Enterobaktériumok, Coliformok, E. coli, és Salmonella

kimutatása

3. gyakorlat

Indikátor mikrobák

Enterobacteriaceae család (bélbaktériumok)

Coliformok Escherichia coli

Salmonellák

Enterobaktériumok

Indikátor baktériumok, jelenlétük fekáliás szennyeződésre utal. Előfordulás: emberi és állati béltraktus, felszíni vizek, talajflóra

Jellemzőik:, Gr-, rövid pálcák, általában peritrich csillóval mozognak, fakultatív anaerobokoxidáz negatívakNO3→NO2-vé redukáljákglükózt bontják sav (esetleg gáz) termelés mellett

Enterobaktériumok kimutatása

Lemezöntés: VRBG-agar, (hagyományos lemezöntés + fedőréteg 4 ml)kristályibolya-neutrálvörös-epe-glükóz, 37oC, 24 óra

értékelés: 0,5 mm-nél nagyobb, ált. 2-3 mm-es, kerek, sötétvörös, csapadékkal körülvett (epesavas sók kicsapódnak, Na-dezoxikolát, Na-taurokolát) telepek

Folyékony: BBG-leves: brillantzöld-glükóz-epe leves, 37oC, 24 óra

értékelés: zavaros és kisárgul → VRBG agarra

VRBG

OXIDÁZ-próba

1%-os parafenilén-diamin-oldat negatív: sárgáspozitív: kékesPár másodperc - perc, A vas katalizálja! (üvegbottal, műanyag kaccsal végezhető)

Enterobaktériumok:Enterobaktériumok: negatívnegatív

FERMENTÁCIÓS próba

Szőlőcukros magas agar (egy telepet leszúrunk), 37 oC, 24 óra

pozitív: pozitív: sárgasárga, gázt termelEnterobaktériumok: az eredetileg

piros színű agar főleg az alján sárgul ki (fak. anaerob), és homogén (mert mozog a szúrási csatornából)

s

Szőlőcukros magasagar

KATALÁZ próba

1 kacsnyi telep + pár csepp 10%-os H2O2 tárgylemezen → +: pezseg

Enterobaktériumok: pozitívpozitív

Coliformok

Laktózt 30°C-on egyidejű sav és gáz termelés mellett bontják

EscherichiaEscherichia (E. coli), KlebsiellaKlebsiella (K. oxytoca),

CitrobacterCitrobacter (C. freundii), EnterobacterEnterobacter (E. aerogenes) nemzetség– Gr-, vaskos pálcák, – epét vagy epesót tartalmazó táptalajban 30°C

hőmérsékleten sav- és gázképződéssel bontják a laktózt,

– Többnyire a normál bélflóra tagjai, de van kivétel is (pl. E. aerogenes, amely soha nem fordul elő a bélben)

– Jelenlétük a friss fekáliás szennyeződést valószínűsíti

Klebsiella

Coliformok kimutatása

VRBL táptalaj (kristályibolya-neutrálvörös-laktóz-epe)– gátlóanyag: kristályibolya, Na-dezoxikolát– savtermelés → neutrálvörös → piros,

precipitációs udvar, min. 1 mm– 0,5 mm átmérőjű, sötétpiros (lilás-vörös)

telepekEndo agar

– gátlóanyag: Na-szulfit, fukszin– laktóz→savak, aldehidek→aldehid+fukszin-

szulfit → felszabadul a fukszin → vörös telepek (E. coli esetében ez olyan intenzív, hogy a fukszin

kikristályosodik → fémes zöld fukszin-fény)

VRB agar

Endo agar

Coliformok kimutatása

BBL leves (brillantzöld-laktóz-epe leves), Durham cső, 30°C, 24-48 óra, zavarosodás+1/10 gáz → Coliform gyanús

Laurilszulfát-laktóz-levesgátlóanyag: Na-lauril-szulfátDurham cső, 30°C, 48 óra → 1/10 gáz

X-leves (szintetikus táptalaj)ammóniumsó, laktóz, puffer, nyomelemek

Kromogén Coliform agarok

Escherichia coli

Csak a bélcsatornában él, jelenléte mindig friss fekáliás kontaminációt jelez (index mikroba)

Önmagában többnyire ártalmatlan, vagy hasznos, egyes törzsei kórokozók (pl. E.coli O157 H7)

Kimutatása során el kell különíteni a Coliformoktól

IMV(E)C próbák

Eijkman-próba: tenyészetből 1 kacsnyit BBL-levesbe → 44,5°C 48 óráig vízfürdőben inkubáljuk → gyanús: zavaros + 1/10 gáz Durham csőben

→ VRBL agar → nutritív agarra szélesztjük az E. coli gyanús piros 2 mm átmérőjű telepet, és ezekkel végezzük el az IMVEC próbákat

IMV(E)C próbák

Indolképzési próba: TRIPTONVÍZbe oltunk, 24 óra 44,5°C inkubáció

0,5 ml KOVÁCS-reagens (p-dimetil-amino-benzaldehid amil-alkoholos sósavval savanyított oldata)

1 perc: + felszínen meggypiros gyűrű

Triptofán + víz → piroszőlősav + indol → +KOVÁCS-reagens → ROZINDOL festék

IMV(E)C próbák

Metilvörös próba: PUFFEROLT GLÜKÓZLEVES, 24 óra 37°C inkubáció

1-2 csepp METILVÖRÖS reagens+: az egész leves színe élénkpiros–: az egész leves színe sárgaA kevertsavas, és a butándiolos erjesztést

végző baktériumokat különíti el egymástól (E.coli kevertsavas erjesztést végez)

IMV(E)C próbák

VP próba: PUFFEROLT GLÜKÓZLEVES, 24 óra, 37°C inkubáció0,2 ml 5%-os alkoholos naftol-oldat0,1 ml 40%-os KOH 2 csepp 0.5%-os kreatin-oldat

2 óra múlva+: tenyészet felső része piros A glükózt butándiolosan erjesztő

baktériumok kimutatására szolgál.

IMV(E)C próbák

VP-próbaGlükóz → acetil-metil karbinol

(acetoin) [ez a butándiolos erjedés egy köztes terméke]

↓ O2, KOH

diacetil

↓ +kreatin piros szín

IMV(E)C próbák

Citráthasznosítási próba: ALAPLEVES, 4-6 óra inkubáció, 37°C-on,

majd oltótűvel CITRÁTOS magas-ferde agarba szúrunk és a felületén is szélesztünk → 24-48 óra, 37°C inkubáció→

+: eredeti zöld KÉK-re vált -: eredeti zöld szín marad, nincs

baktérium-növekedés(Brómtimolkék pH=6,8-on zöld, pH=7,6-on

kék)

Az IMV(E)C próbák értékelése

Indol-képzés

Metilvörös-próba

Voges-Proskauer-

próba

Citrát-hasznosítá

s

ELBÍRÁLÁS

+ + - - Fekáltípusú E. coli

- + - - Atípusos E. coli

- + - + Citrobacter típusos

+ + - + Citrobacter atípusos

- - + + Klebsiella v. Enterobacter

+ - + + Enterobacter atípusos

β-D-glükuronidáz pozitív Escherichia coli kimutatása

β-D-glükuronidáz enzim kimutatása MUG-alMUG ( 4-metil-umbelliferil-D glükuronid): umbelliferil → β-D-glükuronidáz → umbelliferon

(fluoreszkál) β-D-glükuronidáz enzime csak az E. colinak van

(néhány Salmonella és Shigella törzstől eltekintve), a fluoreszcencia így nagy valószínűséggel E. coli jelenlétére utal. (E. coli O157:H7 nem képes ilyen enzimet termelni!)

E. coli MPN: laurilszulfát leves + MUG

β-glükuronidáz-pozitív E. coli számának meghatározása

Minta (10 g/ml) + peptonvíz (90 ml), hígítási sor

TBX (tripton-epe-glükuronid) agar lemezöntés (1 ml)

Inkubálás 44± 1 oC 18-24 óraPozitív telep: kék

További megerősítő vizsgálatok nem szükségesek!

Salmonella

– Enterobacteriaceae család– Gram -, nem spórás– Önálló mozgásra képes, peritrich csillós

kivétel: S. Gallinarum, S. Pullorum, S. Typhi– 1 faj (Salmonella enterica), a szerotípusokat így

írjuk: S. Enteritidis, S. Senftenberg, S. Typhimurium, S. Infantis, stb. (nagybetű, nem dőlt!!)

– Fakultatív anaerob– Laktózt nem bontja, de– Salmonella subgenus III (Arizona)-ba tartozó törzsek

laktóz +, ONPG +– Salmonella subgenus II-be tartozó törzsek között

laktóz -, ONPG +

Általános tulajdonságok

Növekedés: 7-49,5°C, optimum: 35-37°CpH=3,8-9,5, optimum pH=7-7,5

Ellenálló képesség:– Fagyasztástól nem pusztul el– Alacsony vízaktivitás mellett (pl.: csokoládé: aw=0,3-0,5)

sokáig (hónapokig) túlél, és megnő a hőtűrő-képessége– Az alacsony pH-t kevésbé bírja, mint az E. coli– D idők:

60°C-on 2-6 perc 70°C-on <1 perc (alacsony vízaktivitáson extrém hosszú túlélés: D-idő 70°C-on 1050

perc)

– 0,1% ecetsav (pH=5,1) jelenlétében a növekedése gátolt

Salmonellák kimutatása

A Bizottság 2073-2005/EK rendelete az élelmiszerek mikrobiológiai kritériumairól

Kimutatási protokoll: MSZ EN ISO 6579 szerintMintavétel:

– 25 g (vagy egyes esetekben 10 g) minta– 100 cm2 lemosásával vagy ismert mennyiségű

öblítőfolyadék

Minta előkészítése: homogenizálni, majd azonnal leoltani.Szükség esetén 0-5°C-on 1 órát lehet várakozni.

Tenyésztési protokoll: Elődúsítással kombinált dúsítás I.

25 g vizsgálati anyag + 225 ml előmelegített pufferolt peptonvíz

↓H O M O G É N E Z É S

↓18±2 óra 37±1°C (elődúsítás)

0,1 ml 1 ml↓ ↓

+10 ml RVS dúsító +10 ml MKTTn dúsító↓ ↓

24±3 óra 41,5±1°C 24±3 óra 37±1°C↓ ↓

Tenyésztési protokoll: Elődúsítással kombinált dúsítás II.

↓ ↓ ↓ ↓XLD Másik táptalaj XLD Másik táptalaj↓ ↓ ↓ ↓

24±3 óra 37±1°C 24±3 óra 37±1°C Jellemző telepek kiválasztása

↓ Kioltás nem szelektív tápagarra (24±3 óra 37±1°C)

Biokémiai próbák Szerológiai próbák

Dúsítók

RVS: Rappaport-Vassiliadis dúsító

Malachitzöld, Mg-klorid, NaCl, K-dihidrogén-foszfát, pH=5,2±0,2

MKTTn: Müller-Kauffmann-tetrationát-novobiocin

Na-tioszulfát, marhaepe, brillantzöld, lugol-oldat, CaCO3, novobiocin, pH=8,2±0,2

Régen használatban volt még:

Bierbrauer-féle leves: Na-tioszulfát, lugol-oldat, marhaepe, CaCO3, malachitzöld, brillantzöld

Szelenit-cisztin leves: Na-szelenit, laktóz

Szilárd táptalajok - XLD

XLD agar: Xilóz-lizin-dezoxikolát agarxilóz, laktóz, szacharóz (egyiket sem bontja!), L-lizin-hidroklorid, Na-tioszulfát, ammónium-vas(III)-citrát, Na-dezoxikolát (eredetileg vörös színű a táptalaj)– Xilóz, laktóz, szacharóz savvá bontása → sárga szín– H2S képződése → vas-szulfid → fekete szín– Lizin → kadaverin (dekarboxilálás) → telepek körül bíbor

szín (pH-változás)– Na-dezoxikolát: Proteus telepek rajzásának gátlása,

Gram+-okat gátoljaSalmonella: telepek színe azonos a táptalaj színével

(vöröses-bíbor), gyakran fekete középpel

XLD

Egyéb szilárd táptalajok

BPL agar: Brillantzöld-fenolvörös-laktóz agarlila, apró telepek, mivel pH nő (savra sárgulna)Brillantzöld gátolja a Gram+-okat, a S. Typhi-t és a Shigellákat

BPLS agar: Brillantzöld-fenolvörös-laktóz-szacharóz agarSem a laktózt, sem a szacharózt nem bontja, így liláspiros telepeket képez. A laktóz negatív, de szacharóz pozitív zavaró flórát lehet vele kiszűrni.

Drigalski agar: sötétkék telep, mert Salmonella laktózból nem termel savat, sőt fehérjebontás miatt a pH megemelkedik

Rambach agar: propilénglikol bontás, telep piros (savképzés - neutrálvörös indikátor), egyes estekben színtelen: S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Typhisuis, S. Gallinarum

SS agar: Salmonella-Shigella agarlaktóz, marhaepe, Na-tioszulfát, Na-citrát, ammónium-vas(III)-citrát, brillantzöld, neutrálvörösSzulfidképződés → fekete közepe lesz a telepeknekLaktózt nem bontja → vörös marad a táptalaj

BPLS

Az MSRV agar

MSRV agar: Modified Semi-solid Rappaport-Vassiliadis agar– A kimutatás a Salmonellák mozgékonyságán

alapul: a Salmonella-migráció a félfolyékony tápközegben opálos udvaros növekedést eredményez.

– Nagy háttérfertőzöttségű minták esetén (pl.: bélsár-minta, cloaca-tampon) a dúsítási folyamatban az RVS dúsító helyett használatos. Ilyenkor a dúsítás végén a rajzás széléről kell továbboltani.

Biokémiai megerősítés

TSI ferde agar: Triple-sugar-iron agar10g laktóz, 10g szacharóz, 1g glükóz, Fe-citrát, Na-

tioszulfát, fenolvörös1. Glükóz bontás: (TSI)

savképzéssel +sav és gáz +

2. Laktózbontás: - , (TSI)Salmonella enterica subsp. arizonae: + vagy – laktózbontás

3. Szacharóz bontás: - (TSI)4. H2S termelés: +, (TSI)

Biokémiai megerősítés

RÖVID BIOKÉMIAI SOR1. Glükóz bontás: +2. Laktózbontás: általában - 3. Szacharóz bontás: - 4. H2S termelés: +

5. Karbamid bontás: -6. Indolképzés: -7. Lizin-dekarboxilálás: +8. Voges-Proskauer próba: -9. ONPG-reakció: általában -

TSI agar

– TSI alja sárga: glükóz pozitív– TSI teteje piros:

laktóz és szacharóz negatív– Fekete foltok a TSI

agarban:H2S-termelés

Biokémiai próbák

5. Ureáz-próba: (Karbamid bontás) - (karbamid leves, 37°C, 24-48 óra)értékelés: karbamid bontás esetén a felszabaduló NH3 a fenolvörös indikátor színét rózsaszínre, később lilára változtatja

Biokémiai próbák

6. Indolképzés: - (triptonvíz, 37°C, 16-24 óra, Kovács-reagens)értékelés: - sárga

Biokémiai próbák

7. Lizin-dekarboxilálás: + (lizin leves, 37°C, 20-24 óra)értékelés: + zavaros, bíborlila (brómkrezol-bíbor), (- : sárga lenne)

Biokémiai próbák

Karbamidbontás:

negatív

Lizin-dekarboxiláz:

pozitív

Biokémiai megerősítés

8. Voges-Proskauer próba: -, CH3 CH3

CH-OH 40%-os KOH C=OC=O α-naftol, kreatinin C=OCH3 CH3

acetoin diacetil (piros)

9. ONPG-reakció (o-nitrofenil β-D-

galaktopiranozid) : -

Laktóz bontás

Laktáz (β-galaktozidáz) enzim laktóz bontása

ONPG reakció

(0,25 ml fiz. só, toluol, ONPG korong, 37°C, pár perc)értékelés: - nincs színváltozás, (+: sárga lenne)Salmonella enterica subsp. arizonae: ONPG+

Szerológiai azonosítás

Önagglutináció kizárása: 1 csepp fiziológiás konyhasó oldat + kacsnyi törzs1 perc múlva nagyítóval vizsgáljuk az agglutinációt, – Ha pozitív: szerológiai azonosítás nem

lehetséges

Szerológiai azonosítás

O-antigén: anti-O szérum konyhasóoldatban (szomatikus antigén)

Vi-antigén: anti-Vi szérum konyhasóoldatban (fehérje jellegű burok-antigén, az egész baktériumot beburkolja)

H-antigén: anti-H szérum (H-flagellar),

Az eredmények értékelése

Biokémiai próbák

Ön-agglutináció

Szerológiai próbák

Eredmény

Jellemző - O-, Vi- vagy H-Ag pozitív

Salmonella

Jellemző - Mindegyik negatív

Feltehetően

Salmonella

Jellemző + Önagglutináció miatt nem alkalmas

vizsgálatra

Nem jellemző -/+ O-, Vi- vagy H-Ag pozitív

Nem jellemző -/+ Mindegyik negatív

Nem Salmonella

Pozitivitás esetén

Döntő szerológiai azonosítás: A Salmonella vagy feltehetően Salmonella törzseket megerősítésre vagy szerotípus meghatározásra a – Nemzeti Salmonella Központba (Országos

Epidemiológiai Központ) vagy a – Salmonella Referencia Központba (MGSZH)

kell küldeni.

Salmonella bakteriofág

Fág-tipizálás