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INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE: PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
ASESOR EXTERNO: Dr. Luc Dendooven ASESORA INTERNA: Dra. Olivia Franco Hernández
México, D. F. Junio 2009
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE INGENIERO
PRESENTA: Conrado Martínez Suárez
Ex-lago de Texcoco Contaminado con Fenantreno y Antraceno, Utilizando Técnicas de Biología Molecular
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Agradecimientos En primer lugar quisiera agradecer a todos los integrantes del laboratorio de
Ecología de Suelos del Departamento de Biotecnología y Bioingeniería del
CINVESTAV quienes me brindaron su apoyo en estos últimos meses, de manera
particular a las siguientes personas: al M. en C. Fabián Fernández Luqueño, al M. en
C. César Valenzuela Encinas, al M. en C. Edgar Vázquez Núñez y al Dr. Javier Díaz de
la Serna Zavala, cuya ayuda fue fundamental para la culminación de este proyecto.
Además, al Dr. Luc Dendooven por su infinito apoyo y consejo; a la Dra. Olivia
Franco Hernández, por sus lecciones a lo largo de la Licenciatura y asesoría en este
proyecto; a Eduardo Jiménez Zurita por su larga amistad y aportaciones a este
trabajo; a mis compañeros de la UPIBI Efraín, Diana, Jenni y Gaby, por soportarme
durante estos cuatro arduos años; y finalmente, de manera muy afectuosa, a mis
padres y familia por haber estado siempre ahí en todo momento. Muchas gracias.
IV
4.2. Suelos Salinos y Sódicos............................................................................................................ 7 4.2.1. Ubicación y descripción del Exlago de Texcoco.................................................... 7 4.2.2. Características generales de los suelos del Ex – Lago de Texcoco ................. 8
4.3. Hidrocarburos del Petróleo ..................................................................................................... 9 4.3.1. Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos ..................................................................... 9 4.3.1.1. Riesgos a la salud ...........................................................................................................11
4.4. Tecnologías para la remediación de sitios contaminados........................................12 4.4.1. Tratamiento in situ............................................................................................................13 4.4.2. Tratamiento ex situ ...........................................................................................................13
5. METODOLOGÍA....................................................................................................................................24 5.1. Muestreo del suelo ....................................................................................................................24 5.2. Preparación del suelo...............................................................................................................24 5.3. Diseño Experimental y tratamientos propuestos ........................................................24 5.3.1. Contaminación del suelo ................................................................................................26
6. RESULTADOS........................................................................................................................................32 6.1. Caracterización del suelo del Exlago de Texcoco .......................................................32 6.2. Cinética de degradación de fenantreno y antraceno ..................................................33 6.3. Análisis respirométrico de CO2 ............................................................................................35 6.4. Dinámicas de Nitrógeno inorgánico...................................................................................37 6.4.1. Dinámica de NH4+ ..............................................................................................................37 6.4.2. Dinámica de NO2 ...............................................................................................................37 6.4.3. Dinámica de NO3 ...............................................................................................................38
7. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS...............................................................................44 7.1. Caracterización del suelo........................................................................................................44 7.2. Cinética de degradación de fenantreno y antraceno y Análisis respirométrico de CO2 ......................................................................................................................................................44 7.4. Dinámica de Nitrógeno............................................................................................................47 7.5. Perfilado genotípico de la comunidad por 16S rDNA – DGGE.................................49 7.5.1. Variación de la diversidad ..................................................................................................50 7.5.2. Análisis de agrupamiento ..............................................................................................53
Índice de Tablas
Tabla 4.1. Composición de productos derivados del petróleo………………………………….…………9 Tabla 4.2. Hidrocarburos del petróleo que deben analizarse durante un derrame según la NOM–138–SEMARNAT 2003…………...………………………………………………………………………….10 Tabla 4.3. Estructuras moleculares de diversos PAHs comunes………………………….…………….11 Tabla 4.4. Principales características físicas y carcinogénicas de los PAHs prioritarios para la USEPA ……………………………………………………………………………….……………………..……………….12 Tabla 4.5. Principales tecnologías de remediación de suelos y su efecto sobre los contaminantes ………………………………………………………………………………………………………………14 Tabla 5.1. Descripción de tratamientos utilizados en esta investigación…………………..……….25 Tabla 5.2. Reactivos y concentraciones utilizadas para la amplificación por PCR del gen 16S rDNA ………………………..…………………………………………………………………………….………………29 Tabla 6.1. Caracterización del suelo del Exlago de Texcoco …………………………………...….……32 Tabla 6.2. Comparación de medias de Tukey para fenantreno y antraceno a lo largo de la incubación ………………………………………………………………….……………………………….....................…35 Tabla 6.3. Producción acumulativa y diaria de CO2 para todos los tratamientos de la incubación ………………………………………………………………………………………...………………………….37 Tabla 6.4. Cuantificación de DNA metagenómico del suelo ……………………………………………...40 Tabla 11.1. Valores de la curva de calibración del marcador λsty I para la cuantificación de DNA …….………………………………………………………………………………….……...…..63 Tabla 11.2. Cuantificación de las extracciones de DNA para los días 0 y 56…..……………….….64 Tabla 11.3a. Matriz de presencia y ausencia de bandas – Día 0 …………………………………..……67 Tabla 11.3b. Matriz de presencia y ausencia de bandas – Día 56 ……………………………..........…67 Tabla 11.4a. Matriz de intensidad de bandas discretasDía 0 …………………….………………….…68 Tabla A.4b. Matriz de intensidad de bandas discretasDía 56 ………………………..............………..68 Índice de Figuras
Fig. 4.1. Diagrama de flujo de los diferentes posibilidades en la aplicación técnicas de biología molecular en el estudio de comunidades microbianas ………….……………...……...……..20 Fig. 4.2. Diagrama esquemático de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ….………...21 Fig. 5.1. Diagrama esquemático de las unidades experimentales utilizadas en la incubación aerobia del suelo …………………………………………………………...……………..……………...26 Fig. 5.2. Diagrama de bloques de la metodología empleada para la contaminación del suelo …………………………………………………………………………………............................................................27 Fig.5.3. Protocolo de amplificación de PCR 1500 p.b. del gen rDNA 16S ………………......……....29 Fig. 5.4. Diseño Experimental del proyecto de investigación ………………………………..………….31 Fig. 6.1. Cinética de degradación de Fenantreno y Antraceno ……..……………………….….............34 Fig. 6. 2. Producción acumulativa de CO2 …………………………………………………………...…………..36 Fig. 6.3. Dinámica de Nitrógeno inorgánico….....……………………………………………………...……….39 Fig. 6.4. Extracciones de DNA metagenómico del suelo ……………………………………...……………40 Fig. 6.5. Amplificación por PCR de 1500 p.b. del gen 16S rDNA ……………………………….............41 Fig. 6.6. Amplificación PCR anidada de 500 p.b. de la región variable V3 del gen 16S rDNA ………………………………………………………………………………………………………………………….…42 Fig. 6.6. Perfiles genotípicos de DGGE……………………………………………………………………………..43 Fig. 7.1. Variación del la diversidad bacteriana ………………………..……………………………………...52 Fig. 7.2. Porcentaje de disminución del índice de diversidad de Shannon (H´) ………………….52 Fig. 7.3. Dendogramas de agrupamiento ……………….………………………………………….…………….56
VII
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1. INTRODUCCIÓN
Los Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos (PAHs, por sus siglas en inglés) son un grupo de
contaminantes orgánicos formados por dos o más anillos bencénicos fusionados. Estos
compuestos se encuentran distribuidos en el suelo, mar, sistemas fluviales y sedimentos, y
su presencia se atribuye principalmente a procesos de combustión incompleta de materia
orgánica de fuentes naturales y antropogénicas, así como a los derrames y descargas
directas de petróleo y sus derivados.
Debido a las características de estos contaminantes (persistencia en el ambiente, toxicidad,
mutagenicidad y carcinogenicidad), la Agencia de Protección al Ambiente de los Estados
Unidos (USEPA) ha enlistado a quince PAHs como contaminantes prioritarios para la
remediación de entre los cuales quince son potencialmente carcinogénicos para humanos
según reportes de la Agencia Internacional para la Investigación en Cáncer (IRAC) (Zhang,
et al., 2006).
En México no se cuenta con un estimado de las emisiones de PAHs al ambiente; sin
embargo, se conoce que las actividades que generan una mayor cantidad son: las quemas
agrícolas y prácticas de roza, tumba y quema; la quema de combustibles fósiles para
producción de energía primaria (petróleo) y secundaria (combustóleo, gas natural y
gasolinas); la quema de leña en hogares; y finalmente, las actividades de explotación,
extracción y transporte de petróleo (FernándezBermauntz et al., 2004).
Diversos estudios han demostrado que la biodegradación de un amplio rango de
hidrocarburos (incluidos los PAHs), puede ocurrir en variados ambientes extremos (altas o
bajas temperaturas, pH ácido o básico, altas concentraciones de sal o altas presiones). Estas
extraordinarias características, presentes en los microorganismos de dichos ambientes,
podrían ser aprovechadas en múltiples aplicaciones, tales como la degradación de desechos
orgánicos en presencia de aguas industriales con altos contenidos de sales, a bajas o altas
temperaturas; en la remediación de derrames petroleros en ambientes como desiertos,
playas, ciénegas, entre otros (Margesin R. y Schinner, 2001).
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Un caso de ambiente extremo lo encontramos en los suelos que conforman la zona del Ex
lago de Texcoco, modificados por la intensa actividad de drenado que, desde el siglo XVII, se
ha llevado a cabo con el fin de evitar inundaciones en la Ciudad de México. Dichas
modificaciones se manifiestan en condiciones extremas como conductividades eléctricas de
hasta 150 ds m1 y pH alcalino (8.510.5) (Betancur–Galvis et al., 2006)
Investigar la degradación de PAHs en un ambiente extremo como el de los suelos salino
alcalinos del Exlago de Texcoco resulta de gran interés debido a las altas expectativas que
se tienen en cuanto a la identificación y aislamiento de microorganismos tolerantes y
degradadores de PAHs para su aplicación futura en tecnologías de biorremediación de
ambientes como los que se han señalado; así como para aportar evidencias y conocimiento
científico relevante sobre los procesos de atenuación natural de los contaminantes en los
ecosistemas terrestres.
Para determinar lo anterior se realizó una cinética de degradación de dos PAHs (fenantreno
y antraceno) en una incubación aerobia durante 56 días con el objetivo de evidenciar la
capacidad de remoción que tienen las comunidades microbianas existentes en suelo salino
alcalino del Exlago de Texcoco. Además, se analizó el efecto de los PAHs y el medio
utilizado para su incorporación al suelo (acetona) sobre las dinámicas de nitrógeno
inorgánico y en el comportamiento respirométrico de los microorganismos edáficos.
Finalmente, se obtuvieron perfiles genotípicos de la comunidad bacteriana mediante la
técnica de Electroforesis en Gel con Gradiente Desnaturalizante (DGGE) de un fragmento de
aproximadamente 500 pares de bases del gen 16S rDNA para analizar los cambios
estructurales ocurridos en la comunidad microbiana durante el período incubación.
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2. JUSTIFICACIÓN
Si bien en la actualidad no existe contaminación por Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos
en los suelos del Exlago de Texcoco, el estudio de los efectos que estos contaminantes
tienen sobre la comunidad microbiana de un suelo salinoalcalino permitirá evaluar la
posible utilización de microorganismos provenientes de este ecosistema para la
optimización de los procesos de remediación y biorrecuperación de suelos y ambientes
extremos similares. Además, este estudio coadyuvará a la comprensión ecológica de los
procesos de atenuación natural de estos contaminantes en sitios con características
ambientales adversas.
3.1. Objetivo general
Analizar el efecto del antraceno y fenantreno sobre la comunidad microbiana de un suelo
salino–alcalino del Ex–lago de Texcoco.
3.2. Objetivos específicos
• Evaluar la degradación aerobia de fenantreno y antraceno en un suelo salino–
alcalino del Exlago de Texcoco en condiciones de laboratorio.
• Estudiar el efecto de la contaminación por fenantreno y antraceno sobre las
dinámicas de Nitrógeno inorgánico en el suelo.
• Analizar la estructura y dinámica de la comunidad microbiana del suelo al ser
contaminado con fenantreno y antraceno.
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4.1.1. Definición del suelo
El suelo es generalmente definido como la capa superior de la corteza terrestre, mismo que
está compuesto de partículas minerales, materia orgánica, agua, aire y organismos vivos, y
es la interfaz entre la tierra (geósfera), el aire (atmósfera) y el agua (hidrosfera) (COM,
2002). Otra definición, de OrtizVillanueva (1984), expresa que el suelo es el material
mineral no consolidado sobre la superficie terrestre, que ha estado sujeto e influenciado
por factores pedogenéticos (o de formación de suelos) y del medio ambiente como el
material madre, el clima, los macro y micro organismos y la topografía, todos ellos actuando
en un período de tiempo y originando un producto –el suelo– que difiere del material del
cual es derivado en muchas propiedades y características (físicas, químicas, biológicas y
morfológicas).
4.1.2. Principales funciones del suelo
De acuerdo con la Comisión de las Comunidades Europeas (COM, 2002) el suelo desarrolla
una serie de funciones ambientales, económicas y socioculturales de gran importancia:
• Fuente de alimento y biomasa. Los alimentos y otros productos agrícolas,
esenciales para la vida humana, así como la silvicultura dependen en su totalidad del
suelo. Prácticamente toda la vegetación –pastos, cultivos y árboles– necesita del
suelo para obtener tanto agua y nutrientes como soporte físico.
• Almacenamiento, transformación y filtración. El suelo almacena minerales,
materia orgánica, agua y varias sustancias químicas y contribuye en parte a su
transformación. Sirve de filtro natural de las aguas subterráneas, es la principal
reserva de agua potable, y libera CO2, metano y otros gases a la atmósfera.
• Fuente de materias primas. El suelo proporciona materias como arcillas, arenas,
minerales y turba.
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• Entorno físico y cultural para la humanidad. El suelo sirve de base a las
actividades humanas y es así mismo un elemento del paisaje y del patrimonio
cultural.
• Hábitat y reserva genética. El suelo es el hábitat de una gran cantidad de
organismos de todo tipo que viven tanto en el suelo como sobre él, cada uno con un
genotipo irreemplazable. Desempeña, por lo tanto, una serie de funciones ecológicas
esenciales.
4.1.3. Características y propiedades físico­químicas del suelo
• Textura. Se refiere a la proporción relativa de arena, limo y arcilla en el suelo. Es
una característica muy importante ya que afecta a otras propiedades (físicas,
químicas y biológicas). En general, los de texturas finas (arcillosos) poseen mayor
capacidad de adsorción de nutrientes y son más fértiles. Los de texturas gruesas
(arenosas) son más porosos y permiten una más rápida infiltración del agua (Ortiz
Villanueva, 1984).
• Materia Orgánica (M.O.). Proviene de las raíces, residuos de plantas y organismos
vivientes o muertos del suelo y suele representar en suelos minerales menos del
20%, así como en suelos orgánicos más de 20% de la composición total (Ortiz
Villanueva, 1984). La M.O. es de suma importancia en el suelo debido a que
desarrolla las siguientes funciones (Fassender y Bornemisza, 1987):
a. Suministro de elementos nutritivos por mineralización (particularmente: N,
P, S y micronutrientes) para las plantas
b. Aumenta la capacidad de intercambio catiónico y aniónico de los suelos.
c. Afecta la estructura del suelo, pues favorece la formación de agregados
individuales y disminuye su plasticidad.
d. Mejora la retención y el drenaje del agua, y además disminuye la
evaporación de la misma
e. Se reducen las pérdidas del suelo por erosión (OrtizVillanueva, 1984).
• Intercambio de cationes. Puede ser de tipo aniónico (sulfatos, fosfatos, cloruros,
nitratos) o catiónico (calcio, magnesio, sodio, potasio, amonio) y es llevada a cabo
por las arcillas y coloides orgánicos del suelo. Esta propiedad sirve como fuente
importante de nutrientes para las plantas (OrtizVillanueva, 1984)
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4.2. Suelos Salinos y Sódicos
La Organización de Agricultura y (FAO, por sus siglas en inglés) define que, desde el punto
de vista agrícola, un suelo salino es aquél que contiene suficiente cantidad de sales neutras
solubles para afectar adversamente el crecimiento de la mayoría de los cultivos de plantas.
De acuerdo con Richards (1954) (Abron, Yadav, & Massoud, 1988) un suelo salino tiene una
conductividad eléctrica en el extracto de saturación mayor a 4 dS m1 a 25°C; sin embargo, la
Sociedad de la Ciencia del Suelo de América (SSSA, por sus siglas en inglés) ha disminuido el
límite de estos suelos con respecto a los no salinos a un valor de 2 dS m1. Las principales
sales presentes en suelos de esta clase son los cloruros y sulfatos de sodio, calcio y
magnesio. Se presentan en algunos casos niveles apreciables de nitratos. Muchos suelos
salinos contienen cantidades significativas de yeso (sulfato de sodio) (Abron et al., 1988).
Las sales en exceso mantienen las arcillas de los suelos salinos en un estado floculado, por lo
que estos suelos suelen tener buenas propiedades físicas. La estructura de los mismos
suele ser buena y las características de labrado y permeabilidad al agua llegan a ser mejores
que las de suelos no salinos. Sin embargo, cuando ocurre lixiviación por agua baja en sales,
algunos de estos suelos tienden a dispersarse resultando en una baja permeabilidad al agua
y aire, particularmente cuando los suelos contienen arcillas pesadas (Abron et al., 1988).
Por otra parte, los suelos denominados como sódicos son aquellos que desde el punto de
vista de la agricultura, presentan porcentajes de sodio intercambiable mayores a 15%, y que
de tal manera afectan el crecimiento de la mayoría de los cultivos. La principal causa de
reacciones alcalinas de los suelos es la hidrólisis de los cationes intercambiables, así como
de sales: CaCO3, MgCO3, Na2CO3, entre otras (Abron et al., 1988).’
4.2.1. Ubicación y descripción del Ex­lago de Texcoco
De acuerdo con la Red Hemisférica de Reservas para Aves Playeras (RHRAP)
(http://www.whsrn.org, 2008) el ExLago de Texcoco forma parte de la cuenca hidrológica
del Valle de México, situada en el centro del Eje Neovolcánico que atraviesa el territorio
nacional desde la costa del Pacífico hasta el Golfo de México, con una superficie de 10,000
ha. Geográficamente se encuentra localizado entre los paralelos 19º25’ y 19º35’ N, y entre
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los meridianos 98º55’ y 99º03’ O y abarca los municipios de Ecatepec, Atenco,
Chimalhuacán, Netzahualcóyotl y Texcoco, en el Estado de México, México.
El clima de este sitio es semiárido templado, con verano cálido, y precipitación pluvial
mínima de 460 mm y máxima de 600 mm por año. El área se encuentra a una altitud
promedio de 2230 m.s.n.m. (GutiérrezCastorena y OrtizSolorio, 1999).
Según la RHRAP (http://www.whsrn.org, 2008), con los recientes trabajos de recuperación
del área se han generado ambientes integrados por 6,000 ha de praderas de pastizales
halófitos de las especies Egagrostis obtusiflora y Distichlis spicata, zonas de bosque de las
especies Tamarix spp., y Casuarina spp., charcas someras y zonas de tule; las 4,000 ha
restantes son embalses artificiales que regulan aguas residuales, tratadas y de origen
pluvial. La vegetación acuática y subacuática se encuentra representada por los tulares
Scirpus lacustris, S. californicus, S. paludosus y Typha angustiflora.
4.2.2. Características generales de los suelos del Ex – Lago de Texcoco
Los suelos en el área han sido formados por cenizas volcánicas depositadas in situ en un
ambiente lacustre y cubierto recientemente por material coluvial. El acuífero está cerca de
la superficie (80–150 cm); el agua subterránea es altamente salina y son dominantes las
sales NaCl y Na2CO3. Los suelos son salinosódicos con un pH entre 8.5 y 10.5, y
conductividades electrolíticas en extractos de saturación entre 4 y 70 dS m1. Además,
presentan porcentajes de sodio intercambiable elevados (6080%); la textura del suelo es
de limosa a arcillosa, su estructura es granular en la superficie y prismática en el subsuelo.
Los contenidos de materia orgánica se encuentran entre 20 y 50 g kg1 de suelo seco. El
drenaje natural es pobre y a pesar de que los suelos son profundos, las raíces están
restringidas por una capa de ceniza compacta de 5 a 20 cm de grosor a profundidades
medias (16 40 cm). La intemperización está avanzada; una evaporación alta (aprox. 2000
mm año1 y la precipitación pluvial, relativamente baja, incrementan la concentración de sal
de la solución del suelo (LunaGuido et al., 2002)
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4.3. Hidrocarburos del Petróleo
El petróleo y sus productos derivados son mezclas complejas de compuestos orgánicos. En
la Tabla 4.1 se muestran los mayores componentes de los distintos productos del petróleo.
Además, la Norma Oficial Mexicana NOM–138–SEMARNAT–2003 (2005) establece límites
máximos permisibles de contaminación en suelos para diversos productos asociados a
derrames de hidrocarburos (Tabla 4.2).
Tabla 4.1. Composición de productos derivados del petróleo
FUENTE: Nyer y Skladany, 1989 (Tomado de Baker y Herson, 1994)
4.3.1. Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos
De entre los hidrocarburos del petróleo podemos distinguir a un grupo de compuestos muy
especiales, conocidos con el nombre genérico de Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos
(PAHs, por sus siglas en inglés). Estos compuestos contienen dos o más anillos aromáticos
fusionados (Tabla 4.3), cuya persistencia bioquímica proviene de una densa nube de
electronesπ a ambos lados de la estructura del anillo, haciéndolos resistentes al ataque
nucleofílico (Johnsen et al., 2005).
Producto Componentes principales Gas Alcanos lineales y ramificados. Uno a cinco carbonos de
longitud, i.e.: etano, propano. Gasolina Hidrocarburos lineales y ramificados. Seis a diez carbonos de
longitud. Cicloalcanos y alquilbencenos también presentes. Keroseno/ Combustible diesel no. 1
Hidrocarburos lineales y ramificados. Once a doce carbonos de longitud, principalmente. Alcanos lineales predominan. Cicloalcanos y aromáticos también presentes. Contienen de bajas a indetectables concentraciones de benceno y PAHs. La turbosina (Jet A) tiene una composición similar.
Gasóleos ligeros Doce a dieciocho carbonos de longitud. Menor porcentaje de alcanos lineales que en keroseno. Contiene cicloalcanos y cicloalcanos aromáticos, olefinas y olefinas aromáticas como estirenos. Estos productos incluyen al diesel y combustóleo.
Gasóleos pesados y aceites lubricantes ligeros
Hidrocarburos de 18 a 25 carbonos de longitud.
Lubricantes Hidrocarburos de 26 a 38 carbonos de longitud Asfaltos Compuestos policíclicos pesados
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Tabla 4.2. Hidrocarburos del petróleo que deben analizarse durante un derrame Hidrocarburos Producto
contaminante Fracción pesada
PAHs Fracción media
PAHs Fracción ligera
BTEX
Mezclas X X X X X X Petróleo crudo X X Combustóleo X X Parafinas X X Petrolatos X X Aceites X X Gasóleo X X Diesel X X
Turbosina X X Keroseno X X Creosota X X Gasavión X X Gasolvente X X Gasolinas X X Gasnaftas X X
FUENTE: NOM–138–SEMARNAT–2003 (2005).
Los PAHs están presentes en pequeñas cantidades en los productos derivados del petróleo,
tales como combustóleos y aceites crudos, y en grandes cantidades en la creosota utilizada
en la preservación de madera (Baker y Herson, 1994). Estos compuestos resultan
omnipresentes en el ambiente como resultado de la combustión incompleta de materia
orgánica, fuentes de emisión, gases de combustión de los automóviles, plantas generadoras
de energía eléctrica a base de carbón, materia doméstica y materia de fuentes de área
(FinlaysonPitts y Pitts, 1997).
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FUENTE: Modificada de Zhang et al., 2006
4.3.1.1. Riesgos a la salud
Los Hidrocarburos policíclicos aromáticos son ubicuos en el ambiente, lo que conlleva a
encontrar niveles medibles de exposición en la población general. Una fuente significativa a
exposición de PAHs es el humo del tabaco; en los no fumadores y población expuesta no
ocupacional, la dieta es frecuentemente la mayor fuente de exposición a PAHs (IARC, 2006).
Se ha encontrado que existe una mayor exposición a estos contaminantes en trabajadores
de las industrias de gasificación de carbón, producción de coque, destilación de alquitrán de
hulla, conservación de maderas utilizando creosota, producción de aluminio, manufactura
de electrodos de carbono, producción de carburo de calcio, limpieza de chimeneas, así como
plantas de energía termoeléctrica (IARC, 2006).
En un estudio realizado por la IARC (2006) se menciona que, por ejemplo, existe evidencia
de un mayor riesgo de contraer cáncer de pulmón entre trabajadores de la producción de
coque. A su vez, se determinó que los trabajadores de plantas de coque de Estados Unidos y
Canadá, presentaban una mayor incidencia de cáncer de pulmón y que el riesgo era mayor
en áreas de trabajo cercanas a hornos.
PAH (no. anillos)
Naftaleno (2)
Pireno (4)
Antraceno (3)
Benzo(a)pireno (5)
Fenantreno (3)
Coroneno (7)
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Dada la atención que se le debe prestar a estos contaminantes, la Agencia de Protección al
Ambiente de los Estados Unidos (USEPA) ha enlistado 17 PAHs como contaminantes
prioritarios para la remediación (Tabla 4.4), de entre los cuales 15 PAHs son
potencialmente carcinogénicos para humanos según reportes de la Agencia Internacional
para la Investigación en Cáncer (IRAC) (Zhang, et al., 2006).
Tabla 4.4. Principales características físicas y carcinogénicas de los PAHs prioritarios para la USEPA
1 Clasificación de la IARC debido su riesgo carcinogénico a humanos: 1) Carcinogénico, 2A) Probablemente carcinogénico, 2B) Posiblemente carcinogénico, y 3) Carcinogenicidad no clasificable. NR: No reportado. FUENTE: Zhang et al., 2006
4.4. Tecnologías para la remediación de sitios contaminados
Las tecnologías disponibles para el tratamiento y remediación de sitios contaminados
pueden clasificarse inicialmente como: físicas, químicas y biológicas. En la Tabla 4.5 se
resumen las principales tecnologías existentes así como su efecto sobre los contaminantes
PAHs Número de anillos
Coeficiente de partición
Grupo carcinogénico1
Naftaleno 2 3.2 2.3 x 103 2B Naftilamina 2 4.6 1.4 x 103 1 Acenafteno 3 3.4 2.1 x 104 NR Acenaftileno 3 3.93 1.2 x 104 NR Fluoreno 3 1.9 1.5 x 104 3 Antraceno 3 0.05 – 0.07 2.8 x 104 3 Fenantreno 3 1.0 – 1.3 2.9 x 104 3 Fluoranteno 4 0.26 3.4 x 105 3 Criseno 4 0.002 4.0 x 105 3 Pireno 4 0.14 2.0 x 105 3 Benz(a)antraceno 4 0.01 4.0 x 105 2A Benzo(b)fluoranteno 5 NR 4.0 x 106 2B Benzo(k)fluoranteno 5 NR 7.0 x 106 2B Benzo(a)pireno 5 0.0038 1.0 x 106 2A Dibenz(a,b)antraceno 5 0.0005 1.0 x 106 2A Benzo(g,h,i)perileno 6 0.0003 1.0 x 107 3 Indenol (1,2,3 c,d)pireno
6 0.062 5.0 x 107 2B
13
tratados. Los tratamientos de remediación, ya sean físicos, químicos o biológicos, pueden
clasificarse, de acuerdo al sitio en el que se lleven a cabo, como: in situ y ex situ.
4.4.1. Tratamiento in situ
La remediación se realiza directamente en el sitio donde se presentó la contaminación. Su
principal ventaja es que implica una mínima perturbación del sitio y tierras aledañas. Los
procesos in situ, generalmente involucran la distribución de aire y agua a través del suelo
contaminado, lo que se ve favorecido por medios permeables y baja heterogeneidad de las
condiciones físicas y de distribución de la contaminación (Scullion, 2006).
4.4.2. Tratamiento ex situ
Los procesos ex situ se llevan a cabo mediante una excavación del volumen de suelo
contaminado, ya sea on site (sobre el sitio), i.e. compostaje o landfarming (biolabranza), o en
unidades de tratamiento como biorreactores. Este tipo de tratamientos ofrecen un gran
alcance en cuanto al manejo de condiciones para optimizar la eficiencia del tratamiento y
para controlar el esparcimiento de los contaminantes (Scullion, 2006).
4.5. Biorremediación
La biorremediación se define como el uso de microorganismos o procesos microbianos para
descontaminar y degradar contaminantes del ambiente (Baker y Herson, 1994). El objetivo
último de la biorremediación o biorrecuperación es mineralizar los contaminantes, esto es,
transformar aquellos compuestos químicos nocivos en compuestos inocuos, tales como el
CO2 o algún otro gas o sustancia inorgánica, agua y material celular para los organismos
responsables de la degradación (Eweis et al., 1999).
Las tecnologías ex situ en cuanto biorremediación son los biorreactores, landfarming,
compostaje y algunas otras formas de tratamiento en fase sólida. Por otro lado, las
tecnologías in situ pueden ser el bioventeo, bioestimulación y bioaumentación (Baker &
Herson, 1994).
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Tabla 4.5. Principales tecnologías de remediación de suelos y su efecto sobre los contaminantes
FUENTE: Scullion, 2006
La biorremediación ofrece varias ventajas (Baker y Herson, 1994) sobre otras tecnologías
convencionales de remediación, algunas de estas son:
• Puede ser realizada en el sitio, lo que elimina costos de transportación.
• Si se realiza in situ la perturbación del sitio se disminuye
• En ocasiones, los procesos de manufactura e industriales pueden continuar, mientas
se realiza la biorremediación.
• Elimina permanentemente los desechos
• Permite el acoplamiento con otras técnicas de remediación en un tren de
tratamiento.
Tratamiento o proceso Destrucción/
Estabilización
Térmico x x Solidificación (x) x Extracción con vapor x Aireación (x) X Lavado (x) X
F Í S I C A
Electrorremediación (x) x Oxidación x x x
Reducción (x) x x
Manipulación de pH (x) x x
Landfarming x (x) x Biopilas x (x) x Compostaje x (x) x Biorreactores x (x)
BIOLÓGICA (con microorga– nismos)
Biolixiviación x Fitoestabilización (x) (x) x Fitoextracción (x) x (x)
Fitorremediación
En contraste con las ventajas mencionadas, la biorremediación también presenta ciertas
limitaciones y desventajas (Baker y Herson, 1994):
• Algunos compuestos clorados o metales, por ejemplo no son fácilmente tratables
biológicamente.
• Para algunos compuestos químicos la degradación microbiana puede llevar a la
producción de sustancias más tóxicas o móviles que los compuestos originales.
• Dado que la biorremediación es una tecnología específica para cada sitio, los costos
de evaluación, caracterización y determinación de viabilidad pueden ser más altos
que para otras tecnologías convencionales.
4.5.1. Factores involucrados en el proceso de biorremediación
Los factores que afectan el rendimiento de la biorremediación pueden clasificarse en tres
grandes grupos: medioambientales, físicos y químicos. Éstos se describen a continuación.
4.5.1.1. Factores medioambientales
Son aquellos necesarios para proporcionar las condiciones óptimas de crecimiento a los
microorganismos que llevan a cabo la biorrecuperación. Estos factores son: temperatura,
pH, disponibilidad de nutrientes, oxígeno y humedad (Eweis et al., 1999).
Las bacterias de un suelo actúan habitualmente en el intervalo de 5 a 40ºC, aunque la
temperatura depende de cada especie. Con frecuencia los mohos y levaduras suelen realizar
mejor su cometido a valores de pH bajos o neutros. La mayoría de los microorganismos se
desarrollan mejor dentro del rango de pH de 6 a 9, encontrándose las condiciones óptimas
de crecimiento entre 7 y 8 (Eweis et al., 1999).
Los nutrientes son aquellos compuestos químicos necesarios para el crecimiento
microbiano que no proporcionan energía o carbono. Los más importantes son nitrógeno y
fósforo, cuyas cantidades son normalmente insuficientes en los sitios de recuperación
(Eweis, et al., 1999).
16
El oxígeno es el receptor final de electrones generalmente empleado en procesos biológicos
y también es necesario en reacciones redox catalizadas por enzimas. La humedad constituye
otro factor muy importante, ya que los microorganismos obtienen los nutrientes necesarios
para su crecimiento a partir de soluciones acuosas. Debido a que la solubilidad del O2 en
agua es baja, contenidos muy altos de humedad se traducen en una baja disponibilidad de
oxígeno (Eweis et al., 1999).
4.5.1.2. Factores Físicos
Los factores físicos más importantes en la biorremediación son la disponibilidad de los
contaminantes para los microorganismos, la presencia de agua y la provisión de un aceptor
de electrones adecuado (Eweis et al., 1999). La disponibilidad constituye un concepto
complejo, relacionado con la afinidad de los contaminantes por las fases sólidas y gaseosas,
la estructura intersticial de las fases sólidas y la presencia de las comunidades microbianas
adecuadas (Eweis et al., 1999).
Beck et al. (1995), hacen énfasis en la naturaleza bifásica del desprendimiento del
contaminante de la fase sólida, en donde los compuestos no son degradados o desprendidos
suficientemente rápido del suelo y la disponibilidad química y biológica decrece
rápidamente en períodos de minutos a horas, luego lentamente en períodos de semanas a
meses, debido a procesos de adsorción y difusión referidos como ageing (añejamiento),
relacionados con la materia orgánica del suelo.
4.5.1.3. Factores químicos
El factor químico de mayor importancia es la estructura molecular del contaminante. La
capacidad para ser biodegradado está relacionada con factores tales como solubilidad,
grado de ramificación, grado de saturación y la naturaleza y efecto de los sustituyentes
(Eweiss et al., 1999).
hidrocarburos
Se ha demostrado que una gran cantidad de los hidrocarburos que contaminan el ambiente,
principalmente debido a la descarga accidental o a procesos industriales, pueden ser
degradados (mineralizados o transformados) en varios ambientes extremos caracterizados
por bajas o altas temperaturas, pH ácido o alcalino, alta salinidad o altas presiones; y
aquellos adaptados a más de una condición, ofrecen un potencial especial para la
descontaminación biológica de hábitats donde varias condiciones extremas se presentan
simultáneamente (Margesin R. y Schinner, 2001).
Se ha demostrado que en ambientes salinos, tanto algunas arqueas como otras eubacterias
pueden degradar un amplio rango de contaminantes orgánicos; sin embargo, éstas últimas
se presentan como las más prometedoras, debido a que podrían poseer una diversidad
metabólica mucho mayor, ya que las enzimas utilizadas en su metabolismo de
biodegradación podrían ser de tipo convencional (i.e., no requieren sal) y similares a las de
microorganismos no halófilos (Oren et al., 1992. Citado en Margesin y Schinner, 2001).
4.7. Técnicas de Biología Molecular en el estudio de la ecología del suelo
El reciente surgimiento de investigaciones en ecología molecular, las cuales emplean
herramientas moleculares para resolver problemas ecológicos (Eguiarte et al., 2007), ha
proporcionado pruebas irrefutables de la existencia de una gran variedad de nuevos
microorganismos en el ambiente en cantidades y variedades comparativamente mucho
mayores a aquellos microorganismos susceptibles a ser cultivados en laboratorio (Rondon
et al., 2000). Además, se ha evidenciado que dichos cultivos fallan al intentar reproducir los
nichos ecológicos y relaciones simbióticas que se encuentran en ambientes naturales
complejos y que son requeridos para soportar el amplio espectro de la diversidad
microbiana (Nocker et al., 2007).
Dichas herramientas de la ecología molecualr se basan en general en la utilizaición de
moléculas orgánicas que funcionan como marcadores moleculares (i.e. ácidos grasos de
fofolípidos o ácidos nucléicos: DNA y RNA), los cuales están presentes en todos los
18
microorganismos y pueden ser extraídos de éstos sin necesidad de ser cultivados (Nogales,
2005).
Existen diversas investigaciones y revisiones, tales como la de Rappé y Giovannoni (2003),
que han determinado que, sólo 26 de los aproximadamente 52 linajes mayores o phyla
dentro del dominio Bacteria tenían representantes cultivables. En esta revisión se
menciona, por ejemplo, el caso del phylum Verrucomicrobium, aerobio heterótrofo aislado
de ambientes de agua dulce, del cual tres de sus cinco subgrupos, no contienen ningún
representante cultivable. En otro estudio (Dunbar et al., 1999), el cual analiza la diversidad
de comunidades en la rizósfera de piñón en dos suelos áridos del sudoeste de los Estados
Unidos, comparando las técnicas de cultivo en laboratorio y la de librerías a partir de clones
de 16S rDNA, se determinó un total de 34 y 498 filotipos, respectivamente. Dichos filotipos
correspondieron a 3 y 7 divisiones de bacterianas, para cada técnica, demostrando la
desigualdad existente entre las técnicas cultivables convencionales y las técnicas de
ecología molecular actuales.
4.7.1. Perfilado genotípico de la comunidad microbiana (técnicas de huella
genómica).
Se conocen con este nombre una variedad de técnicas genotípicas que proporcionan un
patrón o perfil de la diversidad de la comunidad microbiana, y que están basadas en la
separación física de especies únicas de ácidos nucleicos (Muyzer, 1999). La principal
característica de estos métodos es que permiten el análisis simultáneo de múltiples
muestras, lo que hace posible comparar la diversidad genética de comunidades microbianas
de diferentes hábitats, o estudiar el comportamiento de una comunidad individual a lo largo
del tiempo (Muyzer, 1999). Mediante el empleo de estos métodos, el análisis de
metagenomas proporciona información valiosa con respecto a la diversidad, riqueza de
especies y estructura poblacional. Así mismo, permite una comparación transversal de
diferentes comunidades, monitoreo de cambios temporales como resultado del cambio en
los parámetros ambientales, evaluación de los impactos de la biorremediación y modelado
ecológico (Nocker et al., 2007).
Algunas de las principales técnicas de huella o perfilado genómico se mencionan a
19
continuación:
1. Fragmentos polimórficos de longitud variable (RFLP) o Análisis de restricción de DNA
ribosomal (ARDRA).
3. Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) o Electroforesis en gel con
gradiente de temperatura (TGGE).
4. Perfilado de RNA de bajo peso molecular (LMW RNA fingerprinting)
5. Polimorfismo de conformación de cadena simple (SSCP)
6. DNA polimórfico amplificado aleatoriamente
En la figura 4.1 se muestra un diagrama de flujo que resume los pasos en la aplicación de
técnicas de biología molecular para el estudio de la estructura, dinámica y función de las
comunidades microbianas en diversos ambientes, entre ellos el suelo.
A continuación se dará una breve explicación acerca de una técnica de suma importancia en
la biología molecular: la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés).
Después de lo cual se profundizará en una de las técnicas de huella genómica mencionadas
anteriormente: DGGE; ya que esta técnica será ampliamente discutida a lo largo de este
trabajo.
4.7.2. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
La PCR es un método de amplificación rápida de DNA in vitro, que tiene la capacidad de
multiplicar moléculas de material genético hasta miles de millones de veces en un tubo de
ensaye, proporcionando grandes cantidades de genes para su clonación, secuenciación o
mutagénesis (Madigan et al., 2004).
La PCR se lleva a cabo de forma completamente bioquímica, mediante la utilización de la
enzima DNA polimerasa, la cual dirige la síntesis de nuevo DNA de cadena sencilla a partir
de un DNA molde, utilizando deoxinucleótidos como sustrato. Esta valiosa enzima sintetiza
DNA en dirección 5’ a 3’ y puede agregar nucleótidos al extremo 3’ de un oligonucleótido
20
(llamado, iniciador o primer), el cual es sintetizado según la secuencia nucleotídica de una
región del gen deseado (Watson et al., 2004; Madigan et al., 2004).
A continuación se mencionarán y describirán cada una de las etapas que se llevan a cabo
durante cada ciclo de PCR (Fig. 4.2) (Watson et al., 2004; Madigan et al., 2004; Eguiarte et
al., 2007; Lodish et al., 2003).
Fig. 4.1. Diagrama de flujo de los diferentes posibilidades en la aplicación técnicas de biología molecular en el estudio de comunidades microbianas. FUENTE: Muyzer, 1998.
21
calor para lograr la separación de
las dos cadenas sencillas. Cuando
se utiliza la enzima Taq Polimerasa
(proveniente de la bacteria
ciclos y se lleva a cabo a la misma
temperatura del paso anterior.
reduce hasta unos 50 – 60°C, lo que
permite la hibridación
(alineamiento) de los
permanecerán apartadas debido a
cadenas de DNA en presencia
de deoxinucleótidos (dNTPs) y
polimerasa, mencionada
temperatura óptima es de 72°C.
Fig. 4.2. Diagrama esquemático de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los rectángulos pequeños representan oligonucleótidos que sirven de primers para la síntesis de cadenas complementarias de DNA del gen específico mediante la enzima Taq. polimerasa. Nótese que cada ciclo adicional duplica la cantidad del fragmento de DNA de interés. Al cabo de unos 20 ciclos se tendrán aproximadamente un millón de copias de cada molécula original. FUENTE: Lodish et al., 2003.
22
Esta serie de pasos (2, 3 y 4, Desnaturalización – Alineamiento – Elongación) se repite
tantos ciclos como sea necesario (e.g. 35 ciclos).
5. Elongación final: Al completarse los ciclos de amplificación, se vuelve a elevar
la temperatura a 72°C para permitir que la enzima sintetice los fragmentos que
pudieron haber quedado incompletos.
Luego de cada ciclo el número de copias de la secuencia deseada se duplicará; por lo tanto,
ésta aumentará de forma exponencial, mientras que cualquier otra secuencia de DNA
original permanecerá sin amplificar.
4.7.3. Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)
Como ya se analizó, la PCR, permite amplificar un conjunto de genes de idéntico tamaño y
delimitados por un mismo par de iniciadores o cebadores; sin embargo, si se desea realizar
el análisis de una comunidad microbiana (para un análisis filogenético o determinar el perfil
genotípico de la comunidad, por ejemplo) es necesario separar esos fragmentos de DNA de
misma longitud pero con distinta secuencia de pares de bases. Para ello, se puede recurrir a
la clonación molecular o cualquiera de las técnicas de huella dactilar que se enlistaron
anteriormente. Ahora, se explicará con detalle en que consiste la técnica conocida como
DGGE, de la cual existe una gran cantidad de estudios y revisiones sobre diversas
aplicaciones y ambientes analizados (Nocker et al., 2007; Muyzer, 1999; Malik, 2008)
El procedimiento está basada en la electroforesis de fragmentos del gen 16S rDNA (500 –
700 p.b.) amplificados por PCR en geles de poliacrilamida, los cuales contienen un gradiente
linealmente creciente de desnaturalizantes (Muyzer, 1993). La separación en un DGGE está
basada en la movilidad electroforética de una molécula parcialmente fundida en geles de
poliacrilamida, la cual decrece en comparación con la de la forma completamente helicoidal
de la molécula (Muyzer, 1993). Conforme las moléculas avanzan a través del gel y se ven
expuestas a condiciones desnaturalizantes cada vez más fuertes, los productos de PCR
alcanzan un punto donde ocurre la separación del DNA de doble hélice; este se conoce como
punto de fusión (melting point) de la molécula, el cual depende principalmente de la
longitud del producto, su contenido de Guanina y Citosina (GC) y la secuencia de
23
nucleótidos. Entre mayor la estabilidad intrínseca, mayor debe ser la condición
desnaturalizante para alcanzar la desnaturalización. (Nocker et al. , 2007)
Dado que cada una de las secuencia de fragmentos particulares varía, éstas detendrán su
migración en diferentes posiciones en el gradiente desnaturalizante y así podrán ser
separadas efectivamente mediante esta técnica. (Muyzer, 1993). La separación de cadenas
se consigue a través de los químicos desnaturalizantes formamida (0 – 40%) y urea (0 –
7M) y a una temperatura constante de 60ºC aproximadamente (Nocker et al., 2007).
En los geles con gradiente desnaturalizante, secuencias adicionales ricas en GC, pueden ser
incorporados en uno de los primers para modificar el comportamiento de fusión de los
fragmentos de interés hasta el grado en que cerca del 100% de todas las variaciones de
secuencias posibles pueden ser detectadas (Muyzer, 1993).
4.7.4. Utilización del gen 16S rDNA como marcador molecular
El desarrollo de técnicas que involucran el estudio de los ácidos nucleicos, DNA y RNA,
permiten estudiar la estructura microbiana a un nivel genético. Aunque en principio
cualquier gen puede ser utilizado con este fin, el gen condificante de la subunidad pequeña
del RNA ribosómico, 16S rDNA, (y su equivalente en eucariotas, 18S rDNA) es un excelente
marcador molecular debido a las siguientes características (Muyzer, 1999):
a) Está presente en todos los organismos.
b) Tiene regiones conservadas y otras altamente variables, lo que permite diseñar
primers y sondas generales y específicas.
c) Contiene un número adecuado de secuencias para inferir un análisis filogenético.
d) Es un importante componente celular, lo que facilita su detección.
e) Se transfiere verticalmente, ya que se considera que no está sujeto a transmisión
horizontal entre microorganismos (Nogales, 2005)
24
5.1. Muestreo del suelo
Las muestras empleadas para este experimento fueron tomadas de tres sitios distintos (S1,
S2 y S3), removiendo la cubierta vegetal y recolectando el suelo de la capa superficial (0 –
15 cm). Estos tres sitios están ubicados en la zona del Exlago de Texcoco (N.L. 19o 30’’, W. L.
98o 53’) a una altitud de 2500 m.s.n.m., con una temperatura promedio anual 16° C y
precipitación anual promedio de 600 mm (principalmente de julio a septiembre). En
general, los suelos de ese sitio son salinoalcalinos con presencia de sales como NaCl y
Na2CO3. El pH fluctúa entre 8.5 y 10.5, y la conductividad eléctrica (EC) en extracto de
saturación va de 4 a 150 dS m1 y el suelo tiene un alto porcentaje de sodio intercambiable
(6080%) (FernándezLuqueño, et al., 2008).
5.2. Preparación del suelo
Previamente al establecimiento de la incubación, la totalidad del suelo fue cribado con un
tamiz de 5 mm, y ajustado a un 40% de su CRA mediante la adición de agua destilada.
Inmediatamente después fue preincubado en recipientes de plástico durante 10 días para
reactivar la actividad microbiana del suelo. Se colocaron dos frascos en el interior del
recipiente, uno con 100 mL de NaOH 1M para captura el CO2 producido, y el otro con 100
mL de agua destilada para evitar la desecación del suelo. El suelo fue aireado
periódicamente para evitar condiciones de anaerobiosis.
5.3. Diseño Experimental y tratamientos propuestos
Un total de 90 unidades experimentales se dispusieron para ser sometidas a una incubación
aerobia durante 56 días. Cada una de estas unidades (Fig. 5.1) se conformaron por un frasco
ámbar de 947 mL de capacidad al que se añadió agua destilada para mantener la humedad
dentro de la unidad experimental; además se colocaron otros 2 frascos en su interior: el
primero con 20 g suelo (base seca) ajustado al 40% de su CRA y aplicando los tratamientos
que se indican posteriormente. El segundo frasco contenía 20 mL de solución 1 M de NaOH
para capturar el CO2 emitido durante la incubación.
25
En el primer tratamiento (PAHs) el suelo se contaminó con 1200 mg de fenantreno kg1 SS y
520 mg de antraceno kg1 SS; este tratamiento se estableció para tres sitios (S1, S2 y S3) y
por triplicado. En el segundo tratamiento (Acetona) el suelo se adicionó con 3 mL de
acetona; se estableció para un sitio (S1) y por triplicado. El tercer tratamiento contenía
únicamente los 20 g de suelo y sirvió como tratamiento testigo (Control); este tratamiento
se estableció para un sitio (S1) y por triplicado (Tabla 5.1).
Además, se añadieron 3 unidades adicionales para cada día de muestreo (3, 7, 14, 28 y 56)
las cuales contenían únicamente un frasco con 10 mL de agua destilada y otro más con 20
mL de solución 1M de NaOH , que sirvieron como controles del CO2 presente en la
atmósfera.
De las 90 unidades mencionadas inicialmente se tomaron 15 (3 Control, 3 Acetona y 9
PAHs) que se utilizaron como tiempo cero y fueron analizadas inmediatamente para
determinar N inorgánico (NH4+, NO3, NO2), PAHs y CO2. Las unidades restantes (75) se
sellaron e incubaron por 56 días. Después de 3, 7, 14, 28, 56 días se tomaron las 15
unidades correspondientes y se analizaron para determinar N inorgánico, PAHs y CO2. En
todos los casos de muestreo (0, 3, 7, 14, 28 y 56 días) se tomaron 10 g para determinación
de N inorgánico, 1.5 g para extracción y análisis de PAHs; así como 0.5 g para la extracción
de DNA (únicamente días 0 y 56); el suelo restante se conservó en ultracongelación a 80°C
(Fig. 5.4).
Tratamiento Nombre Características
1 PAHs 20 g sueloa + 1200 mg fenantreno kg1 suelo + 520 mg Antraceno kg1 suelo + 3 mL Acetona
2 Acetona 20 g suelo + 3mL Acetona
3 Control 20 g suelo
a masa de suelo expresada en base seca
26
Fig. 5.1. Diagrama esquemático de las unidades experimentales utilizadas en la incubación aerobia del suelo. Dentro del frasco de mayor capacidad se agregó agua destilada para mantener la humedad dentro del microcosmos. Se colocaron además dos frascos, uno con 20 g suelo (base seca) preincubado al 40% CRA y aplicando el tratamiento correspondiente (PAHs, Acetona o Control). El otro frasco contenía 20 mL de NaOH 1.0 M el cual servía para capturar las emisiones de CO2. Las unidades experimentales se sometieron a una incubación aerobia durante 56 días.
5.3.1. Contaminación del suelo
Como ya se mencionó antes, el tratamiento 1 (PAHs) fue contaminado con 1200 mg fenantreno kg1 s.s. + 520 mg Antraceno kg1 s.s.; esto se realizó de la forma que indica el diagrama de la figura 5.2. En el caso de la adición de acetona en el tratamiento 2 (Acetona), se realizaron los mismos pasos que indica el diagrama, con la diferencia de que se agregó la misma cantidad de acetona en vez de solución madre de PAHs. 5.4. Análisis físicos y químicos
1. La medición de pH se realizó en una suspensión 1:2.5 sueloagua usando un
electrodo de vidrio (Thomas, 1996). 2. La determinación de conductividad eléctrica (CE) se realizó en extracto de
saturación (Rhoades et. al, 1989). 3. La textura del suelo se determinó utilizando el método del hidrómetro (Gee y
Bauder, 1986). 4. El carbono orgánico total se determinó con un analizador de carbono orgánico total
TOCVCSN (SHIMADZU, USA). 5. El carbono inorgánico se determinó mediante la captura de CO2 en 20 mL de
solución 1 M de NaOH, titulado posteriormente con una solución 1M de HCl. 6. El nitrógeno total se analizó mediante el método Kjeldahl (Bremmer, 1996) 7. El N inorgánico (NH4+, NO2 y NO3) se determinó colorimétricamente en un
analizador automático San Plus System – SKALAR (Mulvaney, 1996).
27
Fig. 5.2. Diagrama de bloques que indica la metodología empleada para la contaminación del
suelo
5.5. Análisis de PAHs
La extracción de antraceno y fenantreno en las muestras de suelo se realizó utilizando el
método de extracción desarrollado por Song et al. (1995), que en general se basa en una
serie de tres extracciones utilizando acetona como disolvente, adición de sulfato de sodio
para eliminar la humedad, agitación en vórtex, baño de sonicación y separación de fases por
centrifugación. Inmediatamente después, una alícuota de 2 µL se analizó en un
cromatógrafo HewlettPackard 4890D GC (USA) equipado con un detector de ionización de
flama. Se utilizó una columna HP5 de HewlettPackard (USA) con una longitud de 1.5 m,
diámetro interno de 0.53 mm y grosor de película de 1.5 µm. Como gas acarreador se utilizó
He con un flujo de 7 mL min1 . La temperatura del horno se ajustó para que fuera de 140 a
1. Preparación de una solución madre de PAHs con 8.00 mg Fenantreno mL1
acetona y 3.47 mg Antraceno mL1 acetona
Se contamiron 5 g de suelo (base seca) preincubado con 3 mL de solución madre
corresponientes a 24 y 10.4 mg de Fenantreno y Antraceno, respectivamente (que en 20 g de suelo seco, adicionan 1200 y 520 ppm, según el caso)
Los frascos con 5g de suelo contamiando fueron sometidos a evaporación en una cámra de vacío, hasta que se dejó de percibir el olor a acetona
Cada muestra se reinoculó con 15 g (base seca) de suelo para completar un total de 20 g
Las muestras fueron sometidas a la
incubación aerobia durante 0, 3, 7, 14, 28 y
56 días.
28
170°C a razón de 2 °C min1, manteniendo los 170 °C por 5 min y aumentada hasta 280°C a
30°C min1 y mantenida así por 10 min. La temperatura del inyector se ajustó a 280°C y la
del detector a 300°C (FernándezLuqueño et al., 2008)
5.5. Técnicas de Biología Molecular
5.5.1. Extracción de DNA metagenómico del suelo
La extracción de DNA se realizó utilizando el PowerSoil DNA Isolation Kit (MO BIO,
laboratories, Inc.), que en general se basa en: 1) lisis mecánica, 2) lisis química, 2)
eliminación de proteínas, RNA y ácidos húmicos, 4) captura del DNA a una membrana de
sílica, y 5) lavados con etanol. El producto final se diluyó en 60 µL de agua bidestilada y
esterilizada, y se almacenó en congelación a 20°C hasta su utilización en pasos
subsecuentes.
5.5.2. Amplificación por PCR del gen 16S rDNA.
EL DNA extraído fue utilizado como molde para la amplificación del gen 16S rDNA. El
contenido de la mezcla de reacción (V = 25 μL) se muestra en la Tabla 5.2. El par de primers
que se emplearon son el 46F (5'GCC TAA CAC ATG CAA GTC3′) (Yu and Morrison 2004) y
el 1540R (5'AAG GAG GTG ATC CAG CCGCA3') (Edwards et al., 1989). Los ciclos de
amplificación se llevaron a cabo en un equipo Touchgene Gradient FTGRAD2D (TECHNE
DUXFORT, Cambridge, UK), de acuerdo al protocolo que se muestra en la Fig. 5.3.
5.5.3. Amplificación por PCR anidada con pinza rica en GC de un fragmento de 500
p.b. de la región variable V3 del gen 16 rDNA.
A partir del producto amplificado de 1500 p.b. del gen 16S rDNA se realizó una PCR anidada
utilizando los primers 46F (5' GCC TAA CAC ATG CAA GTC3′) (Yu y Morrison 2004) y 534R
(5'ATT ACC GCG GCT GCT GG 3') (Muyzer et al., 1993)., al primero de los cuales se le
agrega la siguiente secuencia en el extremo 5' para obtener: 46FGC: CGC CCG CCG CGC GCG
GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G. El contenido de la mezcla de reacción se muestra
en la Tabla 5.3. El protocolo de ampliación se modificó con respecto del anterior en la
temperatura de alineación, la cual se elevó de 57°C a 59°C para aumentar la especificidad de
29
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
T ( °C )
t (min)
la reacción y de 35 a 30 ciclos de amplificación; todas las demás condiciones permanecieron
sin cambios.
Tabla 5.2. Reactivos y concentraciones utilizadas para la amplificación por PCR del gen 16S rDNA
Reactivo (concentración
2.5 1 BSA 7.5 30%
MgCl2 25mM 2.0 4.0 H2O 8.625 34.5% Primer F y R 1.25 0.5 cada uno DMSO 1.5 6% Taq. Polimerasa (5 u/μL)
0.125 0.625 DNA 1 ≈ 0.2 μg
dNTP´s (dATP, dGTP, dCTP y dTTP)
0.4 200 μM (cada uno)
Fig.5.3. Protocolo de amplificación de PCR 1500 p.b. del gen rDNA 16S
x 35 ciclos
5.5.4. Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante
Para obtener el patrón de bandeo de los productos de la región variable V3 (0.5 Kpb) de
cada tratamiento, días 0 y 56, se realizó la técnica de electroforesis en gel con gradiente
desnaturalizante (DGGE) de acuerdo a reportes publicados por Muyzer (1993). Se colocó
aproximadamente la misma cantidad de producto de PCR en un gel de poliacrilamida al 8%
m/v (37.5:1, acrilamida:bisacrilamida) en TAE 0.5X , con un gradiente desnaturalizante de
45 – 60% (100% de desnaturalizantes contienen urea 7 M y formamida 40% v/v en 0.5X
TAE). La electroforesis de realizó a una temperatura de 60°C, inicialmente a 170 V (10 min.)
y luego a 50 V (20 h.). Posteriormente a la electroforesis, los geles se tiñeron en una
solución de bromuro de etidio en TAE 0.5x durante 10 min. y se fotografiaron en un
transiluminador UV.
Extracción de DNA total del suelo (MO BIO, laboratories, inc.)
Ampliicación por PCR del gen codiicador de la subunidad 16S rRNA (1.5 kpb)
Ampliicación anidada de un fragmento de 0.5 kpb con pinza rica en GC del gen 16S rRNA
Análisis del patrón de bandeo del producto ampliicado mediante la técnica de DGGE (Muyzer, 1993)
32
6.1. Caracterización del suelo del Ex­lago de Texcoco
Detalles de la caracterización realizada al suelo se muestran en la Tabla 6.1.
Tabla 6.1. Caracterización del suelo del Ex­lago de Texcoco Parámetros / unidades Valor
pHH2O 9.7
Capacidad de Retención de Agua CRA (g kg­1) a 569
Contenido de agua (g kg­1)a 12
Carbono orgánico (g kg­1)a 58.2
Carbono inorgánico (g kg­1)a 12.97
Nitrógeno Kjeldahl total (g kg­1)a 0.6
N­NH4+ (mg kg­1)a 13.7
N­NO3­ (mg kg­1)a 3.5
N­NO2­ (mg kg­1)a 1.3
Conductividad eléctrica (dS m­1) 7.6
Contenido de arcilla (g kg­1)a 24
Contenido de limo (g kg­1)a 103
Contenido de arena (g kg­1)a 873
Textura Areno francoso
a Estos valores están expresados en base seca de suelo Cada valor representa la media de 3 repeticiones de 3 Sitios distintos (n=9)
33
6.2. Cinética de degradación de fenantreno y antraceno
El grado de eficiencia de extracción de PAHs por el método empleado fue de 98.9%,
considerando que se adicionaron 1200 mg fenantreno kg1 suelo seco y que la extracción de
este compuesto en el día 0 (donde no ha existido degradación alguna) de la incubación fue
de 1076 mg fenantreno kg1 suelo seco. En el caso de antraceno la eficiencia fue de 97.3%
para antraceno, considerando que se adicionaron 520 mg antraceno kg1 suelo seco y que al
día 0 se extrajeron 506 mg antraceno kg1 suelo seco.
La cinética de degradación de PAHs muestra un claro descenso en la concentración de
fenantreno (FEN) a lo largo del tiempo; sin embargo, esta degradación no fue significativa
en toda la incubación, tal y como lo demuestra la comparación de medias de Tukey (P<0.05)
(Tabla 6.2). Como puede observarse en la Fig. 6.1a, la mayor degradación se lleva a cabo
entre los días 3 y 7 de la incubación alcanzando una remoción del 29.5%; existiendo además
una diferencia significativa entre estos valores. Entre los días 7 y 14 se observa de nuevo un
descenso en la concentración de FEN; sin embargo, la comparación de medias realizada
indica que no existe diferencia significativa entre estos valores. En días posteriores de la
incubación no se detectó ningún descenso adicional en la concentración de FEN. Al final de
la incubación se logró degradar un 45% del contaminante.
En cuanto a la degradación de antraceno (ANT), el comportamiento a lo largo de la
incubación fue similar a lo descrito para FEN. La única diferencia es que entre los días 3 y 7
la degradación no fue significativa (Tabla 6.2); sin embargo entre los días 7 y 14 si ocurrió
un descenso significativo de la concentración de ANT. Al final de la incubación se degradó
un 31% del contaminante.
34
Fig. 6.1. Cinética de degradación de Fenantreno y Antraceno en el suelo del Ex­lago de Texcoco en una incubación aerobia durante 56 días
Co n ce n tr ac ió n d e P A H s ( m g k g­ 1 s u el o se co )
35
Tabla 6.2. Comparación de medias de Tukey para fenantreno y antraceno a lo largo de la incubación
MDS es la Mínima Diferencia Significativa entre medias (P<0.05) Los valores con diferente letra mayúscula indican que existe una diferencia significativa entre ellos Todos los valores representan la media de nueve repeticiones (n=9)
6.3. Análisis respirométrico de CO2
La producción acumulativa de CO2 (Fig. 6.2) se mantuvo sin diferencias apreciables entre
los tratamientos hasta el día 14 de la incubación. Sin embargo, en el día 28, el tratamiento
Acetona presentó una diferencia muy evidente con respecto a los otros dos tratamientos
(PAHs y Control), que hasta ese día permanecían sin diferencias apreciables. Finalmente,
en el día 56 de la incubación, los tres tratamientos evidencian producciones acumulativas
de CO2 bien diferenciadas, siendo el orden ascendente de estas: Control <PAHs <Acetona.
El tratamiento Acetona fue 9.2 y 2.2 veces mayor que Control y PAHs, respectivamente.
Complementando la información anterior, se determinó la producción diaria de CO2 en mg
CCO2 kg1 suelo seco d1. Estos valores, resultado del cálculo de la pendiente entre cada día
de muestreo, se muestran en la Tabla 6.3. En dicha tabla es posible apreciar que para el
tratamiento Control la producción diaria más alta se manifestó en el día 3 de la incubación,
y que después de este punto, dicha producción decrece gradualmente hasta valores <1 mg
CCO2 kg1 s.s. d1. Por otro lado, en el caso del tratamiento Acetona, la producción diaria de
CO2 disminuyó considerablemente en el día 7 con respecto al día 3 (i.e. 18 veces). Después
de este punto, la generación aumentó notablemente hasta alcanzar su valor más alto en el
día 28 (152.9 mg CCO2 kg1 s.s. d1), para finalmente descender hasta valores similares a los
presentados por el tratamiento PAHs en el mismo día. Por último, el tratamiento PAHs
presentó un comportamiento muy similar a Acetona hasta el día 7; después de este punto,
Fenantreno Antraceno Día Media Media
0 1076 A 506 A 3 1088 A 542 A 7 767 B 474 A 14 610 B 368 B 28 589 B 359 B 56 624 B 351 B
MDS 257.38 105.71
36
la producción diaria se mantuvo en valores mucho menores (3 y 5.2 veces, para día 14 y 28,
respectivamente) son respecto a Acetona. En el día 56, la producción en PAHs fue
prácticamente la misma al tratamiento mencionado, rondando éstos en valores de 32±1 mg
CCO2 kg1 s.s. d1.
Fig. 6. 2. Producción acumulativa de CO2 en el suelo del Exlago de Texcoco de los tratamientos: Control, PAHs y Acetona en una incubación aerobia de 56 días.
37
Tabla 6.3. Producción acumulativa y diaria de CO2 para todos los tratamientos de la incubación
Producción acumulativa de CO2
(mg C­CO2 kg­1 s.s)
Producción diaria de CO2 (mg C­CO2 kg­1ss.s d­1)
Día PAHs Acetona Control PAHs Acetona Control 0 0.00 0.00 0.00 3 99.82 97.38 44.00 33.27 32.46 14.67 7 107.04 112.63 77.52 1.81 3.81 8.38 14 192.50 372.20 167.59 12.21 37.08 12.87 28 606.38 2512.80 351.27 29.56 152.90 13.12 56 1535.46 3383.86 368.87 33.18 31.11 0.63
Los valores representan la media de 9 (PAHs) o 3 (Acetona y Suelo) repeticiones. Cada valor de producción diaria representa la pendiente entre un par de días de muestreo (0, 3, 7, 14, 28 y 56)
6.4. Dinámicas de Nitrógeno inorgánico
6.4.1. Dinámica de NH4+
La concentración del NH4+ extraíble en suelo (Fig. 6.3a) para los tres tratamientos (PAHs,
Acetona y Control) disminuyó apreciablemente en los días 3 y 7, hasta concentraciones
próximas a 23, 14 y 3 mg N kg1 suelo seco, respectivamente. Para PAHs, la concentración
se mantiene prácticamente constante hasta el día 28, para luego volver a disminuir
apreciablemente en el día 56 hasta aproximadamente 9 mg N kg1 suelo seco. Para Acetona,
la concentración sigue disminuyendo hasta aproximadamente 2 mg N kg1 suelo seco en el
día 28, y para el día 56 la concentración se incrementa apreciablemente hasta unos 21 mg N
kg1 suelo seco. Para Control, la concentración se mantiene constante hasta el día 28, pero
para el día 56 se presenta un aumento significativo de la concentración hasta unos 9 mg kg1
suelo seco.
6.4.2. Dinámica de NO2­
En todos los tratamientos (PAHs, Acetona y Control) las concentraciones de NO2 se
mantuvieron menores a 1.29 mg N kg1 suelo seco. Las concentraciones de este compuesto
para el día 56 fueron 1.23, 0.69 y 0.43 mg N kg1 suelo seco para PAHs, Control y Acetona,
respectivamente (Fig. 6.3b).
6.4.3. Dinámica de NO3­
Como se observa en la Fig. 6.3c, en todos los tratamientos (PAHs, Acetona y Control) se
presentó un descenso notable en la concentración de NO3 hacía el día 3, ubicándose todos
ellos aproximadamente en 22 mg N kg1 suelo seco. Sin embargo, a partir de este momento
el tratamiento Control se empieza a comportar de forma distinta al resto, ya que se observa
un aumento sostenido en la concentración de NO3 hasta alcanzar una concentración de 56.7
mg N kg1 suelo seco en el día 56. Los otros dos tratamientos, presentan un descenso
apreciable en la concentración de NO3, siendo más notorio este decremento en el
tratamiento Acetona, llegando hasta 10.8 mg N kg1 suelo seco en el día 56; mientras que el
tratamiento PAHs tiene una concentración en este mismo día de 20.2 mg N kg1 suelo seco.
39
Fig. 6.3. Dinámica de Nitrógeno inorgánico en el suelo del Exlago de Texcoco para los
tratamientos PAHs (T1), Acetona (T2) y Control (T3) en una incubación aerobia de 56 días.
Co n ce n tr ac ió n d e N it ró ge n o in or gá n ic o (m g N k g­ 1 s u el o se co )
40
6.5. Extracción de DNA metagenómico del suelo
En la Fig. 6.4. se observa la imagen de un gel con las extracciones respectivas de los
tratamientos PAHs (T1), Acetona (T2) y Control (T3) de los días 0 y 56. El tamaño
aproximado de las moléculas de DNA metagenómico extraídas es un poco menor a 19 329
p.b. de acuerdo con el marcador LambdastyI (λ).
Fig. 6.4. Imagen de un gel de agarosa con las extracciones de DNA metagenómico del suelo del Exlago de Texcoco de los tratamientos PAHs (T1), Acetona (T2) y Control (T3) para los
días 0 y 56 de la incubación. Se utilizó el marcador de tamaño Lambda­styI (λ).
Además, se calculó que la cantidad de DNA extraído fue en promedio de 0.8200 y 1.0922
mg, para los días 0 y 56, respectivamente (Tabla 6.4). Una explicación más detallada de
cómo se llevó a cabo la cuantificación de DNA se presenta en el Anexo al final de este
documento.
Tratamientos Masa total de DNA extraída
(mg)
5.5006 ± 0.6472
7.3124 ± 1.3713
19329 7743 6223 4254 3472 2690 1882 1498 925 421
p.b. λ T1 T2 T3 T1 T2 T3 λ
D0 D56
6.6. Amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
6.6.1. PCR 1500 p.b. del gen 16S rDNA
Se amplificó un fragmento de aproximadamente 1 500 p.b, como lo indica la posición de la
banda obtenida y el marcador molecular utilizado (Fig. 6.5). Se observa una segunda banda
menos intensa de un fragmento inespecífico de unos pocos pares de bases menos a la
deseada.
Fig. 6.5. Imagen de un gel de una PCR de un fragmento de aproximadamente 1500 p.b. del gen 16S rDNA de los tratamientos PAHs (T1), Acetona (T2) y Control (T3) para los días 0 y 56 de la
incubación y marcador de 1500 p.b. 6.6.2. PCR anidada de 500 p.b. de la región variable V3 del gen 16S rDNA
Se amplificó un fragmento de aproximadamente 500 p.b. como lo indica la posición de la
banda amplificada y el marcador molecular empleado (Fig. 6.6). No se observa ninguna
banda inespecífica por lo que se confirma que la condiciones de la PCR empleadas son las
adecuadas para el fragmento. Además, la reacción negativa no amplificó ninguna banda
descartándose cualquier posible contaminación de las muestras.
T1 T2 T3
42
Fig. 6.6. Imagen de un gel de PCR de un fragmento de aproximadamente 500 p.b. con pinza rica en GC de la región variable V3 del gen 16S rDNA de los tratamientos PAHs (T1), Acetona (T2) y Control (T3) para los días 0 y 56 de la incubación, reacción negativa (–) y marcador de
500 p.b. 6.7. Perfilado genotípico de la comunidad por DGGE
Se obtuvieron los perfiles genómicos (o patrones de bandeo) de cada uno de los
tratamientos propuestos (PAHs, Acetona y Control) para los días 0 y 56 (Fig. 6.6)
utilizando un gradiente desnaturalizante de 45 – 60% de urea y formamida. Éstos perfiles
se analizan más adelante para determinar los cambios en la diversidad y estructura
bacteriana del suelo al comienzo y final de la incubación aerobia por 56 días.
T1 T2 T3 ( - )
T1 T2 T3
43
Fig. 6.6. Imágenes de dos geles de DGGE del experimento del suelo del Ex­lago de Texcoco con los Tratamientos: T1 = PAHs, T2 = Acetona y T3 = Control, para los días D0 (a) y D56 (b).
Ambos geles tienen un gradiente desnaturalizante de 45­60% Urea­Formamida y se corrieron de manera conjunta al mismo voltaje (45 V) por 20 h. en TAE 0.5X a una temperatura
constante (60°C).
PAHs Acetona Control PAHs Acetona Control
44
7.1. Caracterización del suelo
Como se observa en la Tabla 6.1, dentro de las principales características detectadas en el
suelo, podemos observar que el pHH2O es de 9.7, y que se encuentra dentro del rango
característico de los suelos de este sitio: 8.5 a 10.5 (Luna, 2002 ). De acuerdo a la Norma
Oficial Mexicana NOM–022–SEMARNAT–2000, este suelo se caracteriza como Fuertemente
alcalino. Por otro lado, la conductividad eléctrica (C.E.) en el extracto de saturación resultó
de 7.6 dS m1, lo cual refleja la alta salinidad característica de esos suelos; sin embargo, este
valor es cercano a los límites inferiores de CE reportados para el suelo del Exlago de
Texcoco: 0.4 a 70 S m1 (Luna, 2002). De acuerdo a la misma norma, este suele se clasifica
como Salino. La cantidad de nitrógeno Kjeldhal resultó de 0.6 g N kg1 s.s., lo cual conforme
a la misma norma, clasifica a la cantidad de nitrógeno total del suelo como Bajo.
7.2. Cinética de degradación de fenantreno y antraceno y Análisis respirométrico de
CO2
Se calculó el porcentaje de recuperación de estos hidrocarburos mediante la técnica
utilizada (Song et al., 1995) en el suelo del Exlago de Texcoco, el cual fue de 97% para FEN
y 90% ANT. Song (2002) en un estudio comparativ