ncRNA

Boris Rogelj

Boris.Rogelj@ijs.si

Pregled predavanja

• Nekodirajoče RNA

• piRNA

• Endo-siRNA

• snRNA

• snoRNA

• scaRNA

• lncRNA

Raznolikost RNA

Znane ncRNA

??? ncRNA

piRNA

• Najdemo jih v zarodnih celicah pri sesalcih.

• Velikost: 24-31 nt

• Vloga pri omejevanju transpozicije retrotranspozonov pri

zarodnih celicah.

– Pomembno, ker integracija transpozonov v nove lokacije lahko moti

pri izražanju genov in vodi v genetske bolezni ali raka.

• Pri nekaterih organizmih lahko uravnavajo izražanje drugi

genov.

• >15.000 odkritih piRNA – največja skupina ncRNA pri človeku

• piRNA se mapirajo na 89 genomskih intervalov, ki so dolgi 10-

75kb.

• Verjetno se izrežejo iz velikih multigenskih transkriptov.

• Pri človeku multi-piRNA transkripti vsebujejo več sto piRNA.

• piRNA ustavljajo transpozicijo po poti podobni RNAi.

• Vežejo se na PIWI proteine (podskupina družine Argonaut).

Utišanje transpozonov s

piRNA

A. Primarni piRNA izvirajo iz dolgih

prekurzorskih RNA, ki so prepisane s

piRNA regij. Transpozoni, ki so v

nasprotni orientaciji so vir protismiselnih

piRNA.

B. Protismiselni piRNA se vežejo na piwi

protein in usmerjajo rezanje smiselnega

transkripta transpozona. Drugi piwi

protein se veže na 3‘ produkt rezanja in

ga skrajša na velikost piRNA. Ta

sekundarni smiselni piRNA se uporabi

za tvorbo novih protismiselnih piRNA.

C. Protismiselne piRNA usmerijo piwi

komplekse v DNA metilacijo ali v

modifikacijo histonov.

endo-siRNA

• Eksogene siRNA so zelo pomembno orodje pri raziskavah

izražanja genov (Nobelova nagrada - Fire and Mello, 2006)

• Nedavno so odkrili, da v človeških celicah pride do naravne

sinteze endogenih siRNA.

• Verjetno jih je več 10.000 različnih.

• Nastanejo z rezanjem dvoverižnih RNA v celici.

• Dvoverižne RNA lahko nastajajo na račun prepisovanja

psevdogenov.

Psevdogeni uravnavajo izražanje

starševskih genov z endo-siRNA • Psevdogeni nastajajo s kopiranjem

starševskih genov. Nekateri

psevdogeni se prepisujejo v

protismisleni smeri.

• Protismiselna RNA se veže na

starševsko mRNA – tvori se

dvovijačna RNA, ki jo razreže Dicer.

• Endo-siRNA nastane tudi iz

podvojenega obrnjenega zaporedja

(npr. psevdogena)

• Transkripcija skozi obrnjeno

zaporedje tvori transkript z obrnjeno

ponovitvijo, ki tvori daljšo lasnico

• Dicer prepozna dvoverižni del lasnice

in izreže ven siRNA.

• V obeh primerih se endo-siRNA

vežeta v RISC in utišata izražanje oz.

razgradita starševsko mRNA

snRNA

• Devet človeških snRNA

• Dolga so 106-186 nt.

• Na vsako se veže sedem osnovnih proteinov (Sm ali Lsm

skupine)

• U1, U2, U4, U5 in U6 so sestavni del glavnega spliceosoma

(GU-AG)

• U4atac, U6atac, U11 in U12 delujejo v stranskem spliceosomu

(AU-AC).

• Na U6 in U6atac se vežejo proteini Lsm skupine. Ostali snRNA

vežejo proteine Sm skupine.

• Več kot 70 genov nosi zapise za snRNA glavnega spliceosoma

– 44 za U6 snRNA

– 16 za U1 snRNA

A. Sm tip snRNA vsebuje tri pomembne

elemente.

1. 5’ trimetilgvanozinsko kapo

2. Vezavno mesto za SM proteine

3. 3’ strukturo stebra in zanke.

Sm mesto in steber z zanko sta

prepoznavna mesta za SMN kompleks.

Sm mesto določa vezavo sedmih ključnih

proteinov.

Kapa in ključni proteini so pomembni za

vnos snRNP v jedro.

B. Lsm tip snRNA ima 5’ monometilfosfat

gvanozinsko kapo, 3’ stebro in zanko ter 3’

terminalno zaporedje uridinov nakatero se

vežejo sedem Lsm proteinov.

Struktura snRNA

snRNA, ki niso v spliceosomu

• U1 in U2 imata tudi vloge izven spliceosoma

– U1 sodeluje pri spodbujanju transkripcije z RNA pol II

– U2 sodeluje pri spodbujanju elongacije z RNA pol II

• Primeri snRNA, ki ne sodelujejo v spliceosomu:

– U7 snRNA. Dolga je 63 nt in sodeluje pri procesiranju 3’ koncev

histonske mRNA. Histonske mRNA nimajo poli(A) repa.

– 7SK RNA. Dolga je 331 nt. Deluje kot inhibitor P-TEFb (elongacijski

faktor RNA pol II)

– Družina Y RNA. Trije člani dolgi manj kot 100 nt. Delujejo pri

replikacij kromosomske DNA in regulaciji razmnoževanja celic.

snoRNA

• Dolge 60-300 nt.

• Prvotno odkrite v nukleolusu, kjer usmerjajo modifikacije na

rRNA.

• Tvorijo kratke duplekse s tarčnim mestom na rRNA.

• Dve podskupini C/D box in H/ACA box.

• Pri človeku je odkritih 340. Verjetno jih je precej več.

• Večina je v intronih.

• Nekateri imajo več kopij (HBII-52 ima 45 kopij, HBII-85 ima 29

kopij).

• Nekateri so v skupini. Npr. SNURF-SNRPN transkripcijska

enota ima šest različnih snoRNA (vključno z HBII-52 in HBII-85).

• Nekatere snoRNA so tkivno specifične npr. SNURF-SNRPN

skupina je v možganih.

• Nekatere nimajo tarč na rRNA. HBII-52 uravnava 5-HT2C

receptor.

• HBII-85 je povezana s Prader-Willy sindromom.

Box C/D snoRNA

• Usmerjajo 2’-O-metilacijo.

• 5’ in 3’ konca ob regijah C in D

tvorita kratko steblo.

• C’ in D’ (zeleno) sta interni kopiji

C in D.

• snoRNA se prilega na tarčo, s

katero tvorita 10-21nt dolgo

dvojno vijačnico.

• Na nukleotidu tarče, ki je

nasproti 5. nukleotidu pred D ali

D’, pride do metilacije.

• Metilacijo katalizira encim

fibrilarin.

• snoRNP vsebuje še tri strukturne

proteine.

• Ponavadi deluje samo en del

snoRNA.

Struktura C/D snoRNPs

DOI: 10.1002/wrna.117

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/wrna.117/full#fig4

H/ACA box snoRNA

• Usmerjajo pretvorbo uridina v

pseudouridin.

• Imajo strukturo dveh povezanih

lasnic.

• Ena lasnica ali obe lasnici imata

notranjo zanko, ki se ji reče

pseudouridilacijski žep.

• snoRNA tvori dva kratka

dupleksa (3-10nt) s tračno RNA.

Vmes je prosti uridin, ki se

pretvori v pseudouridin.

• Reakcijo katalizira pseudouridin

sintaza – diskerin.

• snoRNP vsebuje še tri strukturne

proteine.

DOI: 10.1002/wrna.117

Struktura H/ACA snoRNPs

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/wrna.117/full#fig4

Strukture malih nukleolarnih RNA (snoRNA) in

njihove interakcije z rRNA

• Sekundarne strukture človeških snoRNA (U3, U8, U13, U14, U16, and

U17) in iz kvasovke (snR10)

• Alternativna struktura U8 snoRNA in

njeno parjenje z rRNA na 5’ koncu.

• Ohranjene regije so prikazane z belo

na črni podlagi, pre‐rRNA so v sivem. Regije za metilacijo in

pseudouridilacijo rRNA so prikazane

z rdečo, tarčni nukleotid je prikazan s

črno in regija za dodatno parjenje v

svetlo modri barvi. Z vijolično so

prikazane regije na rRNA, pomembne

za njeno procesiranje in/ali zvijanje.

DOI: 10.1002/wrna.117

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/wrna.117/full#fig4

Parjenje snoRNA s človeško 18S

ribosomalno RNA

• Prkazana je sekundarna struktura

človeške 18S rRNA.

• Metilacija kanonične regije C/D

snoRNA povzroči interakcije z

18S rRNA (rdeče) in dodatne

interakcije (svetlo modra). Siva

črta povezuje regije ene snoRNA.

• Z vijolično so prikazane

interakcije, ki pomagajo pri pre-

rRNA procesiranju in rRNA

zvijanju.

• U?? Prikazuje metilacijska mesta,

kjer snoRNA še ni identificirana.

DOI: 10.1002/wrna.117

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/wrna.117/full#fig4

Dyskeratosis congenita • Dyskeratosis congenita (DKC) je redka progresivna dedna

bolezen, ki je podobna prezgodnjemu staranju (progeria).

• Sesalski H/ACA ribonukleoprotein ima 4 podenote: diskerin, Gar1,

Nop10 in Nhp2. Mutacije v Nop10, Nhp2 in diskerinu vodijo v

simptome, podobne z DKC.

Možgansko specifične snoRNA

• Majhna skupina snoRNA se izraža samo v možganih.

• Ta skupina nima vloge/tarč pri modifikaciji rRNA/snRNA.

• Kaj je vloga teh snoRNA?

• Kaj so tarče teh snoRNA?

• Ali lahko modificirajo mRNA?

Izražanje (A) MBI‐36, (B) MBII‐48, (C) MBII‐52 in (D) MBII‐85 v možganih odraslih mišk

Rogelj et al., European Journal of Neuroscience 2003

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1460-9568.2003.03026.x/full#f1

Dizajn poskusa, s katerim smo ugotavljali uravnavanje

izražanja snoRNA med učenjem pogojnega refleksa

Rogelj et al., European Journal of Neuroscience 2003

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1460-9568.2003.03026.x/full#f1

Izražanje MBII‐48 se zamnjša in MBII‐52 se poveča v začetnih stadijih tvorbe spomina

Rogelj et al., European Journal of Neuroscience 2003

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1460-9568.2003.03026.x/full#f1

Novo okolje ali šok ne vplivata na izražanje

MBII‐48 in MBII‐52.

Rogelj et al., European Journal of Neuroscience 2003

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1460-9568.2003.03026.x/full#f1

Vpliv snoRNA HBII-52 na RNA procesiranje

Rogelj et al., European Journal of Neuroscience 2003

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1460-9568.2003.03026.x/full#f1

Izražanje 5‐HT2C receptorja v mišjem hipokampusu med učenjem pogojnega refleksa

Rogelj et al., European Journal of Neuroscience 2003

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1460-9568.2003.03026.x/full#f1

scaRNA

• So strukturno in funkcijsko podobne snoRNA, vendar namesto

pri rRNA sodelujejo pri modifikacijah spliceosomnih snRNA.

• Modifikacija snRNA poteka v Cajalovih telescih v jedru.

• Vsaj 25 scaRNA.

• V večini primerov so v intronih in se prepisujejo z RNA pol II.

lncRNA

• Več tisoč različno dolgi ncRNA

• Neke so protismileni transkripti, ki običajno ne gredo skozi

proces izrezovanja in spajanja in ki regulirajo smislene

transkripte.

• Nekatere se procesirajo identično kot mRNA, vendar ne nosijo

zapisa za protein. Nekatere imajo zapise za snoRNA ali piRNA.

• Vloga večin lncRNA ni znana.

• Pri nekaterih je znao, da so tkivno specifične ter da so

pomembne pri uravnavanju izražanja genov.

• Pri analizi vezave lncRNA na komplekse, ki modificirajo

kromatin, jih je bilo odkritih 3.300.

• Neke lncRNA sodelujejo pri uravnavanju imprintinga (Npr. H19)

• Analiza izražanja štirih HOX klastrov je ugotovila 39 HOX genov

in 231 lncRNA. Večina deluje v cis. HOTAIR deluje v trans.

• Najbolj hitro evolucija se dogaja pri lncRNA, ki se izražajo v

človeških možganih.

LncRNA pri inaktivaciji

kromosoma X

A. Xist se prepiše z mesta Xic na

neaktivnem kromosomu X. Xist

pokrije cel kromosom. Z

epigenetskimi modifikacijami

histonov in DNA pride do utišanja

genov.

B. Xic regija in lncRNA, ki so tam

kodirani.

C. Pri inaktivacij kromosoma X (XCI)

nastanejo interakcije Xist z

nekaterimi proteini.

BACE1-AS

• BACE1-AS se nahaja na 11q23.3, kjer je v smisleni smeri zapis

za BACE1

• Povečano izražanje BACE1-AS pri Alzheimerjevi bolezni.

• BACE1-AS poveča stabilnost BACE1 mRNA.

• Posredno povečuje koncentracijo beta amiloida – glavnega

konstituenta senilnih plakov.

• Povečano izražanje BACE1-AS je opaženo tudi pri APP

transgenih miškah, kar pomeni, da beta amiloid s povratno

zanko vpliva na BACE1-AS

• Utišanje BACE1-AS zmanjša proizvodnjo amiloida in nalaganje

plakov.

BACE1in tvorba Aβ pri AD

• Uravnavanje izražanja in aktivnosti proteaze BACE1 vpliva na

proizvodnjo Aβ peptida.

• Lahko pride do tvorbe pozitivne povratne zanke, kjer povečanje

Aβ pri AD sproži povečanje izražanja BACE1, ki posledično še

bolj poveča proizvodnjo Aβ peptida.

St. George-Hyslop et al., Nature Medicine 2008

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1460-9568.2003.03026.x/full#f1

Literatura

• Strachan and Read

• Bratkovič, CMLS 2011

• Chen, WIREs RNA 2010

• Lee, Science 2012

• Rogelj, EJN 2003