva

51

BUFERIAI

Buferis A (pH 7,4): 10% SDS (pH 7,2):

155 mM NH4Cl 8,29g SDS 10g

10 mM KHCO3 1g H2O iki 100 ml

0,5 mM Na2 EDTA (pH 8,0) 200 μl Karštis iki 68 0C

H2O iki 1 litro Suderinti iki reikiamos pH 7,2 su

Gerai išmaišyti ir laikyti 4 0C koncentruota HCl

Buferis B (pH 8,0): Proteinazė K (20 mg/ml):

75 mM NaCl 4,39g Proteinazė K 20 mg

25 mM Na2 EDTA (pH 8,0) 50 μl H2O iki 1 ml

Gerai išmaišyti ir laikyti 4 0C Gerai išmaišyti ir laikyti -20 0C

0,15 M KCl: 6 M NaCl:

KCl 11,8 g NaCL 350,658 g

H2O iki 1 litro Sterilizuoti autoklave.

0,5 M EDTA (pH 8,0) 50×TAE (Tri-acetato buferis)

Na2 EDTAx2H2O 186,1 g Ledinė acto rūgštis 57,1 ml

H2O iki 700 ml Trisas 242,0 g

Suderinti pH iki 8,0 su 10 M NaOH (ca 50 ml) 0,5 M EDTA (pH) 100 ml

H2O iki 1 litro Sterilizuoti autoklave.

Sterilizuoti autoklave.

10 mg/ml Etidžio Bromidas Loading Dye

Etidžio Bromidas 0,2 g Formamidas 10 mM

H2O iki 20 ml Bromfenolio mėlio dažas 0,25 %

Gerai išmaišyti ir laikyti 4 0C tamsoje Ksilolo cianas 0,25 %