DETERMINAREA FITOSTEROLILOR BIOACTIVI DIN ULEIUL DE MĂSLINE

STUDIUSEPARAREA ȘI DETERMINAREA

STEROLILOR DIN ULEIUL DE MĂSLINE PRIN HPLC-MS

STUDENT: PORAICU OANACOORDONATOR: AS. ING.DRD. MIRCEA

OROIAN

Generalități În Grecia măslinul este legendar. Potrivit lui Homer, măslinul crește pe

pământul Greciei de mai bine de 10.000 de ani. De-a lungul timpului, măslinul și-a dăruit frunzele pentru ca din ele să-și facă lauri victorioșii din întrecerile sportive dar și cei din sângeroasele războaie, iar uleiul din fructul s-au uns cele mai nobile capete ale istoriei.  

Coroanele și ramurile de măslin, emblemele binecuvântării și ale purității, erau oferite zeităților și împăraților: câteva au fost găsite și în mormântul lui Tutankhamon. Pomul era considerat sacru iar potrivit legii regelui Solon, oricine ar fi încercat să distrugă un măslin era aruncat în exil sau ucis pe loc.

Uleiul de măsline conține polifenoli, vitamina E și alți antioxidanti, substanțe care constituie conservanții naturali ai uleiului. Antioxidanții diminuează apariția peroxizilor. Astfel se încetinește procesul natural de oxidare și râncezire a uleiului. Polifenolii au un rol foarte important în compoziția uleiului de măsline. Măslinele conțin peste 30 de tipuri de polifenoli, însă nivelul acestora scade odată cu "îmbătrânirea" fructului și apoi odată cu trecerea timpului.

80% din uleiul de masline este compus din acizi grași monosaturați care rezistă la oxidare. Aceștia determină creșterea colesterolului "bun"(HDL) și scăderea colesterolului "rău" (LDL), răspunzător pentru "întărirea arterelor" și creșterea riscului accidentelor vasculare.

CLA

SIFIC

AR

E

Uleiul de măsline se poate clasifica în:  uleiul de măsline extra-virgin provine din prima presare a măslinelor. Are o aciditate nu mai mare de 0.8% și este considerat a avea un gust superior. Cele mai multe uleiuri de măsline sunt extravirgine doar pe etichetă.  uleiul virgin este produs prin folosirea metodelor fizice și fără nici un fel de tratament chimic. Aciditatea este mai mică de 2% și are un gust bun. Rafinat înseamnă că uleiul a fost tratat chimic pentru neutralizarea gustului puternic (caracterizat ca fiind un defect) și a conținutului de acizi. uleiul rafinat este considerat ca fiind de o calitatea mai slabă decât cel virgin.

STEROLII

Steridele sunt lipide simple care se găsesc în cantitate mică în toate organismele vegetale și animale. Ele sunt esterii naturali ai acizilor grași cu sterolii, Dintre acizii grași cel mai des întîlniți fac parte acidul palmitic, acidul stearic și acidul oleic.

Structură chimicăSterolii sunt monoalcooli secundari ciclici, care derivă de la o hidrocarbură policiclica, numită steran, nucleul de baza fiind de naturală ciclopentanperhidrofentrenică.

Sterolii naturali sunt în majoritate lor de tip trans optic activi, levogiri cu excepția coprosterolului care este dextrogir, fiind izomer cis. Sterolii sunt substanțe cristalizate care au puncte de topire mai ridicate decit ale gliceridelor variind între 102 –1700 C. Sunt solubili în solvenți organici și greu solubili în apă. Acei steroli care au în moleculă o legatură dublă dau reacții de adiție cu hidrogenul și halogenii. Sterolii se pot recunoaște prin reacții de culoare cu acidul sulfuric concentrat, anhidrdă acetică, peroxizi în soluție cloroformică.

Clasificare Se clasifică după proveniență în : Fitosteroli caracteristici plantelor superioare și celor

inferioare; Micosteroli caracteristici ciupercilor; Zoosteroli caracteristici organismelor animale

Fitosterolii

Fitosterolii se găsesc în cantitate mai mare în plantele superioare, în semințele plantelor oleaginoase, leguminoase și în boabele cerealelor. Cel mai răspândit este sitosterolul care uneori este însoțit de un procent mai mic de stigmasterol. Ei se găsesc în natură sub formă liberă dar și sub formă de fitosteride, glicozide. Ei au importanță în biosinteza hormonilor steroidici dar și a vitaminelor D. Fitosterolii se găsesc în numeroase plante dar și în semințele unor plante. Se pare că au un rol important în organism prin menținerea nivelului colesterolului la un nivel cât mai mic, mai ales atunci când sunt consumați în cadrul unei alimentații fără colesterol. Inhibă absorbția intestinală a colesterolului; esterii liposolubili (stanoli derivați 5 alfa saturați) au fost introduși pentru scăderea nivelului seric la colesterolului din anii 1990.

Clasificarea tehnicilor cromatografice

S-au imaginat şi realizat numeroase variante ale metodei cromatografice, diferind unele de altele în primul rând prin natura fazei mobile, dar şi a celei staţionare. Astfel se distinge cromatografia de lichide (LC) când faza mobilă este un lichid, cromatografia de gaze (GC) când aceasta este un gaz sau cromatografia cu fluide supracritice la care faza mobilă este un lichid aflat peste temperatura critică. În cadrul cromatografiei de lichide se mai face distincţie între cromatografia pe coloană deschisă şi cea pe coloană închisă. Pe de altă parte, în cadrul fiecăreia dintre acestea, distingem mai multe variante.

Cromatografia de lichide(LC)

În cadrul LC se disting, în funcţie de mecanismele de separare:

÷ Cromatografia de adsorbţie,. ÷ Cromatografia ionică (de schimb ionic) ÷ Cromatografia de excluziune sferică ÷ Cromatografia lichid-lichid (LLC) ÷ Cromatografia pe coloană deschisă sau cromatografia planară (PC) ÷ Cromatogafia pe hârtie ÷ Cromatografia pe strat subţire (TLC ÷ Cromatografia pe strat subţire de înaltă performanţă (HPTLC), Toate acestea se caracterizează prin simplitate,

accesibilitate şi preţ de cost coborât, dar totodată prin performanţe ceva mai slabe decât cromatografia de lichide pe coloană sub presiune ridicată (HPLC) varianta modernă a LC.

Cromatografia de lichide de înaltă performanță (HPLC)

Cromatografia de lichide de înaltă performanţă (HPLC) acoperă azi, în proporţie aproximativ 80%, analiza substanţelor moleculare: organice, organo-metalice şi anorganice inclusiv compuşii foarte polari sau labili termic precum şi compuşii cu masă molecular ridicată (naturali sau sintetici). De aceea, împreună cu cromatografia de gaze constituie un punct de sprijin important în analizele chimice moderne. Deşi eficacitatea coloanelor nu o egalează încă pe cea din GC, prin faptul că se poate modifica, pe lângă faza staţionară, şi faza mobilă, cromatografia de lichide (LC) face posibile separări şi analize uneori imposibil de realizat prin alte tehnici.

Cuplajul cu spectrometria de masă a transformat, în ultimul timp, această metodă în principalul mijloc de analiza a compuşilor moleculari naturali sau sintetici, constituind unul din pilonii pe care se sprijină chimia sintetică actuală şi pe care s-a dezvoltat biochimia şi biotehnologia modernă. So

lvent

Pompă

Injector

Coloană

Detector

înregistrator

Schema bloc a unui cromatograf HPLC

CROMATOGRAFIA PLANARĂ (TLC) O VARIANTĂ MAI SIMPLĂ A LC Cromatografia planară (PC) întâlnită adesea sub denumirea de

cromatografie în strat subţire este cea mai simplă şi ieftină dintre toate metodele cromatografice cunoscute.

În literatura de specialitate se utilizează mai multe denumiri (cu prescurtările associate acestora). Pe lângă termenul consacrat - cromatografia planară (planar chromatography – PC) se mai întâlnesc denumiri ca cromatografia în strat subţire de înaltă performanţă (high performance thin layer chromatography - HPTLC) sau cromatografia de lichide planar (planar liquid chromatography - PLC).

Avantajele cuplării HPLC –MS

Cromatografia – metoda “oarbă” → achiziție simultană atât a timpilor de retenție, cât și a maselor moleculare ale componenților din amestec ;

Polimeri sintetici cu indice de polidispersitate crescut – eficiență de ionizare inegală pentru componenții probei – necesară separarea prealabilă – LC sau GPC

Nu există degradare termică Analiză rapidă Cantități foarte mici de probă, sensibilitate înaltă Informații structurale prin LC/MS/MS Masă moleculară medie sau indicii de polidispersitate pot fi utilizate

pentru a verifica procedurile de sinteză, în studiul mecanismelor de degradare, determinarea aditivilor și a impurităților, etc.

Determinarea masei moleculare absolute a lanțurilor macromoleculare spre deosebire de tehnicile cromatografice precum SEC care furnizează valori relative.

STUDIU SEPARAREA ȘI DETERMINAREA STEROLILOR DIN ULEIUL DE MĂSLINE PRIN HPLC-MS

Acest studiu prezintă prima metodă lichid cromatografică pentru identificarea și cuantificarea a șapte fitosteroli din uleiul de măsline. Sterolii au fost identificați și cuantificați prin cromatografie de lichid cu detectare spectrometrică de masă în mod ACPI (atmospheric pressure chemical ionisation)pozitiv. Probele erau saponificate prin reflux cu KOH 2N etanolic, iar partea nesaponificabilă a fost extrasă cu dietil-eter. Această parte a fost supusă cromatografiei cu strat subțire (TLC – thin layer cromatography) pe plăci de silica-gel și apoi banda de steroli a fost izolată și extrasă cu metanol. Sterolii au fost cuantificați cu LC –MS, pe o coloană Waters Atlantis 5 lm dC182,1 · 150 mm cu un gradient de aceto-nitril/apă (acid acetic0.01%) la o rație de 0.5 mL min_1; temperatura coloanei 30 C. Metoda prezintă ͦvalori între 123 și 677 ng mL_1 pentru limita de detecție, cu abateri standard relative între 4.0% și 5.4% la concetrație de 5 mg L_1 pentru fiecare sterol în parte. Conținutul sterolilor au fost determinate din uleiul de măsline virgin, uleiul de măsline rafinat, un ulei de măsline din sâmburi și un ulei de măsline din sâmburi brut.

Date introductive Metodele determinare a compușilor simpli de obicei necesită izolare și câteva

proceduri de separare, identificare și cuntificare. Analizele sunt bazate de obicei pe metodele oficiale de determinare a numărului total de steroli din grăsimi și uleiuri. Metodele oficiale pentru izolarea sterolilor din uleiul de măsline implică saponifocarea lipidelor, extragerea materiei nesaponificabile cu eter dietilic și spălarea extractului cu apă, separarea cu cromatografie pe strat subțire (TLC- thin layer chromatography) pe placă subțire de silica gel, derivarea sterolilor și analiză cromatografică secvențială. Metoda convențională pentru cuantificarea sterolilor și alcoolilor triterpenici implică analiză GC cu FID, a părților isolate de TLC, ca derivați trimetilsilil. Gas chromatografia (GC) cu diferiți detectori și spectrometria de masă (MS), sunt cele mai uzuale tehnici de determinare a sterilor. HPLC cu diferite sisteme de detectare sunt folosiți de asemenea ca să se determine și să se cuantifice compuși sterolici complecși din alimente.

Câteva publicații există privind identificarea a anumitor steroli din uleiul de soia și alge comestibile prin LC-MS, dar nu există publicații privind analiza sterolilor din uleiul de măsline prin HPLC-MS. Prin urmare, în acest studiu aplicabilitatea LC-MS cu APCI a fost evaluată pentru caracterizarea fracțiunilor sterolice din proba de ulei de măsline. Obiectivul acestui studiu este să reușească separarea completă a amestecului complex de steroli prin LC și identificare lor prin MS. O separare reușită a colesterolului, strigmasterolului, b-sitosterol, sitostanol, fucosterol, erittodiol și uvaol a fost îndeplinită.

INSTRUMENTAȚIE

Sistemul LC folosit a fost Alliance 2695 echipat cu un autosampler, degazor, și o coloană de încălzit achiziționat de la Waters (Milford, MA, USA). Sistemul spectrometric de masă a fost ZQ 2000 unic cuadrupolar cumpărat de la Waters Micromass (Manchester, UK) și a folosit împreună cu o interfață APCI. Informațiile au fost colectate cu softul MassLynk 4.0, pe un calculator personal. Compușii au fost separați de 5-lm Atlantis dC18 150 · 2.1-mm i.d. din Waters cu un gradient de acetonitril / apă (acid acetic 0.01%) la un flux de 0.5 mL min_1.

PREGĂTIREA PROBELOR

Patru probe de ulei de măsline simplu și din sâmburi din regiuni geografice diferite au fost obținute în martie 2005. Probele (5g de ulei de măsline) au fost saponificate prin refularea cu 50mL de soluție etanolică de KOH 2M timp de 1 oră. După răcirea la temperature camerei, 100mL de apă au fost adăugate. După faza de separare din pâlnia de separare, faza apoasă constă în spălarea de 3 ori cu dietil eter. În final, fracțiunile dietilice au fost colectate și spălate cu apă și uscate cu sulfat de sodiu anhidru, filtrate și apoi evaporate la sec utilizândun evaporator rotatoriu la presiune redusă, iar residuul (materialul nesaponificabil) a fost dizolvat în chloroform (1mL).

Extractul (300IL) a fost supus TLC cu plăci de silicagel producând benzi separate diferite potrivite a mai multor clase de compuși simpli. Apoi, banda de steroli a fost izolată și extrasă cu methanol (25mL) și ulterior analizată cu cromatografie cu lichid.

Caracterizarea sterolilor cu spectrometria de masă de ESI și APCI

ESI și APCI au fost folosite ca și surse de ionizare, atât în modul negativ cât și pozitiv, schimbând voltajul conului între 20 și 60V, într-o arie de m/z între 70 și 1000, dar rezultate eficace au fost obținute doar în modul pozitiv. Așa cum se observă și în tabelul 1, sursa ESI nu este aplicabilă pentru determinarea sterolilor deoarece nu se realizează o suficientă fragmentare a compușilor în condițiile impuse. Tabelul 1 arată fragmentele majore observate pentru fiecare sursă în modul pozitiv.

ANALIZA PROBELOR

Conținutul sterolilor de fracțiuni nesaponificabile a probelor de ulei de măsline virgin, ulei de măsline rafinat, ulei de măsline din sâmburi simplu și brut a fost determinat prin HPLC – MS.

Următorii compuși au fost izolați și cuntificați : cholesterol, stigmasterol, b-sitosterol, sitosterol, fucosterol, eritrosterol și uvaol. Cromatogramele celor patru probe se află în fig. 2. Rezultatele conținutului de sterol exprimat în mg/kg de ulei de măsline pentru fiecare sterol sunt prezentate în tabelul 4.

Erythrodiol and uvaol m/z 425.30 (A), cholesterol m/z 369.20 and fucosterol m/z 395.30 (B), stigmasterol m/z 395.30 (C), b-sitosterol m/z 397.30 (D), sitostanol m/z 397.30 (E).

Cromatograma uleiului de măsline virgin

Cromatograma uleiului de măsline rafinat

Cromatograma uleiului din sâmburi de măsline

Cromatograma uleiului dim sâmburi de măsline brut

CONCLUZII

LC-MS cu ACPI a fost evaluat pentru prima dată să identifice și caracterizeze părțile sterolice din probe de ulei de măsline. S-a reușit o separare suficientă a colesterolului, stigmasterolului, b-sitosterolului, sitosterolului, fucosterolului, eritrosterolului și uvaolului și metoda s-a dovedit satisfăcător aplicată pe diferite probe reale.

Vă mulțumesc!