Odreivanje GGT-a

Fakultet zdravstvenih studijaLaboratorijske tehnologijeBroj indexa: 946/12

ODREIVANJE GGT-ASeminarski rad iz predmeta: Kliniko hemijska laboratorijska tehnologija I

Student: Ajla Ljatifaj

SADRAJ

UVOD3GAMA-GLUTAMILTRANSFERAZA (GGT)4KLINIKO ZNAENJE5INDUKCIJA GGT6METODE ODREIVANJA AKTIVNOSTI y-GLUTAMILTRANSFERAZE7ODREIVANJE AKTIVNOSTI GGT-A U SERUMU7FOTOMETRIJSKO ODREIVANJE AKTIVNOSTI GGT-A U SERUMU9ZAKLJUAK10LITERATURA11

UVOD

U ovom radu u obraditi Gama glutamil transferazu. GGT je enzim koji katalizira prijenos hidrolizom osloboenog ostatka glutaminske kiseline na neku aminokiselinu ili peptid. U organizmu se javlja preteno vezan na stanine membrane. Najvie ga ima u etkastom obrubu epitelnih stanica proksimalnih tubula bubrega, prostati, guterai, jetri, epitelu tankog crijeva i mozgu. Porast katalitike koncentracije GGT je najosjetljiviji pokazatelj oteenja jetre, a naroito je izraen ako su oteenja uzrokovana alkoholom. Dobar je pokazatelj u diferencijalnoj dijagnostici hepatocelularne i opstruktivne utice.U drugom dijelu rada u se posvetiti laboratorijskoj dijagnostici te opisati glavne metode za odreivanje ovog enzima.

GAMA-GLUTAMILTRANSFERAZA (GGT)

Y-glutamiltransferaza nazivala se prije i y- glutamintraspeptidaza, i za njezin naziv upotrebljava se vie kratica kao GGT, GT ili y-GT. To je enzim koji katalizira tri tipa reakcija:1. Hidroliza hidrolitiki otcjepljuje glutaminsku kiselinu iz spoja s nekim peptidom, aminokiselinom ili aminom;2. Eksterna transpeptidacija hidrolizom otcjepljeni ostatak glutaminske kiseline ne prenosi na neku aminokiselinu ili peptid koji djeluje kao akceptor;3. Interna transpeptidacija osloboeni ostaci glutaminske kiseline veu se i stvaraju y-glutamiglutaminske peptide.y-glutamiltransferaze ima u bubrenim tubulima, sijenci tankog crijeva i horizomskimpleksusima, dakle upravo na mjestima gdje se izvodi apsorpcija ili prijenos aminokiselinakroz stanine membrane. Zato su mnogi autori smatrali da je fizioloka uloga tog enzima u prijenosu aminokiselina kroz stanine membrane, a time posredno i u sintezi peptida i proteina. Orlowski i Meister tumae metaboliku funkciju y-glutamintransferaze tzv. Y-glutamilskim ciklusom razgradnje i sinteze glutationa (Meisterov ciklus), koji se upravo intezivno odvija u bubregu, mozgu i tankom crijevu.Prvi enzim u ovom ciklusu koji otcjepljuje y-glutamilni ostatak iz glutationa i prenosi na neku drugu aminokiselinu, jeste GGT. Na taj nain nastaje glutamil-dipeptid, iz kojeg se djelovanjem y-glutamil-ciklotransferaze otcjepljuje aminokiselina. Tim procesom aminokiselina prolazi staninu membranu, a iz ponovo osloboene glutaminske kiseline nastaje 5-oksiprolin. Za tu reakciju je potrebna prisutnost ATP-a. Ostatak cisteinil-glicina iz glutationa cijepa jedna dipeptidaza na cistein i glicin, koji sa glutaminskom kiselinom nastalom iz 5-oksiprolinaponovo stvaraju glutation. U tom slijedu reakcija sudjeluju 2 mola ATP-a, te enzimi y-glutamil-cistein-sinteraza i glutation-sinetaza.GGT se u organizmu javlja preteno vezan na stanine membrane, a manjim dijelom u jetri oko 10%, kao slobodna topiva forma. Slobodni GGT ima molekularnu masu oko 80 000 do 90 000, dok je molekularna masa vezanog GGT-a oko 3 x 104 . Vezani GGT prelazi u slobodni enzimskim procesom, vjerovatno djelovanjem proteaza ili deterdentskim djelovanjem unih kiselina.Po svom sastavu GGT je glikoproteid koji sadri neutralne aminoeere i sijalinsku kiselinu. Na enzim djeluju inhibitorno Cu2+, N-etilmaleinimid, bromsulfalein, a prema nekim autorima i 4-nitrolain koji se oslobaa iz supstrata prilikom odreivanja aktivnosti GGT.Enzim se nalazi u raznim organima i tjelesnim tekuinama, ali u diferencijalnim aktivnostima. Najvie GGT-a ima u bubregu, i to vezanog na etkasi obrub epitelnih stanica proksimalnih tubula, te u Henleovoj petlji. Nalazi se zatim u prostati, pankreasu, jetri, epitelu tankog crijeva, mozgu...KLINIKO ZNAENJEDanas se smatra da je porast aktivnosti GGT u serumu najosjetljiviji pokazatelj oteenja jetre. U akutnom virusnom hepatitisu aktivnost GGT-a u serumu raste do 5-8 puta iznad referentnih vrijednosti. U perzistirajuem hroninom hepatitisu moe aktivnost GGT, za razliku od ostalih indikatorskih enzima koji su obino normalno, takoer malo porasti. U agresivnom hroninom hepatitisu i cirozi jetre aktivnost GGT je visoka, osobito ako su hepatitis ili ciroza posljedica prekomjerenog konzumiranja alkohola. U tom sluaju aktivnost moe porasti i do 2 000 - 3 000U/L. Aktivnost GGT-a u serumu raste i u opstruktivnom ikterusu, i to obino jae nego u hepatocelularnoj utici. Zato su neki predlagali ovaj test i za razlikovanje hepatocelularnog i opstruktivnog ikterusa.Aktivnost GGT-a u serumu poveana je i u pankreatitisu, opet jae ako je ovaj izazvan alkoholom. Isto je i u steatozi jetre alkoholiara. U infarktu miokarda, aktivnost GGT-a poinje rasti u serumu nekoliko dana nakon infarkta, obino oko nedjelju dana. Raste postupno i normalizira se u roku od 2-3 sedmice. Meutim, taj se test ipak ne upotrijebljava u dijagnostici infarkta, jer nije specifian, a naknadni porast aktivnosti prepisuje se remisiji ili stazi u jetri koja se moe javiti poslije infarkta. Kliniko znaenje izoforma GGT-a za sada je jo za raspravu. Prema naim ispitivanjima, u akutnom se hepatitisu i cirozi jetre javljaju, kao i kod zdravih ljudi, veinom samo GGT1 i GGT2, ali uz porast aktivnosti oba izoenzima. Prema tome, moglo bi se pretpostaviti da potiu iz jetre. Kako se u jetri javlja samo GGT2, vjerovatno dolazi u serumu do neke promjene karakteristike tog izoenzima. U opstruktivnom ikterusu javlja se jo i izoenzim GGT3, pa se ovaj moe smatrati znakom kolostaze. Taj je izoenzim lokaliziran kao i GGT4 u podruju globulina i postoji stanovita korelacija izmeu njega i koncentracije kolesterola. U nekim oteenjima jetre, ponajvie u malignim bolestima, smanjuje se aktivnost GGT1 i raste aktivnost izoenzima GGT2.Poviena aktivnost GGT kod pankreatitisa uzrokovana je uglavnom viom aktivnou izoenzima GGT1, dok se u serumu osoba koje uivaju alkohol nalazi kad-kad jo jedan izoenzim lokaliziran na elferogramu ispred albumina i oznaen kao GGT1a.Meutim, razni autori iznose raznolike podatke o raspodjeli izoenzima GGT. Ipak se moe zakljuiti da aktivnosti GGT u bolestima jetre uglavnom potie od enzima iz jetre.Pri tome, u hroninom hepatitisu i cirozi, osim GGT1, koji normalno ini 60-80% i GGT2 koji je 20-40% ukupne aktivnosti, nalazi se i do 10% aktivnosti GGt3 ili GGT4, a u cerozi s kolostazom, neoplarni, intra-i ekstrahepatalnoj opstrukciji i vie od 30%. Prema istim autorima u tim se sluajevima moe javiti i GGT0 (na startu elferograma). Takoer tvrde da se izoforma u podruju albumina pojavljuje u 75% sluajeva tumora jetre.INDUKCIJA GGTGGT je dijelom mikrosomalni enzim i inducira se nekim lijekovima. Aktivnost GGT-a najvie povisuje alkohol, pa se taj test ve upotrijebljava screening-test za otkrivanje alkoholiara. Nadalje, aktivnost GGt povisuju barbiturati, antieptileptici, kontraceptivi i lijekovi za sniavanje koncentracije lipida u krvi (noviji lijekovi za sniavanje koncentracije lipida u krvi djeluju suprotno, tj. Smanjuju aktivnost GGT-a). Osim alkohola iji je induktivni efekt najjai i koji moe aktivnost GGt u serumu izrazito povisiti, ostali induktori povisuju samo blae aktivnost GGt-a u serumu.Zbog mogunosti indukcije, treba uvijek kada se umjereno povea aktivnost GGT-a u serumu, ispitati koje lijekove pacijent uzima, kako se ne bi svako povienje aktivnosti GGT-a pgreno pripisalo oteenju jetre.

METODE ODREIVANJA AKTIVNOSTI y-GLUTAMILTRANSFERAZE

Prve metode za odreivanje aktivnosti y-glutamiltransferaze bile su kromatografske, u kojima se nakon inkubacije glutationom ili nekim sintetskim supstratomPostupak:Otpipetira se u epruveteProba mlSlijepa proba seruma u mlSlijepa proba reagensa ml

Supstrat (reag2)Redest. voda1,0--1,01,0-

Epruvete se stave 3 minute na 37 0 c i onda se doda:Serum0,10,1-

Redest. voda--0,1

Epruvete se inkubiraju tano 45 minuta na 37 C. Nakon toga se doda:NaOH (reag 3)5,05,05,0

Pomijea se i mjeri se apsorbancija (A) probe i slijepih proba prema vodi na 405 nm u kiveti od 10 mm.

ODREIVANJE AKTIVNOSTI GGT-A U SERUMU Princip:GGT razgrauje supstrat y-L-glutamil-4-nitroanilid i prenosi osloboenu glutaminsku grupu na akceptor glicilglicin.Pri tome se stvaraju y-glutamilgliciglicin i 4-nitroanilin (p-nitroanilin). 4-nitroanilin je u alkalnom mediju ute boje, te se njegovo stvaranje kontinuirano mjeri kod 405 nm:Reagensi:1. Pufer tris-glicilglicin, pH 8,2. Tris 115 mmol/L, glicilglicin 57,5 mmol/L. Otopi se 13,93 g tris (hidroksimetil) aminometana (NH2-C(CH2OH)3,M, 121,1) i 7,59 g glicilglicina (CH2NH2CONH CH2 COOH, M, 132, 1) u 800 ml redest vode. Naravna se na Ph 8,2 KOD 30 o C s 0,2 mol/L NaOH ili HCI i dopuni redest, vodom do 1 L. Reagens je stabilan 3 mjeseca na +4 o C.2. Supstrat y-glutamil-4-nitroanilid, 57.5 mmol/L. Otopi se u 16,4 mg L-y-glutamil-4-nitroanilida po 1 ml 0,2 mol/L HCI. Priprema se samo koliina reagensa za jedan dan, a treba ga upotrijebiti najdalje unutar 6 sati od pripreme. Reagens je stabilan 2 do 6 sati na sobnoj temperaturi, a jedan dan na +4 o C.Novije metode koriste supstrate u kojima je glutaminska kiselina vezana na neki aromatski amin. U metodi Goldbarga, kao supstrat upotrijebljen je y-glutamilanilid, a nakon inkubacije osloboeni anilin supa u reakciju s NaNO2, s kojim stvara u kiseloj sredini dizalo-sol. Suvini NaNO2 uklanja se sulfamatom, a diazo-spoj se vee s N-(1-naftil) etilendiaminom u plavo obojeni azo-spoj, koji se mjeri kolorimetrijski (Bratton Marshallova reakcija).U nekim je metodama upotrijebljen kao supstrat y-L-glutamil-naftilamid. Djelovanjem GGT-a oslobaa se a-naftol koji se odreuje takoer Bratton-Marshallovom reakcijom. Uvoenjem akceptora osloboene glutaminske kiseline u reakcionu smjesu ubrzava se reakcija. Dananje metode odreivanja aktivnosti GGT-a temelje se uglavnom na metodi Szasza. U ovoj metodi GGT cijepa supstrat y-L-glutamil-4-nitroanilid. Osloboena glutaminska kiselina vee se na akceptor glicil-glicin, koji ujedno slui kao pufer, a oslobaanje 4-nitroanilina mjeri se kontinuirano na 405 nm. Kako je y-glutamil-4-nitroanilid dosta teko topiv, u novije je vrijeme predloen kao supstrat y-glutamil-3-karboksi-4-nitroanilid (N5-(3-karboksi-4-nitrofenil glutamin). Meutim, ovaj supstrat, iako dobro topiv, ima manjak da se njime dobiva suvie visoka poetna apsorbancija reakcijske smjese.Napomena:Spektrofotometar se kontrolira badarenjem standardom 4-nitroanilina.Priredi se otopina 4-nitroanilina 1 mmol/L tako da se odvagne tano 138 mg 4-nitroanilina i otopi u 1 L redest vode u odmjernoj tikvici od 1 L. Da se nitroanilin otopi, potrebno je nekoliko sati uz povremeno mijeanje, a otopina je stabilna oko 3 mjeseca ako se uva u tamnoj boci na +4 0 C. Od matine otopine pripreme se razrjeenja od 10 do 200 mol/L. (Razrjeena od 10 mol/L dobije se tako da se matina otopina razrijedi 1:100, od 100 mol/L. 1:10, od 200 mol/L 1:5).Otopina koja sadri 10 mol/L treba imati apsorbanciju 0,099, a otopina od 100 mol/L apsorbanciju 0,990 kod 405 nm u kiveti od 10 mm. Linearnost treba biti do apsorbancije 2,0.Preciznost metode iznosi oko 5 do 6 %.Referentne vrijednosti:Mukarci 7 do 40 U/L (117 do 667 nkat/L),ene 4 do 25 U/L (67 do 417 nkat/L).FOTOMETRIJSKO ODREIVANJE AKTIVNOSTI GGT-A U SERUMU

Princip:GGT razgrauje supstrat y-glutamil-nitroanilid i prenosi osloboenu glutaminsku kiselinu na akceptor glicilglicin. Pri tome se osloboeni 4- nitroanilin koji je ute boje u alkalnoj otopini mjeri kod 405 nm.ODREIVANJE MULTIMOLEKULARNIH OBLIKA GGT-AIzoforme GGT razdvajaju se elektroforezom na raznim nosaima nakon ega se na traci izvodi reakcija sa supstratom. Zone aktivnosti GGT oboje se ili fluoresciraju, zavisno od upotrijebljenog supstrata. U nekim se metodama supstrat upotrijebljavaju y-glutamil-nitroanilid ili y-glutamil-naftilamid koji nakon djelovanja GGT oslobaaju nitroanilin odnosno a-naftol, a ovi diazotiranjem daju obojene azo-spojeve.Osjetljivija je metoda u kojoj se kao supstrat upotrijebljava y-glutamil-7-amino-4-metilkumarin iz kojeg se djelovanjem GGT oslobaa 7-amino-4-kumarin koji fluorescira.Prema ovom postupku stavlja se 2 L seruma na traku celuloza acetata i izvodi elektroforeza 40 minuta na 220 V. Kao pufer za elektroforezu uzima se tris-barbitonski pufer, pH 8,6. 30 g/L y-glutamil-7-amino-4-metilkumarina otopi se sonifikacijom u metiloksietanolu i tome doda 40 ml 100 mmol/L glicilglicina i 200 mmol/L tris pufera, pH 8,2.Ova se otopina pripremi svjea i kroz nju provue traka filtar papira sa kojom se onda prekriju elektroforetska traka. Tako pripremljeni sendvi inkubira se 3 minute na 37 0 C i 3-4 minute na 65 0 C, te mjeri fluorescencija na340 nm.

ZAKLJUAK

GGT se odreuje, zajedno sa drugim analizama, za procjenu funkcije jetre.Takoe se koristi za praenje lijeenja alkoholizma. GGT se odreuje u uzorku krvi. Prema nekim istraivanjima, nivo GGT opada nakon obroka. Zbog toga se preporuuje da se krv vadi ujutru, nakon nonog gladovanja. Ako konzumirate ak i malu koliinu alkohola 24h prije vaenja krvi, GGT moe biti povien. GGT (gama-glutamil-transferaza) je enzim koji uestvuje u transportu aminokiselina i peptida kroz elijsku membranu. Takoe, ima kljunu ulogu u odravanju adekvatnog nivoa odreenih antioksidativnih supstanci u elijama. Prisutan je u bubrezima, jetri, pankreasu i dr. tkivima. Aktivnost u krvi uglavnom potie iz jetre Metode koje se koriste su fotometrijske, hromatografkse i spektrofotometrijske.

Literatura

1. Boidar traus, Medicinska Biohemija2. Tietz Textbook of Clinical chemistry and Molecular Diagnostics/ edited by CA Burtis,ER Ashwood, DE Burns-5th edition Elsevier, -Glutamyltransferase 581-5823. Milan Miholji, Biohemija4. Internet:http://www.laboratorijskeanalize.com/analize/g/ggt/ (27.04.2014)

http://www.ifcc.org/ifcc-communications-publications-division-(cpd)/ifcc-publications/ejifcc-(journal)/e-journal-volumes/ejifcc-2009-vol-20/vol-20-n%C2%B0-3/standardization-in-clinical-enzymology/ (26.04.2014)

https://www.abbottdiagnostics.com/ products/general-chemistry.html (27.04.2014)

11