Enterobaktériumok, Coliformok, E. coli, és Salmonella
kimutatása
3. gyakorlat
Indikátor mikrobák
Enterobacteriaceae család (bélbaktériumok)
Coliformok Escherichia coli
Salmonellák
Enterobaktériumok
Indikátor baktériumok, jelenlétük fekáliás szennyeződésre utal. Előfordulás: emberi és állati béltraktus, felszíni vizek, talajflóra
Jellemzőik:, Gr-, rövid pálcák, általában peritrich csillóval mozognak, fakultatív anaerobokoxidáz negatívakNO3→NO2-vé redukáljákglükózt bontják sav (esetleg gáz) termelés mellett
Enterobaktériumok kimutatása
Lemezöntés: VRBG-agar, (hagyományos lemezöntés + fedőréteg 4 ml)kristályibolya-neutrálvörös-epe-glükóz, 37oC, 24 óra
értékelés: 0,5 mm-nél nagyobb, ált. 2-3 mm-es, kerek, sötétvörös, csapadékkal körülvett (epesavas sók kicsapódnak, Na-dezoxikolát, Na-taurokolát) telepek
Folyékony: BBG-leves: brillantzöld-glükóz-epe leves, 37oC, 24 óra
értékelés: zavaros és kisárgul → VRBG agarra
VRBG
OXIDÁZ-próba
1%-os parafenilén-diamin-oldat negatív: sárgáspozitív: kékesPár másodperc - perc, A vas katalizálja! (üvegbottal, műanyag kaccsal végezhető)
Enterobaktériumok:Enterobaktériumok: negatívnegatív
FERMENTÁCIÓS próba
Szőlőcukros magas agar (egy telepet leszúrunk), 37 oC, 24 óra
pozitív: pozitív: sárgasárga, gázt termelEnterobaktériumok: az eredetileg
piros színű agar főleg az alján sárgul ki (fak. anaerob), és homogén (mert mozog a szúrási csatornából)
s
Szőlőcukros magasagar
KATALÁZ próba
1 kacsnyi telep + pár csepp 10%-os H2O2 tárgylemezen → +: pezseg
Enterobaktériumok: pozitívpozitív
Coliformok
Laktózt 30°C-on egyidejű sav és gáz termelés mellett bontják
EscherichiaEscherichia (E. coli), KlebsiellaKlebsiella (K. oxytoca),
CitrobacterCitrobacter (C. freundii), EnterobacterEnterobacter (E. aerogenes) nemzetség– Gr-, vaskos pálcák, – epét vagy epesót tartalmazó táptalajban 30°C
hőmérsékleten sav- és gázképződéssel bontják a laktózt,
– Többnyire a normál bélflóra tagjai, de van kivétel is (pl. E. aerogenes, amely soha nem fordul elő a bélben)
– Jelenlétük a friss fekáliás szennyeződést valószínűsíti
Klebsiella
Coliformok kimutatása
VRBL táptalaj (kristályibolya-neutrálvörös-laktóz-epe)– gátlóanyag: kristályibolya, Na-dezoxikolát– savtermelés → neutrálvörös → piros,
precipitációs udvar, min. 1 mm– 0,5 mm átmérőjű, sötétpiros (lilás-vörös)
telepekEndo agar
– gátlóanyag: Na-szulfit, fukszin– laktóz→savak, aldehidek→aldehid+fukszin-
szulfit → felszabadul a fukszin → vörös telepek (E. coli esetében ez olyan intenzív, hogy a fukszin
kikristályosodik → fémes zöld fukszin-fény)
VRB agar
Endo agar
Coliformok kimutatása
BBL leves (brillantzöld-laktóz-epe leves), Durham cső, 30°C, 24-48 óra, zavarosodás+1/10 gáz → Coliform gyanús
Laurilszulfát-laktóz-levesgátlóanyag: Na-lauril-szulfátDurham cső, 30°C, 48 óra → 1/10 gáz
X-leves (szintetikus táptalaj)ammóniumsó, laktóz, puffer, nyomelemek
Kromogén Coliform agarok
Escherichia coli
Csak a bélcsatornában él, jelenléte mindig friss fekáliás kontaminációt jelez (index mikroba)
Önmagában többnyire ártalmatlan, vagy hasznos, egyes törzsei kórokozók (pl. E.coli O157 H7)
Kimutatása során el kell különíteni a Coliformoktól
IMV(E)C próbák
Eijkman-próba: tenyészetből 1 kacsnyit BBL-levesbe → 44,5°C 48 óráig vízfürdőben inkubáljuk → gyanús: zavaros + 1/10 gáz Durham csőben
→ VRBL agar → nutritív agarra szélesztjük az E. coli gyanús piros 2 mm átmérőjű telepet, és ezekkel végezzük el az IMVEC próbákat
IMV(E)C próbák
Indolképzési próba: TRIPTONVÍZbe oltunk, 24 óra 44,5°C inkubáció
0,5 ml KOVÁCS-reagens (p-dimetil-amino-benzaldehid amil-alkoholos sósavval savanyított oldata)
1 perc: + felszínen meggypiros gyűrű
Triptofán + víz → piroszőlősav + indol → +KOVÁCS-reagens → ROZINDOL festék
IMV(E)C próbák
Metilvörös próba: PUFFEROLT GLÜKÓZLEVES, 24 óra 37°C inkubáció
1-2 csepp METILVÖRÖS reagens+: az egész leves színe élénkpiros–: az egész leves színe sárgaA kevertsavas, és a butándiolos erjesztést
végző baktériumokat különíti el egymástól (E.coli kevertsavas erjesztést végez)
IMV(E)C próbák
VP próba: PUFFEROLT GLÜKÓZLEVES, 24 óra, 37°C inkubáció0,2 ml 5%-os alkoholos naftol-oldat0,1 ml 40%-os KOH 2 csepp 0.5%-os kreatin-oldat
2 óra múlva+: tenyészet felső része piros A glükózt butándiolosan erjesztő
baktériumok kimutatására szolgál.
IMV(E)C próbák
VP-próbaGlükóz → acetil-metil karbinol
(acetoin) [ez a butándiolos erjedés egy köztes terméke]
↓ O2, KOH
diacetil
↓ +kreatin piros szín
IMV(E)C próbák
Citráthasznosítási próba: ALAPLEVES, 4-6 óra inkubáció, 37°C-on,
majd oltótűvel CITRÁTOS magas-ferde agarba szúrunk és a felületén is szélesztünk → 24-48 óra, 37°C inkubáció→
+: eredeti zöld KÉK-re vált -: eredeti zöld szín marad, nincs
baktérium-növekedés(Brómtimolkék pH=6,8-on zöld, pH=7,6-on
kék)
Az IMV(E)C próbák értékelése
Indol-képzés
Metilvörös-próba
Voges-Proskauer-
próba
Citrát-hasznosítá
s
ELBÍRÁLÁS
+ + - - Fekáltípusú E. coli
- + - - Atípusos E. coli
- + - + Citrobacter típusos
+ + - + Citrobacter atípusos
- - + + Klebsiella v. Enterobacter
+ - + + Enterobacter atípusos
β-D-glükuronidáz pozitív Escherichia coli kimutatása
β-D-glükuronidáz enzim kimutatása MUG-alMUG ( 4-metil-umbelliferil-D glükuronid): umbelliferil → β-D-glükuronidáz → umbelliferon
(fluoreszkál) β-D-glükuronidáz enzime csak az E. colinak van
(néhány Salmonella és Shigella törzstől eltekintve), a fluoreszcencia így nagy valószínűséggel E. coli jelenlétére utal. (E. coli O157:H7 nem képes ilyen enzimet termelni!)
E. coli MPN: laurilszulfát leves + MUG
β-glükuronidáz-pozitív E. coli számának meghatározása
Minta (10 g/ml) + peptonvíz (90 ml), hígítási sor
TBX (tripton-epe-glükuronid) agar lemezöntés (1 ml)
Inkubálás 44± 1 oC 18-24 óraPozitív telep: kék
További megerősítő vizsgálatok nem szükségesek!
Salmonella
– Enterobacteriaceae család– Gram -, nem spórás– Önálló mozgásra képes, peritrich csillós
kivétel: S. Gallinarum, S. Pullorum, S. Typhi– 1 faj (Salmonella enterica), a szerotípusokat így
írjuk: S. Enteritidis, S. Senftenberg, S. Typhimurium, S. Infantis, stb. (nagybetű, nem dőlt!!)
– Fakultatív anaerob– Laktózt nem bontja, de– Salmonella subgenus III (Arizona)-ba tartozó törzsek
laktóz +, ONPG +– Salmonella subgenus II-be tartozó törzsek között
laktóz -, ONPG +
Általános tulajdonságok
Növekedés: 7-49,5°C, optimum: 35-37°CpH=3,8-9,5, optimum pH=7-7,5
Ellenálló képesség:– Fagyasztástól nem pusztul el– Alacsony vízaktivitás mellett (pl.: csokoládé: aw=0,3-0,5)
sokáig (hónapokig) túlél, és megnő a hőtűrő-képessége– Az alacsony pH-t kevésbé bírja, mint az E. coli– D idők:
60°C-on 2-6 perc 70°C-on <1 perc (alacsony vízaktivitáson extrém hosszú túlélés: D-idő 70°C-on 1050
perc)
– 0,1% ecetsav (pH=5,1) jelenlétében a növekedése gátolt
Salmonellák kimutatása
A Bizottság 2073-2005/EK rendelete az élelmiszerek mikrobiológiai kritériumairól
Kimutatási protokoll: MSZ EN ISO 6579 szerintMintavétel:
– 25 g (vagy egyes esetekben 10 g) minta– 100 cm2 lemosásával vagy ismert mennyiségű
öblítőfolyadék
Minta előkészítése: homogenizálni, majd azonnal leoltani.Szükség esetén 0-5°C-on 1 órát lehet várakozni.
Tenyésztési protokoll: Elődúsítással kombinált dúsítás I.
25 g vizsgálati anyag + 225 ml előmelegített pufferolt peptonvíz
↓H O M O G É N E Z É S
↓18±2 óra 37±1°C (elődúsítás)
0,1 ml 1 ml↓ ↓
+10 ml RVS dúsító +10 ml MKTTn dúsító↓ ↓
24±3 óra 41,5±1°C 24±3 óra 37±1°C↓ ↓
Tenyésztési protokoll: Elődúsítással kombinált dúsítás II.
↓ ↓ ↓ ↓XLD Másik táptalaj XLD Másik táptalaj↓ ↓ ↓ ↓
24±3 óra 37±1°C 24±3 óra 37±1°C Jellemző telepek kiválasztása
↓ Kioltás nem szelektív tápagarra (24±3 óra 37±1°C)
Biokémiai próbák Szerológiai próbák
Dúsítók
RVS: Rappaport-Vassiliadis dúsító
Malachitzöld, Mg-klorid, NaCl, K-dihidrogén-foszfát, pH=5,2±0,2
MKTTn: Müller-Kauffmann-tetrationát-novobiocin
Na-tioszulfát, marhaepe, brillantzöld, lugol-oldat, CaCO3, novobiocin, pH=8,2±0,2
Régen használatban volt még:
Bierbrauer-féle leves: Na-tioszulfát, lugol-oldat, marhaepe, CaCO3, malachitzöld, brillantzöld
Szelenit-cisztin leves: Na-szelenit, laktóz
Szilárd táptalajok - XLD
XLD agar: Xilóz-lizin-dezoxikolát agarxilóz, laktóz, szacharóz (egyiket sem bontja!), L-lizin-hidroklorid, Na-tioszulfát, ammónium-vas(III)-citrát, Na-dezoxikolát (eredetileg vörös színű a táptalaj)– Xilóz, laktóz, szacharóz savvá bontása → sárga szín– H2S képződése → vas-szulfid → fekete szín– Lizin → kadaverin (dekarboxilálás) → telepek körül bíbor
szín (pH-változás)– Na-dezoxikolát: Proteus telepek rajzásának gátlása,
Gram+-okat gátoljaSalmonella: telepek színe azonos a táptalaj színével
(vöröses-bíbor), gyakran fekete középpel
XLD
Egyéb szilárd táptalajok
BPL agar: Brillantzöld-fenolvörös-laktóz agarlila, apró telepek, mivel pH nő (savra sárgulna)Brillantzöld gátolja a Gram+-okat, a S. Typhi-t és a Shigellákat
BPLS agar: Brillantzöld-fenolvörös-laktóz-szacharóz agarSem a laktózt, sem a szacharózt nem bontja, így liláspiros telepeket képez. A laktóz negatív, de szacharóz pozitív zavaró flórát lehet vele kiszűrni.
Drigalski agar: sötétkék telep, mert Salmonella laktózból nem termel savat, sőt fehérjebontás miatt a pH megemelkedik
Rambach agar: propilénglikol bontás, telep piros (savképzés - neutrálvörös indikátor), egyes estekben színtelen: S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Typhisuis, S. Gallinarum
SS agar: Salmonella-Shigella agarlaktóz, marhaepe, Na-tioszulfát, Na-citrát, ammónium-vas(III)-citrát, brillantzöld, neutrálvörösSzulfidképződés → fekete közepe lesz a telepeknekLaktózt nem bontja → vörös marad a táptalaj
BPLS
Az MSRV agar
MSRV agar: Modified Semi-solid Rappaport-Vassiliadis agar– A kimutatás a Salmonellák mozgékonyságán
alapul: a Salmonella-migráció a félfolyékony tápközegben opálos udvaros növekedést eredményez.
– Nagy háttérfertőzöttségű minták esetén (pl.: bélsár-minta, cloaca-tampon) a dúsítási folyamatban az RVS dúsító helyett használatos. Ilyenkor a dúsítás végén a rajzás széléről kell továbboltani.
Biokémiai megerősítés
TSI ferde agar: Triple-sugar-iron agar10g laktóz, 10g szacharóz, 1g glükóz, Fe-citrát, Na-
tioszulfát, fenolvörös1. Glükóz bontás: (TSI)
savképzéssel +sav és gáz +
2. Laktózbontás: - , (TSI)Salmonella enterica subsp. arizonae: + vagy – laktózbontás
3. Szacharóz bontás: - (TSI)4. H2S termelés: +, (TSI)
Biokémiai megerősítés
RÖVID BIOKÉMIAI SOR1. Glükóz bontás: +2. Laktózbontás: általában - 3. Szacharóz bontás: - 4. H2S termelés: +
5. Karbamid bontás: -6. Indolképzés: -7. Lizin-dekarboxilálás: +8. Voges-Proskauer próba: -9. ONPG-reakció: általában -
TSI agar
– TSI alja sárga: glükóz pozitív– TSI teteje piros:
laktóz és szacharóz negatív– Fekete foltok a TSI
agarban:H2S-termelés
Biokémiai próbák
5. Ureáz-próba: (Karbamid bontás) - (karbamid leves, 37°C, 24-48 óra)értékelés: karbamid bontás esetén a felszabaduló NH3 a fenolvörös indikátor színét rózsaszínre, később lilára változtatja
Biokémiai próbák
6. Indolképzés: - (triptonvíz, 37°C, 16-24 óra, Kovács-reagens)értékelés: - sárga
Biokémiai próbák
7. Lizin-dekarboxilálás: + (lizin leves, 37°C, 20-24 óra)értékelés: + zavaros, bíborlila (brómkrezol-bíbor), (- : sárga lenne)
Biokémiai próbák
Karbamidbontás:
negatív
Lizin-dekarboxiláz:
pozitív
Biokémiai megerősítés
8. Voges-Proskauer próba: -, CH3 CH3
CH-OH 40%-os KOH C=OC=O α-naftol, kreatinin C=OCH3 CH3
acetoin diacetil (piros)
9. ONPG-reakció (o-nitrofenil β-D-
galaktopiranozid) : -
Laktóz bontás
Laktáz (β-galaktozidáz) enzim laktóz bontása
ONPG reakció
(0,25 ml fiz. só, toluol, ONPG korong, 37°C, pár perc)értékelés: - nincs színváltozás, (+: sárga lenne)Salmonella enterica subsp. arizonae: ONPG+
Szerológiai azonosítás
Önagglutináció kizárása: 1 csepp fiziológiás konyhasó oldat + kacsnyi törzs1 perc múlva nagyítóval vizsgáljuk az agglutinációt, – Ha pozitív: szerológiai azonosítás nem
lehetséges
Szerológiai azonosítás
O-antigén: anti-O szérum konyhasóoldatban (szomatikus antigén)
Vi-antigén: anti-Vi szérum konyhasóoldatban (fehérje jellegű burok-antigén, az egész baktériumot beburkolja)
H-antigén: anti-H szérum (H-flagellar),
Az eredmények értékelése
Biokémiai próbák
Ön-agglutináció
Szerológiai próbák
Eredmény
Jellemző - O-, Vi- vagy H-Ag pozitív
Salmonella
Jellemző - Mindegyik negatív
Feltehetően
Salmonella
Jellemző + Önagglutináció miatt nem alkalmas
vizsgálatra
Nem jellemző -/+ O-, Vi- vagy H-Ag pozitív
Nem jellemző -/+ Mindegyik negatív
Nem Salmonella
Pozitivitás esetén
Döntő szerológiai azonosítás: A Salmonella vagy feltehetően Salmonella törzseket megerősítésre vagy szerotípus meghatározásra a – Nemzeti Salmonella Központba (Országos
Epidemiológiai Központ) vagy a – Salmonella Referencia Központba (MGSZH)
kell küldeni.
Salmonella bakteriofág
Fág-tipizálás