V.Baliuckas Genetikos ir selekcijos skyrius 3.4 Genomų sekvenavimas

V.Baliuckas

Genetikos ir selekcijos skyrius

3.4 Genomų sekvenavimas

V.Baliuckas


DNR sekvenavimo metodai: Sengerio (sukurtas 1974 m., modifikuotas 1982 m.) fermentinis metodas

V.Rančelis (2000)

V.Baliuckas


Maksamo-Gilberto cheminis metodas

V.Rančelis (2000)

DNR sekvenavimo metodai:

V.Baliuckas


automatinis metodas – tai automatizuotas F. Sengerio išrastas metodas

DNR sekvenavimo metodai:

Chromatografo kreivės

Visi dabartiniu metu naudojami genomų sekvenavimo būdai remiasi ‘Shotgun’ automatiniu DNR sekų generavimu

V.Baliuckas


Genomo sekvenavimo tikslas gauti pilnai iššifruotą DNR grandinėlę (A, C, G, T).

Bibliotekos

Sekvenavimas

Perdavimas naudojimui

Grupavimas/susiejimas

Anotacija

Užbaigimas

Strategija

Dauguma genomų gali būti sekvenuoti be didesnių problemų

Klonų gretinimo (hierarchiniu) būdu arba viso genomo sekvenavimas per kartą

Subklonavimas; ant gerai žinomų vektorių sudaromos nedidelės “įterpimo” bibliotekos

Atskirų DNR fragmentų apjungimas į artimas, kaimynines

sulygintų sekų grupes (angl. contig) pagal jų persidengimą

Sulygintos sekos apjungiamos į vientisą ištisinę seką

-DNR savybės (pasikartojimai/panašumai)-Genų lokalizacija-Peptidų savybės-Pirminis peptidų vaidmens ar paskirties nustatymas-Kitos reguliatorinės sritys

V.Baliuckas


Pagrindinės genomo sekvenavimo strategijosHierarchinė arba klonų gretinimo (angl. Clone by clone):1. DNR skaidymas į daugybę pakankamai ilgų segmentų ir didelės kolekcija BAC klonų sudarymas.2. DNR fragmentų sudėliojimas į fizinius genolapius.3. Minimalaus fragmentų persidengimo varianto suradimas.4. Kiekvieno varianto klono sekvenavimas su ‘Shotgun’.5. Fragmentų apjungimas kaimynystės principu į klonų gretinius (angl. contig).6. Visų fragmentų sujungimas į vientisą seką.

Šis būdas panaudotas mielių, kirmėlių, žmogaus, žiurkės genomų sekvenavimui.

Hierarchinės strategijos atmaina yra ‘žingsniavimas’ (angl. walking), kai nesudaromi fiziniai genolapiai:

1. DNR skaidymas į daugybę pakankamai ilgų segmentų ir perteklinės BAC klonų kolekcijos sudarymas.

2. Sekvenavimas kiekvieno klono, pirmiausia parinkus keletą kertinių klonų (angl. seed clones).

3. Vientisos sekos konstravimas vis pridedant sekvenuotus prie jau esamų.Tokiu būdu sekvenuotas ryžio genomas.

Viso genomo sekvenavimas iš karto (WGS), išvengiant genolapių sudarymo.

Šis būdas taikytas sekvenuojant drozofilos, žmogaus, pelės, žiurkės, šuns genomus.

V.Baliuckas


www.sanbi.ac.za/mrc/tdr2004/Presentation/ genomics_lawson/sanbi_genome_files/

Genomo dydis ir sekvenavimo strategijos

Genomo dydis (log Mb)

D.melanogaster (170 Mb)C.elegans (100Mb)

H.sapiens (3000 Mb)

S.cerevisiae (14 Mb)E.coli (4 Mb)

P.falciparum (30 Mb)

0 1 2 3 4

Viso genomo per kartą (WGS)

Hierarchinis arba klonavimo

Viso genomo per kartą ‘Shotgun’ (WGS) derinant su BAC mažo padengimo klonais (panaudotas žiurkės genomo sekvenavimui)

Visos chromosomos (WCS)

V.Baliuckas


Vektorių tipai

VektoriusIntarpo dydis

(bp)

Plazmidės 2,000-10,000

Kosmidės 40,000

BAC (bakterijų dirbtinė chromosoma)

70,000-300,000

YAC (mielių dirbtinė chromosoma)

> 300,000

(vis mažiau naudojama)

Vektoriai – struktūros, kuriose laikoma įterpta klonuota svetima DNR. Tai atliekama dviem tikslais: saugoti ir dauginti klonuotą DNR.

V.Baliuckas


DNR sekvenavimas – vektoriai

+ =

DNR

DNR fragmentai

Vektorius (žiedinė plazmidės DNR)

Žinoma vieta(restriktazių pažinimo vieta)

V.Baliuckas


V.Baliuckas


Genetiniai genolapiai sudaromi pasinaudojant rekombinacijų dažniais ir santykiniais atstumais (cM), o fiziniai – pasinaudojant fiziniais klonuotų DNR sekų atstumais.

Genetiniai žymenys naudojami kaip gairės sudarant genolapius:-morfologiniai kategoriniai žymenys, pvz. žmonių hemofilija, daltonizmas, žirnelių raukšlėtumas;-Fiziniai žymenys - RFLP, CAPS, VNTR, STS.

V.Baliuckas


http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml

V.Baliuckas


Komplementaraus jungimosi būdu gaunamas tikslus molekulinių žymenų išsidėstymas chromosomoje

Detalus genolapio STS (angl. sequence-tagged-site) pagrindu sudarymas remiasi klonuotų BAC fragmentų kartografavimu, persidengimo principu (angl. contig).

V.Baliuckas


Viso genomo sekvenavimas (WGS)

V.Baliuckas

Genetikos ir selekcijos skyrius www.ist.temple.edu/~vucetic/ cis595spring2003/

V.Baliuckas


Sekvenavimo strategijų privalumai ir trūkumai

Hierarchinis sekvenavimas

Privalumai:- Lengvesnis apjungimas sekvenuotų fragmentų į klonų gretinius- Reikalauja mažiau kompiuterinių

resursų- Yra patikimesnis

Trūkumai:- Reikalingi fiziniai genolapiai ir klonų

bibliotekos- Daug perteklinio padengimo (angl.

redundant sequencing)- Techniškai sudėtingas ir

pakankamai brangus

Viso genomo sekvenavimas per kartą

Privalumai:- Nereikia genolapių- Mažiau perteklinio padengimo- Reikalauja daugiau kompiuterinių

resursų- Yra pigesnis

Trūkumai:- Sudėtingas sekvenuotų fragmentų

apjungimas į klonų gretinius, t.y. eksperimentiškai sudėtingesnis

- Reikalauja daugiau kompiuterinių resursų

- Nėra patikimas

V.Baliuckas


Eukariotų genomų anotacija

transkripcija

RNR procesingas

transliacija

AAAAAAA

Genominė DNR

Pirminė RNR

Brandi mRNR

Susidarantis polipeptidas

susisukimas

Reaktantas A Produktas BFunkcija

Aktyvus enzimas

ab initio genų suradimas

Lyginamasis genų išaiškinimas

Funkcinė identifikacija

Gm3

Genomo anotacija ar išaiškinimas – tai genus atitinkančių DNR sekų identifikavimas, siekiant atsakyti į klausimus: kiek genų yra ir kuriose genomo vietose, kokius baltymus jie koduoja, kokie yra reguliaciniai mechanizmai ir sąveikos schemos.

V.Baliuckas


Struktūrinė anotacija susijusi genų vietos suradimu, homologinių su kitais genomais, cDNA sekomis ir baltymų sekomis DNR grandinės vietų paieška, o taip pat transkripciją reguliuojančių elementų identifikavimu.

Funkcinė anotacija susijusi su baltymų molekuline funkcija, jų dalyvavimu apykaitos ir reguliatorinėje veikloje.

1000

1000

2000

2000

3000

3000

4000

4000

5000

5000

6000

6000

7000

7000

3 3

2 2

1 1

-1 -1

-2 -2

-3 -3

E.coli genomo vietos fragmentas

V.Baliuckas


Start kodonasATG

5’ 3’

Egzonas 1 Egzonas 2 Egzonas 3Intronas 1 Intronas 2

Stop kodonasTAG/TGA/TAA

Susijungimo vietos

Ab initio genų metodai paremti specifinių vietų sekose paieška, tokių kaip start ir stop kodonai, ir ribosominės kilpos. Jei nukleotidai sekoje išsidėstę atsitiktinai (tai būdinga introninėms geno dalims, tarpgeninei DNR), maždaug kas dvidešimtas nukleotidų trejetas esti atsitiktinis stop kodonas.

Palyginti ilgas DNR fragmentas, kuriame nėra stop kodonų, vadinamas atviru skaitymo rėmeliu (ORF). GenScan, Genie, GeneID kompiuterinės programos yra naudojamos tokio pobūdžio analizei.

V.Baliuckas


Kiti genų identifikavimo metodai grindžiami homologija su jau žinomais genais (naudojama GenomeScan kompiuterinė programa). Tokie yra, pvz.:

- zooblotingas, kai hibridizuojant naujai nustatyto žmogaus geno DNR sekas su žinomais kitų rūšių (beždžionių, galvijų, pelių, paukščių) genais, galima identifikuoti tų genų analogus žmogaus genome (GeneWise, Procrustes ir kt. kompiuterinės programos);

- CpG salelės, kurių buvimas nustatytose DNR sekose padeda rasti visą geną. Šios salelės labiau būdingos bendriniams (angl. housekeeping) genams, pvz., tokiems, kurie koduoja ląstelės energetikai būtinus baltymus ir kt. (Rosseta, SGP1 kompiuterinės programos);

- egzono įterpimas (angl. exon trapping) paremtas žiniomis apie tam tikras nukleotidų sekas eukariotų genuose žyminčias introno pradžią ir pabaigą. Jei gautos mDNR ilgis pasikeičia, vadinasi svetimos DNR egzonas buvo atpažintas ir prijungtas (CEM kompiuterinė programa).

V.Baliuckas


Genai yra identifikuojami pasinaudojant ekspresuotų sekų žymekliais (EST). Idėja grindžiama tuo, kad identiškos sekos atlieka panašų vaidmenį ir kituose genomuose. Specialios kompiuterinės programos padeda identifikuoti genus pagal nukleotidų sekų išreikštumą (BLASTN, FASTA, TBLASTN).

Naujesnės kompiuterinės programos, tokios kaip SGP-2, TwinScan, SLAM, DoubleScan yra sukonstruotos panašumo principu ir naudojamos homologiniams genomų lyginimams.

Iškylantys sunkumai:

- sunku tiksliai iškart nustatyti genų skaičių

- visas genomas sekvenuotas su kai kuriomis pasitaikančiomis klaidomis

- mažus genus yra sunku identifikuoti

- kai kurie genai retai pasireiškia ir neturi būdingos kodonų struktūros, todėl juos sunku aptikti

- genų funkcijos daugumoje yra nežinomos

V.Baliuckas


Genomų ypatybės apsprendžia jų sekvenavimo eigos sklandumą

Gerai Vidutiniškai Blogai

Polimorfizmas Haploidai Savidulkiniai Kryžmadulkiniai

Padengimas žymenimis

Tankus Retas Nėra

Fragmentų dydis 3kb, 10kb, 50kb, 200kb

3kb, 50kb 3kb

Klonų pasiskirstymas

Atsitiktinis Atsitiktinis kai kurių dydžių fragmentuose

Neatsitiktinis daugumoje atvejų

BAC galai Daug porose Nedaug porose Nėra porose

EST Daug 300/Mb Mažai 100/Mb Nėra

mRNA Daug Mažai Nėra

Padengimas 10x 6x 2x

Sekvenavimo paklaidos

Nėra Nedaug Daug

Genomo dydis 30Mb - 100Mb 100Mb - 1Gb >1Gb

V.Baliuckas

Genetikos ir selekcijos skyrius www.ist.temple.edu/~vucetic/ cis595spring2003/

Naujai įsitvirtinantys sekvenavimo metodai

Hibridinis sekvenavimas (SBH)Daugybinis spektrometrinis sekvenavimasTiesioginė atskiros DNR molekulės vizualizacija naudojant atominę

mikroskopiją (AFM)Atskiros molekulės sekvenavimasAtskiro nukleotido metodasGeno ekspresijos ląstelėje nustatymo metodasSekvenavimas panaudojant nanoporą

V.Baliuckas


globinas

Egzonas 2Egzonas 1 Egzonas 3

5’ UTR 3’ UTR

(11 chromosoma)

Žmogaus genomas

*5.000

*20

6*104 bp

3.2*109 bp

*103

3*103 bp

ATTGCCATGTCGATAATTGGACTATTTGGA 30 bp

Myoglobinas globinas

aa aa aa aa aa aa aa aa aa aa

DNR:

Baltymas:

1

2 3

4 56 7

8 9X

Y151413121011

2120191817

1622

279251

221197 198

176 163 148 140 143 148 142118 107 100

10488 86

72 66 45 48

163

51

mitochondrija

.016

http://www.sanger.ac.uk/HGP/

V.Baliuckas


- Genai sudaro ~ 25% viso genomo

- Egzonai užima tik 1%

Vidutinis žmogaus genas:27kb ilgio ir koduojančia seka sudarančia 1,340 bpTik 5% genų atitinka koduojančias sekas (genai skiriasi pagal intronų

skaičių)www.gmu.edu/departments/ biology/568-0304.ppt

Žmogaus genomas

V.Baliuckas


• Egzonai: baltymus koduojantys ir netransliuojamos sritys (UTR)

1 to 178 egzonų gali turėti genas (vidurkis 8.8)8 bp to 17 kb gali sudaryti egzoną (vidurkis 145 bp)

• Intronai: nekoduojančios DNR sekos vidutiniškai 1 kb – 50 kb sudaro introną

• Genų dydis: Didžiausias – 2.4 Mb (Distrofinas). Vidurkis – 27 kb.

Eukariotų genomai turi santykinai mažai koduojančių sričių

Eukariotų genomus didžiąja dalimi sudaro kartotinės sekos

Eukariotų genai yra grupuojami blokuose tarp kartotinių sekų

Dėl minėtų priežasčių yra reikalingi paprastesni “modeliniai” genomai

V.Baliuckas


http://www.genomesonline.org/

•Publikuoti pilni genomai: 359

•Prokariotų vykstantys genomų dekodavimai: 944

•Eukariotų vykstantys genomų dekodavimai: 599

•Viso: 1902

2006 metų (pirmo ketvirčio) duomenys

V.Baliuckas

Genetikos ir selekcijos skyrius Steane (2005)

V.Baliuckas


Bananas (Musa)873.000 Kb

Lilium50.000.000 Kb

Augalų genomai skiriasi dydžiu, ploidiškumu ir chromosomų skaičiumi

Arabidopsis

125.000 Kb

http://www.redbio.org/portal/encuentros/enc_2001/conferencias/C-04/

V.Baliuckas

Genetikos ir selekcijos skyrius Savolainen O. 2006

V.Baliuckas


V.Baliuckas


Ląst

elių

tip

ų ir

mor

folo

gini

s ko

mpl

eksi

škum

as

Genomų dydis nėra proporcingas organizmų kompleksiškumui

V.Baliuckas


Kai kurie duomenys apie jau sekvenuotus genomusOrganizmas Dydis, bazinės poros Apytikslis genų

skaičiusChromosomų skaičius

Homo sapiens

(žmogus)

3,164 mln. bp ~30,000 46

Rattus norvegicus

(žiurkė)

2,750 mln. bp ~30,000 42

Mus musculus

(pelė)

2500 mln. bp ~30,000 40

Oryza sativa L.

(ryžis)

450 mln. bp ~40,000 12

Drosophila melanogaster (vaisinė muselė)

180 mln. bp 13,600 8

Arabidopsis thaliana

(baltažiedis vairenis)

125 mln. bp 25,500 5

Caenorhabditis Elegans

(apvalioji kirmėlė)

97 mln. bp 19,100 6

Saccharomyces cerevisiae (mielės)

12 mln. bp 6300 16

Escherichia coli

(bakterija)

4.7 mln. bp 3200 1

V.Baliuckas

Genetikos ir selekcijos skyrius Eriksson and Ekberg (2001)

Požymis Pinus spp Eucalyptus spp

Arabidopsis

Dydis, pg (haploidinės ląstelės)

24 0,6 0,15

Chromosomų skaičius 12 11 5

Kartotinė DNR (%) 75 75 10

Nesikartojanti DNR (%) 25 25 90

Koduojanti DNR (%) 0,3 13,3 50

pg=1012g

V.Baliuckas


Kokios galimos priežastys genomų dydžio skirtumų tarp baltažiedžio vairenio (Arabidopsis) ir daugumos spygliuočių medžių rūšių?

- Daugiau resursų reikalaujančios DNR sintezė, matyt, nėra didelis kliuvinys

- Svarbu pažymėti, kad didelis genomas koreliuoja su dideliu ląstelės branduoliu, o branduolio dydis savo ruožtu su lėtesne mitozės ir mejozės dalijimosi eiga

- Paminėta ypatybė nėra svarbi medžių rūšių išlikimui. Medžiai ir žolės augančios šiaurinėse platumose pasižymi labai nedideliu DNR turiniu. Tikėtina, kad tą lemia trumpas vegetacijos sezonas, nes augalams reikia praeiti keletą vystymosi stadijų

- Arabidopsio gyvenimo ciklas labai trumpas 2-3 savaitės nuo sėklos iki sėklos. Tik mažas augalo genomas gali leisti tokį spartų ląstelių dalijimąsi

- Pozityvi didelio genomo selekcija vyksta daugelyje spygliuočių medžių rūšių. Paprastai šios rūšys vietoj vandens indų turi tracheides. Yra nustatytas priežastinis teigiamas ryšys tarp tracheides produkuojančių kambio ląstelių ir branduolio DNR dydžio. 18 Š.Amerikos pušų rūšių tyrimai parodė, kad rūšys prisitaikę gyventi nepalankiomis sąlygomis (pusdykumėse) turi didesnį genomą nei augančios optimaliose sąlygose.

Eriksson and Ekberg (2001)

V.Baliuckas


Literatūros sąrašas

Brown G.R., Gill G.P., Kuntz R.J., Langley C.H. and Neale D.B. 2004. Nucleotide diversity and linkage disequilibrium in loblolly pine. PNAS 101 (42): 15255–15260.

Brown GR., Kadel EE. III, Bassoni DL., Kiehne KL., Temesgen B., Buijtenen JP. van, Sewell MM., Marshall KA., Neale DB., van Buijtenen JPAD 2001. Anchored reference loci in loblolly pine (Pinus taeda L.) for integrating pine genomics. Genetics, 159 (2): 799-809.

Eriksson G. and Ekberg I. 2001. An introduction to forest genetics. SLU Repro, Uppsala. Pp. 166.

Neale DB. and Savolainen O. 2004. Association genetics of complex traits in conifers. Trends inPlant Science 9: 325-330.

Pavy N., Paule Ch., Parsons L., Crow J.A., Morency M-J., Cooke J., Johnson J.E., Noumen E.,Guillet-Claude C., Butterfield Y., Barber S., Yang G., Liu J., Stott J., Kirkpatrick R., Siddiqui A., Holt R., Marra M., Seguin A., Retzel E., Bousquet J. and MacKay J. 2005. Generation, annotation, analysis and database integration of 16,500 white spruce EST clusters. BMC Genomics 6 (144): 1-19.

Rančelis V. 2000. Genetika. Lietuvos Mokslų Akademijos leidykla, Vilnius. Pp. 662.

Steane D. 2005. Complete Nucleotide Sequence of the Chloroplast Genome fromthe Tasmanian Blue Gum, Eucalyptus globulus (Myrtaceae). DNA Research 12: 215-220.

Documents

V.Baliuckas Genetikos ir selekcijos skyrius 3.4 Genomų sekvenavimas