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UNIVERSIDAD DEL TURABO
COMUNIDADES MICROBIANAS PRESENTES EN LA HOJARASCA A DIFERENTES ESTADOS DE DESCOMPOSICIÓN CON O SIN LA ABERTURA DEL
DOSEL Y LA DEPOSICIÓN DEL DETRITO
Por
María L. Ortiz Hernández B.S., Ciencias Naturales, Universidad de Puerto Rico en Río Piedras
TESIS
Escuela de Ciencias y Tecnología Universidad del Turabo
Requisito parcial para el grado de
Maestría en Ciencias Ambientales
Con Especialidad en Manejo Ambiental
Gurabo, Puerto Rico
mayo, 2008
ii
© Copyright 2008
María L. Ortiz Hernández. All Rights Reserved.
iii
Dedicatoria
Dedico este trabajo de investigación primeramente a DIOS y a mi mayor tesoro:
mi familia. Porque siempre han estado a mi lado apoyándome en los momentos o
situaciones que me hacían flaquear. Jean Carlos, Carlos Javier y Karla Michelle ustedes
son mi fuente de motivación e inspiración para cada día seguir superándome. Carlos,
amado esposo, gracias por escoger estar a mi lado y por brindarme el espacio y la fuerza
que me han permitido culminar este gran reto. A mis padres, Rogelio y Monserrate,
porque me enseñaron que en la vida hay que luchar con empeño para lograr nuestros
sueños. A mi nieto Adrián Alexander y a mi futura nieta Ariana Michelle, gracias por
brindarle ternura y energía a mi vida. Este logro se lo dedico, especialmente, a todos
ustedes.
iv
Agradecimiento
Siempre he pensado que Dios pone en nuestro camino a personas que de una
forma u otra han de impactar nuestras vidas. Durante esta investigación hubo muchas
personas que colaboraron conmigo. En primer lugar, quiero agradecer de manera muy
especial a la Profesora Sharon Cantrell la confianza que tuvo en mí al escogerme para
realizar esta investigación. Usted ha sido mi guía y asesora, la persona que ha estado
durante estos años brindándome su apoyo y conocimiento para que hoy pueda culminar
con este gran reto. Gracias por su paciencia y dedicación. También quiero agradecer de
manera especial el asesoramiento, las recomendaciones y el apoyo del Profesor José
Pérez y la Dra. Deborah J. Logde.
Mi agradecimiento especial al “Luquillo Long Term Ecological Research” por
proporcionarnos la asistencia técnica y al “Institute for Tropical Ecology Study” por
proveernos las facilidades y los recursos económicos que nos permitieron llevar a cabo
este estudio.
Agradezco a Francisco Rivera, Zulma Ortiz, Claribel Báez, Albany Agues
Marchetti y a Carlos Cruz la ayuda que me brindaron en las tareas realizadas en el
laboratorio. Gracias por su ayuda incondicional.
Finalmente, agradezco a mis familiares, amistades y a todos aquellos que dieron
de su conocimiento, tiempo, y dedicación para que esta investigación se realizara.
Gracias por su apoyo.
v
Tabla de contenido
página
Lista de Tablas ..................................................................................................................vii
Lista de Figuras ................................................................................................................viii
Tabla de Apéndices ............................................................................................................ xi
Abstract .............................................................................................................................xii
Resumen...........................................................................................................................xiii
Capítulo Uno Introducción.................................................................................................. 1
Justificación............................................................................................................. 1
Metas y Objetivos.................................................................................................... 3
Hipótesis.................................................................................................................. 4
Capítulo Dos Revisión de Literatura................................................................................... 8
Capítulo Tres Metodología................................................................................................ 22
Descripción del lugar de estudio ........................................................................... 22
Diseño experimental.............................................................................................. 24
Procedimiento para la colección y manejo de muestras........................................ 28
Extracción de ADN ............................................................................................... 28
Amplificación del ADN ........................................................................................ 28
Comparar estructura y estimar diversidad............................................................. 29
vi
página
Análisis estadísticos .............................................................................................. 29
Capítulo Cuatro Resultados .............................................................................................. 30
Resultados de la investigación .............................................................................. 30
Capítulo Cinco Discusión.................................................................................................. 76
Literatura Citada................................................................................................................ 81
Apéndices .......................................................................................................................... 85
vii
Lista de Tablas
página
Tabla 4.01. Muestras colectadas durante los intervalos de muestreo.............................. 31 Tabla 4.02. Amplificación de ADN ................................................................................ 32 Tabla 4.03. Promedio del ADN total (µg/ml) en los Bloques A, B y C de acuerdo
al tratamiento aplicado y al tiempo de muestreo en la cohorte de hojarasca fresca ............................................................................................ 34
Tabla 4.04. Promedio del ADN total (µg/ml) en los Bloques A, B y C de acuerdo
al tratamiento aplicado y al tiempo de muestreo en la cohorte de hojas verdes .................................................................................................. 36
Tabla 4.05. Resultados del análisis estadístico “Two-Way ANOVA” del ADN
(µg/ml) versus el tratamiento aplicado y el tiempo en las hojas verdes y en la hojarasca fresca ..................................................................... 40
Tabla 4.06. Relación entre el número de filotipos de hongos y el número de
filotipos de bacterias versus el % de humedad de acuerdo al tratamiento aplicado en la cohorte de hojarasca fresca ................................ 46
Tabla 4.07. Resultados del análisis estadístico “ANOVA” al aplicar la técnica
TRFLP en hongos versus el tratamiento aplicado y el tiempo en las hojas verdes y en la hojarasca fresca............................................................ 50
Tabla 4.08. Resultados del análisis estadístico “ANOVA” al aplicar la técnica
TRFLP en bacterias versus el tratamiento aplicado y el tiempo en las hojas verdes y en la hojarasca fresca............................................................ 51
Tabla 4.09. Por ciento (%) de masa remanente en los Bloques A, B y C de
acuerdo al tratamiento aplicado y al tiempo de muestreo en la cohorte de hojarasca fresca .......................................................................... 52
viii
Lista de Figuras
página
Figura 3.01. Mapa del área este de Puerto Rico ............................................................ 23
Figura 3.02. Mapa topográfico del área de estudio en la Estación El Verde................. 24 Figura 3.03. Mapa del área de estudio en el Bosque Experimental de Luquillo,
Estación El Verde...................................................................................... 25 Figura 3.04. Diagrama de la canasta de descomposición .............................................. 26 Figura 3.05. Remoción de la canasta de descomposición en el intervalo de las
31 semanas ................................................................................................ 27 Figura 4.01. Comparación del promedio del ADN total (µg/ml) en la hojarasca
fresca de acuerdo al tiempo y al tratamiento aplicado .............................. 38 Figura 4.02. Comparación del promedio del ADN total (µg/ml) en las hojas
verdes de acuerdo al tiempo y al tratamiento aplicado ............................. 39 Figura 4.03. Diversidad de bacterias y hongos encontrada en la cohorte de
hojarasca fresca de acuerdo al tiempo y al tratamiento aplicado y basados en el TRFLP................................................................................. 43
Figura 4.04. Relación del número de filotipos de bacterias versus el número de
filotipos de hongos en el tratamiento poda del dosel sin adición del detrito en la hojarasca fresca en los intervalos de las 17, 31 y 55 semanas ..................................................................................................... 44
Figura 4.05. Relación del número de filotipos de bacterias versus el número de
filotipos de hongos en el tratamiento control en la hojarasca fresca en los intervalos de las 17, 31 y 55 semanas............................................. 44
Figura 4.06. Relación del número de filotipos de bacterias versus el número de
filotipos de hongos en el tratamiento no poda del dosel más adición del detrito en la hojarasca fresca en los intervalos de las 17, 31 y 55 semanas ................................................................................................ 45
Figura 4.07. Relación del número de filotipos de bacterias versus el número de
filotipos de hongos en el tratamiento poda del dosel más adición del detrito en la hojarasca fresca en los intervalos de las 17, 31 y 55 semanas ................................................................................................ 45
ix
Figura 4.08. Razón del número de filotipos de hongos entre el número de filotipos de bacterias versus el por ciento de humedad encontrada en la hojarasca fresca en los intervalos de las 17, 31 y 55 semanas.......... 47
Figura 4.09. Diversidad de bacterias y hongos encontrada en la cohorte de hojas
verdes de acuerdo al tiempo y tratamiento aplicado y basados en el TRFLP....................................................................................................... 49
Figura 4.10. ADN total extraído de 0.3 g de la hojarasca fresca en las 17, 31 y
55 semanas y el por ciento de masa remanente......................................... 53 Figura 4.11. Cladograma del TRFLP del “pool” de las muestras que dieron
positivo al PCR mostrando la estructura de la comunidad de bacterias y hongos presentes en las diferentes cohortes de hojas y en los tratamientos aplicados..................................................................... 56
Figura 4.12. Perfil de TRFLP de muestras de bacterias de la hojarasca fresca en
el bloque (A) a las que se les aplicó el tratamiento control a través del tiempo.................................................................................................. 58
Figura 4.13. Perfil de TRFLP de muestras de hongos de la hojarasca fresca en el
bloque (A) a las que se les aplicó el tratamiento control a través del tiempo........................................................................................................ 59
Figura 4.14. Perfil de TRFLP de muestras de las diferentes cohortes de la
misma canasta del bloque A que dieron positivo a bacterias y a las que se les aplicó el tratamiento de no poda más adición de detrito en el intervalo de las 17 semanas .............................................................. 62
Figura 4.15. Perfil de TRFLP de muestras de las diferentes cohortes de la
misma canasta del bloque A que dieron positivo a bacterias y a las que se les aplicó el tratamiento de no poda más adición de detrito en el intervalo de las 55 semanas .............................................................. 63
Figura 4.16. Perfil de TRFLP de muestras de las diferentes cohortes de la
misma canasta del bloque A que dieron positivo a hongos y a las que se les aplicó el tratamiento de no poda más adición de detrito en el intervalo de las 17 semanas .............................................................. 64
Figura 4.17. Perfil de TRFLP de muestras de las diferentes cohortes de la
misma canasta del bloque A que dieron positivo a hongos y a las que se les aplicó el tratamiento de no poda más adición de detrito en el intervalo de las 55 semanas .............................................................. 65
x
Figura 4.18. Perfil de TRFLP de muestras de las diferentes cohortes de la misma canasta del bloque A que dieron positivo a bacterias y a las que se les aplicó el tratamiento de poda más adición de detrito en el intervalo de las 17 semanas ................................................................... 67
Figura 4.19. Perfil de TRFLP de muestras de las diferentes cohortes de la
misma canasta del bloque A que dieron positivo a bacterias y a las que se les aplicó el tratamiento de poda más adición de detrito en el intervalo de las 55 semanas ................................................................... 68
Figura 4.20. Perfil de TRFLP de muestras de las diferentes cohortes de la
misma canasta del bloque A que dieron positivo a hongos y a las que se les aplicó el tratamiento de poda más adición de detrito en el intervalo de las 17 semanas ................................................................... 70
Figura 4.21. Perfil de TRFLP de muestras de las diferentes cohortes de la
misma canasta del bloque A que dieron positivo a hongos y a las que se les aplicó el tratamiento de poda más adición de detrito en el intervalo de las 55 semanas ................................................................... 71
Figura 4.22. Perfil de TRFLP de muestras de la cohorte de hojarasca fresca del
bloque A que dieron positivo a bacterias y a las que se les aplicaron distintos tratamientos en el intervalo de las 55 semanas ........... 73
Figura 4.23. Perfil de TRFLP de muestras de la cohorte de hojarasca fresca del
bloque A que dieron positivo a hongos y a las que se les aplicaron distintos tratamiento en el intervalo de las 55 semanas ............................ 74
xi
Lista de Apéndices
página
Apéndice Uno. ....................................................................................................... 85
Apéndice 1.01. Protocolo para extracción de ADN ............................................... 86 Apéndice 1.02. Dilución de iniciadores oligonucleótidos...................................... 88 Apéndice 1.03. Protocolo de precipitación para productos de secuenciación........ 89 Apéndice Dos. Resultados ..................................................................................... 91 Apéndice 2.01. Resultados de la amplificación del ADN mediante la
técnica de reacción de la cadena de polimerasa (PCR) utilizando la enzima de restricción Red Taq ................................. 91
Apéndice 2.02. Resultados obtenidos en las muestras de hojarasca fresca
colectadas en los Bloques A, B y C al determinar la concentración de ADN total (µg/ml) y la diversidad de microorganismos utilizando la técnica de TRFLP de acuerdo a los tratamientos e intervalos de tiempo......................... 96
Apéndice 2.03. Resultados obtenidos en las muestras de hojas verdes
colectadas en los Bloques A, B y C al determinar la concentración de ADN total (µg/ml) y la diversidad de microorganismos utilizando la técnica de TRFLP de acuerdo a los tratamientos e intervalos de tiempo......................... 98
xii
Abstract
María L. Ortiz Hernández (Master of Science, Environmental Science)
Leaf litter microbial communities at different stages of decomposition with and without
canopy opening and debris deposition (May 2008)
Abstract of Master’s Thesis at the Universidad del Turabo
M.S. thesis supervised by Dr. Sharon Cantrell
No. of the pages in the text 99
Hurricanes are common disturbances affecting forest ecosystems in the
Caribbean. Our objective was to determine the relative abundance and diversity of
microorganisms in leaf litter at different stages of decomposition, and the influence of
canopy opening and debris addition or removal. The study was conducted in the tabonuco
forest (subtropical moist) at El Yunque Rain Forest, Puerto Rico. Three blocks with four
treatment plots were established. TRFLP profiles of the 16S rDNA digested with MnlI
and fungal ITS digested with HaeIII showed that the microbial communities at 17, 31 and
55 weeks were highly divergent among treatments. Ratio of fungal to bacterial
phylotypes increased for close canopy with debris addition. Leaf mass loss was slowest in
the treatment with canopy trimming and debris removal. Microbial community changes
through time can be related to microclimate and the availability of labile compounds.
Fungi appeared to control the succession of microorganisms in decomposing leaves.
xiii
Resumen
Los huracanes son disturbios comunes que afectan los ecosistemas de bosques en
el Caribe. El objetivo de nuestro estudio fue determinar la abundancia relativa y la
diversidad de microorganismos en la hojarasca a diferentes estados de descomposición, y
el efecto de la poda del dosel y la adición o remoción del detrito. El estudio fue realizado
en bosque tabonuco (subtropical húmedo) en el bosque lluvioso El Yunque en Puerto
Rico. Se establecieron tres bloques divididos en cuatro parcelas con cuatro tratamientos
distintos. El TRFLP de la región 16S rADN digerida con la enzima MnlI y la región ITS
digerida con la enzima HaeIII mostró que las comunidades microbianas a las 17, 31 y 55
semanas fueron altamente divergentes a través de los tratamientos. La razón del número
de filotipos de hongos versus los de bacterias fue mayor en el tratamiento de no poda más
adición del detrito. La pérdida de masa en la hojarasca fresca fue más lenta en el
tratamiento de poda del dosel sin adición de detrito. Los cambios de las comunidades
microbianas a través del tiempo pudieron ser relacionados al microclima y a la
disponibilidad de compuestos lábiles. Los hongos aparentan controlar la sucesión de
microorganismos al descomponer la hojarasca.
xiv
.
1
Capítulo Uno
Introducción
Justificación
Los disturbios atmosféricos que afectan los bosques del Caribe son causados
principalmente por los huracanes. Éstos se originan en la costa occidental de África y una
vez llegan al Caribe provocan cambios profundos en la fauna, la flora, la geografía, el
suelo y en diversos aspectos generales del lugar. En trabajos realizados en Puerto Rico se
ha sugerido que los disturbios naturales, como los huracanes, tienen un efecto
significativo en la estructuración de los bosques tropicales, particularmente en la
distribución de árboles, la diversidad de especies y la biomasa (Weaver, 1986; Lugo y
Rivera-Battle, 1987).
Durante los huracanes Hugo (1989) y Georges (1998), se crearon aberturas en el
dosel del bosque de El Yunque y se produjo un aumento en la cantidad de hojarasca y
madera acumulada en el suelo (Lodge et al, 1991; Ostertag et al, 2003). De acuerdo a los
estudios realizados por Lodge et al, (1991), el Huracán Hugo depositó 1 kg/m2 de
hojarasca en el suelo del bosque. En un periodo de dos años, la diversidad funcional de
comunidades microbianas (Willig et al, 1996) y la supervivencia de los hongos (Lodge
and Cantrell, 1995) fue afectada por el aumento en detrito, luz, humedad y nutrientes. En
estudios realizados por Quishui y Zak (1995), se relaciona el tamaño de la abertura del
dosel en bosques subtropicales y la descomposición de la hojarasca. En su trabajo se
establece que los factores de temperatura, humedad y la radiación solar son factores que
median las actividades y la estructura de las comunidades microbianas. Por otra parte en
2
estudios realizados por Cornejo, Varela y Wright (1994), se utiliza el método de
irrigación para manipular el agua en el terreno durante la época de sequía y poder
examinar el efecto de ésta sobre la razón de descomposición, la liberación de nutrientes,
las bacterias y los hongos. Utilizaron series de diluciones para cuantificar la densidad de
bacterias y hongos. En su estudio encontraron que las concentraciones de nutrientes en
las fracciones recalcitrantes de la hojarasca mostraban una declinación rápida en el
primer mes seguida por la bioacumulación o cambios no significativos en los siguientes
cuatro meses. El conteo de bacterias mostró la tendencia a disminuir de valores altos en
enero, febrero y marzo a valores bajos en abril y mayo, cuando la hojarasca era irrigada.
Esta disminución fue correlacionada con la pérdida de masa y probablemente reflejaba
una variedad de cambios en la calidad del sustrato durante la descomposición. Por el
contrario, en la parcela control, el conteo de hongos fue mayor cuando las condiciones
eran más secas durante febrero y marzo y declinaba con la leve lluvia de abril y las
fuertes lluvias de mayo. Estas observaciones confirmaron que las condiciones secas
favorecían la actividad de los hongos (Cornejo et al, 1994). No obstante, aún tiene que ser
determinado el papel que desempeñan las interacciones de las comunidades microbianas
presentes en la sucesión de la descomposición de la hojarasca sobre el suelo.
El valor de este estudio estribaba en que se pudiera determinar como la
deposición de la hojarasca verde y la abertura del dosel en el bosque afectaban las
comunidades de microorganismos (hongos y bacterias) presentes en la hojarasca. El
objetivo se alcanzó mediante la aplicación de “Terminal Restriction Fragment Length
Polymorphism” (TRFLP) utilizando el gen para la subunidad ribosomal pequeña en
bacterias (16S rADN) y la región interna que se transcribe en hongos (ITS, por sus siglas
3
en inglés), independientemente. Esta técnica es considerada una herramienta poderosa y
rápida para estimar la diversidad y estructura de comunidades microbianas complejas.
Meta y Objetivos
La meta del estudio fue determinar cómo la deposición de la hojarasca verde y la
abertura del dosel en el bosque afectaban independientemente o en conjunto las
comunidades microbianas (hongos y bacterias) presentes en la hojarasca. En otras
palabras, se pretendía caracterizar y medir los cambios en la sucesión microbiana en la
hojarasca simulando las condiciones que surgen con el paso de un huracán. Las aberturas
en el dosel del bosque y la deposición del detrito ocurren normalmente en conjunto como
resultado de los daños causados por los huracanes, pero en este estudio se utilizó un
diseño factorial 2 x 2 para separar estos efectos. El estudio se realizó en tres áreas del
Bosque Experimental de Luquillo en las cuales se recrearon los efectos de un huracán
podando de manera sistemática el dosel para luego redistribuir la vegetación acumulada
en distintas áreas. El cambio en las comunidades se analizó estableciendo distintas
condiciones y simulando el movimiento de fuentes orgánicas, como hojas y ramas,
durante el paso de un huracán. Con este estudio se pretendía medir los cambios en la
estructura microbiana en respuesta a los diferentes tratamientos y sus efectos relativos en
los organismos presentes en la sucesión de descomposición del material orgánico. Se
tuvo como finalidad relacionar la información a nivel molecular con la actividad a escala
ecológica. Los objetivos de este estudio son:
� Analizar la composición y estructura de las comunidades microbianas en la
hojarasca por medio de TRFLP.
4
� Determinar si hay alguna diferencia significativa entre los tratamientos y
diferentes niveles de descomposición de la hojarasca.
� Determinar la diversidad de bacterias y hongos presentes en la sucesión en la
hojarasca.
Hipótesis
Ho: La deposición de materia orgánica y las aberturas en el dosel mantendrán
invariable la diversidad de microorganismos en la hojarasca a diferentes estados de
descomposición.
Ha: La deposición de materia orgánica y las aberturas en el dosel cambiarán la
diversidad relativa de microorganismos en la hojarasca a diferentes estados de
descomposición.
En trabajos realizados en el Bosque Experimental de Luquillo se ha encontrado,
que la formación de aberturas en el dosel del bosque han causado cambios en la
composición de comunidades de basidiomicetos en hojarasca, y a la misma vez, una
disminución en la abundancia de especies (Hedger, 1985; Lodge and Cantrell, 1995). Por
otro lado, Quishui y Zak (1995), encontraron que estas aberturas en el dosel afectan
drásticamente la tasa de descomposición del lugar al reducir las actividades microbianas
debido a los cambios en temperatura e irradiación de luz solar que ocurren en el suelo.
El “Long Term Ecological Research” (LTER) auspiciado por la Fundación
Nacional para la ciencias en su propuesta número 3 propuso estudiar los efectos de un
huracán en las comunidades de organismos sobre el suelo del bosque. A estos fines, se
seleccionaron tres áreas o bloques de estudios, las cuales estuvieron divididas en cuatro
parcelas cada una y estas parcelas se dividieron en cinco subparcelas. En estas áreas se
5
simularon los diferentes efectos de un huracán. Dos de las cuatro parcelas fueron
sometidas a una poda del dosel (corte de ramas por arboristas profesionales). En una de
estas parcelas, se removió toda la hojarasca y las ramas verdes, y éstas se distribuyeron
en otra parcela (donde no hubo poda del dosel). Al podar el dosel y redistribuir la
biomasa, se crearon cambios en el microclima y estructura del bosque. Durante un año se
tomaron muestras de la hojarasca para extraer el ADN y determinar los cambios,
mediante indicadores genéticos, en la sucesión de las comunidades de microorganismos
presentes durante la descomposición en la hojarasca después de un disturbio natural.
Con el propósito de determinar como estos cambios afectan los microorganismos
describiremos a continuación los distintos tratamientos.
Descripción de los tratamientos:
1. Abertura del dosel y adición del detrito
Este tratamiento simulará cambios en el microclima causados por la abertura en el
dosel y la adición de materia orgánica. La tasa de descomposición de la hojarasca
presente en las canastas aumentará debido al incremento relativo en la humedad de la
capa de hojarasca protegida y al movimiento de nutrientes de las hojas verdes. Los
cambios en humedad, profundidad de la hojarasca y la alta concentración de nutrientes en
las hojas verdes podrán interactuar e influenciar la tasa de descomposición en la capa de
la hojarasca presente sobre el suelo, además de la hojarasca verde. Por tanto, la
diversidad de microorganismos en la hojarasca no cambiará inmediatamente después que
el dosel sea podado. Eventualmente habrá una disminución en la diversidad relativa
debido a la abertura de dosel y los cambios microclimáticos asociados (altas temperaturas
y radiación de luz) que afectarán el desarrollo y las actividades microbianas en la
6
sucesión de descomposición de la hojarasca. Una vez que la abertura de dosel se cierre y
las condiciones microclimáticas se reestablezcan aumentará la diversidad de
microorganismos.
2. Abertura del dosel y remoción del detrito
Esto simulará los cambios en el microclima (aberturas) creados por el huracán sin
la incorporación de cambios en la redistribución de biomasa. El incorporar material
orgánico es un factor importante para el desarrollo microbiano dentro de un ecosistema.
Por ende, si se retira esta fuente orgánica, se disminuye el desarrollo de los
microorganismos, particularmente los hongos. En este tratamiento se observará una
diversidad reducida en el número de microorganismos inmediatamente después que el
dosel del bosque se ha podado y se retire el material orgánico ya que habrá una
disminución en la sucesión de descomposición de la hojarasca. Eventualmente, la
diversidad de microorganismos comenzará a reestablecerse una vez la abertura del dosel
se cierre y se reestablezcan las condiciones climáticas dentro del bosque.
3. Dosel cerrado y adición del detrito
Esto simuló los cambios en la redistribución de biomasa creados por el huracán
sin la asociación de los cambios del microclima. Se esperará que la hojarasca existente en
las canastas tenga un aumento en la tasa de descomposición debido al aumento en la
profundidad de la hojarasca y el ambiente favorable. Este tratamiento podrá tener la tasa
más rápida de pérdida de hojarasca presente sobre el suelo. Las condiciones climáticas
invariables y la entrada de biomasa dentro del bosque mantendrán sin cambios la
diversidad de microorganismos. Inmediatamente luego del tratamiento habrá un marcado
y rápido aumento en la diversidad de los microorganismos ocasionado por el incremento
7
de biomasa en la descomposición de la hojarasca sobre el suelo. La diversidad de
microorganismos podrá mantenerse sin cambios.
4. Control. Dosel cerrado y no adición del detrito
Esto mantendrá las condiciones del bosque sin cambios Se esperará que este
tratamiento tenga el segundo o tercer lugar más alto en la tasa de descomposición. La
diversidad de microorganismos en la hojarasca de las canastas no cambiará. Las
condiciones invariables del bosque mantendrán la composición, la estructura y la
diversidad microbiana.
8
Capítulo Dos
Revisión de Literatura
El suelo es un recurso natural dinámico necesario para sustentar cualquier
ecosistema terrestre. La calidad de éste puede afectar la sustentabilidad y productividad
de uso de la tierra y, al mismo tiempo, esta calidad puede ser influenciada fuertemente
por procesos microbiológicos tales como el reciclaje y la capacidad de nutrientes entre
otros.
La biomasa microbiana del suelo y de la hojarasca en los bosques tropicales está
compuesta de eubacterias, arqueobacterias, hongos, actinomicetos, algas, protozoarios y
algunos nemátodos. Esto constituye un cuarto de la biomasa total del planeta. Es por esta
razón que la biomasa microbiana contribuye al mantenimiento de la fertilidad y calidad
del suelo tanto en el ecosistema terrestre natural como en el ecosistema terrestre
manipulado. De acuerdo a los estudios realizados por Willig et al, (1996), el uso que se le
da al suelo afecta la estructura del ecosistema, éste incluye características tales como
composición química, profundidad, disponibilidad de agua y concentración de materia
orgánica. Aunque todos estos factores se pueden relacionar, no se ha podido determinar
cuál de éstos es más importante en la estructura de la comunidad microbiana debido a la
falta de manipulaciones en la experimentación. La biomasa microbiana es parte de la
materia orgánica del suelo y de la hojarasca que se encuentra sobre éste y tiene una
función importante en el desarrollo y funcionamiento de ecosistemas terrestres. La
materia orgánica del suelo es una mezcla compleja de materia viva, muerta y
descompuesta, en adición a los compuestos inorgánicos. El componente vivo comprende
9
alrededor de un 4% del carbono orgánico total del suelo y es subdividido en tres
componentes: raíces de plantas (5-10%), macroorganismos (15-30%) y microorganismos
(60-80%). Por otro lado el componente no vivo de la materia orgánica del suelo se puede
dividir en materia macroorgánica (residuos de plantas en diferentes estados de
descomposición), y humus incluyendo sustancias no húmicas (carbohidratos, lípidos,
ácidos orgánicos, pigmentos y proteínas) y sustancia húmicas (ácido húmico y ácido
fúlvico) (Theng et al, 1989).
En la naturaleza los microorganismos viven en comunidades. Estas comunidades
desempeñan un papel importante en la biosfera, principalmente reciclando elementos
biológicos importantes (Vestal y White, 1989). Todos los ciclos bioquímicos esenciales
como los de carbono, hidrógeno, nitrógeno, oxígeno y azufre están mediados por
comunidades de microorganismos. Por ende, si se entiende la función que tienen los
microorganismos en el ambiente natural, se facilitará el distinguir cuáles organismos
están presentes. Es sumamente importante entender el papel de estos microorganismos en
el ecosistema. Los microorganismos controlan muchos de los procesos esenciales para el
mantenimiento y supervivencia de los bosques tropicales. Lodge et al, (1996) presenta las
dinámicas de la diversidad microbiana y el funcionamiento de los bosques. En adición, se
mencionan los atributos funcionales de los microorganismos y se identifican los procesos
que son sensibles a la pérdida de la diversidad, de manera especial, aquellos relacionados
con disturbios o cambios ambientales en los bosques tropicales. En ese trabajo, los
autores reconocen que existen pocas publicaciones que presenten cómo los
microorganismos pueden influenciar los ecosistemas en los bosques tropicales. Esto
ocurre ya que las publicaciones que más abundan están asociadas a la caracterización de
10
microorganismos que se relacionan a procesos en ecosistemas tropicales, pero el estudio
de cómo la diversidad afecta el funcionamiento de los ecosistemas es prácticamente
limitado.
Se ha intentado determinar la función de ciertos microorganismos, como bacterias
y hongos, en las comunidades microbianas naturales por medio de cultivos selectivos
enriquecidos (Vestal y White, 1989). Por ejemplo, se puede seleccionar un medio con una
sola fuente de carbono y luego mezclar el medio con la muestra de suelo o sedimento, se
esperará que sólo aquellos microorganismos que puedan degradar la fuente de carbono
añadida puedan crecer. De esta manera, dichos organismos serán seleccionados y
enriquecidos produciendo una fuente de biomasa medible. Los microorganismos serán
cultivados para obtener colonias puras. Este método ha sido utilizado para demostrar el
papel de los microorganismos en el reciclaje de la materia en la naturaleza (Vestal y
White, 1989).
La cadena alimentaria subterránea del suelo difiere en varias maneras de la cadena
superior de éste, pero quizás, una de las diferencias más importantes está en su función.
Se ha señalado que las cadenas subterráneas del suelo son responsables de la mayor parte
de la descomposición y el reciclaje de nutrientes en los ecosistemas, mientras las cadenas
superiores son responsables de la productividad, como por ejemplo la entrada de carbono
(Gange et al, 2002). Esta diferencia ocurre ya que la cadena subterránea es dominada por
componentes microbianos. Gange et al, (2002) llegó a la conclusión que en la sucesión
temprana los insectos que se alimentan de raíces y los hongos AM (micorrizales
arbusculares) miembros de la cadena alimentaria del suelo afectan la estructura de las
plantas de la comunidad. Ocurren varias interacciones entre ellos, el efecto de los
11
insectos es más grande cuando los hongos están presentes, pero el efecto de los hongos es
mayor cuando los insectos están ausentes. Los insectos que se alimentan de raíces
aceleran el proceso de sucesión, mientras los hongos micorrizales arbusculares la
retrasan. Por otra parte, en su trabajo LaMontagne et al, (2003) compararon comunidades
bacterianas del suelo a través de dos transectos verticales desde la superficie hasta cuatro
metros de profundidad utilizando la técnica de polimorfismos en longitud de fragmentos
terminales de restricción (TRFLP) para amplicones de genes 16S rARN para determinar
cómo se diferenciaban las comunidades bacterianas en la superficie y las capas
subterráneas. Los hallazgos revelaron que el ADN extraído de la muestras del suelo de
los dos transectos disminuyó exponencialmente desde la superficie hasta cuatro metros de
profundidad. La riqueza, adquirida por el número de picos obtenidos después de la
digestión con las enzimas HhaI, MspI, RsaI, o HaeIII, y la diversidad, obtenida por los
índices de diversidad Shannon, fueron menores en las muestras más profundas. La
disminución en diversidad en la profundidad es consistente con la teoría de energía de las
especies, la cual predice una diversidad relativa menor en los horizontes de materia
orgánica más profundos. El patrón de uso del sustrato indica que el cultivo de
microorganismos difiere entre los horizontes A (capa del suelo en la que se encuentra el
humus, materia orgánica descomponiéndose y la actividad microbiana) y el horizonte O
(capa superior del suelo en el que se encuentra la hojarasca) en los suelos del bosque.
Este cambio en las poblaciones coincide con la disminución en el carbono del suelo, la
biomasa microbiana total y la actividad que se produce a medida que aumenta la
profundidad. En adición, LaMontagne et al, (2003) mencionan en su trabajo que las
comunidades bacterianas en la superficie cambian con la disponibilidad de nutrientes y
12
que hay diferencias causadas por la profundidad y las estaciones del año. Existen varios
ejemplos de cómo la alteración en la productividad de la planta (usualmente por
defoliación) afecta la estructura de la cadena alimentaria del suelo (Mikola et al, 2001).
Estos experimentos mostraron que las interacciones son complejas a medida que algunos
componentes de la biota del suelo, como los nemátodos microbívoros, son afectados por
algunas combinaciones particulares de especies de plantas defoliadas. Mientras tanto para
otros (hongos), no es importante la identidad de la especie de planta, pero si la cantidad
del follaje que fue removido (Gange et al, 2002). Los trabajos de Mikola et al, 2001
sugieren que la intensidad de la defoliación puede afectar grandemente la cadena
alimentaria del suelo. En ese trabajo se concluyó que los datos microbianos obtenidos
implicaban que el efecto de la intensidad de la defoliación en la estructura de la cadena
alimentaria del suelo podría depender de la duración de la defoliación y, por
consiguiente, es probable que sea más dinámico que constante en la naturaleza. En
trabajos realizados en Puerto Rico, se ha sugerido que los disturbios naturales, como los
huracanes, tienen un efecto significativo en la estructuración de los bosques tropicales.
Esto ocurre en relación a los aspectos de distribución de árboles, diversidad de especies y
la biomasa del lugar (Weaver, 1986; Lugo y Rivera-Battle, 1987). Según Lodge et al,
(1996), en los bosques tropicales existen grupos funcionales sensitivos que realizan
funciones básicas en los procesos de los ecosistemas. La función de la masa microbiana
en la materia orgánica sobre el suelo y en el mantenimiento de nitrógeno puede ser
significante, particularmente en ecosistemas perturbados o que se están regenerando
(Arunachalam et al, 1996). Gran parte de estos microorganismos llevan a cabo
interacciones mutualistas con otros organismos, como, las bacterias fijadoras de
13
nitrógeno en los nódulos de las plantas y los que actúan con artrópodos y las micorrizas.
Como gran parte de estos organismos tienen su propio nicho ecológico, se hace difícil
que puedan sustituir la existencia de otros. Es razonable pensar que algunos procesos en
los bosques tropicales asociados a estos microorganismos y a sus interacciones sean
sensitivos a disturbios debido a que las actividades y los grupos funcionales de éstos
están delimitados a ambientes restringidos y son sensibles a cambios. El tamaño de una
abertura producida en el dosel de un bosque después de un evento climatológico, como
un huracán, es determinante en las actividades de la descomposición de la hojarasca. En
estudios realizados por Quishui y Zak (1995), se relaciona el tamaño de la abertura del
dosel en bosques subtropicales y la descomposición de la hojarasca. En su trabajo se
establece que la temperatura, la humedad y la radiación solar son factores que median las
actividades y la estructura de las comunidades microbianas. Por ejemplo, las aberturas de
gran tamaño provocarán aumento en la entrada de la radiación solar, esto a su vez causará
que aumente la evaporación y disminuya rápidamente la humedad de la hojarasca. Por
otro lado, según Vestal y White (1989), cuando se habla del estado metabólico de las
comunidades microbianas se tiene que mencionar que éstas pueden vivir bajo
condiciones de estrés metabólico o crecimiento desigual cuando los factores de humedad,
pH, luz, nutrientes inorgánicos, materia orgánica disponible y temperatura no son
adecuados. Existen muchas células eucariotas y bacterianas que almacenan moléculas
intracelulares durante los períodos de estrés metabólicos. El análisis de estos compuestos
almacenados puede ser usado como indicador de la salud metabólica de la comunidad.
Los cambios en estos compuestos pueden ser seguidos durante la manipulación ambiental
para estudiar los efectos de los cambios en el metabolismo de la comunidad. De acuerdo
14
a trabajos realizados por Liu et al, (1997), la caracterización de la diversidad microbiana
utilizando la técnica TRFLP demostraron que esta metodología provee un análisis rápido
para conocer diversidad microbiana y los cambios en la estructura microbiana de la
comunidad que ocurre a escalas temporales y espaciales o que ocurren en respuesta a
perturbaciones ambientales.
En las últimas décadas se han utilizado medios selectivos enriquecidos con una o
varias fuentes de energía para estudiar la estructura de una comunidad microbiana
natural. El aislamiento y la identificación de colonias, en adición a la utilización de
técnicas básicas, como la técnica de tinción, observaciones morfológicas y pruebas
bioquímicas, son acercamientos taxonómicos numéricos. Éstos presentan gran dificultad,
consumen mucho tiempo, son costosos y solamente muestran la presencia de
microorganismos que pueden ser cultivados en el medio seleccionado. El cultivo de
microorganismos de muestras naturales puede indicar la presencia de microorganismos,
pero no revela cuando los microorganismos biodegradan un compuesto particular bajo
condiciones ambientales. En adición, muchas comunidades microbianas relacionadas a
un sustrato no pueden ser cuantitativamente removidas y contabilizadas.
Con el propósito de solucionar estos problemas se han desarrollando diversas
técnicas para medir la biomasa, la estructura, el estatus metabólico y la actividad de una
comunidad microbiana bajo condiciones in situ, tratando de revelar de forma más precisa
el papel funcional de dicha comunidad en la naturaleza. Una de estas técnicas es el uso de
análisis de lípidos. El análisis de lípidos se utiliza para el estudio de la biomasa, la
estructura de la comunidad, el estatus metabólico y la actividad de las comunidades
microbianas naturales y, en adición, es una técnica relativamente sensitiva y cuantitativa
15
que permite un mayor conteo de los microorganismos naturalmente presentes. Al usar
esta metodología se pueden estudiar los cambios, a través del tiempo, en las poblaciones
microbianas producidos por las perturbaciones físicas o químicas en el ambiente (Vestal
y White, 1989). El análisis de lípidos descrito por Vestal y White en el 1989 involucra la
extracción de lípidos de una muestra con solventes orgánicos seguido por el análisis de
ciertas fracciones del material extraído. La extracción y el análisis deben ser directos. En
el área de estudio o en el laboratorio, la muestra debe ser expuesta a una mezcla de fase
sencilla de cloroformo, metanol y agua en una razón inicial de 1:2:0.8. Cuando estos
solventes son añadidos, los lípidos se disuelven instantáneamente y el metabolismo de los
lípidos se detiene. Esta técnica provee una visión de los lípidos al momento de la
extracción de éstos. Después de un corto período de haberse hecho la extracción se añade
agua y cloroformo al sistema con el propósito de separar las fases cambiando la polaridad
de la mezcla. La fracción total de los lípidos puede ser encontrada en la fase más baja del
cloroformo y las proteínas de mayor polaridad, los ácidos nucleicos, las paredes de las
células y otros componentes permanecen en la fase metano-agua superior o en la interfase
cloroformo-agua. La fase orgánica (contenido de lípidos) puede ser fraccionada en
fosfolípidos para el análisis de la estructura de la comunidad y la biomasa. El residuo en
la interfase puede ser usado para medir bacterias gram negativa, gram positiva y la
biomasa eubacteriana total.
Actualmente se ha desarrollado un método más simple con el objetivo de extraer
los ácidos grasos directamente del suelo. MIDI (Microbial ID) es un protocolo diseñado
para extraer los ácidos grasos de cultivos de bacterias puros, aunque de acuerdo a Sasser
(1990), éste se ha utilizado en la extracción de ácidos grasos del suelo. En ambas
16
metodologías los ácidos grasos pasan por una metilación que dará lugar a la formación de
los ácidos grasos metilados (“Fatty Acid Methyl Ester” o FAME por sus siglas en inglés).
Éstos serán analizados en un cromatógrafo de gas. Según Cavigelli et al, 1995, el valor
del análisis de los ácidos grasos metilados (FAME) surge del hecho de que hay un gran
número de diferentes clases de ácidos grasos en los lípidos de los microorganismos y esa
diversidad de organismos provee diferentes combinaciones de éstos. Este trabajo fue
realizado por medio de un acercamiento in situ de la distribución espacial de las
comunidades microbianas del suelo y es parte del esfuerzo que se realiza para mejorar el
entendimiento de los patrones, las causas, y las consecuencias de la diversidad
microbiana en el suelo. Los perfiles de los ácidos grasos metilados fueron usados en el
experimento por su habilidad única de caracterizar rápidamente toda la comunidad y por
su costo relativamente bajo. En su trabajo se mostró que la interpretación de los perfiles
de todo el suelo de la comunidad puede ser difícil porque muchos ácidos grasos son
comunes en diferentes organismos y porque en las muestras del ambiente hay cientos de
ácidos grasos diferentes.
Al determinar la biomasa de una comunidad microbiana se provee un estimado de
la cantidad de los microorganismos activos en un ambiente particular y la capacidad para
transformaciones metabólicas en ese ambiente. La masa viable de una comunidad
microbiana es determinada midiendo los componentes celulares que son comunes a todas
las células de la microbiota y que se degradan rápidamente con la muerte de la célula.
Una manera de medir la biomasa es a través de la extracción y análisis de los
componentes de los fosfolípidos. Todas las células contienen en sus membranas
fosfolípidos, los cuales no son almacenados, pero si transformados rápidamente durante
17
el metabolismo. La totalidad de los lípidos serán extraídos como se mencionó
anteriormente. La biomasa de ciertos organismos de una comunidad microbiana puede
ser estimada por la extracción de compuestos que son únicos en esos organismos, por
ejemplo, la eubacteria en una muestra puede ser estimada midiendo la cantidad de ácido
murámico. Éste puede ser extraído de la interfase residual de una extracción típica de
lípidos y luego será purificada y analizada usando la cromatografía de gas. Un dato sobre
este método es que el ácido murámico varía dramáticamente en las células de las
bacterias gram positiva y gram negativa, al igual que en las cianobacterias. En el caso de
los hongos, la biomasa de éstos puede ser estimada por medio del contenido de ergosterol
(Buchan et al, 2003).
Por otro lado, cuando se habla de la estructura de la comunidad se hace notar que
la diversidad en la estructura de las comunidades microbianas presentes en el ambiente
determinará cuando se llevarán a cabo ciertas transformaciones. Para estudiar la
estructura de la comunidad microbiana es importante discriminar entre diferentes tipos de
microorganismos. El análisis del contenido de los patrones PLFA (Análisis de ácidos
grasos fosfolipídicos) proveerá significado a los resultados obtenidos. Muchas células
tienen en sus membranas fosfolípidos que contienen ácidos grasos metilados. El análisis
cuantitativo y cualitativo de la fracción de fosfolípidos para ácidos grasos puede revelar
la presencia y abundancia de ciertos tipos de microorganismos bajo condiciones
naturales. De esta manera proveerá un patrón de los microorganismos presentes en un
momento en particular. La presencia de ciertos ácidos grasos de fosfolípidos podría servir
de marcadores para ciertos tipos de microorganismos (Vestal y Wise, 1989) pero no
puede determinar con certeza las especies.
18
Para el 1985 se reportó el desarrollo de una nueva técnica conocida como
reacción en cadena de polimerasa (PCR por siglas en inglés de Polymerase Chain
Reaction) por Kary Mullis y asociados, la cual amplió grandemente el poder de la
investigación con el ADN recombinante e inclusive reemplazo algunos de los métodos
que existían anteriormente (Bridge et al, 1998). Uno de los requisitos para muchas de las
técnicas de ADN recombinante es la disponibilidad de grandes cantidades de un
segmento específico de ADN. El PCR permite la amplificación directa de segmentos de
ADN específicos sin clonación y puede utilizarse en fragmentos de ADN que estén
presentes en cantidades muy pequeñas. Este método se basa en la amplificación de un
segmento de ADN utilizando una polimerasa de ADN y cebadores oligonucleótidos que
hibridizan con la cadena complementaria la secuencia a amplificar. En la investigación de
Fierer et al, (2005), se describe un método cuantitativo de PCR para estimar la
abundancia relativa de grupos taxonómicos de bacterias y hongos en el suelo. Los
cebadores oligonucleótidos fueron probados para especificidad y el método fue aplicado
a tres distintos suelos. Los resultados demostraron que la técnica provee un índice rápido
y sólido de la estructura microbiana de la comunidad.
El PCR comienza con ADN de cadena doble que contiene la secuencia que será
amplificada y sitios complementarios para el par de iniciadores. Los iniciadores por lo
general son de 20 nucleótidos de longitud y son hechos sintéticamente. El PCR se puede
resumir en un ciclo de tres etapas fundamentales: (1) la cadena doble del ADN que se
quiere amplificar se denaturaliza en cadenas sencillas calentando a 94-95°C por un
tiempo aproximado de 5 minutos; (2) la solución se enfría y los iniciadores se hibridan al
ADN de cadena sencilla a 37-65°C, se utilizan dos iniciadores distintos ya que cada uno
19
tiene la secuencia complementaria a una de las dos cadenas del ADN y se alinea con sus
extremos 3’ encarados debido a que se hibridan a cadenas opuestas; (3) a la mezcla de la
reacción se le añade una ADN polimerasa resistente al calor a 70-75°C, la cual se
extiende en dirección 5’–3’ utilizando como modelo el ADN de la cadena sencilla unido
al iniciador teniendo como producto una molécula de ADN de doble cadena con los
cebadores incorporados en el producto final. Cada grupo de tres pasos se denomina ciclo.
El proceso es automático, rápido y se realiza en un aparato de ciclos termales programado
para realizar un número predeterminado de ciclos en un tiempo y temperatura dada. En el
PCR, la cantidad del nuevo ADN generado aumenta geométricamente, comenzando con
una molécula de ADN, en el primer ciclo se producen dos moléculas de ADN, en el
segundo cuatro moléculas, en el tercero 8 moléculas y así sucesivamente (Russell, 2006;
Klug & Cummings, 1999). En su libro Bridge et al, (1998), expone los principios y las
aplicaciones de la técnica de PCR en una variedad de áreas diversas de la micología.
Entre estas se encuentran genética de los hongos, ecología microbiana, patología de las
plantas, micología medicinal y biotecnología de hongos. En conclusión, el PCR es una de
las herramientas más abarcadoras en el estudio del campo de la microbiología.
Por otra parte en su libro Osborn & Smith (2005), describen la técnica conocida
como el análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos terminales de restricción
(TRFLP) del gen 16S rADN, también conocido como el análisis de restricción de rADN
amplificado (ARDRA). Este análisis es conocido porque permite la fácil comparación del
rADN de bacterias aisladas o bibliotecas de clones. Los productos de PCR son obtenidos
usando los iniciadores cebadores universales 16S rADN y el producto es digerido con
enzimas de restricción. Los productos del PCR 16S rADN de diferentes bacterias,
20
proveyéndoles el mismo iniciador, podrían mostrar sólo una variación limitada en la
longitud. Sin embargo, los sitios de restricción se pueden encontrar en posiciones
diferentes dentro de la secuencia 16S rADN de diferentes bacterias y de aquí se adhiere el
producto del PCR en dos o más fragmentos de diferente longitud. El factor discriminante
es la localización de los sitios de restricción dentro del 16S rADN, con secuencia
específica y por lo tanto, potencialmente, un taxón específico. En investigaciones
realizadas por Liu et al, (1997), se trabajó con la técnica de PCR en donde uno de los dos
iniciadores usados era fluorescentemente marcado en el Terminal 5’ y fue usado para
amplificar una región seleccionada del 16S rADN del ADN total de la comunidad. El
producto de PCR fue digerido con enzimas de restricción y el fragmento de restricción
terminal marcado fluorescentemente fue medido con precisión utilizando un analizador
genético automático.
Un análisis simulado de computadoras para polimorfismos de longitud de
fragmentos terminales de restricción para 1,002 secuencias eubacterianas mostraron que
con una selección adecuada de los iniciadores del PCR y de la enzima de restricción, 686
secuencias podrían ser amplificadas por PCR y clasificadas en 233 fragmentos de
longitud de restricción terminal o ribotipos (Liu et al, 1997). Utilizando TRFLP, se fue
capaz de distinguir todas las cadenas bacterianas en un modelo de comunidad bacteriana
y el patrón fue consistente con la predicción. Los resultados demostraron que el TRFLP
es una herramienta poderosa para determinar la diversidad de comunidades bacterianas
complejas y para la comparación rápida de la estructura de la comunidad y la diversidad
de diferentes ecosistemas.
21
En conclusión, seremos capaces de predecir el desarrollo de comunidades y
manejar efectivamente los procesos que se dan en ellas, cuando comencemos a entender
la complejidad de las interacciones bióticas en el suelo y en la hojarasca y la manera en
que éstas afectan las comunidades de plantas. Podemos mencionar que el conocimiento
detallado de los procesos ecológicos y las interrelaciones entre ellos, a escalas específicas
de tiempo y espacio, es integral para el manejo de los ecosistemas.
Se han desarrollado procedimientos analíticos sensitivos para el estudio
cuantitativo de las comunidades naturales de microorganismos in situ. Aunque estos
métodos no contestan todas las preguntas experimentales concernientes a las
comunidades microbianas naturales, éstos proveen un conjunto de herramientas
necesarias para estudiar los microorganismos ya que pueden proveer información
cuantitativa del estatus y del papel de los componentes más importantes del ecosistema.
22
Capítulo Tres
Metodología
Descripción del Lugar de Estudio
El Bosque Experimental de Luquillo está ubicado en la parte noreste de Puerto
Rico y comprende cuatro zonas de vida que resultan de los cambios en elevación, clima y
características de suelo (Willig, 1996). El estudio se realizó en el bosque de tabonuco
(Dacryodes excelsa) en la estación El Verde, la cual está localizada en una de las zonas
de vida clasificada como bosque subtropical montano bajo húmedo (Figura 3.01). La
temperatura promedio mensual es de 21˚C en enero a 25˚C en septiembre (Brown et al,
1983). La precipitación anual es poco cambiante (375.95 ± 79.47 cm) con valores bajos
entre enero y abril (19.57 ± 23.71 cm) y valores altos (35.01 ± 45.99 cm) en los semanas
restantes (Brown et al, 1983).
Diseño Experimental
En esta área el “Luquillo Long Term Ecological Research” (Luq–LTER)
estableció tres bloques (60 x 60 m) seleccionados de acuerdo a su similitud en pendiente,
características de suelo, composición de especies y cobertura del dosel (Figura 3.02). Los
bloques fueron divididos en cuatro parcelas (20 x 20 m), (Figura 3.03), sometidas a
cuatro tratamientos (ver sección anterior).
23
Figura 3.01. Mapa del área este de Puerto Rico (Cortesía de la Junta de Planificación de
Puerto Rico, 1996).
El Yunque
24
Figura 3.02. Mapa topográfico del área de estudio en la Estación de El Verde
(Cortesía del Servicio Geológico de Estados Unidos, 1977).
Bloque
A
Bloque
B
Bloque
C
186
Estación del Verde
25
#### ##
##
#
#####
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######
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##
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#
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## ####
#
#
#
#
#
Block C
450-470mW-NW facing
Block B
450-470mNW facing
Block A
340-360mW facing
N
Figura 3.03. Mapa del área de estudio en el Bosque Experimental de
Luquillo, Estación El Verde mostrando los tres bloques y las parcelas por
bloque (Cortesía de “Luquillo-Long Term Ecological Research”, 1998).
En cada parcela se seleccionaron cinco subparcelas y en cada una se colocaron
seis canastas en donde se recolectó la hojarasca estudiada (Figura 3.04). Las canastas
plásticas (35 x 25 cm) estuvieron descubiertas y su fondo fue reemplazado con una maya
de nilón. Se cubrió el fondo de las canastas con una porción de la hojarasca sobre el suelo
existente en cada subparcela. Luego se colocó una tela plástica de 1 mm en cada canasta
para separar la hojarasca sobre el suelo de la capa de hojarasca fresca que se encontraba
en el lugar. Nuevamente se colocó otra tela plástica para separar la capa de hojarasca
Bloque A 340-360m
Bloque C 450-470m
Bloque B
450-470m
26
fresca de la capa de hojas verde. Es importante recordar que solo se añadió la capa de
hojas verdes a la canasta en aquellos tratamientos donde hubo adición de detrito. Se
colocó otra tela plástica en cada canasta para separar las hojas nuevas que van cayendo
durante cada intervalo del muestreo, como se muestra en la Figura 3.05. Sin embargo, el
tratamiento donde el dosel es podado y la biomasa es removida sólo tuvo canastas en
cuatro de las cinco subparcelas de descomposición de hojarasca, en los bloque B y C.
Figura 3.04. Diagrama de la canasta de descomposición
Hojarasca de 31 a 44 semanas
Hojarasca de 17 a 31 semanas
Hojarasca de 7 a 17 semanas
Hojarasca caída de 0 a 7 semanas
Hojas verdes
Hojarasca Fresca
Hojarasca sobre el suelo
Hojarasca
Nueva
Hojarasca de 44 a 55 semanas
semanas semanas
27
Una canasta fue removida de cada subparcela durante los siguientes intervalos de
tiempo 7, 17, 31, 44 y 55 semanas. En cada intervalo de muestreo se hizo una
combinación de las muestras recolectadas de la misma cohorte que se encontraban en las
cinco subparcelas para tener una muestra más representativa de la parcela. El
experimento comenzó entre el 1 y el 10 de julio de 2005 y se extendió por un año.
Figura 3.05. Foto donde se ilustran las canastas de descomposición y la
remoción de una de las canastas en el intervalo de las 31 semanas.
28
Procedimiento para la Colección y Manejo de la Muestra
Las cinco muestras de cada parcela se mezclaron para tener una muestra
representativa de ésta. Las muestras fueron colocadas en bolsas estériles y se
transportaron en neveras portátiles para luego ser almacenadas en un refrigerador a -20˚C
para evitar cambios en composición (Shutter and Dick, 2000). Las muestras se obtuvieron
durante los meses de agosto, octubre, enero, abril y julio comenzando en el 2005 y
terminando en el 2006.
Extracción de ADN
El ADN se extrajo directamente de la hojarasca utilizando “UltraClean Soil
DNA Isolation Kit” (MoBio Laboratorios, Solana Beach, CA). Se tomó 0.3g de cada
muestra y se siguió el protocolo indicado por el manufacturero para la extracción de
ADN (Apéndice 2.01).
Amplificación del ADN
Se utilizó “Polymerase Chain Reaction” (PCR) con el propósito de amplificar
segmentos específicos del ADN seleccionado. Se hizo un estimado de la concentración
de ADN de acuerdo a la intensidad de la banda en el gel. La amplificación fue hecha
utilizando la enzima “Red Taq DNA Polymerase” (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), los
marcadores moleculares 16S rARN y la región interna que se transcribe (ITS) y los
iniciadores oligonucleótidos que se utilizaron para las bacterias fueron el 27F-FAM y el
1525R, mientras que para los hongos se utilizaron el ITS1-FAM y el ITS4 (Apéndice
2.02).
29
Comparar Estructura de la Comunidad y Estimar Diversidad
Para comparar la estructura y estimar la diversidad de las comunidades
microbianas en estudio se utilizó la técnica TRFLP. Se utilizó esta técnica ya que es
sensitiva e informativa para describir comunidades microbianas. Una vez obtenido el
amplicón, se realizó la digestión de éste con enzimas de restricción específicas, las cuales
cortarían el ADN en lugares característicos. En nuestro caso, las enzimas de restricción
utilizadas fueron MnlI para bacterias y HaeIII para hongos.
La digestión procedió a 37ºC por 2 horas. Cada producto de digestión se precipitó
con alcohol para ser procesados en el Analizador Genético Automático ABI 3130
(Applied Biosystems, Foster City, CA; Apéndice 2.03). Se utilizó el estándar “Liz 500
size standard” (Applied Biosystem, Warrinton, UK).
Análisis Estadístico
Con los resultados obtenidos se preparó una matriz de 0 y 1, donde 0 representaba
la ausencia de un filotipo y 1 la presencia del filotipo. Para comparar las comunidades se
construyeron árboles filogenéticos utilizando PAUP 4.1b10 (Swofford, 2003). De esta
manera se determinaron las diferencias entre las comunidades microbianas en la
hojarasca en cada tratamiento y la temporada de muestreo. En adición, se realizó el
análisis estadístico “Two-way ANOVA” del ADN y del número de picos obtenidos al aplicar la
técnica de TRFLP para determinar si surgieron diferencias significativas en las comunidades de
hongos y bacterias a través del tiempo y el tratamiento aplicado utilizando el programa MINI
TAB (Versión 14). Para construir las gráficas en las que se presentan los resultados de nuestro
estudio se utilizó el programa Microsoft Office Excel 2003.
30
Capítulo Cuatro
Resultados
Introducción
La meta del estudio fue determinar cómo la deposición de la hojarasca verde y la
abertura del dosel en el bosque afectaban independientemente o en conjunto las
comunidades microbianas (hongos y bacterias) presentes en la hojarasca. En otras
palabras, se pretendía caracterizar y medir los cambios en la sucesión microbiana en la
hojarasca luego del paso de un huracán. Con este propósito aplicamos cuatros
tratamientos distintos a nuestras áreas de estudio (ver capítulo tres) y en base a dichos
tratamientos se aplicaron diversas técnicas de análisis que nos permitieron obtener
resultados de los muestreos realizados en los distintos intervalos de tiempo.
Colección de Muestras
Se recolectaron un total de 135 muestras. El desglose del número de muestras
resultantes de acuerdo a los intervalos de tiempo establecidos en nuestro diseño
experimental está contenido en la Tabla 4.01. A partir de las 31 semanas se observa una
reducción en el número de muestras colectadas ya que se estuvo trabajando,
exclusivamente, con las muestras de hojarasca fresca y las de hojas verdes.
31
Tabla 4.01. Muestras colectadas durante los diferentes tiempos de colección.
Amplificación del ADN
Al utilizar la técnica de PCR con el propósito de amplificar segmentos específicos
del ADN seleccionado, se comenzó diluyendo 2 µl de la muestra pura del ADN en 18 µl
de agua deionizada estéril. La amplificación del ADN fue lograda en 60 muestras (de un
total de 78) a diversas concentraciones del ADN para bacterias, y en 68 muestras para
hongos (Tabla 4.02). Se infiere la presencia de sustancias inhibidoras en algunas de las
muestras a las que no se le pudo amplificar el ADN ya que se mezcló una cantidad de
ADN de muestras que fueron positivas a PCR con muestras que habían dado negativo y
el resultado fue negativo. No pudimos determinar que sustancia estaba inhibiendo la
reacción en cadena de la polimerasa en dichas muestras.
Los datos de la amplificación del ADN de cada muestra individual se presentan
en el Apéndice 2.01.
Tiempo de muestreo (semanas)
7 17 31 44 55
Número de muestras colectadas 39 42 18 18 18
32
Tabla 4.02. Amplificación de ADN para hongos y bacterias.
1 En relación al ADN genómico total extraído
2 No se realizó PCR a las muestras de las 7 y las 44 semanas.
Los resultados de la Tabla 4.02 reflejan que a las 31 semanas la concentración del
ADN de hongos aumentó en las muestras. Esto lo podemos deducir ya que durante este
período hubo que diluir el ADN extraído en 17 de las 18 muestras que se obtuvieron
hasta una concentración de 10-2 (2µl de ADN diluido 10-1 en 18 µl de agua deionizada
Amplificación de 16S rADN
(Bacterias)
Amplificación de ITS
(Hongos)
Dilución de
ADN1
Dilución de
ADN1
Tiempo
de
muestreo
(semanas)
Número de
muestras
colectadas Negativas
10-1
10-2
Negativas
10-1
10-2
72 39
17 42 12 13 17 10 24 8
31 18 6 4 8 0 1 17
442 18
55 18 0 17 1 0 18 0
33
estéril) para obtener resultados positivos al PCR. Por otra parte, tanto para hongos como
para bacterias, la concentración del ADN disminuyó a las 55 semanas ya que para las
muestras de hongos que dieron positiva al PCR, el 100% (18 de 18) se encontraban a una
concentración de 10-1 (2µl de ADN extraído en 18 µl de agua deionizada estéril) y en el
caso de las muestras para bacterias, el 94% (17 de 18) se encontraban en una dilución de
10-1.
El Apéndice 2.01 presenta los resultados individuales de la amplificación del
ADN de cada muestra de acuerdo al periodo de muestreo y a la dilución a la que se
encontraba la muestra cuando resultó positivo al PCR utilizando la ADN polimerasa
RedTaq. Estos datos fueron resumidos en la Tabla 4.02.
Los resultados obtenidos al calcular el promedio del ADN total (µg/ml) en los
bloques A, B y C de acuerdo al tratamiento aplicado y al tiempo de muestreo en las
cohortes de hojarasca fresca (Tabla 4.03) y las hojas verdes (Tabla 4.04) se utilizaron
para construir las gráficas en las que se compara el promedio del ADN total (µg/ml) en la
hojarasca fresca (Figura 4.01) y en las hojas verdes (Figura 4.02) de acuerdo al tiempo y
al tratamiento aplicado.
34
Tabla 4.03. Promedio del ADN total (µg/ml) en los bloques A, B y C de acuerdo al
tratamiento aplicado y al tiempo de muestreo en la cohorte de hojarasca fresca.
Tratamiento Tiempo Promedio ADN1 Desviación
(semanas) (µg/ml) Estándar
Control 7 126.50 99.64 No poda + detrito 7 84.77 0.06 Poda + No adición 7 151.77 227.47 Poda + Detrito 7 111.87 66.40 Control 17 34.17 39.99 No poda + Detrito 17 29.47 27.20 Poda + No adición 17 87.30 13.02 Poda + Detrito 17 85.03 23.34 Control 31 60.37 66.39 No poda + Detrito 31 93.13 17.25 Poda + No adición 31 90.93 47.30 Poda + Detrito 31 64.13 47.86 Control 44 26.83 9.29 No poda + Detrito 44 30.27 4.27 Poda + No adición 44 36.63 27.00 Poda + Detrito 44 29.27 12.69 Control 55 17.53 77.42 No Poda + Detrito 55 27.60 22.68
35
Poda + No adición 55 22.27 31.29 Poda + Detrito 55 20.00 31.29 1 El promedio se calculó en base a los datos obtenidos al utilizar el biofotómetro para
obtener la concentración del ADN total (µg/ml) en cada muestra individual (Apéndice
2.02, página 96). Por ejemplo, para calcular el promedio del ADN (µg/ml) en el intervalo
de 17 semanas en el tratamiento control en la hojarasca fresca se utilizaron los datos
obtenidos en ese intervalo para los tres bloques. En el bloque A la concentración del
ADN total fue de 8.10 (µg/ml), en el bloque B fue de 30.50 (µg/ml) y en el bloque C fue
de 63.90 (µg/ml). Se suman estos tres datos y se dividen entre el número de bloques, que
son tres, y obtenemos que el ADN promedio en el intervalo de las 17 semanas para el
grupo control en la hojarasca fresca fue de 34.17 (µg/ml). Este proceso se utilizó para
completar la Tabla 4.03 y la Tabla 4.04.
36
Tabla 4.04. Promedio del ADN (µg/ml) en los Bloques A, B y C de acuerdo al
tratamiento aplicado y al tiempo de muestreo en la cohorte de hojas verdes.
Tratamiento Tiempo Promedio ADN Desviación
(semanas) (µg/ml) Estándar
Poda + Detrito
7
140.75
162.28
No poda + Detrito
7
290.43
201.62
Poda + Detrito
17
57.40
28.99
No poda + Detrito
17
49.23
30.28
Poda + Detrito
31
38.07
17.82
No poda + Detrito
31
52.77
1.59
Poda + Detrito
44
28.37
12.87
No poda + Detrito
44
27.07
10.15
Poda + Detrito
55
15.43
1.79
No poda + Detrito
55
22.30
5.59
37
La información presentada en la Figura 4.01 muestra que la concentración de
ADN total en la hojarasca fresca disminuye a las 17 semanas, pero aumenta nuevamente
en las 31 semanas, excepto en el tratamiento en el que hubo poda y adición del detrito, el
cual continuó disminuyendo hasta las 55 semanas. Este dato correlaciona los resultados
obtenidos en la Tabla 4.02 para la comunidad de hongos, con respecto al aumento en la
concentración de ADN presente en las muestras a las 31 semanas, ya que se puede
observar que durante este intervalo de tiempo la concentración del ADN total (µg/ml) en
la hojarasca fresca aumenta en tres de los tratamientos.
En el caso de la cohorte de hojas verdes la concentración del ADN total va
disminuyendo a través del tiempo, excepto en el tratamiento de no poda y adición del
detrito, el cual tuvo un ligero aumento en la concentración de ADN, pero luego continuó
su trayectoria descendente. En los períodos de las 44 semanas y las 55 semanas el ADN
total (µg/ml) disminuye en todos los tratamientos, tanto para la hojarasca fresca (Figura
4.01) como para las hojas verdes (Figura 4.02).
38
Figura 4.01 Comparación del promedio del ADN
total (µg/ml) en la hojarasca fresca de acuerdo al
tiempo y al tratamiento aplicado. O = no poda o
no adición de detrito, 1 = poda o adición de
detrito.
1 0
0
1
0
4 0
80
1 2 0
1 6 0
A D N to ta l
(µ g /m l)
P od a
D etr ito
H o ja ra sca fr e sca (4 4 sem an a s)
10
0
10
4 0
80
1 20
1 6 0
A D N to ta l
(µ g /m l)
P od a
D etr ito
H o ja ra sca fr e sca (7 sem an a s)
01
0
10
4 0
80
1 20
16 0
A D N to ta l
(µ g /m l)
P od a
D etr ito
H o ja ra sca fr e s ca (1 7 sem an a s)
10
0
10
40
8 0
12 0
16 0
A DN to ta l
(µ g /m l)
P od a
D etr ito
H o ja ra sca fr e sca (3 1 sem an a s)
01
0
10
4 0
8 0
1 20
16 0
A D N to ta l
(µ g /m l)
P od a
D etr ito
H o jara sca f r e sca (5 5 sem an as )
39
Figura 4.02. Comparación del promedio del ADN total (µg/ml) en las hojas verdes de
acuerdo al tiempo y al tratamiento aplicado.
7 17 3144 55
0
50
100
150
200
250
300
ADN total
(µg/ml)
Tiempo (semanas)
Poda + Detrito
No poda + Detrito
Tratamiento
40
Tabla 4.05. Resultados del análisis estadístico “Two Way ANOVA” del ADN (µg/ml)
versus el tratamiento aplicado y el tiempo en las hojas verdes y en la hojarasca fresca.
P P
Recurso Hojas verdes Hojarasca fresca
Tratamiento 0.623 0.247 Tiempo (meses) 0.020 0.001 Interacción 0.577 0.265
Los resultados del análisis estadístico ANOVA muestran que hubo una diferencia
significativa en la concentración de ADN total (µg/ml) versus el tiempo que se tomó la
muestra, tanto en la hojas verdes (P=0.020) como en la hojarasca fresca (P=0.001). Esta
diferencia significativa no fue observada en el ADN total (µg/ml) versus el tratamiento
aplicado en ambos cohortes (Tabla 4.05). Los resultados del análisis estadístico ANOVA
confirman los resultados obtenidos al calcular el ADN total y al realizar el PCR en
relación a que la concentración de ADN total cambió a través del tiempo.
41
Comparación de la Estructura de la Comunidad y Estimar Diversidad
De acuerdo al TRFLP de la región 16S rADN bacteriana digerida con la enzima
de restricción MnlI, el número de filotipos en las comunidades bacterianas de la hojarasca
fresca en el tratamiento en que hubo poda y adición del detrito disminuyó durante el
período de las 31 semanas, pero posteriormente aumentó a las 55 semanas (Figura
4.03.A-C). Por otra parte, considerando el TRFLP de la región ITS de hongos con la
enzima de restricción HaeIII, se pudo observar que el número de filotipos en las
comunidades de hongos se mantuvo muy similar en las 17 y 31 semanas, pero disminuyó
a las 55 semanas para el mismo tratamiento (Figura 4.03.D-F).
Si comparamos la composición de las comunidades de bacterias y hongos
presentes en la hojarasca fresca en el intervalo de las 31 semanas, podemos observar que
el número de filotipos de las comunidades de hongos fue mayor en todos los
tratamientos. Este marcado aumento en el número de filotipos en las comunidades de
hongos corrobora el aumento que hubo en el ADN total (µg/ml) que se encontró a las 31
semanas (Figura 4.01) y los encontrados en la amplificación del ADN para hongos (Tabla
4.02).
En el tratamiento donde hubo poda, sin adición del detrito, el número de filotipos
en las comunidades bacterianas fue disminuyendo desde las 17 semanas a las 31 semanas
y en las 55 semanas no se obtuvo resultado alguno. Este resultado pudo ser causado por
la falta de incorporar una fuente de material orgánico que promoviera el desarrollo de
microorganismos y por el aumento en la radiación solar. En el caso de las comunidades
de hongos se encontró que el número de filotipos en éstas se mantuvo bastante uniforme
en los tratamientos aplicados entre las 17 y 31 semanas, ocurriendo una disminución en el
42
intervalo de las 55 semanas. En el caso de las comunidades de hongos, el tratamiento que
presentó una mayor disminución en el número de filotipos a través del tiempo fue el de
poda y adición del detrito.
La Figura 4.04 muestra una relación o tendencia directa entre el número de
filotipos de bacterias versus el número de filotipos de hongos cuando se aplicó el
tratamiento de poda del dosel sin adición del detrito en la hojarasca fresca durante los
intervalos de las 17, 31 y 55 semanas (R2=0.8304). La relación muestra una tendencia en
la que si los hongos disminuían, las bacterias también lo hacían. En la Figura 4.05 no se
pudo observar una relación o tendencia entre el número de filotipos de bacterias versus
los de hongos cuando se aplicó el tratamiento control durante los mismos intervalos de
tiempo (R2=0.3271). La Figura 4.06 muestra que al aplicar el tratamiento de no poda del
dosel más adición del detrito se pudo observar una relación directa entre el número de
filotipos de bacterias versus el número de filotipos de hongos en la hojarasca fresca en los
intervalos de las 17, 31 y 55 semanas (R2=0.7272). La relación muestra una tendencia en
la cual cuando los hongos disminuían, las bacterias también lo hacían. En el caso del
tratamiento de poda del dosel más adición del detrito (Figura 4.07) se pudo observar una
relación inversa entre el número de filotipos de bacterias versus el número de filotipos de
hongos en la hojarasca fresca durante los mismos intervalos de tiempo (R2=0.9159). La
relación mostró una tendencia en la cual al aumentar los hongos disminuían las bacterias
o por el contrario, cuando disminuían los hongos las bacterias aumentaban.
43
Figura 4.03. Número de filotipos de bacterias (A-C) encontrada en la cohorte de
hojarasca fresca de acuerdo al tiempo y al tratamiento aplicado y basados en el TRFLP de
la región 16S rADN bacteriana digerida con la enzima de restricción MnlI. Número de
filotipos de hongos (D-F) encontrada en la cohorte de hojarasca fresca de acuerdo al
tiempo y al tratamiento aplicado y basados en el TRFLP de la región ITS de hongos con
la enzima de restricción HaeIII. O = no poda o no adición de detrito, 1 = poda o adición
de detrito.
0
42.5
44
10
0
10
20
40
60
80
100
Número de
filotipos de
bacterias
Poda
Detrito
Hojarasca fresca (17 semanas)
10
0
10
20
40
60
80
100
Número de
filotipos de
bacterias
Poda
Detrito
Hojarasca fresca (31 semanas)
AB
10
0
10
20
40
60
80
100
Número de
filotipos de
bacterias
Poda
Detrito
Hojarasca fresca (55 semanas)C
10
0
10
20
40
60
80
100
Número de
filotipos de
hongos
Poda
Detrito
Hojarasca fresca (17 semanas)D
10
0
10
20
40
60
80
100
Número de
filotipos de
hongos
Poda
Detrito
Hojarasca fresca (31 semanas) E
10
0
10
20
40
60
80
100
Número de
filotipos de
hongos
Poda
Detrito
Hojarasca fresca (55 semanas)F
A
44
Figura 4.04. Relación del número de filotipos de bacterias versus el número de filotipos
de hongos en el tratamiento poda del dosel sin adición del detrito en la hojarasca fresca
en los intervalos de las 17, 31 y 55 semanas.
Figura 4.05. Relación del número de filotipos de bacterias versus el número de filotipos
de hongos en el tratamiento control en la hojarasca fresca en los intervalos de las 17, 31 y
55 semanas.
y = 0.7092x + 15.061
R2 = 0.3271
0
10
20
30
40
50
60
70
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Número de filotipos de bacterias
Número de filotipos de hongos
17 S
55 S
31 S
y = 0.2385x + 38.211
R2 = 0.8304
0
10
20
30
40
50
60
70
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Número de filotipos de bacterias
Número de filotipos de hongos
55 S 31 S
17 S
45
Figura 4.06. Relación del número de filotipos de bacterias versus el número de filotipos
de hongos en el tratamiento de no poda del dosel más adición del detrito en la hojarasca
fresca en los intervalos de las 17, 31 y 55 semanas.
Figura 4.07. Relación del número de filotipos de bacterias versus el número de filotipos
de hongos en el tratamiento de poda del dosel más adición del detrito en la hojarasca
fresca en los intervalos de las 17, 31 y 55 semanas.
y = 1.6646x - 10.139
R2 = 0.7272
0
10
20
30
40
50
60
70
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Número de filotipos de bacterias
Número de filotipos de hongos
55 S
31 S 17 S
y = -0.6391x + 72.882
R2 = 0.9159
0
10
20
30
40
50
60
70
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Número de filotipos de bacterias
Número de filotipos de hongos
31 S
17 S
55 S
46
Tabla 4.06. Datos utilizados para determinar la relación entre la razón del número de
picos de hongos y el número de picos de bacterias versus el por ciento de humedad de
acuerdo al tratamiento aplicado en la cohorte de hojarasca fresca.
Tratamiento Número de filotipos Número de filotipos Razón1 % de humedad
de hongos de bacterias
Control 38 34 1.12 69.70
Control 59 48 1.22 81.20
Control 42 50 0.85 83.30
No poda + detrito 63 45 1.40 77.86
No poda + detrito 59 38 1.55 82.43
No poda + detrito 44 35 1.26 82.93
Poda - detrito 49 40 1.24 56.07
Poda - detrito 41 22 1.86 74.68
Poda - detrito 39 0 0 73.62
Poda + detrito 49 46 1.08 73.00
Poda + detrito 57 21 2.70 79.06
Poda + detrito 27 68 0.40 78.30
1 La razón se obtuvo al dividir el número de filotipos de hongos versus el de bacterias.
47
Figura 4.08. Razón del número de filotipos de hongos entre el número de filotipos de
bacterias versus el por ciento de humedad encontrada en la hojarasca fresca de acuerdo al
tratamiento aplicado en los intervalo de las 17, 31 y 55 semanas.
Los datos presentados en la Tabla 4.06 fueron utilizados para determinar la
relación entre la razón del número de picos de hongos y el número de picos de bacterias
versus el por ciento de humedad de acuerdo al tratamiento aplicado en la cohorte de
hojarasca fresca mostrada en la Figura 4.08. De esta figura se puede concluir que al
aumentar el por ciento de humedad se promovió el desarrollo de hongos, especialmente
en el tratamiento de no poda más adición del detrito.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
% de humedad
Razón del número de filotipos
de hongos entre el número
de filotipos de bacterias
Tratamiento Poda - detrito Poda + detrito No poda + detrito Control
48
Los resultados obtenidos del TRFLP de la región 16S rADN bacteriana digerida
con la enzima de restricción MnlI en las hojas verdes mostraron que en el tratamiento de
no poda más adición del detrito hubo un mayor número de filotipos a medida que
transcurrió el tiempo (Figura 4.09.A). En el caso del tratamiento en el que hubo poda y
adición del detrito se pudo observar una leve disminución en el número de filotipos de
bacterias en el intervalo de las 31 semanas, seguida de un aumento de éstos en el
intervalo de las 55 semanas.
En la Figura 4.09.B se muestra que en el tratamiento de no poda más detrito el
número de filotipos de hongos fue mayor en el periodo de las 17 y 31 semanas y que en
las 55 semanas éstos disminuyeron. En el caso del tratamiento de poda más detrito, se
observó un ligero aumento en el número de filotipos en la comunidad de hongos a las 31
semanas, seguido por una leve disminución en el intervalo de las 55 semanas.
(Resultados basados en el TRFLP de la región ITS de hongos con la enzima de
restricción HaeIII).
Hay que señalar que cuando se compara el número de filotipos bacterianos versus
el número de filotipos de hongos se observa una tendencia inversa en el comportamiento
de éstos. El número de filotipos en las bacterias aumenta a través del tiempo, pero en el
caso de los hongos, el número de filotipos disminuye a través del tiempo. Este resultado
es más evidente en el tratamiento de no poda más detrito. Una vez los hongos actúan
degradando el sustrato (compuestos recalcitrantes) las bacterias aumentan ya que tienen
los nutrientes necesarios para colonizar el sustrato (compuestos lábiles). Este resultado es
observado en las hojarasca fresca, Figura 4.03 y en las hojas verdes, Figura 4.09.
49
Figura 4.09. A representa el número de filotipos de bacterias encontrados en la cohorte de
hojas verdes de acuerdo al tiempo y al tratamiento aplicado y basados en el TRFLP de la
región 16S rADN bacteriana digerida con la enzima de restricción MnlI. B representa el
número de filotipos de hongos encontrados en la cohorte de hojas verdes de acuerdo al
tiempo y al tratamiento aplicado y basados en el TRFLP de la región ITS de hongos con
la enzima de restricción HaeIII.
1731
55
0
20
40
60
80
100
Número de
filotipos de
bacterias
Tiempo (semanas)
Poda + Detrito
No poda + Detrito
1731
55
0
20
40
60
80
100
Número de
filotipos de
hongos
Tiempo (semanas)
Poda + Detrito
No poda + detrito
A
B
50
Tabla 4.07. Resultados del análisis estadístico “Two-Way ANOVA” del número de picos
obtenidos al aplicar la técnica TRFLP en hongos versus el tratamiento aplicado y el
tiempo en las hojas verdes y en la hojarasca fresca.
P P
Recurso Hojas verdes Hojarasca fresca
Tratamiento 0.114 0.916 Tiempo (semanas) 0.025 0.054 Interacción 0.073 0.917
Los resultados del análisis estadístico ANOVA (Tabla 4.07) muestran que hubo
una diferencia significativa en el número de filotipos de hongos versus el tiempo de
muestreo en las hojas verdes (P=0.025) y en la hojarasca fresca (P=0.054). Por otra parte,
el análisis mostró que no hubo una diferencia significativa en el número de filotipos de
hongos versus el tratamiento aplicado, tanto en las hojas verdes (P=0.114), como en la
hojarasca fresca (P=0.916). En el caso de las comunidades de bacterias, los resultados
obtenidos del análisis estadístico ANOVA muestran que no hubo diferencias
significativas en el número de filotipos de bacterias versus el tiempo y el tratamiento
aplicado, tanto en las hojas verdes, como en la hojarasca fresca (Tabla 4.08).
51
Tabla 4.08. Resultados del análisis estadístico “Two Way ANOVA” del número de picos
obtenidos al aplicar la técnica TRFLP en bacterias versus el tratamiento aplicado y el
tiempo en las hojas verdes y en la hojarasca fresca.
P P Recurso Hojas verdes Hojarasca fresca Tratamiento 0.233 0.508 Tiempo (semanas) 0.299 0.973 Interacción 0.601 0.567
52
Tabla 4.09. Por ciento (%) de masa remanente en los Bloques A, B y C de acuerdo al
tratamiento aplicado y al tiempo de muestreo en la cohorte de hojarasca fresca.
Tratamiento Tiempo % de Masa Remanente Desviación
(semanas) Estándar
Control 17 59.00 5.67
No poda + Detrito 17 57.20 7.46
Poda + No adición 17 61.30 8.64
Poda + Detrito 17 62.30 7.43
Control 31 46.97 1.59
No poda + Detrito 31 43.47 5.27
Poda + No adición 31 49.60 4.65
Poda + Detrito 31 49.30 3.89
Control 55 35.00 1.16
No poda + Detrito 55 34.00 2.42
Poda + No adición 55 45.30 4.28
Poda + Detrito 55 25.90 5.11
53
Figura 4.10. A-C representa el ADN total extraído de 0.3 g de hojarasca fresca en las 17,
31 y 55 semanas. D-F representa el por ciento de masa remanente en la hojarasca fresca
en las 17, 31 y 55 semanas. O = no poda o no adición de detrito, 1 = poda o adición de
detrito.
01
0
10
20
40
60
80
100
ADN total
(µg/ml)
Poda
Detrito
Hojarasca fresca (17 semanas)
01
0
10
20
40
60
80
100
ADN total
(µg/ml)
Poda
Detrito
Hojarasca fresca (55 semanas)C
10
0
10
20
40
60
80
100
ADN total
(µg/ml)
Poda
Detrito
Hojarasca fresca (31 semanas)
B
01
0
120
30
40
50
60
Poda
Detrito
Hojarasca fresca (55 semanas)
% de masa
remanente
F
01
0
120
30
40
50
60
Poda
Detrito
Hojarasca fresca (17 semanas)
% de masa
remanente
D
01
0
120
30
40
50
60
Poda
Detrito
Hojarasca fresca (31 semanas)
% de masa
remanente
E
A
54
En investigaciones realizadas por la Dra. Jean Lodge en la misma área de estudio,
ésta encontró que el por ciento de masa remanente en la hojarasca fresca fue muy
uniforme en todos los tratamientos en el intervalo de las 17 semanas (Lodge, datos no
publicados) (Tabla 4.09). Al comenzar nuestra investigación la Dra. Lodge buscó la masa
de las capas de hojarasca sobre el suelo, la de la hojarasca fresca y la de las hojas verdes
(en los tratamientos que hubo adición de detrito) que fueron colocadas en todas las
canasta como se explica en la Figura 3.04. El por ciento de masa remanente se calculó
luego de haber retirado los 2 gramos que fueron utilizados para realizar el análisis
microbiano. Después de haber retirado los 2 gramos de cada muestra se procedió a buscar
la masa de éstas con el propósito de calcular el por ciento de masa remanente.
Finalmente, el por ciento de masa remanente se calculó utilizando los datos que se
obtuvieron al comenzar la investigación para la masa de cada muestra y los que se
obtuvieron después de cada muestreo. Si comparamos estos resultados con los obtenidos
al calcular la concentración de ADN total en nuestra investigación en el intervalo de las
17 semanas veremos que la concentración de ADN total disminuyó drásticamente en los
tratamientos donde no hubo poda. En el intervalo de las 31 semanas el por ciento de masa
remanente disminuyó, pero se mantuvo uniforme entre los tratamientos (Figura 4.10). Por
otra parte, en relación a la concentración de ADN total durante este intervalo de tiempo,
se pudo observar un marcado aumento en la concentración de ADN en los tratamientos
donde no hubo poda y una reducción en la concentración de ADN en el tratamiento en
donde hubo poda y adición del detrito. Durante las 55 semanas el por ciento de masa
remanente se mantuvo muy similar al de las 31 semanas en el tratamiento en el cual hubo
poda y no adición del detrito. En el resto de los tratamientos hubo una marcada reducción
55
en el por ciento de masa remanente, en especial, en el tratamiento en el cual hubo poda y
adición del detrito. En relación a la concentración de ADN total en el intervalo de las 55
semanas, se pudo observar una reducción drástica de ésta en todos los tratamientos.
En términos de la estructura de las comunidades microbianas presentes en
nuestras áreas de estudio, los resultados presentados en el cladograma (Figura 4.11)
indican que en la estructura de la comunidad de bacterias, hay un aparente agrupamiento
de éstas basado en el tratamiento donde hubo poda del dosel o donde no hubo poda y por
el tiempo. Este resultado se puede observar en los clados señalados con las letras A, B y
C cuando se agruparon en base al tratamiento y D para las que se agruparon en base al
tiempo (Figura 4.11.A). Por otro lado, en la estructura de la comunidad de los hongos se
observa que éstos se agruparon de acuerdo a los tratamientos en los cuales hubo adición o
no adición del detrito, por el tipo de cohorte de hojas y por el tiempo. Este dato se
observa en los clados señalados con las letras E, F y G cuando se agruparon en base a los
tratamientos e I para los que se agruparon en base al tiempo (Figura 4.11. B).
56
Figura 4.11. Cladograma del TRFLP de las combinaciones de las muestras que dieron
positivo al PCR mostrando la estructura de la comunidad de bacterias (A) y hongos (B)
presentes en diferentes cohortes de hojas y en los tratamientos. Las siglas HF señalan la
hojarasca fresca; HN señala la hojarasca nueva y HV representa las hojas verdes. La letra
S representa la unidad de tiempo en semana.
No poda + detrito Poda + detrito
B
HN 17 s
HF 31 s
HF 31 s
HV 17 s
HV 31 s
HF 17 s
HF 17 s
HV 17 s
HN 17 s
HF 55 s
s HF 55 s
HF 31 s
HV 31 s
HF 31 s
HF 31 s
HF 17 s
HV 55 s
HF 55 s
HV 55 s
HN 17 s
HF 17 s
HF 55 s
HF 55 s
HV 55 s
HF 55 s
HV 55 s
s HF 17 s
HF 17 s
HF 55 s
HF 31 s
HN 17 s
HN 17 s
HV 17 s
s HN 17 s
s HN 17 s
s HF 17 s
s HV 31s
HF 31 s
HV 17 s
HV 31 s
HF 31 s
HF 31 s
Poda + no detrito
A
B
C
F
H
G
A
E
I
D
Control
57
A partir de la selección de varias muestras a las que se les aplicó la técnica de
TRFLP, se obtuvo el mapa genético de los distintos filotipos que las conformaban. La
Figura 4.12 muestra el número de filotipos presentes en la comunidad bacteriana cuando
se aplica el tratamiento control en la cohorte de hojarasca fresca. La composición de la
comunidad bacteriana se observa diferente y cambia a partir de las 17 semanas, pero no
se observa una diferencia significativa entre las comunidades en los intervalos de las 31 y
55 semanas. Este dato puede ser señalado con el filotipo marcado con la letra A, el cual
surge en el intervalo de las 31 semanas y perdura hasta las 55 semanas, pero no se
encuentra en la comunidad de bacterias presente a las 17 semanas. En el caso de la
comunidad de hongos para la misma cohorte y tratamiento se encontró que hubo una
diferencia significativa en la riqueza de filotipos que se obtuvieron. La composición de la
comunidad de hongos cambia a través del tiempo, este dato se puede corroborar al
observar la Figura 4.13. En el intervalo de las 31 semanas no se observan filotipos que
estuvieran presentes a las 17 semanas, por ejemplo, los filotipos señalados con las letras
A y B. Por otra parte, en las 31 semanas surgen filotipos que no estaban presentes en las
17 semanas, como los filotipos señalados con las letras C, D y E. En el intervalo de las 55
semanas se observan filotipos que no estaban presentes en las 17 y 31 semanas, por
ejemplo, los filotipos señalados con las letras F y G. Es importante recordar que en el
tratamiento control no hubo poda ni adición de detrito, pero a pesar de este hecho la
composición de las comunidades de bacterias y de hongos cambiaron a través del tiempo.
Este dato nos muestra que hubo un efecto de temporalidad en los resultados obtenidos
que pudo haber surgido por la disponibilidad de nutrientes en cada intervalo de muestreo.
58
Figura 4.12. Perfil de TRFLP de muestras de la cohorte de hojarasca fresca del bloque A
que dieron positivo a bacterias y a las que se les aplicó el tratamiento control a través del
tiempo (17, 31 y 55 semanas). La letra A representa filotipo que se repite en la
comunidad de bacterias a las 17 y 55 semanas. Las letras pb representan los pares de
bases.
A
17 semanas
55 semanas
31 semanas
A
U n i d a d e s d e f l u o r e s c e n c i a
Longitud de fragmento terminal (pb)
59
Figura 4.13. Perfil de TRFLP de muestras de la cohorte de hojarasca fresca del bloque A
que dieron positivo a hongos y a las que se les aplicó el tratamiento control a través del
tiempo (17, 31 y 55 semanas). Las letras A, B, C, D, E, F y G representan filotipos
presentes en la comunidad de hongos a través del tiempo.
A B
CD E
F G
17 semanas
31 semanas
55 semanas
Longitud de fragmento terminal (pb)
Un i d a d e s d e f l u o r e s c e n c i a
60
Si comparamos los resultados presentados en la Figura 4.12 con los que se
muestran en la Figura 4.13 podemos concluir que hubo una mayor variabilidad en la
composición de la comunidad de hongos en la cohorte de hojarasca fresca versus la de
bacterias a través del tiempo cuando se aplicó el tratamiento control. Estos resultados
coinciden con los encontrados en la técnica de análisis ANOVA (Tablas 4.07 y Tabla
4.08).
La Figura 4.14 muestra el perfil de TRFLP de las muestras de diferentes cohortes
en la misma canasta del bloque A que dieron positivo a bacterias y a las que se les aplicó
el tratamiento de no poda más adición de detrito en el intervalo de las 17 semanas. Se
puede observar que aún dentro de la misma canasta la composición de la comunidad
bacteriana cambia. Aunque cabe señalar que hay filotipos que se mantienen en todas las
cohortes de la canasta, por ejemplo, el filotipo señalado con la letra A. Por otra parte, hay
filotipos que se mantuvieron en algunas cohortes, pero no se mostraban en el resto de
éstas. Por ejemplo, el filotipo señalado con la letra B se presenta en las cohortes de
hojarasca sobre el suelo y la de hojas verdes, pero no se presenta en la hojarasca fresca y
en las hojas nuevas. Si comparamos la composición de la comunidad bacteriana en el
intervalo de las 17 semanas con la composición de esta misma comunidad en el intervalo
de las 55 semanas (Figura 4.15) podremos observar como ésta cambia a través del
tiempo. Hay que señalar que en esta figura hay filotipos que permanecen presentes en
ambos cohortes, por ejemplo, el filotipo señalado con la letra A. En la Figura 4.15 se
muestran únicamente las cohortes de hojarasca fresca y hojas verdes ya que se trabajó
exclusivamente con estas cohortes a partir de las 31 semanas. Al observar la Figura 4.15
se puede constatar que los filotipos señalados con las letras A y B en la Figura 4.14 no
61
están presentes en ésta a pesar de que se encuentran en la misma canasta y se les aplicó el
mismo tratamiento. Este resultado evidencia que la composición de la comunidad
bacteriana presentó un cambio más pronunciado a través del tiempo versus el que ocurrió
dentro de la misma canasta durante el mismo intervalo de tiempo.
La Figura 4.16 muestra como la composición de la comunidad de hongos cambió
en las diferentes cohortes que se encontraba dentro de la misma canasta del bloque A y a
las que se les aplicó el tratamiento de no poda más adición de detrito en el intervalo de las
17 semanas. Se observa una gran variedad en los filotipos presentes en las distintas
cohortes (por ejemplo, ver los filotipos contenidos en la figura señalada con la letra A),
pero cabe señalar que en esta figura hay filotipos que se presentan en más de una cohorte,
por ejemplo, los filotipos señalados con las letras B y C. Cuando se compara la
composición de las comunidades de hongos en la cohorte de hojas verdes y hojas frescas
en el intervalo de las 55 semanas con la de las 17 semanas se puede observar como la
composición y la riqueza de los filotipos de esta comunidad cambia a través del tiempo
(Figura 4.17). Se puede indicar que el cambio en la composición de la comunidad de
hongos fue más pronunciada y evidente que en la de la comunidad de bacterias (Figura
4.14 y Figura 4.15).
62
Figura 4.14. Perfil de TRFLP de muestras de diferentes cohortes en la misma canasta del
bloque A que dieron positivo a bacterias y a las que se les aplicó el tratamiento de no
poda más adición de detrito en el intervalo de las 17 semanas.
A
A
A
A
Longitud de fragmento terminal (pb)
Hojarasca sobre el suelo
Hojas verdes
Hojarasca fresca
Hojas nuevas U n i d a d e s d e f l u o r e s c e n c i a
B
B
63
Figura 4.15. Perfil de TRFLP de muestras de diferentes cohortes en la misma canasta del
bloque A que dieron positivo a bacterias y a las que se les aplicó el tratamiento de no
poda más adición de detrito en el intervalo de las 55 semanas.
U n i d a d e s d e f l u o r e s c e n c i a
A
A
Hojas verdes
Hojarasca fresca
Longitud de fragmento terminal (pb)
64
Figura 4.16. Perfil de TRFLP de muestras de diferentes cohortes en la misma canasta del
bloque A que dieron positivo a hongos y a las que se les aplicó el tratamiento de no poda
más adición de detrito en el intervalo de las 17 semanas. La letra A representa un filotipo
señalado.
Longitud de fragmento terminal (pb)
U n i d a d e s d e f l u o r e s c e n c i a
Hojas nuevas
Hojas verdes
Hojarasca fresca
Hojarasca sobre el suelo
C
B
A
65
Figura 4.17. Perfil de TRFLP de muestras de diferentes cohortes en la misma canasta del
bloque A que dieron positivo a hongos y a las que se les aplicó el tratamiento de no poda
más adición de detrito en el intervalo de las 55 semanas.
U n i d a d e s d e f l u o r e s c e n c i a
Hojas verdes
Hojarasca fresca
Longitud de fragmento terminal (pb)
A
A
66
En las Figuras 4.18 y 4.19 se continua observando el mismo patrón en relación a
los cambios que ocurrieron en la composición de la comunidad bacteriana en los
intervalos de las 17 y 55 semanas cuando se trabajó con las muestras de las distintas
cohortes dentro de una misma canasta, pero en este caso se aplicó el tratamiento de poda
más adición del detrito. En el caso de la comunidad de bacterias se observa como cambia
la composición de ésta en las distintas cohortes. Por ejemplo, los filotipos delimitados por
la figura señalada con la letra A muestran como varia la composición de la comunidad
cuando pasamos al intervalo de las 55 semanas. En el intervalo de las 55 semanas (Figura
4.19) no se observan los filotipos que estaban presentes en la Figura 4.18. Nuevamente
se muestra un efecto de temporalidad ya que aún dentro de la misma canasta se pudo
observar como la composición de la comunidad bacteriana cambia a través del tiempo.
En la Figura 4.20 se observa una disminución drástica en el número de filotipos
en la cohorte de hojarasca sobre el suelo cuando se aplica el tratamiento de poda más
adición del detrito en el intervalo de las 17 semanas. Se muestra una diferencia
significativa en la composición de la comunidad de hongos en la hojarasca sobre el suelo
versus la cohorte de hojarasca fresca y la de hojas nuevas. A pesar de este hecho, se
encontraron filotipos comunes en la cohorte de hojarasca sobre el suelo y la de hojarasca
fresca, por ejemplo, el filotipo señalado con la letra A. La composición de la comunidad
de hongos en la cohorte de hojarasca fresca y la cohorte de hojas nuevas presenta un
mayor número y riqueza de filotipos. Por ejemplo, los filotipos señalados con las letras B
y C. En la Figura 4.21 se observa como la composición de la comunidad de hongos
presente en la Figura 4.20 en el intervalo de las 17 semanas cambió en el intervalo de las
55 semanas.
67
Figura 4.18. Perfil de TRFLP de muestras de diferentes cohortes en la misma canasta del
bloque A que dieron positivo a bacterias y a las que se les aplicó el tratamiento de poda
más adición de detrito en el intervalo de las 17 semanas.
Longitud de fragmento terminal (pb)
Hojas nuevas
Hojarasca fresca
Hojarasca sobre el suelo
U n i d a d e s d e f l u o r e s c e n c i a
A
68
Figura 4.19. Perfil de TRFLP de muestras de diferentes cohortes en la misma canasta del
bloque A que dieron positivo a bacterias y a las que se les aplicó el tratamiento de poda
más adición de detrito en el intervalo de las 55 semanas.
Longitud de fragmento terminal (pb)
Hojas verdes
Hojarasca fresca
U n i d a d e s d e f l u o r e s c e n c i a
A
69
Para poder comparar la composición de la comunidad de hongos en ambas figuras
tenemos que referirnos a la cohorte de hojarasca fresca. En base a este hecho podemos
decir que surgieron cambios en la composición de la comunidad de hongos en la
hojarasca fresca a través del tiempo ya que en el intervalo de las 55 semanas surgieron
filotipos que no estuvieron presente en las 17 semanas. Por ejemplo, los filotipos
contenido en las figuras señaladas con las letras A y D. Por otra parte, hay que indicar
que los filotipos señalados en el perfil de la hojarasca fresca con las letras B y C en el
intervalo de las 17 semanas (Figura 4.20) continúan presentándose en el intervalo de las
55 semanas, no solo en la hojarasca fresca, sino que también se presentan en las hojas
verdes. Esto nos puede indicar que parte de la comunidad de hongos originales se está
restableciendo en el intervalo de un año o que éstos han logrado adaptarse y subsistir a
través del tiempo.
La Figura 4.22 presenta muestras de la cohorte de hojarasca fresca y del bloque A
que dieron positivo a bacterias y a las que se les aplicaron distintos tratamientos en el
intervalo de las 55 semanas. Hay que señalar la presencia de un mayor número de
filotipos en aquellos tratamiento en donde no hubo poda versus los tratamientos en que sí
hubo poda. Podríamos inferir que la composición de la comunidad de bacterias no se
restablece completamente de los efectos de un huracán o que ésta cambia en un período
de 55 semanas, aunque estén dentro del mismo bloque. En el caso de la composición de
la comunidad de hongos para el mismo tratamiento e intervalo de tiempo, se observó una
disminución en el número de filotipos presentes en todos los tratamientos dentro del
mismo bloque (Figura 4.23).
70
Figura 4.20. Perfil de TRFLP de muestras de diferentes cohortes en la misma canasta del
bloque A que dieron positivo a hongos y a las que se les aplicó el tratamiento de poda
más adición de detrito en el intervalo de las 17 semanas.
U n i d a d e s d e f l u o r e s c e n c i a
Longitud de fragmento terminal (pb)
Hojas nuevas
Hojarasca fresca
Hojarasca sobre el suelo
A
B
C
C
A
B
71
Figura 4.21. Perfil de TRFLP de muestras de diferentes cohortes en la misma canasta del
bloque A que dieron positivo a hongos y a las que se les aplicó el tratamiento de poda
más adición de detrito en el intervalo de las 55 semanas.
Longitud de fragmento terminal (pb)
Hojas verdes
Hojarasca fresca
U n i d a d e s d e f l u o r e s c e n c i a
B
D
B C
C
A
72
Hay que señalar que aunque se observó una reducción en el número de filotipos
presentes en la comunidad de hongos durante este intervalo de tiempo hubo filotipos que
se encontraron en prácticamente todos los tratamientos, excepto en el tratamiento control.
Este es el caso del filotipo señalado con la letra A. Si comparamos la composición de la
comunidad de bacterias (Figura 4.22) con la de la comunidad de hongos (Figura 4.23)
podríamos concluir que en el intervalo de las 55 semanas el número de filotipos presentes
en todos los tratamientos fue mayor para la comunidad de bacterias, especialmente en los
tratamientos donde no hubo poda.
En resumen, podemos decir que los resultados de los distintos análisis
microbianos mostraron, al aplicar los diferentes tratamientos en nuestra área de estudio,
que hubo cambios en la sucesión microbiana a través del tiempo, especialmente en el
caso de los hongos. Los resultados obtenidos del TRFLP para la región 16S rADN
bacteriana digerida con la enzima de restricción MnlI y el TRFLP de la región ITS de
hongos con la enzima de restricción HaeIII corroboran lo anteriormente expuesto ya que
cuando se aplicó el análisis estadístico ANOVA a estos resultados se encontró que hubo
una diferencia significativa en el número de filotipos de hongos a través del tiempo. En el
caso de las bacterias hubo cambios en el número de filotipos a través del tiempo, pero la
diferencia no fue significativa. Otro aspecto importante fue que los electroferogramas
mostraron que, en el caso de los hongos en la hojarasca fresca, hubo un mayor número de
filotipos en los tratamientos donde no hubo poda o en los que hubo adición del detrito. En
adición, se pudo observar que había variedad de filotipos en las cohortes que se
encontraban dentro de una misma canasta del mismo bloque y durante el mismo intervalo
de tiempo.
73
Figura 4.22. Perfil de TRFLP de muestras de la cohorte de hojarasca fresca del bloque A
que dieron positivo a bacterias y a las que se les aplicaron distintos tratamientos en el
intervalo de las 55 semanas.
Longitud de fragmento terminal (pb)
Control
No poda + detrito
Poda - detrito
Poda + detrito
U n i d a d e s d e f l u o r e s c e n c i a
74
Figura 4.23. Perfil de TRFLP de muestras de la cohorte de hojarasca fresca del bloque A
que dieron positivo a hongos y a las que se les aplicaron distintos tratamientos en el
intervalo de las 55 semanas.
Control
No poda + detrito
Poda - detrito
Poda + detrito
A
A
A
Longitud de fragmento terminal (pb)
U n i d a d e s d e f l u o r e s c e n c i a
75
En relación al número de filotipos obtenidos del TRFLP para la comunidad de
hongos en la hojarasca fresca podemos decir que hubo un mayor número de filotipos de
hongos en prácticamente todos los tratamientos en los intervalos de las 17 y 31 semanas.
En términos de las hojas verdes se observó que hubo un mayor número de filotipos de
bacterias en el tratamiento de no poda más detrito durante el intervalo de las 55 semanas,
mientras que para los hongos el número de filotipos fue mayor en los intervalos de las 17
y 31 semanas. Este dato puede sugerirnos que en los hojas verdes la comunidad de
bacterias empieza a recuperarse de los efectos de un disturbio en aproximadamente un
año. Se observó una tendencia en la cual después que la comunidad de hongos actuaba
descomponiendo la materia orgánica se podía observar un aumento en la comunidad de
bacterias, es decir, cuando los hongos aumentaban las bacterias disminuían o por el
contrario, cuando los hongos disminuían las bacterias aumentaban.
76
Capítulo Cinco
Discusión
El estudio pretendía medir los cambios en la estructura microbiana en respuesta a
los diferentes tratamientos y sus efectos relativos en los organismos presentes en la
sucesión de descomposición del material orgánico. Los objetivos del estudio incluían
analizar la composición y estructura de las comunidades microbianas en la hojarasca por
medio de la técnica de TRFLP, determinar si hubo alguna diferencia significativa entre
las áreas de estudio y diferentes niveles de descomposición de la hojarasca y determinar
organismos presentes en la sucesión en la hojarasca.
La actividad microbiana es responsable de una gran parte de la descomposición.
Los diferentes grupos de descomponedores microbianos se han adaptado a degradar
diversos tipos de recursos y, en adición, se han adaptado a diferentes condiciones
ambientales, dirigiendo la sucesión de la comunidad microbiana al descomponer la
hojarasca (Lodge, 1996). Los compuestos lábiles son degradados, en primer lugar, por las
bacterias de crecimiento rápido y por los hongos azúcares, mientras que los recursos
recalcitrantes (ej. lignina) pueden ser descompuestos más tarde, primeramente por
hongos, especialmente por basidiomicetos de producción blanca que utilizan las bandas
de las hifas para colonizar nuevos recursos y para importar nutrientes de su fuente de
alimentos previa (Miller and Lodge, 1997). La degradación de la lignocelulosa por los
hongos de producción blanca provee variedad en los recursos adicionales que son
descompuestos por otros microbios, dirigiendo los nuevos cambios de la comunidad
microbiana. Los disturbios que ocasionan la apertura del dosel y depositan el detrito,
77
tanto de actividades naturales (ej. huracanes) como antropogénicas (ej. esparcimiento)
pueden afectar significativamente las comunidades de descomponedores microbianos y la
tasa de descomposición, a través de sus efectos en el ambiente del suelo del bosque y la
calidad de la hojarasca (Miller and Lodge, 1997).
En términos de la concentración de ADN total se establece que no hubo una
diferencia significativa de éste entre los bloques, tratamientos y cohortes de las hojas,
pero si fue significativamente diferente a través del tiempo en la hojarasca fresca
(P=0.001). En el tratamiento donde hubo poda y adición del detrito la concentración del
ADN fue mayor en las 7 y 17 semanas si se compara con el resto de los intervalos de
muestreo (Figura 4.01). La colonización de hongos basidiomicetos es promovida en la
hojarasca fresca. La tasa de descomposición pudo aumentar debido al aumento relativo
en la humedad de la capa de la hojarasca fresca cubierta y al movimiento de nutrientes de
las hojas verdes que están sobre ellas. Los cambios en humedad, profundidad de la
hojarasca y la alta concentración de nutrientes en las hojas verdes pudieron interactuar y
de esta manera influenciar la tasa de descomposición en la capa de la hojarasca fresca
presente en el suelo, además de las hojas verdes. La tasa de descomposición pudo ser más
rápida en este tratamiento como muestra el bajo por ciento de masa remanente en el
intervalo de las 55 semanas presentado en la Figura 4.10.F (Lodge, datos no publicados).
El clímax de la comunidad microbiana es más rápido en este tratamiento, como muestra
la disminución de ADN a las 31 semanas (Figura 4.10.B). Es el único tratamiento donde
el ADN disminuye durante este intervalo de tiempo.
La alta concentración de ADN en el tratamiento de poda sin adición del detrito
pudo estar causada por la ausencia de hongos basidiomicetos. Cuando los hongos
78
basidiomicetos no están presentes en el sustrato, las bacterias y los hongos azúcares
pueden colonizarlo. Por tanto, la alta concentración de ADN en este tratamiento pudo
estar dirigida por estos microorganismos (Figura. 4.10.A). Este resultado está sustentado
por el alto por ciento de masa remanente que se obtuvo a las 55 semanas en el
tratamiento, mostrando que la descomposición fue más lenta en ausencia de hongos
basidiomicetos (Figura 4.10.F) (Lodge, datos no publicados). La aceleración de la
descomposición temprana en las hojas por algunos hongos basidiomicetos puede ser
atribuida, en parte, a su capacidad de colonizar rápidamente el sustrato y a su capacidad
de mover los nutrientes, las cuales les permiten convertir la biomasa en nuevos recursos
cuando la incorporación de nutrientes es mínima (Lodge et al, 2008). Al no incorporar
una fuente de material orgánico se disminuyó el desarrollo de los microorganismos,
particularmente, los hongos. Por tal razón la hojarasca presente en el suelo se
descompone más lentamente que en los otros tratamientos ya que la concentración de
nutrientes declina rápidamente en la hojarasca existente debido a la pérdida de nutrientes
de los microbios y al aumento de la radiación del sol. El tamaño de la abertura del dosel
es determinante en las actividades de la descomposición de la hojarasca (Quishui and
Zak, 1995). En este tratamiento se observó una disminución en el número de filotipos a
través del tiempo ya que al realizarse la poda del dosel, y al retirar el detrito se disminuye
la sucesión de descomposición de la hojarasca (Figura 4.03.A–C). Los resultados del
análisis estadístico ANOVA confirmaron que no hubo una diferencia significativa en el
número de filotipos en las comunidades de bacterias en la hojarasca fresca a través del
tiempo.
79
El clímax de la comunidad microbiana es más lento en el tratamiento donde no se
poda el dosel, pero la abundancia de microorganismos puede ser más alta cuando se
añade el detrito, debido a que se propicia una alta conectividad de hongos (Lodge,
trabajos no publicados). Este hecho es apoyado por la alta concentración de ADN en el
tratamiento donde no hubo poda, pero si adición del detrito (Fig. 4.10.B).
Los resultados del cladograma mostraron que la estructura de las comunidades de
hongos y bacterias cambia a través del tiempo y el espacio. La poda del dosel y la adición
del detrito pueden afectar la comunidad microbiana. Estos cambios y diferencias
observadas entre los tratamientos y las cohortes de hojas, pudieron ser provocados
principalmente por el tiempo de recolección de la muestra y por el lapso de tiempo que se
tuvo que esperar para defoliar entre un bloque y otro. Además, se encontró que las
muestras son altamente divergentes y no pudo ser observado un patrón definido en las
comunidades debido a la diversidad de las comunidades de hongos y bacterias, y a la
variabilidad entre los bloques. El efecto de la intensidad de la defoliación en la estructura
de la cadena alimentaria sobre el suelo pudo depender de la duración de la defoliación
provocando que el efecto sobre las comunidades microbianas sea más dinámico que
constante (Mikola et al, 2001). Por tanto, pudimos probar que la hipótesis (Ha) en la que
se señalaba que la deposición de la materia orgánica y las aberturas en el dosel
cambiarían la diversidad de microorganismos en nuestra área de estudio es cierta. Esto es
de esta manera, ya que los resultados obtenidos de los distintos análisis que se aplicaron a
las muestras recolectadas corroboraron que la deposición de materia orgánica y las
aberturas en el dosel cambiaron la diversidad relativa de microorganismos, en nuestro
caso, hubo una diferencia significativa mayor en el número de filotipos en la comunidad
80
de hongos a través del tiempo, tanto en la hojarasca fresca, como en las hojas verdes.
Podemos concluir que los cambios ocurridos a través del tiempo en las comunidades
microbianas pueden ser relacionados a los cambios ocurridos en el microclima y a la
disponibilidad de los compuestos lábiles. En adición, podemos concluir que los hongos
aparentan controlar la sucesión de microorganismos al descomponer la hojarasca presente
sobre el suelo.
Por último, en muy pocos trabajos de investigación se ha aplicado la técnica de
TRFLP al estudio de las comunidades microbianas en las hojas y en determinar como los
cambios en el ambiente afectan su estructura y diversidad. En este estudio se logró
aplicar, por primera vez, la técnica de TRFLP en la región del trópico, pero aún se
necesitan realizar más investigaciones, ya que las enzimas de restricción que se utilizaron
en el estudio nos dieron una resolución limitada. Es necesario evaluar otras enzimas para
de esta manera poder determinar cual es más eficaz al momento de discriminar entre los
efectos causados por los tratamientos y los causados por las cohortes de hojas. Es decir,
utilizar otras enzimas de restricción que nos provean una mayor resolución de la
estructura microbiana presente en la hojarasca.
81
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85
Apéndices
86
Apéndice Uno
Apéndice 1.01.
Protocolo alternativo para extraer ADN
(UltraClean Soil DNA Isolation Kit, MoBio Laboratorios, Solana Beach, CA).
Ponerse guantes todo el tiempo.
1. Añadir 0.25 g a 1.00 g de muestra del suelo a la solución ya preparada (2 ml Bead
Solution Tubes). Enumerar cada solución.
2. Mover las soluciones.
3. Cotejar la solución S1, para verificar que no halla precipitado. Si hay precipitado se
tendrá que calentar la solución a una temperatura de 60ºC, hasta que se disuelva el
precipitado.
4. Añadir 60 µl de la solución S1 e invertirla varias veces o moverla brevemente.
5. Añadir 200 µl de la solución IRS (“Inhibitor Renoval Solution”), se requiere solo si el
ADN será utilizado en PCR.
6. Asegurar los tubos horizontalmente utilizando el “Mo Bio Vortex Adapter’’ con cinta
adhesiva. Mover a velocidad máxima por 10 minutos.
7. Centrifugar los tubos a 10,000 x g durante 30 segundos.
8. Transferir el sobrenadante a tubos microcentrifugados limpios.
9. Se espera tener alrededor de 400 µl a 450 µl de sobrenadante.
10. Añadir 250 µl de la solución S2 y moverla por 5 segundos. Colocarla en el congelador
a 4ºC por 5 minutos.
11. Centrifugar los tubos a 10,000 x g.
87
12. Transferir el volumen completo de sobrenadante a un tubo de sobrenadante limpio.
13. Añadir 1.3 ml de la solución S3 al sobrenadante y moverlo por 5 minutos.
14. Colocar 700 ml en el filtro “Spin filter” y centrifugar por 1 minuto a 10,000 x g.
Descartar el flujo. Repetir el proceso con el sobrenadante que falta. Se realizará un total
de 3 tandas por cada muestra.
15. Añadir 300 µl de la solución S4 y centrifugar por 30 segundos a 10,00 x g.
16. Descartar el flujo.
17. Centrifugar nuevamente por 1 minuto.
18. Colocar cuidadosamente el filtro en un tubo nuevo. Se provee.
19. Añadir 50 µl de la solución S5 en el centro de la membrana del filtro.
20. Centrifugar por 30 segundos.
21. Desechar el filtro. El ADN en el tubo está listo para las aplicaciones. Se recomienda
que se almacene el tubo con el ADN a una temperatura de -20ºC.
88
Apéndice 1.02.
Dilución de iniciadores oligonucleótidos “primers” para bacterias 1525R
Ci = 100 pmol 20pmol (100 µl) Vi = =
100pmol 27F (FAM)
Ci= 48.2 20 pmol (100 µl) Vi = = 48.2 pmol
Se aplicará el mismo procedimiento para diluir los iniciadores oligonucleótidos
“primers” de hongos (ITS4 e ITS1).
20 µl “primer”
41.5 µl de “primer”
20 µl “primer” 80 µl ddH2O
41.5 µl “primer” 58.2 µl ddH2O
89
Apéndice 1.03.
Protocolo para Precipitación de
Productos de Secuenciación
Volumen inicial 20µl
1. Transferir todo el volumen de la digestión a un microtubo de 1.5 ml. 2. Preparar y añadir:
a. 49 µl de agua deionizada estéril (ddH2O)
b. 6 µl de 3M acetato de sodio (CH3COONa)
c. 125 µl de etanol 95% (CH3CH2OH)
3. Mezclar bien (vortex) e incubar a temperatura ambiente por 15 a 20 minutos (reposar).
4. Centrifugar a velocidad máxima por 20 minutos. Asegurarse de colocar los microtubos
en la misma orientación para localizar el “pellet”.
5. Utilizando una micropipeta, aspirar todo el sobrenadante con mucho cuidado y en la
dirección opuesta a donde se supone que esté el “pellet”.
6. Añadir 250 µl de etanol 70% para lavar el “pellet”.
7. Centrifugar a velocidad máxima por 5 minutos. Asegurarse de colocar los microtubos
en la misma orientación.
8. Aspirar el sobrenadante con premura y mucho cuidado con una micropipeta. 9. Dejar secar las muestras en un bloque termal a 70oC por 15 minutos o dejarlo abierto
de forma horizontal hasta evaporarse el alcohol residual. Si posee secado al vacío mejor.
Puede secar en un horno de secado a 70o C.
10. Resuspender el “pellet” en Formamida (CH3NO) y en el marcador de peso molecular
“Liz 500’’ (Applied Biosystem, Warrinton, UK). Utilizar 14.8 µl de Formamida + 0.2 µl
90
de “Liz marker” (por muestra). Luego, con una micropipeta, se transfieren todas las
muestras al plato de secuenciar y se le coloca el septo (la tapa de goma gris).
11. El plato de secuenciar se coloca en el termociclador y se aplica el programa de
desnaturalizar. Este método es aplicado para romper interacciones débiles como los
puentes de hidrógeno que pueden formarse.
12. Cuando finalice el ciclo de desnaturalizar, colocar rápidamente el plato de secuenciar
que contiene las muestras en un baño de agua fría para un cambio drástico de temperatura
por 2 minutos. Luego secar el plato y colocar la base y la cubierta requerida para la
secuenciación en el Analizador Genético.
91
Apéndice Dos
Apéndice 2.01. Resultados de la amplificación del ADN mediante la técnica de reacción
de la polimerasa en cadena (PCR) utilizando la enzima Polimerasa de ADN Red Taq
ADN Descripción Bacterias Dilución Hongos Dilución 16s rADN ITS Período de muestreo: 17 semanas 40 A1 - Hojarasca nueva - N/A - N/A 41 A1 - Hojarasca fresca + 10-1 + 10-1 42 A1 - Hojarasca sobre suelo + 10-1 + 10-2
43 A2 - Hojarasca nueva + 10-2 + 10-1
44 A2 - Hojarasca fresca - N/A - N/A 45 A2 - Hojarasca sobre suelo + 10-2 + 10-1
46 A3 - Hojas verdes - N/A - N/A 47 A3 - Hojarasca nueva + 10-1 + 10-1 48 A3 – Hojarasca fresca + 10-2 + 10-1 49 A3 - Hojarasca sobre suelo + 10-2 + 10-2 50 A4 - Hojas verdes + 10-2 + 10-1 51 A4 - Hojarasca nueva + 10-1 + 10-1 52 A4 - Hojarasca fresca + 10-2 + 10-1 53 A4 - Hojarasca sobre suelo + 10-2 + 10-1
54 B1 - Hojarasca nueva + 10-2 - N/A
92
Apéndice 2.01., continuación. 55 B1 - Hojarasca fresca + 10-2 + 10-1
56 B1 - Hojarasca sobre suelo + 10-2 + 10-1
57 B2 - Hojas verdes + 10-1 + 10-1 58 B2 - Hojarasca nueva - N/A + 10-1
59 B2 - Hojarasca fresca + 10-2 - N/A 60 B2 - Hojarasca sobre suelo + 10-2 + 10-1
61 B3 - Hojas verdes + 10-2 + 10-1
62 B3 – Hojarasca nueva + 10-2 + 10-1
63 B3 – Hojarasca fresca - N/A - N/A 64 B3 - Hojarasca sobre suelo + 10-1 - N/A 65 B4 - Hojarasca nueva - N/A + 10-1
66 B4 - Hojarasca fresca + 10-1 + 10-1
67 B4 - Hojarasca sobre suelo + 10-1 N/A N/A 68 C1 - Hojas verdes - N/A + 10-1
69 C1 - Hojarasca nueva - N/A + 10-1
70 C1 - Hojarasca fresca - N/A - N/A 71 C1 - Hojarasca sobre suelo + 10-1 + 10-1 72 C2 - Hojas verdes - N/A + 10-1
73 C2 - Hojarasca nueva + 10-1 N/A N/A 74 C2 - Hojarasca fresca + 10-2 + 10-2
75 C2 - Hojarasca sobre suelo + 10-2 + 10-2
76 C3 - Hojarasca nueva + 10-1 + 10-2
77 C3 - Hojarasca fresca + 10-2 + 10-1
93
Apéndice 2.01., continuación. 78 C3 - Hojarasca sobre suelo + 10-1 + 10-1 79 C4 - Hojarasca nueva - N/A + 10-2
80 C4 - Hojarasca fresca - N/A + 10-2 81 C4 - Hojarasca sobre suelo + 10-1 + 10-2 Período de muestreo: 31 semanas 82 A1 - Hojarasca fresca + 10-1 + 10-2 83 A2 - Hojarasca fresca + 10-2 + 10-2
84 A3 - Hojas verdes - N/A + 10-1 85 A3 - Hojarasca fresca + 10-2 + 10-2 86 A4 - Hojas verdes + 10-1 + 10-2
87 A4 - Hojarasca fresca - N/A + 10-2
88 B1 – Hojarasca fresca - N/A + 10-2
89 B2 – Hojas verdes - N/A + 10-2
90 B2 - Hojarasca fresca - N/A + 10-2
91 B3 - Hojas verdes + 10-2 + 10-2 92 B3 - Hojarasca fresca + 10-1 + 10-2
93 B4 - Hojarasca fresca + 10-1 + 10-2 94 C1 - Hojas verdes + 10-2 + 10-2 95 C1 - Hojarasca fresca + 10-2 + 10-2 96 C2 - Hojas verdes + 10-2 + 10-2 97 C2 - Hojarasca fresca + 10-2 + 10-2
98 C3 - Hojarasca fresca - N/A + 10-2
99 C4 - Hojarasca fresca + 10-2 + 10-2
94
Apéndice 2.01., continuación. Período de muestreo: 55 semanas 118 A1 - Hojarasca fresca + 10-1 + 10-1
119 A2 - Hojarasca fresca + 10-1 + 10-1 120 A3 - Hojas verdes + 10-1 + 10-1
121 A3 - Hojarasca fresca + 10-1 + 10-1 122 A4 - Hojas verdes + 10-2 + 10-1
123 A4 - Hojarasca fresca + 10-1 + 10-1
124 B1 - Hojarasca fresca + 10-1 + 10-1 125 B2 - Hojas verdes + 10-1 + 10-1
126 B2 - Hojarasca fresca + 10-1 + 10-1
127 B3 - Hojas verdes + 10-1 + 10-1 128 B3 - Hojarasca fresca + 10-1 + 10-1 129 B4 - Hojarasca fresca + 10-1 + 10-1 130 C1 - Hojas verdes + 10-1 + 10-1
131 C1 - Hojarasca fresca + 10-1 + 10-1 132 C2 - Hojas verdes + 10-1 + 10-1
133 C2 - Hojarasca fresca + 10-1 + 10-1 134 C3 - Hojarasca fresca + 10-1 + 10-1
135 C4 - Hojarasca fresca + 10-1 + 10-1
+ resultado positivo al PCR - resultado negativo al PCR
N/A no aplica
95
10 -1 muestras positivas al PCR al tener 2µl de ADN extraído en 18 µl de agua deionizada
estéril
10 -2 muestras positivas al PCR al tener 2µl de ADN diluido 10 -1 en 18 µl de agua
deionizada estéril.
Tratamientos:
A1, B1, C4 --- Control A2, B4, C3--- Poda sin adición de detrito A3, B2, C2 --- Poda más adición de detrito A4, B3, C1 --- No poda más adición de detrito
96
Apéndice 2.02. Resultados obtenidos en las muestras de hojarasca fresca colectadas en los
Bloques A, B y C al determinar la concentración de ADN total (µg/ml) y el número de
filotipos utilizando la técnica de TRFLP de acuerdo a los tratamientos e intervalos de tiempo.
TRFLP (16S rADN) TRFLP (ITS)
Bloque Tratamiento Tiempo ADN Número de picos Número de picos
(meses) (µg/ml) para bacterias para hongos
A control 17 8.1 34 34
A control 31 80.3 48 66
A control 55 14.4 50 29
A No poda + Detrito 17 29.7 45 63
A No poda + Detrito 31 141.3 N/A 34
A No poda + Detrito 55 23.2 35 44
A Poda + No adición 17 172.2 N/A N/A
A Poda + No adición 31 107.3 10 59
A Poda + No adición 55 18.0 N/A 58
A Poda + Detrito 17 52.5 41 23
A Poda + Detrito 31 66.8 17 81
A Poda + Detrito 55 14.2 45 68
B control 17 30.5 N/A N/A
B control 31 55.5 N/A 51
B control 55
22.4 N/A 56
B No poda + Detrito 17 29.1 N/A N/A
97
B No poda + Detrito 31 65.1 33 54
B No poda + Detrito 55 23.2 N/A N/A
B Poda + No adición 17 37.6 31 24
B Poda + No adición 31 43.8 34
45
B Poda + No adición 55 18.8 N/A 27
B Poda + Detrito 17 109.7 N/A N/A
B Poda + Detrito 31 58.8 N/A 22
B Poda + Detrito 55 15.2 N/A 31
C control 17 63.9 N/A 42
C control 31 45.3 15 64
C control 55 15.8 N/A N/A
C No poda + Detrito 17 29.6 N/A N/A
C No poda + Detrito 31 73.0 43 89
C No poda + Detrito 55 36.4 N/A N/A
C Poda + No adición 17 52.1 48 74
C Poda + No adición 31 121.7 N/A 19
C Poda + No adición 55 30.0 N/A 33
C Poda + Detrito 17 92.9 50 75
C Poda + Detrito 31 66.8 25 68
C Poda + Detrito 55 30.6 94 N/A
98
Apéndice 2.03. Resultados obtenidos en las muestras de hojas verdes colectadas en los
Bloques A, B y C al determinar la concentración de ADN total (µg/ml) y el número de
filotipos utilizando la técnica de TRFLP de acuerdo a los tratamientos e intervalos de tiempo.
TRFLP (16S rADN) TRFLP (ITS)
Bloque Tratamiento Tiempo ADN1 Número de picos Número de picos
(meses) (µg/ml) para bacterias para hongos
A
Poda + Detrito
17
34.2
N/A
N/A
A
Poda + Detrito
31
28.9
N/A
72
A
Poda + Detrito
55
13.9
10
65
A
No poda + Detrito
17
34
23
80
A
No poda + Detrito
31
51.7
58
64
A
No poda + Detrito
55
28.7
31
N/A
B
Poda + Detrito
17
48.1
25
45
B
Poda + Detrito
31
26.7
N/A
17
B
Poda + Detrito
55
17.4
N/A
15
B
No poda + Detrito
17
84.1
N/A
66
B
No poda + Detrito
31
52
28
95
B
No poda + Detrito
55
18.4
N/A
29
C
Poda + Detrito
17
89.9
N/A
13
C
Poda + Detrito
31
58.6
13
62
C
Poda + Detrito
55
15
65
N/A
99
1 Los resultados obtenidos al calcular la concentración de ADN total se obtuvieron de las
muestras que fueron colectadas de los bloques A, B y C utilizando el biofotómetro. Se
utilizaron 6 µl del ADN extraído diluidos en 54 µl de agua esterilizada.
C No poda + Detrito 17 29.6 N/A 69
C
No poda + Detrito
31
54.6
22
56
C
No poda + Detrito
55
19.8
96
N/A
