ELVÁLASZTÁS TECHNIKALabor beszámolóM2 csoport

Bartus ZsuzsannaFodor MelindaMahunka MariettaMarosi DóraNémeth ViktóriaSzabados ÁdámSzabó DávidTakács MónikaTroczkis Fruzsina

HS-GC-MS

HS-GC-MS

Gőztéranalizátor (headspace) – mintaadagolás Gázkromatográf – elválasztás Tömegspektrométer - detektálás

PerkinElmer HS-GC-MS

GŐZTÉRANALIZÁTOR (HS) - MINTATARTÓ

•Minta (folyadék, szilárd)- és Gázfázis közt egyensúly alakul ki

•Az egyensúly eltolódását a gőztér hőmérséklet változtatásával (termosztálás) tudjuk befolyásolni

•Egyensúly beállta után véges térfogatot bocsájtunk a gázkromatográfba

KIEGYENSÚLYOZOTT NYOMÁSÚ MINTAADAGOLÁS (BALANCED PRESSURE)

• d=0,2-0,3 mm, kicsi holttértfogat, elhanyagolható zónaszélesítő hatás

• Minta térfogat nagysága a ∆p-től és adagolási időtől függ• Zárt, minden részében jól termosztált rendszer• Paraméterek könnyen kontrolálhatók, jól reprodukálható mérések

GŐZTÉRANALIZÁTOR – BEÁLLÍTANDÓ PARAMÉTEREK ÉS FŐBB HATÁSAIK Gőztér hőmérséklete (max 400°C):

megoszlási hányados Termosztálási idő: megoszlási hányados Tű hőmérséklet: kondenzálás Átvezető cső hőmérséklete: kondenzálás Nyomás alá helyezés ideje: mintatérfogat,

kapilláris Injektálási idő: mintatérfogat

GÁZKROMATOGRÁFIA Kromatográfia: fizika-kémiai elválasztási módszer,

ahol az elválasztandó alkotók 2 fázis közt – álló és mozgó – oszlanak meg a különböző mértékű kötődéseik szerint

Gázkromatográfia: gáz halmazállapotú mozgófázis Kolonna töltete/belső bevonata lehet az állófázis Gázok és gőz halmazállapotúra hozható

folyadékok vizsgálatára alkalmas Az elválasztás nagyszámú szorpciós-deszorpciós

lépésen keresztül történik Az elválasztás függ a vivő gáztól (Hidrogén,

Nitrogén, Hélium) MS-nél Héliumot alkalmaznak a nagy ionizációs

energiája miatt

GÁZKROMATOGRÁFIA• Két kolonna típus:

– töltött kolonna: töltet lehet szilikagél, aktív szén, diatómaföld…stb., 2-4 mm belső átmérő, 0,3-3 m hossz

– kapilláris kolonna: belső folyadék film bevonat lehet metil-szilikon olaj, fenil-metil-szilikon olaj…stb., 0,10-0,53 mm belső átmérő, 15-75 m hossz

• Elválasztás befolyásolása:– Termosztáló hőmérséklet– Hőmérséklet egyenletes, lineáris változtatása– Állófázis változtatása

TÖMEGSPEKTROSZKÓP• Mérés elve: ionos részecskéket választunk el

fajlagos tömegük (töltésegységre eső tömegük: m/z) szerint csökkentett nyomáson elektromos vagy mágneses mezők segítségével

• Mérjük az elválasztott ionok intenzitását• Tömegspektrum (ujjlenyomat)• Minőségi információ: legintenzívebb ion

intenzitásra normált karakterisztikus tömegspektrum

LEGFONTOSABB KÉSZÜLÉKELEMEK Mintabeviteli rendszerek (GC-MS) Ionforrás Analizátor Detektor Számítógép Vákuumrendszer Energiaellátó elektromos egységek

MS DETEKTOR

IM

minta

R

TMSz

++-

-V (egyenfeszültség)o

TMSzIM

:: ionsokszorozó detektor

turbomolekuláris szivattyúR : olajrotációs (elõvákuum) szivattyú

I A

I: elektronütközéses ionforrás10-6 -810- kPa

A: analizátor

=Vo oV+ sin toVV +

U

V: váltófeszültség

,vagy diffúziós szivattyú

kvadrupól rudak

ELŐNYÖK összetett elegyek minőségi és mennyiségi

elemzése rövid idő alatt (20-30 perc) elvégezhető, s igen kis mennyiségű alkotók (10-15-10-21 g) meghatározása lehetséges

Minőségi,szerkezeti információ (hogyan?): Referencia anyagot kell használni a mérés során kapott tömegspektrum és

ismert vegyületek, ismert tömegspektrumainak az összehasonlítása,

a mérés során kapott tömegspektrum "megfejtése", ismert szabályok alapján történő értelmezése

SCANFUNKCIÓK• Pásztázó:

– az egész m/z tartományra történő ionintenzitás mérés– A különböző m/z pontoknál mért intenzitások

egymáshoz való arányát is lehet látni → minőségi információ

– Dinamikus üzemmód,pillanatnyi ionáramot mér,nagyobb hibával jár

• SID:– Különböző, kevés m/z pontokban történő ionintenzitás

mérés– Legalább 2 pontban kell mérni– Az adott mérések csak pár m/z pontra korlátozódnak,

így a kérdéses ionokról sokkal pontosabb mérési eredményeket kapunk → mennyiségi információ

– Kimutatási határ 1 nagyságrenddel jobb

FID (LÁNGIONIZÁCIÓS DETEKTOR)

kb. 2000-2500 K hőmérsékletű hidrogén-levegő láng

A lángban a C-H kötéseket tartalmazó molekulák, azaz a szerves vegyületek (pl szerves savak) fragmentálódnak és egy részük ionizálódik

Láng fölé helyezett elektródpár között gyenge áram folyik ionok képződésének hatására jel (feszültséget mér)(mintakomponens koncentrációjával arányos)

Standardek használata

HS-GC MÉRÉSGYAKORLAT Mérés célja:

Melaszban lévő karbonsavak vizsgálata. Vizsgált minták:

C2, V2 Felhasznált vegyszerek:

85%-os foszforsav, NaCl (Merck, Darmstadt), több komponensű kereskedelmi standard (minden komponens 10 mmol/l)

GŐZTÉRANALIZÁTOR (HS) PARAMÉTEREI Minta hőmérséklete: 60 °C Tű hőmérséklete: 100 °C Átvezető cső hőmérséklete: 150 °C Termosztálási idő: 10 perc Nyomás alá helyezés ideje: 2 perc Injektálási idő: 0,05 perc Tű visszahúzás ideje: 0,5 min

GÁZKROMATOGRÁFIÁS KÉSZÜLÉK ADATAI Készülék: Perkin Elmer AutoSystem XL Detektor: FID Vivőgáz: N2, 110 kPa Adagoló: Perkin Elmer Headspace

Sampler HS 40 Kolonna: VOCOL 60m x 0,53 mm x 3

μm Hőmérsékletprogram: 50 °C – ról 200 °C – ig 7 °C/perc sebességgel

A STANDARDEK ÉS A MINTÁK ELŐKÉSZÍTÉSE Légmentesen záródó 20 ml-es üvegedénybe bemértünk 2g NaCl-ot (kisózás), majd 1 ml

foszforsavat adtunk hozzá. Erre mértük rá automata pipettával a

standard/minta 1 ml-es részletét. Közvetlenül ezután az edényt gyorsan légmentesen lezártuk.

STANDARD KROMATOGRAMJA

C2-ES MINTA KROMATOGRAMJA

V2-ES MINTA KROMATOGRAMJA

MÉRÉSI EREDMÉNYEK

A C2-es mintában azonosított komponensek:propionsav, izovajsav, izovaleriánsav, izokapronsav, kapronsav

A V2-es mintában azonosított komponensek:propionsav, izovajsav, vajsav, izovaleriánsav

GYORSLC

KROMATOGRÁFIA ÁLTALÁNOSAN Többfokozatú, nagyhatékonyságú, dinamikus

elválasztási módszerek gyűjtőneve.

Közös elem: az elválasztandó komponensek az egymással érintkező két fázis között oszlanak meg, ezek közül az egyik áll, a másik pedig meghatározott irányba halad.

UHPLC (UPLC) HPLC

8x, 10x gyorsabb p›1200-1300 bar Dp‹2-3 µm; héjszerű

szemcse L= 3-10 cm; 2-3 mm 0,1-0,5 µl minta térf. UV-VIS

p<400 bar Dp= 3-10 µm, porózus,

nem porózus L= 15-25 cm; 3-8mm 5-200 µl UV-VIS

ALAPÖSSZEFÜGGÉSEK A KOLONNÁN KÍVÜLI ZÓNASZÉLESEDÉSRE OPTIMÁLT GYORS LC ÉS HPLC MÓDSZEREKNÉL

Kis szemcseátmérő

Kis térfogat (kisebb holttérfogat, kisebb komponens hígulás)

Elemzési idő csökk.: L csökk., u növelése (k nem- interferencia veszély) meg kell növelni p-t (Darcy)

Szemcse sérülése (UHPLC nagyobb nyomás) Kis η mozgófázis acetonitril tartalmú (gradiens

elúció, maximumos görbe) H csak kis mértében nőjön u-val (függ η) Készülék max nyomás sebességnövelés határa Nagy nyomáshőhossz-, keresztirányú hőm.-

grad. széles torzult csúcs (belső átmérő csökk.) belső átmérő csökk.Vr csökk. külső

zónaszélesítő hatások

KROMATOGRÁFIA KINETIKUS ELMÉLETE:

van Deemter egyenlet: H- elméleti tányérszámmal ekvivalens

oszlopmagasság, u-mozgófázis lineáris áramlási sebessége

A: az oszlop geometriájának hatása (szemcsék közti tér nem teljesen rendezett)

B: longitudinális diffúzió (molekula áramlik a szemcsék között)

C: anyagátadással szembeni ellenállás

KROMATOGRÁFIA KINETIKUS ELMÉLETE:

Szemcseátmérő csökkentése: élesebb csúcs, rövidebb, kisebb átmérő

KROMATOGRÁFIA KINETIKUS ELMÉLETE:

Hőmérséklet növelésével:csökken a kölcsönható erők viszkozitása (mozgófázis), nő a mérendő komponens diffúziós állandója. B≈DM (molekuláris diffúziós állandó); C≈ (póruson belüli diffúziós állandó)

Kis szemcsén belüli átmérő, a mozgófázis áll, csak a részecske diffúzióját vizsgáljuk.

KROMATOGRÁFIA KINETIKUS ELMÉLETE: Nyomás növelése: a szemcseátmérő csökkentés velejárója,

lamináris tartomány Héjszerkezetű állófázis: a diffúziós úthossz rövidebb, mint

egy teljesen porózus szemcsénél. Kolonna ellenállását csökkenteni, mozgófázis gyorsabb, nem

töltetes, hanem monolit kolonna esetén. Egy nagyságrenddel kisebb nyomás, mint a porózus töltet esetén. Könnyebben alakul ki nagyobb sebesség.

Nyomástartomány és az oszlopon kívüli térfogat nagyon fontos.

UPLC KÉSZÜLÉK PARAMÉTEREI Waters Acquity, Ascentis Express Peptide ES 10 cm x 3 mm; 2,7 µm (0,5 µm tömör belső) Gradiens elúció Eluens (30 % B-ig mentünk fel):

A: víz+0,1 % TFA; B: acetonitril:víz+0,1 % TFA (= 90:10)

U=0,8 ml/min, beinj.: 2 µl, Detektálás: λ=260 nm

MÉRÉS KIÉRTÉKELÉS

Mennyi komponenst tud meghatározni? Pc=1+tg/wb (tg= 2.5 min alatt) Pc= 41

KORLÁTOK A GYORS FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS MÓDSZEREKNÉL

KORLÁTOK A GYORS FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS MÓDSZEREKNÉL Azt vizsgáljuk, hogy milyen követelmények

vannak műszer oldalról nézve az elemzés gyorsaságának növelésére.

A kromatogramon mért zónaszélesedés két fő részből tevődik össze:

Kolonna által okozott Kolonnán kívüli zónaszélesítő hatások

Adagoló okozta zónaszélesedés σ2A Összekötő vezeték okozta zónaszélesedés σ2Ö Detektorcella okozta zónaszélesedés σ2Dcell Detektor elektronika okozta zónaszélesedés σ2Dt

σ2E = σ2A+σ2Ö+σ2Dcell+σ2Dt ∑σ2= σ2C+ σ2E

Az adagolóban és az összekötő vezetékben azért van zónaszélesedés, mert az

áramlás lamináris és a sebességi profil parabolikus, az egyes rétegek közöttikeveredés elhanyagolható. Azok a molekulák, amelyek a cső falához

közelebbvannak kb fele sebességgel haladnak, mint a maximumban lévők => áramlási csúcsdiszperzió

Ehhez hozzájárul a detektorban az áramlási sebesség megváltozása: ha lassú

az elektronika, akkor nem lehetséges legalább 20 adatpont gyűjtése, amiből a

kromatográfiás csúcs analóg jele leképezhető =>változik a görbe alatti terület

és a zónaszélesség.

A zónaszélesedés összege nem lehet nagyobb, mint a kolonnán mért tizede.σ2

E=0,1σ2C

PéldaUPLC: 5 cm hosszú, 2,1 mm belső átmérőjű kolonna, 1,7 µm

szemcseátmérőjű töltetKolonna okozta zónaszélesedés:

σ2k=(πr2εT)2HL UPLC:

σ2k=8,14 µm

A komponens hígulása a kolonnán kicsi és a csúcskapacitás nagy, mert szűk a zóna, viszont a kolonnán kívüli zónaszélesedést meghatározza.

A 10 %-os szabályt betartva a kolonnán kívüli zónaszélesedésnek 1 µl alatt kell lennie. Ez pedig több függetlenből tevődik össze, meg kell adni az egyes tagok járulékait: - megengedett legnagyobb injektált térfogat Vinj=105 nl- Detektor okozta zónaszélesedés és detektor térfogat σ 2det=20,8 µl - összekötő vezeték okozta zónaszélesedés σ2

Ö=1,28 µl*1280 nl- detektor időállandó τRC=0,17 sec

r=2,1 cmεT=0,5Dp=1,7 µmH= 3,4 µmL=5 cm

Mintavételezési sebesség hatása a csúcskapacitásra és a felbontásra:a csúcskapacitás összefügg a kromatográfiás felbontással, így ha a csúcskapacitás csökken, csökken a felbontás is.

Mintavételi sebesség Csúcskapacitás80 Hz40 Hz20 Hz10 Hz5 Hz

6156442816

A lassú mintavétel jelentősen csökkenti a kromatogramon látható csúcsok számát

80 Hz40 Hz20 Hz10 Hz5 Hz

2,252,051,711,170,67

HPLC

UHPLC

A gyors kolonnák nagy mintavételi frekvenciát igényelnek

A kis belső átmérőjű és rövid kolonnákhoz a hagyományos HPLC rendszer nem, vagy csak nagy hatékonyság csökkenéssel alkalmazható.

Rövid kolonnák alkalmazása HPLC rendszerben:- 5 µl jelenti az adagolás felső határát- a minta oldószerének gyengébbnek kell lenni, mint a mozgófázis eluenserőssége- a molekuláris formának azonosnak kell lennie a mintában és a mozgófázisban- az összekötő vezetékek hosszát a készülék által megadott minimumra kell csökkenteniAdagoláskor a kolonna elején csúcskompresszió történik => gradienselúciót alkalmazunk akkor is, amikor nem lép fel az általános elúciós probléma. A kiindulási mozgófázis összetételének olyan gyengének kell lennie, hogy a minta leggyengébben visszatartott komponensének is nagyobb kell, hogy legyen a visszatartása, mint 10.

Visszatartási tényező:K= KVs/Vm=ns/nm*Vs/Vm

Vs, Vm: álló- és mozgófázis térfogataK: megoszlási hányadosns, nm: álló- és mozgófázisban mért mólok száma

k>10A komponensek döntő részben az állófázisban tartózkodnak. Az

összes komponens vándorlási sebessége lecsökken, a mintaadagolás során a kolonna eleje koncentrálja azokat.

Vándorlási sebesség [ux=u/(1+k)] csökken.

k=10Tizenegyed részére csökken a vándorlási sebesség, így a

komponensek szűk zónában koncentrálódnak.Itt problémát okozhat az oldhatóság, ha a minta

komponenseinek nagyon eltérő az apolaritása vagy polaritása. Ekkor a jobban visszatartott komponensek a gyenge

eluenserősségűmozgófázisban kevésbé oldódnak. A közel egyforma

tulajdonságúvegyületeknél a szelektivitás csökken.

AZ ELVÁLASZTÁST BEFOLYÁSOLÓ PARAMÉTEREK HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA

A KROMATOGRÁFIÁS FELBONTÁS ALAPÖSSZEFÜGGÉSE

Rs = N ½ (α – 1/α)(k+1/k)

N az elméleti tányérszám (kinetikai hatékonyság),

α a relatív retenció vagy szelektivitás (termodinamikai hatékonyság),

k a visszatartási tényező.

A kromatográfiás rendszerekben az elválasztás ezen három paramétertől függ.

HOGYAN BEFOLYÁSOLJA A PARAMÉTEREK MEGVÁLTOZTATÁSA AZ ELVÁLASZTÁST?

Deriváljuk az elválasztást megadó Rs = N ½ (α – 1/α)(k+1/k)

összefüggést, mindig az adott vizsgálandó paraméter (N, α, k) szerint.

1.) ELMÉLETI TÁNYÉRSZÁM HATÁSA ΔRs/ΔN = 1/8(N½)(α-1/α)(k/(k+1))

Egységnyi N változás 0,0144% elválasztás-változás.

Ha a kolonnahosszat 2x-esére növeljük (pl. N = 3000-ről 6000-re) az elválasztás értéke kb. 14%-kal nő (ha ua. a kolonna és változatlan a mozgófázis összetétele).

Ez a hatás kismértékű, tehát a kolonnahossz növelése csak mérsékelten növeli az elválasztást.

A nyomásesés a kolonnán közben kétszeresére nő.

Ezek az adatok k = 2-3, α = 1,1 és ΔR = 1 körüli értékekre igazak.

Van Deemter ha a szemcseátmérőt felére csökk. az elméleti tányérmagasság is a felére csökken (Hmin és az Nmax) N 2x-esére nő.

A H-u görbe meredeksége annál kisebb, minél kisebb a szemcseátmérő (N-ben nagyobb lesz a nyereség).

Ha 3 µm-ről 1,5 µm-re csökkentjük az állófázis szemcseátmérőjét, akkor pl. N=1000 2500-ra nő kb. 26%-os növekedés az elválasztásban (ha az egyéb paramétereket változatlanul hagyjuk). A nyomásesés 4x-esére nő!

2.) SZELEKTIVITÁS HATÁSA ΔRs/Δα = ((N½)/4)(1/α2)(k/(k+1))

Egységnyi változás az α-ban közel 1000-szeres változást okoz az elválasztási tényezőben.

A szelektivitási tényező kismértékű változása nagymértékben növeli az elválasztást.

Folyadékkromatográfiában vagy az állófázis típusát változtatjuk meg (állófázis hatás), vagy a mozgófázis összetételét (mozgófázis hatás). Ahhoz, hogy a mozgófázissal a megfelelő elválasztást tudjuk elérni, szükséges, hogy az állófázison minimális elválasztás elérhető legyen. A vegyületek szerkezetének függvényében, tehát az első feladat a legnagyobb szelektivitást nyújtó állófázis kiválasztása, csak utána következhet a mozgófázissal az elválasztás „finomhangolása”.

3.) VISSZATARTÁSI TÉNYEZŐ HATÁSA ΔRs/Δk = ((N½)/4)((α-1)/α)(1/(1+k)2)

Egy egységnyi változás k-ban kb. 8% változást jelent a felbontásban.

A deriváltnak maximum helye van a 2-3 k érték körül.

Folyadékkromatográfiában a visszatartást az állófázis minőségével, a mozgófázis összetételével és a hőmérséklettel tudjuk változtatni.

HŐMÉRSÉKLET Új elválasztást befolyásoló tényező, amely a

technikai megvalósításban a legutóbbi években jelent meg.

MONOLIT KOLONNÁK

ELEMZÉSI IDŐ CSÖKKEN, HA A LINEÁRIS ÁRAMLÁSI SEBESSÉG NŐ!

tr=L/u(1+k)

Szemcsés tölteteknél a lineáris áramlási sebesség növelésével egyenes arányban nő a kolonnán a nyomásesés

Ez monolit kolonnákra is igaz, viszont ezeknek az áramlási ellenállásuk sokkal kisebb, mivel porozitása a szemcsés töltethez képest sokkal nagyobb (a kolonna térfogatának 80%-a holttérfogat)

Azaz ugyanolyan áramlási sebességhez sokkal kisebb nyomásesés tartozik (~ 1 nagyságrenddel)

MONOLIT TÖLTET ELEKTRONMIKROSZKÓPOS KÉPE

Vannak szilikagél és szerves polimer alapú monolitok.Szerves alapúnál a mikropórusosság elkerülhetetlen, ami szélesebb kromatográfiás csúcsot eredményez, valamint ezek mechanikailag kevésbé stabilak (biopolimerek elválasztására alkalmazzák).

Fehér rész: szilikagél alapváz (benne 10-20 nm-es mezopórusok; visszatartást eredményezik)Sötét rész: nagy átmérőjű pórusok (1-2 μm; mozgófázis áramlás itt)

AZ ELVÁLASZTÁSI ELLENÁLLÁS

TÉRFOGATÁRAMLÁSI SEBESSÉG ÉS NYOMÁSESÉS A KOLONNÁN

Tehát nyomásesés szempontjából a monolit előnyösebb,mint a szemcsés.Az általánosan alkalmazott 1-2 ml/min térfogatáramlási sebességek 6-9 ml/min értékre növelhetők.

ELŐNYÖK ÉS HÁTRÁNYOK Előnyök: Térfogatáramlási

sebesség növelhető Az elválasztás

hatékonysága csak kis mértékben csökken gyors elválasztáskor

Hagyományos készüléknél alkalmazható

Gyors elválasztások közül ez adja a legkisebb elválasztási ellenállást

Elemzési idő csökkenthető a térfogatáramlási seb. programozásával

Hátrányok: A kolonna felületi

kémiája korlátozott- elsődlegesen oktadecil és oktil módosított kolonnák kaphatók, és a normál fázisú kromatográfiában alkalmazott alap szilikagél

Mivel műanyag házban van a töltet, így max. 200 bar nyomás alkalmazható

KÖSZÖNJÜK A FIGYELMET!