ASISTIRANA REPRODUKCIJA U VETERINARSKOJ MEDICINIDoc. dr. sc. Iva Getz

Studeni, 2009. S d i 2009

ASISTIRANA REPRODUKCIJAtermin u humanoj medicini

=

BIOTEHNOLOGIJA RASPLOIVANJAtermin u veterini

METODE BIOTEHNOLOGIJE RASPLOIVANJA (ART*): ( ) I generacija - UMJETNO OSJEMENJIVANJE II generacija EMBRIOTRANSFER III generacija PROIZVODNJA ZAMETAKA IN VITRO IV generacija MANIPULACIJA ZAMECIMA, KLONIRANJE, KLONIRANJE TRANSGENEZA*ART = Assisted Reproductive Technologies

ASISTIRANA HUMANA REPRODUKCIJA (POTPOMOGNUTA OPLODNJA):Tehnike u lijeenju neplodnosti (steriliteta): IUI - intrauterina inseminacija ITI - intratubarna inseminacija IVF - izvantjelesna oplodnja ISCI - intracitoplazmatsko injiciranje spermija GIFT povrat gameta u jajovode laparoskopskim postupkom Krioprezervacija smrzavanje/odmrzavanje jajnih stanica i zametaka

BIOTEHNOLOGIJA RASPLOIVANJA GENETSKO POBOLJANJEIMBENICI: 1. Genetska varijacija (varijabilnost) j 2. Preciznost u selekciji 3. Intenzitet selekcije 4 Generacijiski interval 4. Inbreeding (srodstvo)

Biotehnoloka metoda I generacije I. generacije UMJETNO OSJEMENJIVANJE uinkovito

poboljanje intenziteta i preciznosti selekcije koritenjem sjemena progeno testiranih bikova; poveanje efikasnosti proizvodnje mlijeka i mesa; j fik i i d j lij k spreavanje irenja zaraznih bolesti; meunarodna trgovina kvalitetnim genetskim materijalom.

Biotehnoloka metoda II generacije II. generacije EMBRIOTRANSFER (MOET)EMBRIOTRANSFER = biotehnoloki postupak kojim se genetski kvalitetnim davateljicama u ranom graviditetu ispiru zametci iz maternice koji se zatim prenaaju u maternicu istovrsne primateljice kako bi nastavili intrauterini razvoj razvoj.

Ciljevi MOET-a MOET-

irenje genoma najkvalitetnih plotkinja j g j p j Zamrzavanje zametaka - meunarodni promet i trgovina zamecima, uvoz genetike Veterinarsko sanitarna kontrola - spreavanje irenja zaraznih bolesti Dobivanje potomstva od sekundarno jalovih krava Primjena drugih biotehnolokih postupaka poput cijepanja i seksiranja zametaka j p j j Ouvanje autohtonih i ugroenih pasmina

Povijest embriotransfera1891. Prvi uspjean embriotransfer u kunia 1933. 1933 Roenje takora nakon embriotransfera 1949. Roenje prvog janjeta i jareta nakon embriotransfera 1951. 1951 Roenje prvog praia nakon embriotransfera 1951. Roenje prvog teleta nakon embriotransfera 1973. 1973 Roenje prvog teleta nakon transfera duboko smrznutog zametka

Povijest embriotransfera u RHMeunarodni projekt: M M d i j kt Mogunost prijenosa viroza u t ij i svinja embriotransferom 1985./86. glavnog istraivaa prof dr sc Miroslava Heraka prof. dr. sc. Projekt Ministarstva znanosti i tehnologije "Embriotransfer u krava" (1992.-1996.) glavnog Embriotransfer krava (1992. 1996.) istraivaa prof. dr. sc. Zdenka Makeka utemeljen Laboratorij za asistiranu reprodukciju rujan 1995. - prvo ET tele u Republici Hrvatskoj Projekt MZT In vitro oplodnja u goveda" (1997.- ) glavnog istraivaa prof. dr. sc. Zdenka Makeka svibanj 2001. prvo IVP tele u Hrvatskoj

Biotehnoloka metoda II. generacije generacije EMBRIOTRANSFER (MOET)Multipla ovulacija i embriotransfer: Izbor davateljica i primateljica Superovulaciju davateljica (PMSG, FSH) U.O. davateljica Ispiranje I i j maternice d i davateljica lji (poluivanje zametaka) 6. Ili 7. dana nakon U O U.O. Transfer svjeih ili DS zametaka u sinkronizirane primateljice

Izbor krava davateljica2 osnovna kriterija: Genetika Sposobnost proizvodnje velikog broja zametaka

Izbor krava davateljica Uzgojne vrijednosti davateljice:

Proizvodni rezultati davateljica i njenih potomaka (% odbijene teladi, mlijenost, prirast) Kondicija i eksterijer Podrijetlo i nasljedstvo Eventualo prethodna povijest uspjeha u embriotransferu

Izbor krava davateljica Reprodukcijske vrijednosti davateljica:

Optimalna reprodukcijska dob (3-8 godina) Visok stupanj plodnosti Uredni ciklusi Normalno teljenje Uredan puerperij Zdravi Zd i spolni organi l i i Dobro razvijeno vime

Izbor krava i junica primateljica1 davateljica : 7 primateljica, odnosno 2 : 10 ( (direktni ET) Junice ili mlade krave s besprijekornom plodnou koje plodnou, ne moraju biti uzgojno vrijedne, ali: g j j - dobrog zdravlja i kondicije - zdravih spolnih organa (pratiti najmanje 1 spolni ciklus) - dobre mljenosti - moraju koncipirati brzo i lagano - poslije t l j normalno ui u ciklus lij telenja l i ikl

Izbor krava i junica primateljicaPrednosti junica primateljica: d t dostupnije i j fti ij ij jeftinije bolje odgovaraju na postupak sinkronizacije nema puerperalnih infekcija afunkcija jajnika i infekcija,

drugo

Mane junica primateljica: tea telenja gubitak teladi neprohodnost cerviksa (10 do 15%) sindom velikog teleta kod IVP zametaka g

Sinkronizacija primateljicaTransfer u spontanom estrusu Sinkronizacija s PGF Sinkronizacija s gestagenima (implantati, PRID, CIDR) ) Ovsync (GnRH PGF GnRH)

Menagement krava i junica primateljicaOtkrivanje estrusa embriotransfera bi t f osnovni korak za uspjenost

PALJIVO, SAVJESNO PALJIVO SAVJESNO, TONO!!! Sinkronizacija davateljica i primateljica ( 1 d ) Si k i ij d lji i lji (1 dan) Optimalni rezultati kada su primateljice u estrusu neto prije davateljica

Superovulacija davateljicaStimulacija jajnika Sti l ij j j ik gonadotropnim h d t i horminima i i dovode do rasta vie folikula i multiple ovulacije Zapoinje izmeu 9. i 12. dana ciklusa - kontrola C.L.!!! PMSG preparati jednokratna primjena uz aplikaciju PGF2 nakon 48 sati Purificirani ekstrakti hipofize svinja (FSHp) ili ovaca (FSHo) dva puta dnevno tijekom 4 do 5 dana uz aplikaciju PGF2 48 sati nakon prve aplikacije FSH

Sinkronizacija i superovulacija davateljicaProtokoli: razni, s razliitim hormonima, razlike izmeu pasmina te kategorija ivotinja

Hormoni: Prostaglandin, FSH/LH, GnRH Umjetno osjemenivanje: sjeme vrhunskih bikova dvokratno u maternicu

U.O. davateljicaviekratno (2 ili 3) u induciranom estrusu 12 i 24 sata nakon poetka estrusa sjeme kvalitetnih bikova visoke plodnosti kontrola kvalitete sjemena prije U.O. davateljica Polaganje sjemena (2 doze) u svaki rog poveava g p postotak koncepcije presudno iskustvo

Superovulacija davateljica s FSH

Superovulacija davateljica s PMSG

Rezultati MOET-a MOET

broj folikula / broj C.L. superovulacija: 10 do 20 C.L. 5 do 6 zametaka po kravi davateljici po ispiranju 40 do 50% neoploenih jajnih stanica p j j Postotak breosti nakon transfera svjeih zametaka iznosi 61%, a zamrznutih 50 do 60%

Superovulacija d S l ij davateljica t lji imbenik uspjenosti ET

-

glavni l i

ograniavajui i j i

Folikuli - estrus

Multipla C.L. 7. dan

Jajnik krave davateljice 3. dan superovulacije s FSH. Uoava se 5 folikula promjera 6 do 9 mm (F), nekoliko manjih te centralno smjeteno uto tijelo (CL).

Jajnik krave davateljice superovulacije s FSH FSH.

4.

dan

imbenici koji utjeu na uspjeh superovulacije:Dob Pasmina Kondicija Hranidba ne smije se mijenjati min 4 tj. prije ispiranja Dranje Laktacija Godinje doba Prisustvo DF na jajnicima prije zapoinjanja superovulacije Genetika G tik Stres

Ispiranje davateljica u ET postupku6. 8. 6 do 8 dan nakon induciranog estrusa

Ispiranje davateljica u ET postupkuNekirurko ispiranje rogova maternice Ocjena broja i kvalitete C.L. j j Epiduralna anestezija (5 ml 2% lidokaina) Pranje i dezinfekcija stidnice (70% alkohol) Sterilni dilatator za cerviks Foley kateter (18 do 24G) s mandrenom Sanitarna navlaka Boca s medijem zagrijana na tjelesnu temperaturu

Ispiranje davateljica u ET postupku

Ispiranje davateljica u ET postupku

Izolacija zametakaSistem bez filtera: Ispirak iz maternice sakuplja se u sterilne 2 litrene boce 2-litrene Sedimentacija kroz 20 minuta Odbacivanje sadraja osim doljnjih 150 ml u drugu bocu Prebacivanje doljnjih 150 ml u petrijeve zdjelice za pretraivanje Ispiranje boce dvokratno s 20 ml medija zbog eventualno zaostalih zametaka Boca s odbaenim i i k B db i ispirkom se zatiti od oneienja i titi d i j svijetla

Izolacija zametakaSistem s filterom promjera pora 75 m: Ispirak maternice prolazi kroz sistem sa filterom Zametci ostaju unutar filtera, ispirak se sakuplja u bocu radi eventualnog kasnijeg pretraivanja 1 cm medija t b stalno biti prisutan u filt dij treba t l i t filteru k k bi kako sprijeili dehidraciju Sad aj Sadraj iz filtera se p ebacuje u pe je u zdjelicu za ea prebacuje petrijevu dje cu a pretraivanje Filter se viekratno ispere zbog eventualno zaostalih zametaka Boca s odbaenim ispirkom se zati od oneienja i svijetla

Izolacija zametakaIspirak se pretrauje u pravokutnim petrijevim zdjelicama pod poveanjem 10-16x

Uvjeti dranja zametaka in vitroPreivljavanje zametka i vitro ovisi o uvjetima k ji ga P i lj j tk in it i i j ti koji okruuju: Medij Temperatura Izloenost svijetlu Zametke moemo pohraniti u p p prikladnim medijima na j temperaturi od 18-37C do 12 sati Danje svijetlo nije tetno ako je izloenost zametka do pola sata t

Uvjeti dranja zametaka in vitroMedij za odravanje zametaka (holding medium HM) Ispiru se deset puta u HM Za kratki period uzgoja zametaka hranjive vrijednosti medija nisu od velike vanosti, za razliku od: pH Osmolarnosti Temperature Sterilnosti Netoksinosti

Uvjeti dranja zametaka in vitroPosueZametci se pohranjuju u male, sterilne, prozirne, zatvorene posude poput petrijevki, posuda s 4 plitice, epruveta malog volumena ( 50% Promjer zametka raste a ZP postaje tanja ZP je pukla a zametak je djelomino ili pukla, potpuno izlegnut

Evaluacija zametakaPri klasifikaciji biljeimo slijedee parametre:Starost Broj stanica Kompaktnost p Razlike u veliini stanica Boja citoplazme Broj izbaenih blastomera j Veliina perivitelinog prostra Stadij embrionalnog razvoja Retardacija

Evaluacija zametakaPrema stupnju kvalitete zametci se klasificiraju u ti i k t etiri kategorije (IETS 1993.): ij (IETS, 1993 )

Stupanj 1: Zametci izvrsne ili dobre kvalitete Stupanj 2: Zametci osrednje kvalitete Stupanj 3: Zametci loe kvalitete Stupanj 4 M t i ili d St j 4: Mrtvi degenerirani zametci i i t i

Evaluacija zametaka

Evaluacija zametaka

Evaluacija zametaka

Evaluacija zametaka E l ij t k

Krioprezervacija zametaka Ki ij t kDananji protokoli omoguuju gotovo isti postotak gravidnosti (70 80% nii) kao kod transfera svijeih (70-80% zametaka Zamrzavaju se samo zametci izvrsne i dobre kvalitete Smrzavanje u roku 3-4 sata od ispiranja 34 Prije smrzavanja potrebna je ekvilibracija zametka u otopini kriopreotektora : glicerol ili etilen glikol

Otapanje zametakaVaenje pajete iz tekueg duika Otapanje: 0.5 cc: 20 sek na zraku + 20 sek u vodi 37 C 0.25 cc: 15 sek na zraku + 15 sek u vodi 37 C Rezanje pajete Isputanje sadraja u petrijevu zdjelicu Izolacija zametka

Transfer zametaka u primateljiceIpsilateralni rog maternice: Kirurki transfer Laparoskopski tranfer Nekirurki transfer

Nekirurki transfer zametaka u N ki ki t f t k primateljiceEmbriotransfer odmrznutih zametaka neposredno nakon otapanja Ne smije se istodobno otopiti otapanja. nekoliko pajeta. Po jednoj davateljici transferira se samo jedan zametak. Sprijeiti traume endometrija. Stojnice, onemoguavanje naglih pokreta ivotinje te mirna i lagana manipulacija su jako vane u g p j j spreavanju ozljeda kod ET.

Nekirurki transfer zametaka u primateljiceKontrola kvalitete C.L. Epiduralna anestezija ET pistolet s p p plastinom navlakom

Laparoskopski embriotransfer u kouta p p (Cervus elaphus)Anestezija: ksilazin + zolazepam, tiletamin Insuflacija CO2: 10 mm Hg, 6-8 l Wolfov laparoskop 10 mm, 0 o o apa os op 0 , Allisov forceps Duboko smrznuti/odmrznuti zameci Transfer 7. dana nakon induciranog estrusa

Meunarodno D t za E b i t M d Drutvo Embriotransfer f (IETS = International Embryo Transfer Society) Society)

Donosi propise vezane uz sanitarnu kontrolu proizvodnje zametaka da bi se smanjio rizik mogueg prijenosa zaraznih bolesti Manual of the International Embryo Transfer Society

Veterinarsko - sanitarna kontrolaNeophodna u prevenciji irenja zaraznih bolesti ET Obuhvaa: Ob h Ocjena i praenje sanitarnog statusa davateljica Sanitarni uvjeti tijekom ispiranja (zasebna sterila oprema,aseptian rad, sterilno laboratorijsko posue) Sanitarna kontrola medija Viekratno ispiranje zametaka (PBS+antibiotik+0.4% BSA) + ispiranje tripsinom Rizik prijenosa zaraznih bolesti embriotransferom manji je nego prirodnim pripustom ili U.O. ako se slijede p op sa postupc sa ta e o t o e (St g e o , 985 ) propisani postupci sanitarne kontrole (Stringfellow,1985.)

Oekivani rezultati MOET-a MOETMOET-om moe se dobiti u prosjeku 5 kvalitetnih zametka po zahvatu. Postupak se moe primjeniti na i t j i ti ji 3 4 puta P t k i j iti istoj ivotinji 3-4 t godinje. Tijekom jedne godine moemo dobiti 15 20 zametaka po 15-20 kravi. Postotak breosti je 50-70 % embriotransferom svjeih zametaka. Postotak breosti je 40-60 % sa zamrznutim zamecima. 40 60 Po davateljici moemo oekivati 7-12 teladi godinje.

Oekivani rezultatiIsta I t se d davateljica moe svaki put oploditi sa razliitim t lji ki t l diti liiti bikom - poveanje genetske raznolikosti. Primjena ET zamrznutih zametaka u "direktnom direktnom postupku", bez otapanja, daje 40-50% breosti. Telad dobivena u potpunosti je morfoloki i fizioloki jednako razvijena kao i telad dobivena prirodnim p p pripustom ili U.O. Omjer spolova je 1:1. Gubici (pobaaj) su oko 11%, a perinatalna smrtnost je (p j) , p j oko 9%.

Statistiki podatci o aktivnosti ET u EuropiU 2006. ukupno je isprano 15 859 davateljica Prosjek: 5.93 zametka/davateljici U 2007. ukupno je isprano 18 287 davateljica Prosjek: 5.79 j zametka/davateljici

Statistiki podatci o aktivnosti ET u EuropiU 2006. ukupno je transferirano 96 626 zametaka (58% smrznutih) U 2007. ukupno je transferirano 97 292 zametka (49 936 svijeih/ 47 329 smrznutih)

Biotehnoloka metoda III. generacije generacije j PROIZVODNJA ZAMETAKA IN VITRO:A. B. C. C D. E. F.

Poluivanje nezrelih j j j jajanih stanica Ocjena i kategorizacija jajanih stanica Dozrijevanje in vitro (IVM) Oplodnja in vitro (IVF) Uzgoj zametaka in vitro (IVC) Transfer zametaka

A. Poluivanje nezrelih jajanih stanica A (KOK = kumulus-oocita kompleks) kumulusIz klaonikog materijala: jajnici junica ili krava:

Iz ivih ivotinja:

Aspiracijom folikula promjera 3 do 8 mm (periferni folikuli)

Laparoskopskom folikula

punkcijom

Transvaginalnom ultrazvunom punkcijom jajnika (OPU = ovum pick-up) superovuliranih ili krava u ciklusu

TRANSVAGINALNA ULTRAZVUNA ASPIRACIJA JAJNIKA (OPU = Ovum Pick-Up) Pick mogunosti primjeneAlternativa klasinom MOET-u; ; Viekratno ponavljanje OPU/IVF kod davateljica razliitog fiziolokog statusa; Stimulirane (PMSG, FSH, IGF, BST) ili nestimulirane davateljice u ciklusu Dobivanje potomstva od sekundarno jalovih, genetski vrijednih plotkinja;

Stimulacija jajnika krava davateljica za OPU/IVF FSH skupina (n=8):

ESTRUS09,00 h 21,00 h gin. pregled vaenje krvi 0. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

OPU 1

OPU 2

OPU 3

OPU 4

FSH

FSH

FSH

FSH

9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34.

Stimulacija jajnika krava davateljica za OPU/IVF DFDF-/FSH skupina (n=8): (n=8):

09,00 21,00 gin. pregled vaenje krvi

ESTRU US

OPU 2 U

OPU 3 U

OPU 1 U

OPU 4 U

0. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55

DF F FSH

DF F FSH

DF F FSH

DF F FSH

Transvaginalna ultrazvuna punkcija jajnika (OPU = ovum pick-up) pick

Oprema za OPU: Ultrazvuni aparat sa sektorskom sondom (5/7,5 MHz) Uvaa igle za punkciju (Terumo 18 G) Vakuum pumpa Shematski prikaz tehnike transvaginalne ultrazvune punkcije jajnika.

B. Morfoloka j B Morfolok ocjena i k t M f l ka kategorizacija i ij jajanih stanicaNajvei razvojni kapacitet za IVM/IVF/IVC postupak imaju jajane stanice iz folikula >2 mm s homogenom ooplazmom potpuno okruene s vie p p slojeva kompaktnih kumulusnih stanica (Makek (M k k i sur, 1998 ) 1998.)

C. Dozrijevanje j j ih stanica i vitro C D ij j jajanih t i in it (IVM = in vitro maturacija)

TCM 199 (Tissue Culture Medium) uz dodatak fetalnog goveeg seruma (FCS) ili seruma krava u estrusu (ECS) te gonadotropnih (FHS/LH) i/ili steriodnih hormona (E217) 17). Inkubacija: 24 sati, 39oC, 5% CO2

Uspjeh maturacije mjeri se postotkom jajanih stanica koje su dostigle metafazu II (M II) - izbaeno prvo polarno tjelece (P) u perivitelinom prostoru (PS); - prosjeno iznosi 85% i vie.

D. Oplodnja in vitro (IVF = in vitro fertilizacija)METODE PRIPREME SJEMENA U IVF POSTUPKU: Centrifugiranje na gradijentu Percolla (Parrish i sur., 1995.) Selekcija pokretljivih spermija aktivnom migracijom u mediju - Swim-up postupak (Parrish i sur., 1984.) Ispiranje i Centrifugiranje u sp TALP mediju bez kalcija sp-TALP (Shamsuddin i sur., 1993.)

Koinkubacija jajnih t i K i k b ij j j ih stanica i spermija: 24 d 48 sati ovisno o ij do ti i metodi uzgoja na 39oC i 5% CO2

ODREIVANJE USPJEHA OPLODNJE IN VITRO JAJANIH STANICA GOVEDA

Nalaz mukog pronukleusa; kl

i

enskog

Nalaz zametaka koji su dostigli razvoj od 4 i vie stanica.

E. Uzgoj zametaka in vitro (IVC = in vitro kultura)Oploene jajane stanice uzgajaju se in vitro do stadija blastociste, kada takvi zameci mogu biti presaeni u primateljice ili smrznuti i pohranjeni u tekuem duiku. Primjenjuju se dvije metode uzgoja in vitro: ko-kultura zametaka s razliitim somatskim stanicama: kumulusnim sta ca a, ep te stanicama, epitelnim stanicama goveeg jajovoda (BOEC = bovine sta ca a go eeg jajo oda ( O C bo e oviduct epithelial cells), trofoblastinim vezikulima; uzgoj u d fi i i medijima (CZB SOF KSOM) - omoguuje b lj j definiranim diji (CZB, SOF, j bolju sanitarnu kontrolu, kao i bolju kontrolu uvjeta uzgoja.

ODREIVANJE EMBRIONALNOG RAZVOJA I USPJEHA UZGOJA IN VITRO GOVEIH ZAMETAKA Uinkovitost metode uzgoja zametaka in vitro ocijenjuje se na osnovi: postotka morula i blastocista uzgojenih do 7 og dana; 7-og morfolokom ocjenom i kategorizacijom morula i blastocista (Prirunik IETS, 1998); odreivanjem broja stanica zametka; ocjenom preivljavanja poslije dubokog smrzavanja zametaka; brojem oteljene IVP teladi.

Govei zameci uzgojeni in vitro (10. dan) u definiranom SOFaaBSA mediju

IVP goveih zametaka: mogunosti primjene(prema Van Soomu i de Kruifu, 1996) EKONOMSKI ASPEKTI: transfer IVP zametaka teladi mesnih pasmina u primateljice mlijenih pasmina; dobivanje gameta od genetski elitnih ivotinja koje su postale jalove; OPU krava k eminentnog i t pedigrea; koritenje j j j jajanih stanica juvenilnih ivotinja (znaajno smanjene generacijskog intervala); sprijeavanje prijenosa bolesti. BIOTEHNOLOKE MOGUNOSTI: cijepanje zametaka kloniranje transgene ivotinje odreivanje spola zametaka (PCR = Polymerase Chain Reaction) duboko smrzavanje IVP zametaka

Mogunosti primjene OPU tehnike: Alternativa klasinom MOET-u (do 100 zametaka godinje po davateljici) Vie teladi od iste davateljice i razliitih bikova (smanjivanje inbreedinga) Jajne stanice gravidnih junica i krava te krava u puerperiju Dobivanje potomstva od sekundarno jalovih, genetski vrijednih p j plotkinja j Jajne stanice od enske teladi prije puberteta

IV Generacija biotehnologije: Kloniranje i Transgeneza Mikromanipulacija zamecima Cijepanje zametaka Prijenos jezgre Seksiranje sperme Seksiranje zametaka

KloniranjeTehnika nuklearne transplantacije koja ukljuuje: Enukleaciju jajnih stanica (aspiracija polarnog tijela i dijela ooplazme) Transfer blastomera Fuziju stanice (elektrofuzija) Aktivaciju jajne stanice Predimplantacijski razvoj p j j zametka in vitro i transfer.

TransgenezaUvoenje transgena u zametke prije implantacije pronuklearnim mikroubrizgavnjem s ciljem da se direktno djeluje na genetsku modifikaciju ivotinja. Primjena: Ksenotransplantacija Proizvodnja ivotinja rezistentnih na odreene bolesti ivotinje posebnih proizvodnih svojstava (proizvodnja laktoalbumina, humanih rekombinantnih bjelanevina)

Seksiranje sperme p j p protonom citometrijom (Flow-cytometry) (FlowMjerenjem sadraja DNA na osnovi intenziteta fluorescentne emisije nakon bojenja DNAspecifinim fluorescentnim bojama: 6x106 seksiranih spermija na sat 90% tonost Primjena: umjetno osjemenjivanje in vitro oplodnja (IVF) Krioprezervacija p j ICSI (intracitoplazmatska injekcija

spermija)Cijena seksiranja: US$ 30,00 po dozi od 6x106

EVOLUTION OF BOVINE ET/IVF ACTIVITY IN EUROPE ET/IVF

(s.Merton, AETE Proccedings) Merton, Proccedings)Embryo production In vivo In vitro Total % of in vitro Embryo transfer In vivo In vitro Total % Of in vitro % of frozen Transfer

Year 1997 145 032 11 443 156 475 7.3% Year 1997 110 802 7 748 118 550 6.5% 53%

Year 2000 125 005 26 520 151 525 Year 2000 105 964 13 803 119 769 11.52% 55%

Year 2005 96 581 18 597 115 178 Year 2005 85 007 5 816 93 034 6.3% 56.8%

Year 2008 88 858 7 832 96 690 Year 2008 89 438 5 601 101 149 5.5% 56.4%

EMBROTRANSFER ACTIVITIES IN OTHER SPECIES IN EUROPE (S. Merton, AETE Proccedings) Merton, Proccedings)Embryo production Sheep Swine Goat Horse Embryo transfer Sheep Swine Goat Horse

Year 1999 6 744 3 995 303 222 6 330 534 176 194

Year 2000 847 816 243 563 440 619 145 226

Year 2005 83 271 160 509 61 192 76 711 (47 IVP)

Year 2008 419 736 83 1043 375 28 75 1014 (48 IVP)

Laboratorij za asistiranu reprodukciju

SVEUILITE U ZAGREBU VETERINARSKI FAKULTET U ZAGREBU