DESCRIPCIÓN DE COMUNIDADES MICROBIANAS CULTIVABLES EN LAS …

DESCRIPCIÓN DE COMUNIDADES MICROBIANAS CULTIVABLES EN

LAS RAÍCES DE ESPECIES SELECCIONADAS EN EL ESTUDIO DE

HUMEDALES CONSTRUIDOS EN EL PÁRAMO CHINGAZA

Autor: NATALIA DELGADILLO FORERO

TRABAJO DE TESIS PARA OPTAR POR EL TÍTULO DE INGENIERA AMBIENTAL

ASESOR: MANUEL SALVADOR RODRÍGUEZ SUSA (PH.D. EN INGENIERÍA)

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES, BOGOTÁ

FACULTAD DE INGENIERÍA, DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA CIVIL Y AMBIENTAL

JULIO DE 2015

RESUMEN El Parque Nacional Natural Chingaza está conformado por ecosistemas de páramo y de bosque alto andino, este se encuentra sobre los departamentos de Cundinamarca y Meta de Colombia. Del páramo que se encuentra en el municipio de la Calera, se provee el 80% de agua para consumo a la ciudad de Bogotá, capital colombiana. Actualmente recibe grandes cantidades de turistas que generan aguas residuales a diario. Por medio del proyecto “Implementación de Humedales Construidos para el Tratamiento de Agua Residual Doméstica en Ecosistema de Páramo” se busca evaluar a pequeña escala (microcosmos) con especies nativas la posible implementación de un humedal construido de flujo subsuperficial, para mejorar el tratamiento que actualmente se le da en el parque a estas aguas residuales. Para apoyar este proyecto en el cual participa la organización de Parques Nacionales Naturales de Colombia en el presente estudio se hace una descripción general y conteo de los microorganismos encontrados en un (1) gramo extraído de las raíces de cada una de las especies seleccionadas para ser plantadas en los microcosmos: Eccremis coarctata, Chusquea tesellata, Cortadeira columbiana, Elaphoglussum engelli, Juncus echinocephalus y Paepalanthus columbiensis. Dichos microorganismos serían los encargados de participar en la remoción de contaminantes (nutrientes y materia orgánica) provenientes del agua residual. El tipo de bacterias más abundante encontrado en dichas raíces fueron los bacilos y en el caso de los hongos fue el género Penicilium. No se encontraron relaciones directas entre la forma de la raíz con el número total de microorganismos y la diversidad de los morfotipos encontrados. Los microorganismos encontrados en este trabajo tienen morfologías y características potenciales de algunas comunidades microbianas de los humedales de flujo subsuperficial que se han construido en proyectos similares, sin embargo, se necesitan más pruebas y estudios que determinen el género y la especie de los microorganismos cultivados en este estudio para rectificarlo. Se recomienda que para investigaciones futuras se hagan cultivos selectivos de microorganismos aún más específicos y se usen métodos de biología molecular de ADN para así tener un mayor rango de caracterización de microorganismos. Los resultados del presente estudio son un aporte al conocimiento de la microbiota de los suelos de los páramos colombianos, área de baja investigación en el país, principalmente en el páramo de Chingaza.

PALABRAS CLAVE: Páramo Chingaza, humedal construido, microcosmos, microbiota, bacilos, Penicilium

INTRODUCCIÓN Los páramos son ecosistemas de gran importancia ecológica, genética y científica por su flora y fauna endémica. Tienen funciones hidrológicas de gran importancia como agentes fundamentales en la regulación hídrica natural regional (Diaz-Granados, Navarrete, & Suárez, 2005). El Parque Nacional Natural Chingaza se encuentra ubicado sobre los departamentos de Cundinamarca y Meta, y cuenta con una entrada cerca a las afueras de Bogotá, en el área predomina el ecosistema de páramo. Sumada a su importancia biológica, Chingaza presta uno de los servicios ambientales más importantes a la ciudad de Bogotá ya que provee agua para el consumo al 80% de la población de la capital además de 11 municipios aledaños (Acueducto, 2015).

Los páramos son ecosistemas sensibles a las actividades humanas como por ejemplo la ganadería, la deforestación, la agricultura o el turismo, que de ser manejadas de manera inadecuada pueden causar serios daños ambientales. El ecoturismo es un concepto que ha venido tomando auge en el país, aspecto de vital importancia dentro del Parque Nacional Natural Chingaza, ya que en los últimos años la cantidad de turistas que visitan el parque ha aumentado significativamente (PNN, 2014). Dentro del parque se generan aguas residuales a diario y éstas deben ser tratadas de manera apropiada.

Una buena alternativa natural de tratamiento de aguas residuales frente a los tratamientos convencionales son los humedales construidos, los cuales tienen alta remoción de materia orgánica, sólidos suspendidos, nutrientes, patógenos entre otros (Kadlec & Wallace, 2009). Las cargas contaminantes de las aguas residuales pueden ser removidas a través de la combinación de procesos físicos, químicos y biológicos por medio de

sedimentación, precipitación, adsorción de las partículas de tierra, asimilación por las plantas y transformaciones microbianas (Kadlec & Wallace, 2009). En la actualidad se está trabajando en el proyecto “Implementación de Humedales Construidos para el Tratamiento de Agua Residual Doméstica en Ecosistema de Páramo” el cual consiste en la evaluación de este tipo de sistema de tratamiento (humedal construido de flujo sub-superficial horizontal) dentro del PNN Chingaza utilizando especies nativas.

El lugar principal de investigación es el punto de Piedras Gordas (Latitud 4°44´13” Norte y Longitud 73°50’31” Oeste) (MinAmbiente, 2014), caseta de entrada al parque Chingaza. Allí se da la bienvenida a los turistas, hay venta de boletería, suvenires y comida, además de estar equipada con baños para los visitantes y cocina para uso de los guardabosques. Este lugar genera aguas residuales a diario, siendo ésta de mayor cantidad los fines de semana y en temporada de vacaciones cuando el número de turistas aumenta.

El recinto al tener una población flotante debería estar equipado con un sistema de tratamiento capaz de remover los contaminantes según las cargas generadas, teniendo en cuenta que es un Parque Nacional Natural que no debe ser contaminado. Piedras Gordas actualmente cuenta con un sistema de tratamiento de aguas residuales que está compuesto por una trampa de grasas, un tanque séptico Imhoff, un tanque anaeróbico, un tanque aeróbico y un campo de infiltración (MinAmbiente, 2014). Con el proyecto se busca mejorar la calidad del agua antes de ser vertida en el campo de infiltración para no generar afectación del medio y por ende que sea beneficioso para la salud de aquellos que reciben en sus casas agua proveniente del Parque Nacional Natural Chingaza. El presente estudio se enfoca en hacer una descripción general de los microorganismos

encontrados en las raíces de cada una de las especies seleccionadas en el proyecto que se está llevando a cabo, los cuales juegan un rol importante en el tratamiento de los contaminantes del agua residual. Adicionalmente se busca analizar posibles relaciones que existan entre la forma de la raíz con el número total de microorganismos y la diversidad de morfotipos encontrados. Por último, se busca hacer una comparación entre los microorganismos registrados en la literatura que se encuentran en un humedal construido de flujo subsuperficial horizontal y en el suelo de los páramos con los encontrados en el presente estudio.

ANTECEDENTES

Humedales de Flujo Subsuperficial Horizontal En este estudio se quiere utilizar un humedal construido de flujo subsuperficial horizontal. Este tipo de humedales consiste en camas de tierra o grava plantadas con vegetación de humedal. En estos sistemas se desea que el agua residual permanezca debajo de la superficie del medio, fluyendo a través de las raíces y rizomas de las plantas. Este tipo de

humedales es utilizado comúnmente para el tratamiento de aguas residuales domésticas de viviendas unifamiliares o pequeñas comunidades. Por lo general se componen de tuberías de entrada y de salida, arcillas o revestimiento sintético para evitar filtraciones, el medio poroso de filtro, vegetación emergente, bermas y un sistema de control del nivel del agua. Este tipo de configuración se utiliza más en climas fríos por su habilidad de aislar la superficie (Kadlec & Wallace, 2009).

La vegetación de un humedal construido hace parte clave del buen funcionamiento del mismo. Las plantas llevan a cabo varios procesos físicos y hacen parte de otros ecológicos y químicos de gran importancia. Las plantas son de especial interés ya que hacen parte esencial en la remoción potencial de contaminantes del agua en un humedal construido. Es trascendente escoger plantas con un sistema de raíces desarrollado por varias razones. Proporcionan mayor superficie para que crezca biopelícula y hacen más diverso el medio microbiológico, adicionalmente utilizan exudados químicos que desintoxican los alrededores de las raíces (Brissom & Chazarenc, 2008).

Ilustración 1. Humedal de flujo subsuperficial horizontal (Kadlec & Wallace, 2009)

Las plantas cuentan con un periodo de crecimiento donde almacenan y liberan todo tipo de nutrientes siendo estos de utilidad para los procesos microbiológicos. Además las hojas y tallos de las plantas que se caen sirven como superficies aptas para la supervivencia de microorganismos que contribuyen a distintos procesos químicos de remoción de nutrientes (como por ejemplo los nitrificadores, denitrificadores y descomponedores). Las plantas si bien pueden interrumpir el flujo de oxígeno atmosférico con el agua por la falta de reaireación, también pueden ser fuente del mismo supliendo oxígeno directamente a través de sus raíces a sus vecindades más cercanas (Kadlec & Wallace, 2009).

En este tipo de humedales, la grava o tierra se encuentra inundada de manera continua, por lo que la tasa de difusión del oxígeno en los mismos es baja. Cuando no hay disponibilidad de oxígeno los microorganismos aeróbicos mueren o entran en estado de reposo. Es allí cuando proliferan comunidades microbianas anaerobias facultativas y anaerobias estrictas. Este tipo de microorganismos llevan a cabo procesos de respiración anaerobia que utilizan la materia orgánica como fuente de energía (Vymazal & Kropfelová, 2008). Dichos procesos son llevados a cabo por distintas comunidades microbianas.

Los humedales y medios acuáticos dan pie a condiciones óptimas de crecimiento a dos tipos de microorganismos importantes como lo son las bacterias y los hongos. Ambos juegan un papel crucial en la asimilación, transformación y reciclaje de compuestos orgánicos presentes en varios tipos de aguas residuales como por ejemplo las domésticas. Tales microorganismos son típicamente los primeros en colonizar estos medios y comienzan el proceso de descomposición de los sólidos presentes en aguas residuales y el uso de constituyentes disueltos presentes. Estos compuestos los pueden tomar directamente para su absorción y

transformación o pueden ser suministrados y al organismo con el cual están viviendo en una relación de simbiosis (planta) (Kadlec & Wallace, 2009).

Dentro de un humedal construido lo que se busca principalmente es aumentar el tiempo de contacto entre los contaminantes y los microorganismos para que de esta forma éstos puedan absorber, consumir o transformar los mismos contaminantes. Las especies presentes en un humedal construido pueden ser cada vez más jerárquicamente sofisticadas, cada una con una actividad enzimática única de bioconversión (Hammer, 2000). Hay investigaciones que demuestran que en este tipo de humedales construidos coexiste gran diversidad de comunidades microbianas con necesidades metabólicas diferentes. Esto se ha comprobado al ser medida la diferencia de concentración de donantes (oxígeno, nitrato y sulfato) y aceptores de electrones (amonio) y al ser detectada la presencia de productos intermedios y finales gaseosos como óxido nitroso, metano y sulfuro de dimetilo (Samsó & García, 2013).

Existen diversos tipos de procesos de intervención microbiana dentro de los humedales construidos de flujo subsuperficial. Estos están involucrados en los mecanismos de transformación de nutrientes como el nitrógeno, el fósforo, el azufre, el hierro y el manganeso. En el ciclo del nitrógeno se dan procesos de amonificación, volatilización del amonio, nitrificación, oxidación anaeróbica del amonio, denitrificación, fijación, asimilación y absorción de las plantas entre otros. En el ciclo del fósforo hay procesos de transformación y retención dentro de los humedales como por ejemplo la creación de turba, adsorción y precipitación de la tierra, consumo de la microbiota y de las especies vegetales. En cuanto al ciclo de azufre hay procesos de asimilación/desasimilación de sulfato reducción y oxidación inorgánica del

azufre (Vymazal & Kropfelová, 2008). Dichos procesos son llevados a cabo por comunidades microbianas como las bacterias o los hongos (microorganismos de interés del presente estudio).

Ahora bien, las bacterias son microorganismos unicelulares que se pueden clasificar por su morfología, características de tinción química, nutrición y metabolismo. Por lo general se pueden catalogar en cuatro tipos morfológicos: esféricas, bacilos, espirales y filamentosas (Hammer, 2000) tal y como lo muestra la Ilustración 2.

Ilustración 2. A) Esféricas, B) Bacilos C) Espirales (Hammer, 2000)

Las esféricas tienen una estructuración que depende del orden sucesivo de su división celular binaria. Estas pueden crecer en racimos y se denominan estreptococos. Los bacilos son los más comunes y tienen forma de barras o cilindros. Algunos bacilos tienden a formar cadenas y son generalmente motiles (se mueven por sí mismos). Las bacterias en espiral tienen forma cilíndrica, pueden ser vibriones las cuales son barras curvas, espirillas que son espirales rígidas o espiroquetas que son espirales capaces de flexionase y culebrear. Por último las filamentosas son muy largas pero tienen un diámetro pequeño (Hammer, 2000). Las formas bacterianas están condicionadas por rasgos hereditarios, de edad y condiciones ambientales. La mayoría de éstas son heterotróficas, lo que indica que suplen sus necesidades energéticas de compuestos

orgánicos. En los humedales éstas por lo general se encuentran asociadas con las superficies de las plantas, materia orgánica en decaimiento y en la tierra (Hammer, 2000).

Dentro de los humedales construidos, las bacterias quimioautotróficas son de vital importancia; éstas obtienen su energía de la oxidación de compuestos químicos inorgánicos reducidos y utilizan dióxido de carbono como fuente de carbono para la síntesis celular. Dentro de éstas se encuentran las bacterias del género Nitrosomonas, las cuales oxidan nitrógeno amoniacal a nitritos y las del género Nitrobacter oxidan los nitritos a nitratos derivando energía, la cual es utilizada en el metabolismo de la célula (Kadlec & Wallace, 2009). Otros géneros como Beggiatoa producen energía de la oxidación del sulfuro de hidrógeno, Thiobacillus oxidan azufre elemental y hierro ferroso y las Pseudomonas oxidan hidrógeno gaseoso. Por otro lado en procesos anaeróbicos, los géneros de Pseudomonas y Bacillus utilizan nitrógeno en forma de nitrato como aceptor final de electrones, llevando a cabo procesos de denitrificación y produciendo nitritos, óxidos de nitrógeno o nitrógeno gaseoso. El género Desulfovibrio usa sulfatos y el Methanobacterium usa carbonatos como aceptores finales de electrones formando sulfuro de hidrógeno y gas metano respectivamente (Kadlec & Wallace, 2009).

Por su lado los hongos se califican como microorganismos eucariotas que tienen un núcleo separado del citoplasma por una membrana. Todos los hongos son heterotróficos y obtienen su energía y requerimientos de carbono de la materia orgánica. Su nutrición es primordialmente saprofítica, es decir que se basa en la degradación de la materia orgánica muerta, siendo parte importante en el reciclaje de nutrientes como el carbono en medios acuáticos. Los hongos viven en relaciones simbióticas con algas y raíces (formando

micorrizas como lo muestra la Ilustración 3) (Kadlec & Wallace, 2009).

Ilustración 3. Vista frontal de una micorriza (Osorio, 2006)

Los hongos son mediadores en todos los aspectos de producción, descomposición y retención de materia orgánica, además de jugar un rol importante en la mineralización y el ciclo del nitrógeno y el fósforo. Por un lado, los filos Ascomycota, Basidiomycota y Glomeromycota tienen una alta producción de enzimas degradadoras de materia orgánica, lo cual es óptimo en su rol degradador en estos medios (Eldor, 2015). En cuanto al ciclo del nitrógeno, en los humedales construidos, o en los procesos de nitrificación heterotrófica, los hongos del género Aspergillus, Penicilium y Cephalosporium son parte importante de los mismos (Vymazal & Kropfelová, 2008). En los procesos de denitrificación el género Ascomycota tiene un rol importante en la producción del óxido nitroso. Dentro del ciclo del fósforo los géneros Ascomycota, Basidiomycota y Glomeromycota producen enzimas específicas para la hidrolización de fosfatos (Eldor, 2015).

Por otra parte, los hongos filamentosos ayudan a la producción primaria de las especies vegetales a través de asociaciones con las raíces (micorrizas), donde el hongo provee beneficios nutricionales a las especies vegetales, ayudando en la absorción de macronutrientes, microelementos y agua del medio (Eldor, 2015). Los hongos reciben

carbohidratos fotosintéticos por parte de las plantas. Hay dos tipos de micorrizas según su condición morfológica, las ectomicorrizas y las endomicorrizas, las primeras se forman fuera de las raíces de las plantas y las segundas adentro. Las endomicorrizas cuentan con vesículas y arbúsculos, por lo que se conocen como micorrizas vesículoarbusculares (VA). Las micorrizas VA reciben el carbono de la planta y la reparten gradualmente a las demás comunidades microbianas de la rizósfera. Adicionalmente este tipo de micorrizas se asocian con la transferencia de fósforo en forma de polifosfato, sulfatos, amonio y nitratos a la planta hospedera. Por su parte las endomicorrizas tienen un rol principal en la absorción particularmente del amonio, ya que cuenta con estructuras de absorción de las formas orgánicas del nitrógeno necesarias para el metabolismo de las plantas (Eldor, 2015).

Microrganismos presentes en el

suelo y las raíces de plantas de

páramo Los páramos son ecosistemas acumuladores de agua, donde todos sus sistemas han desarrollado mecanismos de almacenamiento de agua incluyendo el componente del suelo. El clima frío y húmedo que caracteriza a los páramos reduce la actividad microbiana (IDEA-UNAL, 2015). Por lo tanto la evolución de la materia orgánica se encuentra restringida y se presentan procesos de humificación y mineralización de restos orgánicos lentamente generando acumulación de materia orgánica parcialmente descompuesta (Cárdenas & Cleef, 1996). En cuanto a la composición de las bacterias en el suelo del páramo, estas dependen de igual manera de la disponibilidad de nutrientes en el medio. Principalmente en la rizósfera hay bacterias que participan en la fijación del nitrógeno como Rhizobium, Azospirillium o Acetobacter entre otros procesos como el ciclo del fósforo y el crecimiento de la planta (Osorio, 2006).

Para dichas características del suelo, la vegetación de los páramos ha desarrollado adaptaciones que se relacionan de manera directa con la presencia de micorrizas arbusculares y vesículo-arbusculares (MA-VA), hongos solubilizadores de fosfatos (el fósforo presente es insoluble y no utilizable por las plantas), hongos filamentosos, bacterias promotoras de crecimiento (PGPR) y rizobacterias entre otros (García, García, & Correa de Restrepo, 2005).

Las micorrizas son esenciales en el reciclaje de los nutrientes y en la adaptación de condiciones extremas de clima y de los suelos de alta montaña que presentan características como acidez, baja disponibilidad de nutrientes siendo relevante el fósforo y saturación de compuestos como el aluminio (García, García, & Correa de Restrepo, 2005). Las micorrizas MA-VA absorben agua y nutrientes y se encargan de transportar los mismos a las plantas con las cuales se asocian y las que se conectan a través de la estera de raíces formadas por comunidades vegetales vecinas. Este tipo de raíces cuentan con estructuras como las hifas extramatriarcales que aumentan la longitud del área de absorción de una planta, aumentando su alcance de agua y nutrientes. También cuentan con vesículas para el almacenamiento de nutrientes. Adicionalmente juegan un rol saprofitico, favoreciendo procesos de descomposición en especies con necromasa (García, García, & Correa de Restrepo, 2005).

Las raíces que cuentan con micorrizas sintetizan enzimas fotosintéticas que son utilizadas por los hongos para su crecimiento, lo cual ayuda simultáneamente la respiración de la planta, aumentado su área foliar. Éstas también al estar influenciadas por los hongos, producen exudados que alteran en pH ácido del suelo y reducen la cantidad del dióxido de carbono (Coba de Gutiérrez). En cuanto a la disponibilidad de nutrientes como el fósforo, los hongos pueden transforman compuestos

de ortofosfatos escasamente solubles en formas solubles que son asimilables por las plantas para su crecimiento. Los géneros Aspergillus y Penicillium son géneros de hongos que comúnmente tienen la capacidad de solubilizar varios tipos de fosfatos (Cepeda et al, 2005).

METODOLOGÍA A través de la Resolución Número 106 del 16 de Septiembre del 2014, el Ministerio de Ambiente y Desarrollo Sostenible otorga “el permiso individual de recolección de especímenes de especies silvestres de la diversidad biológica con fines de investigación científica no comercial” dentro del PNN Chingaza para el desarrollo del proyecto. Las especies recolectadas están siendo plantadas dentro de los microcosmos (simulación de un humedal construido a pequeña escala) a los cuales se les introduce agua residual para luego evaluar cuál de las asociaciones de especies seleccionadas presentan un mejor desempeño en la remoción de algunos contaminantes. Las especies fueron seleccionadas por sus características tales como alta tasa de crecimiento, buena capacidad de adaptación a cambios del medio (tolerancia a las condiciones de un humedal construido), buena propagación clonal vegetativa, alta cantidad de biomasa y un sistema radicular desarrollado (Brissom & Chazarenc, 2008).

Dentro del proyecto las especies seleccionadas fueron: Eccremis coarctata, Chusquea tesellata, Cortadeira columbiana, Elaphoglussum engelli, Juncus echinocephalus y Paepalanthus columbiensis. En un sitio aledaño a la caseta de Piedras Gordas se ubicaron 5 microcosmos con su respectiva réplica con diferentes asociaciones de especies identificadas en el Parque Nacional Natural Chingaza. Adicionalmente se ubicaron dos microcosmos sin plantas como controles o blancos en el experimento.

Tabla 1. Descripción especies seleccionadas SIB (Sistema de Información sobre Biodiversidad en Colombia).

Se sustrajeron muestras de raíz de cada una de las especies seleccionadas. Las muestras fueron envasadas y refrigeradas a 4°C. Se pesó un (1) gramo de cada raíz. Para cada especie se hizo un conteo de raíces, se le midió el largo y el diámetro a cada una con un calibrador. Se hizo una sumatoria de los largos y un promedio de diámetros, para luego calcular un área superficial aproximada a cada especie como si éstas tuvieran forma de cilindro. Luego cada gramo fue introducido en un tubo de ensayo con 9 ml de agua destilada para cada especie. Los tubos de ensayo fueron introducidos en un sonicador Elmasonic-E60H® durante tres (3) minutos para así desprender a los microorganismos de las raíces. Un sonicador convierte una señal eléctrica en una vibración física que en este caso se utiliza para separar la raíz de las células de los microorganismos para ser estudiados en detalle (QSONICA, 2015).

Se prosiguió a elaborar el método de conteo de células viables donde en un principio se hicieron diluciones de las raíces sonicadas (la muestra original) como lo muestra la Ilustración 4. La primera dilución corresponde a 10−1, la segunda a 10−2 y así sucesivamente. Con las diluciones elaboradas se prosiguió a elaborar el procedimiento de la

siembra en placa por extensión. Este método consiste en la extensión de 0.1 ml de cada dilución con un rastrillo de vidrio estéril sobre la superficie de una placa de medio de cultivo solidificado en una caja de Petri estéril. Dicho medio se selecciona de acuerdo al tipo de microorganismo que se desea cultivar. En este caso se hizo uso de TSA (Agar de soja tríptico), el cual es un medio selectivo para el crecimiento de bacterias y de PDA (Agar de patata y dextrosa) el cual se utiliza para el crecimiento de hongos y levaduras (Echandi, 1967).

Para el presente caso se hicieron 9 diluciones. Al extender el volumen de cada muestra en las cajas de Petri se vuelve a diluir el cultivo al ser este cambiado de medio. La dilución en un tubo de ensayo con 10−1, en la caja de Petri tiene una dilución de 10−2 y así sucesivamente. Se hicieron cultivos en caja

desde 10−5 hasta 10−10 para el caso del TSA y PDA. Las cajas de Petri con TSA fueron aisladas con plástico e incubadas por 24 horas a 30.4°C. Las cajas de Petri con PDA fueron aisladas con plástico e incubadas por 7 días a la misma temperatura. Todas las placas se incubaron con la tapa hacia abajo para el óptimo crecimiento de los microorganismos.

De las siembras masivas realizadas con TSA, se escogieron 9 cajas diferentes con muestras representativas de las especies microbianas en las seis especies de estudio. De estas cajas se hizo una siembra selectiva de las especies encontradas para lograr una identificación separada de los microorganismos encontrados. Con un asa estéril se tomó una muestra de cada uno de los morfotipos de interés encontrados, muestras que se sembraron por separado para aislar los

microorganismos encontrados. Para la identificación del tipo de bacterias y levaduras se utilizó la técnica de la tinción de Gram para luego fueron observadas en el microscopio. En el caso de los hongos se utilizó cinta adhesiva para tomar muestras directamente de las cajas de Petri sembradas, que luego fueron teñidas con azul de metileno para finalmente ser observadas bajo el microscopio y proseguir con su identificación.

Ilustración 4. Método de conteo de células viables (Tortora et al, 2007)

TOMA DE DATOS

Ilustración 5. Chusquea tessellata (Autor)

Ilustración 6.Eccremis coarctata (Autor)

Ilustración 7. Juncus echinocephalus(Autor)

Ilustración 8. Cortadeira columbiana (Autor)

Ilustración 9. Elaphoglossum engelli (Autor)

Ilustración 10. Paepalanthus columbiensis (Autor)

Tabla 2. Datos tomados de las raíces en estudio

RESULTADOS

Conteo de microorganismos A continuación se presentan los resultados del conteo en placa por extensión de microorganismos

para el caso de bacterias, hongos y levaduras. Para este cálculo se hizo uso de la siguiente

ecuación:

𝑈𝐹𝐶

𝑔(𝑟𝑎í𝑧)=

𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎𝑑𝑎𝑠 𝑥 𝐹𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛

𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑖𝑒𝑚𝑏𝑟𝑎 𝑒𝑛 𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎

Ecuación 1.

Tabla 3. Conteo microorganismos Especie 1






Identificación de Bacterias A continuación se presenta la identificación del tipo de morfología y las características de tinción

encontradas en las 9 cajas seleccionadas con muestras representativas de los microorganismos

encontrados. También se hizo un registro fotográfico de las cajas seleccionadas en conjunto con

sus siembras selectivas y sus vistas al microscopio.

Tabla 9. Identificación tipo de bacterias

*Para ver el registro fotográfico completo de las siembras masivas y selectivas en PDA y sus

respectivas vistas al microscopio de las bacterias remítase al ANEXO 3.1 y ANEXO 3.2. Las

imágenes fueron tomadas por el Autor de este trabajo.

Ilustración 11. Ejemplo: Caja 3, siembra selectiva morfotipo 2 y microscopio de Chusquea tessellata

En las siguientes cajas de siembra selectiva se encontraron dos especies por lo que se tuvo que

hacer una siembra aislada de nuevo:

Tabla 10. Cajas con dos tipos de bacterias - Descripción física

Tabla 11. Identificación tipo de bacterias

Identificación de Hongos

Macroscópica

Para cada una de las cajas de siembra masiva en PDA se hizo una descripción morfológica de cada

uno de los morfotipos encontrados. Se describió el color y la textura de la superficie y el color del

envés (parte inferior de la estructura fúngica).

Tabla 12. Identificación macroscópica de hongos Especie 1






Microscópica

Para la descripción microscópica de hongos se hizo uso de las siguientes claves taxonómicas:

Hongos anamórficos, conidiales o mitospóricos y del filo Zygomycota (Cepero de García, 2012).

Tabla 18. Identificación de hongos con claves taxonómicas Especie 1






Ilustración 12. EJEMPLO: Siembra masiva PDA y vista microscopio para hongo tipo 5) de Chusquea Tessellata

Identificación de Levaduras Tabla 24. Identificación macroscópica y microscópica de levaduras Especie 2

Tabla 25. Identificación macroscópica y microscópica de levaduras Especie 3

Tabla 26. Identificación macroscópica y microscópica de levaduras Especie 6

*Para ver el registro fotográfico completo de las siembras masivas en PDA y sus respectivas vistas

al microscopio de los hongos remítase al ANEXO 3.3 y ANEXO 3.4. Las imágenes fueron tomadas

por el Autor de este trabajo.

Ilustración 13. EJEMPLO: Siembra masiva PDA y vista microscopio para la levadura encontrada en las raíces de Paepalanthus columbiensis

Número de morfotipos Para cada una de las especies seleccionadas se contaron el número de morfotipos encontrados

tanto de bacterias como hongos, no se tuvo en cuenta la levadura al solo encontrar una. En el

medio selectivo de PDA crecieron dos morfotipos, correspondientes a las especies Eccremis

coarctata y Juncus echinocephalus, que al ser observadas bajo el microscopio se determinó que se

trataba de bacterias aunque se le haya aplicado al medio antibiótico antes de la siembra.

Tabla 27. Número de morfotipos de bacterias y hongos

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN En cuanto al tipo de microorganismos encontrados en las raíces de las especies seleccionadas se puede concluir que para el caso de las bacterias el único tipo morfológico encontrado fueron bacilos para todas las cajas cultivadas. En el caso de los hongos, el género que más se encontró dentro de todas las raíces muestreadas fue el de Penicilium. Dentro del marco de esta investigación se esperaba encontrar una mayor diversidad de géneros de bacterias, teniendo en cuenta las características del suelo de donde éstas fueron obtenidas. El tipo de microorganismos que se encuentra con mayor abundancia está condicionado por los nutrientes disponibles en el medio del cual fueron extraídos. En este caso es difícil determinar las condiciones en las que se encontraban los microorganismos ya que los bacilos participan en procesos tanto aeróbicos como anaeróbicos en el ciclo de nutrientes como el del nitrógeno. Por su lado la presencia del género Penicilium puede indicar la existencia de hongos solubulizadores de fosfatos, provenientes del suelo del páramo.

Ahora bien, la especie que cuenta con una mayor área superficial aproximada de raíces extraídas es Elaphoglossum engelli, le sigue Eccremis coarctata, luego Juncus echinocephalus, Chusquea tessellata, Paepalanthus columbiensis y finalmente Cortadeira Columbiana. En cuanto a la relación existente entre el área superficial de las raíces con el número de microorganismos de bacterias y hongos encontrados, se puede concluir que en este estudio no se encuentra una correlación directa, ya que la especie con menor número de microorganismos tanto de hongos como de bacterias no concuerda con la especie que cuenta con la menor área superficial aproximada. Sin embargo, en estas medidas no se tuvieron en cuenta las ramificaciones pequeñas que salían de los segmentos de raíz principal para cada caso, pudiendo tener alguna influencia en el resultado final.

Se observa que la raíz que cuenta con mayor cantidad de ramificaciones pequeñas es la que tiene más bacterias contadas en placa siendo ésta la especie 5, Elaphoglossum engelli. Esta especie al ser un helecho presenta una raíz fibrosa además de

presentar rizomas (tallo subterráneo y horizontal al suelo) (Kumar, Fernández, & Revilla, 2010) donde mayor cantidad y tipos de microorganismos pudieron ser sonicados y luego cultivados en el laboratorio. Aunque esta condición se cumple para la especie con mayor número de microorganismos no es posible concluir que a medida que haya menor área superficial se encuentre un menor número de microorganismos y de morfotipos. Al no haberse definido como un aspecto a tener en cuenta en un principio de la investigación, no es posible conocer la especie que cuenta con menor número de ramificaciones y por lo tanto menor área superficial total.

Se debe tener en cuenta por ejemplo, como lo estableció un estudio llevado a cabo en la Universidad de Waterloo en Ontario, Canadá, que los patrones de colonización de las comunidades microbianas en las raíces de una planta están condicionados por las regiones donde los exudados son liberados. Esto quiere decir que las colonias se forman donde los exudados de las raíces son liberados siempre y cuando éstos no sean inhibitorios para su crecimiento (Polonenko & Mayfield, 1979). En este caso de investigación, no se tuvo en cuenta si se extrajo la parte de la raíz donde se secretan exudados, de haber sido así un mayor número de microorganismos y de morfotipos se pudo haber cultivado como principal interés del estudio.

En cuanto al número de morfotipos encontrados para bacterias, la especie en la que se encuentra una mayor variedad es Chusquea tessellata con cinco morfotipos, seguida por Juncus echinocephalus con cuatro, luego por Elaphoglossum engelli y Eccremis coarctata con tres, Cortadeira Columbiana con dos y finalmente Paepalanthus columbiensis con un solo morfotipo. Con respecto a los morfotipos de los hongos encontrados, la especie en la que se encuentra una mayor variedad es Chusquea tessellata con siete morfotipos,

seguida por Paepalanthus columbiensis con cinco, luego por Cortadeira Columbiana con cuatro, Elaphoglossum engelli con dos y finalmente Eccremis coarctata y Juncus echinocephalus con un solo morfotipo. La especie que tiene un mayor número de morfotipos tanto de bacterias como de hongos es la especie 1, Chusquea tessellata, sin embargo la especie que cuenta con el menor tipo de morfotipos para bacterias no es la misma con el menor número de morfotipos de hongos. Si se desea saber cúal sería esta relación se deberían emplear otros métodos de identificación como lo son los estudios genéticos para tener en cuenta la porción no cultivable de cada raíz, y esto puede variar de especie a especie.

En un estudio realizado en California, EEUU, se determinó que en un humedal construido de flujo subsuperficial que trata aguas residuales domésticas, la comunidad bacteriana está compuesta principalmente por los siguientes grupos filogenéticos: Bacillus, Clostridium, Mycoplasma, Eubacterium y Proteobacteria (Ibekwe, Grieve, & Lyon, 2003). En otro estudio en Dinamarca, en varios tipos de humedales construidos se encontró que en los de tipo de flujo subsuperficial varios hay géneros de bacterias tales como Acinetobacter, Arthrobacter y Bacillus (bacterias potencialmente denitrificadoras) (Adrados et al,2014). Los microorganismos encontrados en este trabajo tienen morfologías similares a la de los estudios previamente descritos. Los microorganismos encontrados en las raíces de estas plantas de páramo, tienen características potenciales de algunas comunidades microbianas de los humedales construidos de flujo subsuperficial, sin embargo se necesitan más pruebas y estudios que determinen el género y la especie de los microorganismos cultivados y así obtener conclusiones determinantes.

En otros estudios relacionados con la identificación de la comunidad bacteriana en

humedales construidos realizados en la ciudad de Mahdia en Tunisia, donde se utiliza un humedal construido de flujo subsuperficial horizontal para tratar aguas residuales, se hicieron pruebas genéticas a los microorganismos, estableciendo que el filo más abundante es el de las Proteobacterias (uno de los filos más abundantes en el suelo de alta montaña (Lizarazo & Gómez, 2015)), seguido por Bacterioidetes, Planctomycetes y Chloroflexi. Este tipo de bacterias juegan un rol importante en la degradación de la materia orgánica y en el ciclo del nitrógeno (Bouali et al, 2012).

Con lo referente a la caracterización de microorganismos en suelo de páramo, en una investigación realizada en los páramos de Santa Inés y Frontino-Urrao de Antioquia, el género más abundante encontrado fue el de Bacillus, este tipo de bacterias presenta un crecimiento simbionte, comensal o mutualista en interacción con raíces (Lizarazo & Gómez, 2015). En el presente estudio en Chingaza, como ya se dijo antes, únicamente se encontraron bacilos, siendo estos también morfológicamente similares a los encontrados en el estudio mencionado anteriormente.

En cuanto al conteo en placa de los microorganismos de este estudio para el caso de las bacterias se obtuvo un rango entre UFC x 107𝑔 (𝑟𝑎í𝑧)−1 y UFC x 1012𝑔 (𝑟𝑎í𝑧)−1. Para el caso de los hongos se obtuvo un rango entre UFC x 102𝑔 (𝑟𝑎í𝑧)−1 y UFC x 105𝑔 (𝑟𝑎í𝑧)−1. No se encontraron estudios que hicieran muestreo y conteo de microorganismos exclusivamente en raíz. Los muestreos microbiológicos realizados toman tierra de la rizósfera, ya que en esta zona se encuentran comunidades microbianas claves para el crecimiento y asimilación de nutrientes y compuestos de interés en los humedales construidos. Los resultados reportados se dan por gramo de tierra extraída, como por ejemplo en el estudio realizado en la Isla subantártica de Marion, se reportan para bacterias un rango de UFC x

104𝑔 (𝑡𝑖𝑒𝑟𝑟𝑎)−1 y para hongos un rango de UFC x 103𝑔 (𝑡𝑖𝑒𝑟𝑟𝑎)−1 (Smith & Steyn, 1982). En un estudio del suelo en Gran Bretaña se presentan ordenes de UFC x 106𝑔 (𝑡𝑖𝑒𝑟𝑟𝑎)−1 para bacterias (Maltby, 2015). En los estudios de humedales construidos mencionados, (Ibekwe, Grieve, & Lyon, 2003), (Adrados et al,2014) y (Bouali et al, 2012), se hicieron muestreos microbiológicos de la rizósfera de los humedales construidos, ya que estos se componen de tierra y no de grava.

De las seis especies plantadas en los microcosmos, cinco de ellas presentaron sobre sus estructuras algunas formaciones no esperadas durante el periodo de seguimiento. En las especies Eccremis coarctata, Chusquea tessellata y Paepalanthus columbiensis se presentaron puntos negros. La especie Cortadeira columbiana presentó puntos pequeños de color café y Elaphoglossum engelli presentó machas blancas. Cada una de las condiciones fue estudiada en el Laboratorio de Fitipatología de la Universidad de los Andes (Olaya, 2015). De la especie Eccremis coarctata no fue posible el cultivo de patógenos, sin embargo en observación directa se encontraron posibles esporas de Curvularia spp (Olaya, 2015), el cual es un hongo filamentoso, patógeno para plantas y suelos (UDEA, 2011). Para el caso de las especies Chusquea tessellata y Cortadeira Columbiana se identificó la presencia de Cladosporium spp siendo este un hongo típico del suelo el cual se pudo provenir de la tierra de las raíces (Olaya, 2015). En cuanto a Paepalanthus columbiensis y Elaphoglossum engelli no se encontraron estructuras fúngicas que estuvieran poniendo en riesgo las plantas.

Para este estudio, la presencia de este tipo de patógenos pudo influir en los resultados ya que las plantas cuentan con mecanismos de resistencia para afrontar el ataque de los mismos. Por ejemplo, algunas plantas pueden secretar exudados radiculares como forma de

defensa al ataque de agentes externos que pongan en riesgo su estado (UTM, 2006), siendo esto un factor determinante en la composición microbiana de las raíces. Las muestras de este estudio fueron tomadas una vez las especies recolectadas fueron plantadas en los microcosmos y no se tuvo en cuenta si las plantas se encontraban con agentes externos en el momento de extracción de la raíz.

En un estudio realizado por la Universidad Nacional de Colombia, se identificó que la micorrización en raíces en un páramo se ve afectada por la edad de las especies vegetales y de la época del año (en términos de temporadas secas y húmedas) (García et al, 2005). Hay niveles más altos de micorrizas en plántulas y juveniles durante la época seca y los más bajos se presentaron en los adultos durante la época de mayor precipitación. Este pudo ser otro factor determinante dentro del muestreo de microorganismos del presente estudio, ya que de haber tomado una muestra de raíces en otra época del año o en especies de distinta edad, los resultados podrían ser diferentes. En el caso de plantas jóvenes, una mayor cantidad de micorrizas se expresa por el desarrollo de procesos fisiológicos de las especies vegetales como el incremento de la biomasa o procesos reproductivos que necesitan más nutrientes. Durante la época seca los hongos en las plantas jóvenes se activan bajo condiciones de estrés hídrico (García et al, 2005).

Los estudios microbiológicos de páramo se han restringido a los ubicados en Cundinamarca y se han empleado las técnicas dependientes del cultivo. Se han determinado poblaciones de hongos rizosféricos y de suelo y comunidades bacterianas en los páramos de Guasca y Cruz Verde en el 2007 y 2008. También se determinaron bacterias diazotróficas y hongos solubilizadores de fósforo en el páramo de Guerrero en el 2006. Así mismo, se determinó la microbiota rizosférica de los páramos de Santa Inés y de

Frontino-Urrao en Antioquia (Lizarazo & Gómez, 2015), entre otros estudios realizados por universidades del país. Este estudio es un punto de partida para una investigación futura más grande y específica acerca de la biodiversidad que presentan estos ecosistemas inexplorados. Los resultados de este trabajo son un aporte al registro y conocimiento de la microbiota de los suelos de los páramos colombianos, área de bajo estudio e investigación del área microbiológica en el país.

CONCLUSIONES

El único morfotipo de bacterias encontrado en este estudio fue el de bacilos y el género más abundante de los hongos en todas las raíces muestreadas fue el de Penicilium. No se encontraron relaciones directas entre el área superficial aproximada de las raíces y el número de microorganismos contados en placa así como la diversidad de morfotipos encontrados en cada especie. Se deben tener más factores en cuenta a la hora de un muestreo microbiológico como el de este estudio como lo son la zona de secreción de exudados en la raíz, la edad de las plantas, la época de extracción de la muestra y el tipo de matriz muestreada (no solo hacer cultivos de raíz sino también incluir rizósfera en el mismo).

RECOMENDACIONES

Para la continuación de este trabajo se deben tener varios factores en cuenta para obtener resultados más específicos y concluyentes. Primero, este tipo de estudios necesitan largos tiempos de monitoreo debido a que los ciclos de los nutrientes son de larga duración. Si se desea hacer una debida caracterización de la comunidad microbiana cultivable de los microcosmos se debe tener en cuenta que las condiciones del medio cambian según la

época del año, modificando los nutrientes disponibles y por lo tanto las comunidades microbianas activas. El tipo de microorganismos cambia según el momento del ciclo en el que se encuentren los nutrientes en el medio, ya sea en suelo o grava como para el caso del humedal.

También se recomienda que para investigaciones futuras se hagan cultivos selectivos de microorganismos aún más específicos como por ejemplo bacterias nitrificadoras, denitrifacdoras, fijadoras de nitrógeno o heterotróficas, para así poder hacer una comparación más directa con los estudios previamente realizados en este tipo de humedales construidos alrededor del mundo y en otros suelos de páramo principalmente en el país.

En un estudio realizado por la Universidad Politécnica de Cataluña-Barcelona sobre la distribución y dinámica de la comunidad bacteriana en humedales construidos de flujo subsuperficial indica que el tiempo de estabilización de la comunidad bacteriana se establece entre 400 y 700 días. Según sus resultados de medición y modelación, se indica que las comunidades bacterianas en el humedal construido varían según el sitio del cual sean extraídas, ya que las condiciones de nutrientes y disponibilidad de oxígeno varía para cada zona tal como lo indica la Ilustración 14 (Samsó & García, 2013).

Ilustración 14. Distribución bacterias en un humedal construido de flujo subsuperficial (Samsó & García,

2013)

Al hacer la revisión bibliográfica del presente estudio, se evidencia la importancia del muestreo no sólo de la raíz de la especie vegetal, también es necesario hacer cultivos de la rizósfera donde se llevan a cabo la mayor parte de los procesos de transformación y asimilación de nutrientes beneficiosos para las plantas. Tomar muestras del suelo de extracción de las especies de recolección daría un mejor entendimiento del medio donde se encuentran los microorganismos, determinando sus necesidades energéticas y prediciendo sus posibles procesos metabólicos. Adicionalmente se deben hacer estudios de caracterización físico-química del suelo o del medio donde se vayan a plantar las especies vegetales dentro de los microcosmos, ya sea con tierra o con grava, ya que se deben tener en cuenta las condiciones bajo las cuales están expuestos los microorganismos en estudio.

El método de conteo en placa solo permite la evaluación aproximada entre el 1-10% de los microorganismos presentes, ya que la mayoría de estos no son cultivables en las condiciones del laboratorio (Truu & Juhanson, 2009). Por lo tanto este método genera una subestimación de la verdadera abundancia y diversidad de los microrganismos que se desea muestrear. Es por lo tanto recomendable, hacer estudios de biología molecular de ADN para así tener un mayor rango de caracterización de microorganismos en estudios y ahondar en la especificidad de los mismos al momento de caracterizarlos. Está por ejemplo la investigación realizada en la ciudad de Mahdia en Tunisia, en un humedal construido de flujo subsuperficial horizontal, en la cual se realizó una caracterización de la comunidad microbiana de bacterias y arqueas extrayendo y ampliando con PCR genomas de muestras de la rizósfera del humedal, utilizando primers específicos con la técnica 16S rRNA, ampliamente utilizada en investigaciones recientes (Boual et al , 2012).

ANEXO 1: PLANTAS UTILIZADAS

Especie 1: Chusquea tessellata

Especie 2: Eccremis coarctata

Especie 3: Juncus echinocephalus

Ilustración 15. Chusquea tessellata en su hábitat natural y registro del SIB

Ilustración 16. Eccremis coarctata en su hábitat natural y su registro del SIB

Ilustración 17. Juncus echinocephalus en su hábitat natural y su registro del SIB

Especie 4: Cortadeira columbiana

Especie 5: Elaphoglossum engelli

Especie 6: Paepalanthus columbiensis

Ilustración 18. Cortadeira Columbiana en su hábitat natural y su registro del SIB

Ilustración 19. Elaphoglossum engelli en su hábitat natural y su registro del SIB

Ilustración 20. Paepalanthus columbiensis en su hábitat natural y su registro del SIB

ANEXO 2: MICROCOSMOS Y ASOCIACIONES

Ilustración 21. Microcosmos ubicados en el punto de Piedras Gordas

Ilustración 24. Eccremis coarctata & Elaphoglussum engelli

Ilustración 22. Cortadeira columbiana & Paepalanthus columbiensis

Ilustración 23. Chusquea tesellata & Eccremis coarctata

Ilustración 27. Juncus Echinocephalus & Eccremis coarctata

Ilustración 26. Cortadeira Columbiana, Eccremis coarctata y

Elaphoglussum engelli

Ilustración 25. Blanco

ANEXO 3: REGISTRO FOTOGRÁFICO

3.1 Bacterias: Siembra masiva

Ilustración 42. Caja 1 Ilustración 41. Caja 2




Ilustración 49. Caja 9

3.2 Bacterias: Siembra selectiva y microscopio

Ilustración 51. Caja 1- Especie 3 Ilustración 50. Siembra Caja 1 Especie 3

Ilustración 53. Siembra Caja 2 Especie 3 Ilustración 52. Caja 2- Especie 3

Ilustración 55. Siembra Caja 3 Especie 1 Tipo 2 Ilustración 54. Caja 3 Especie 1 Tipo 2


Ilustración 58. Siembra Caja 4 Especie 1 Ilustración 57. Caja 4 Especie 1


Ilustración 63. Siembra Caja 8 Especie 4 Tipo 1 Ilustración 62. Caja 8 Especien 4 Tipo 1



Ilustración 70. Siembra Caja 3 Tipo 1 Especie 1 Manchas

Ilustración 68. Caja 3 Tipo 1 Especie 1 Manchas

Ilustración 71. Siembra Caja 5 Especie 5 Grandes

Ilustración 73. Siembra Caja 5 Especie 5 Pequeñas

Ilustración 72. Caja 5 Especie 5 Pequeñas

Ilustración 69. Caja 5 Especie 5 Grandes

Ilustración 75. Siembra Caja 7 Especie 2 – Lineales

Ilustración 74. Caja 7 Especie 2 – Lineales

Ilustración 77. Siembra Caja 7 Especie 2 – Manchas

Ilustración 76. Caja 7 Especie 2 – Manchas

3.3 Hongos y levaduras: Siembra masiva

Ilustración 79. Siembra Especie 1 Ilustración 78. Siembra Especie 1

Ilustración 81. Especie 2 Ilustración 80. Especie 2





3.4 Hongos y Levaduras: Microscopio

Ilustración 90. Especie 1 - Hongo tipo 1 Ilustración 91. Especie 1 - Hongo tipo 2



Ilustración 97. Especie 2 - Levadura Ilustración 96. Especie 3 - Levadura



Ilustración 103. Especie 6- Hongo tipo 1 Ilustración 102. Especie 6 – Hongo tipo 2

Ilustración 105. Especie 6 - Hongo tipo 3

Ilustración 107. Especie 6 tipo 4 Ilustración 106. Especie 6 Levadura

Ilustración 104. Especie 6 - Hongo tipo 4

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