Embed Size (px)
Citation preview
Pregled predavanja
• Nekodirajoče RNA
• piRNA
• Endo-siRNA
• snRNA
• snoRNA
• scaRNA
• lncRNA
Raznolikost RNA
Znane ncRNA
??? ncRNA
piRNA
• Najdemo jih v zarodnih celicah pri sesalcih.
• Velikost: 24-31 nt
• Vloga pri omejevanju transpozicije retrotranspozonov pri
zarodnih celicah.
– Pomembno, ker integracija transpozonov v nove lokacije lahko moti
pri izražanju genov in vodi v genetske bolezni ali raka.
• Pri nekaterih organizmih lahko uravnavajo izražanje drugi
genov.
• >15.000 odkritih piRNA – največja skupina ncRNA pri človeku
• piRNA se mapirajo na 89 genomskih intervalov, ki so dolgi 10-
75kb.
• Verjetno se izrežejo iz velikih multigenskih transkriptov.
• Pri človeku multi-piRNA transkripti vsebujejo več sto piRNA.
• piRNA ustavljajo transpozicijo po poti podobni RNAi.
• Vežejo se na PIWI proteine (podskupina družine Argonaut).
Utišanje transpozonov s
piRNA
A. Primarni piRNA izvirajo iz dolgih
prekurzorskih RNA, ki so prepisane s
piRNA regij. Transpozoni, ki so v
nasprotni orientaciji so vir protismiselnih
piRNA.
B. Protismiselni piRNA se vežejo na piwi
protein in usmerjajo rezanje smiselnega
transkripta transpozona. Drugi piwi
protein se veže na 3‘ produkt rezanja in
ga skrajša na velikost piRNA. Ta
sekundarni smiselni piRNA se uporabi
za tvorbo novih protismiselnih piRNA.
C. Protismiselne piRNA usmerijo piwi
komplekse v DNA metilacijo ali v
modifikacijo histonov.
endo-siRNA
• Eksogene siRNA so zelo pomembno orodje pri raziskavah
izražanja genov (Nobelova nagrada - Fire and Mello, 2006)
• Nedavno so odkrili, da v človeških celicah pride do naravne
sinteze endogenih siRNA.
• Verjetno jih je več 10.000 različnih.
• Nastanejo z rezanjem dvoverižnih RNA v celici.
• Dvoverižne RNA lahko nastajajo na račun prepisovanja
psevdogenov.
Psevdogeni uravnavajo izražanje
starševskih genov z endo-siRNA • Psevdogeni nastajajo s kopiranjem
starševskih genov. Nekateri
psevdogeni se prepisujejo v
protismisleni smeri.
• Protismiselna RNA se veže na
starševsko mRNA – tvori se
dvovijačna RNA, ki jo razreže Dicer.
• Endo-siRNA nastane tudi iz
podvojenega obrnjenega zaporedja
(npr. psevdogena)
• Transkripcija skozi obrnjeno
zaporedje tvori transkript z obrnjeno
ponovitvijo, ki tvori daljšo lasnico
• Dicer prepozna dvoverižni del lasnice
in izreže ven siRNA.
• V obeh primerih se endo-siRNA
vežeta v RISC in utišata izražanje oz.
razgradita starševsko mRNA
snRNA
• Devet človeških snRNA
• Dolga so 106-186 nt.
• Na vsako se veže sedem osnovnih proteinov (Sm ali Lsm
skupine)
• U1, U2, U4, U5 in U6 so sestavni del glavnega spliceosoma
(GU-AG)
• U4atac, U6atac, U11 in U12 delujejo v stranskem spliceosomu
(AU-AC).
• Na U6 in U6atac se vežejo proteini Lsm skupine. Ostali snRNA
vežejo proteine Sm skupine.
• Več kot 70 genov nosi zapise za snRNA glavnega spliceosoma
– 44 za U6 snRNA
– 16 za U1 snRNA
A. Sm tip snRNA vsebuje tri pomembne
elemente.
1. 5’ trimetilgvanozinsko kapo
2. Vezavno mesto za SM proteine
3. 3’ strukturo stebra in zanke.
Sm mesto in steber z zanko sta
prepoznavna mesta za SMN kompleks.
Sm mesto določa vezavo sedmih ključnih
proteinov.
Kapa in ključni proteini so pomembni za
vnos snRNP v jedro.
B. Lsm tip snRNA ima 5’ monometilfosfat
gvanozinsko kapo, 3’ stebro in zanko ter 3’
terminalno zaporedje uridinov nakatero se
vežejo sedem Lsm proteinov.
Struktura snRNA
snRNA, ki niso v spliceosomu
• U1 in U2 imata tudi vloge izven spliceosoma
– U1 sodeluje pri spodbujanju transkripcije z RNA pol II
– U2 sodeluje pri spodbujanju elongacije z RNA pol II
• Primeri snRNA, ki ne sodelujejo v spliceosomu:
– U7 snRNA. Dolga je 63 nt in sodeluje pri procesiranju 3’ koncev
histonske mRNA. Histonske mRNA nimajo poli(A) repa.
– 7SK RNA. Dolga je 331 nt. Deluje kot inhibitor P-TEFb (elongacijski
faktor RNA pol II)
– Družina Y RNA. Trije člani dolgi manj kot 100 nt. Delujejo pri
replikacij kromosomske DNA in regulaciji razmnoževanja celic.
snoRNA
• Dolge 60-300 nt.
• Prvotno odkrite v nukleolusu, kjer usmerjajo modifikacije na
rRNA.
• Tvorijo kratke duplekse s tarčnim mestom na rRNA.
• Dve podskupini C/D box in H/ACA box.
• Pri človeku je odkritih 340. Verjetno jih je precej več.
• Večina je v intronih.
• Nekateri imajo več kopij (HBII-52 ima 45 kopij, HBII-85 ima 29
kopij).
• Nekateri so v skupini. Npr. SNURF-SNRPN transkripcijska
enota ima šest različnih snoRNA (vključno z HBII-52 in HBII-85).
• Nekatere snoRNA so tkivno specifične npr. SNURF-SNRPN
skupina je v možganih.
• Nekatere nimajo tarč na rRNA. HBII-52 uravnava 5-HT2C
receptor.
• HBII-85 je povezana s Prader-Willy sindromom.
Box C/D snoRNA
• Usmerjajo 2’-O-metilacijo.
• 5’ in 3’ konca ob regijah C in D
tvorita kratko steblo.
• C’ in D’ (zeleno) sta interni kopiji
C in D.
• snoRNA se prilega na tarčo, s
katero tvorita 10-21nt dolgo
dvojno vijačnico.
• Na nukleotidu tarče, ki je
nasproti 5. nukleotidu pred D ali
D’, pride do metilacije.
• Metilacijo katalizira encim
fibrilarin.
• snoRNP vsebuje še tri strukturne
proteine.
• Ponavadi deluje samo en del
snoRNA.
Struktura C/D snoRNPs
DOI: 10.1002/wrna.117
H/ACA box snoRNA
• Usmerjajo pretvorbo uridina v
pseudouridin.
• Imajo strukturo dveh povezanih
lasnic.
• Ena lasnica ali obe lasnici imata
notranjo zanko, ki se ji reče
pseudouridilacijski žep.
• snoRNA tvori dva kratka
dupleksa (3-10nt) s tračno RNA.
Vmes je prosti uridin, ki se
pretvori v pseudouridin.
• Reakcijo katalizira pseudouridin
sintaza – diskerin.
• snoRNP vsebuje še tri strukturne
proteine.
DOI: 10.1002/wrna.117
Struktura H/ACA snoRNPs
Strukture malih nukleolarnih RNA (snoRNA) in
njihove interakcije z rRNA
• Sekundarne strukture človeških
snoRNA (U3, U8, U13, U14, U16, and
U17) in iz kvasovke (snR10)
• Alternativna struktura U8 snoRNA in
njeno parjenje z rRNA na 5’ koncu.
• Ohranjene regije so prikazane z belo
na črni podlagi, pre‐rRNA so v sivem.
Regije za metilacijo in
pseudouridilacijo rRNA so prikazane
z rdečo, tarčni nukleotid je prikazan s
črno in regija za dodatno parjenje v
svetlo modri barvi. Z vijolično so
prikazane regije na rRNA, pomembne
za njeno procesiranje in/ali zvijanje.
DOI: 10.1002/wrna.117
Parjenje snoRNA s človeško 18S
ribosomalno RNA
• Prkazana je sekundarna struktura
človeške 18S rRNA.
• Metilacija kanonične regije C/D
snoRNA povzroči interakcije z
18S rRNA (rdeče) in dodatne
interakcije (svetlo modra). Siva
črta povezuje regije ene snoRNA.
• Z vijolično so prikazane
interakcije, ki pomagajo pri pre-
rRNA procesiranju in rRNA
zvijanju.
• U?? Prikazuje metilacijska mesta,
kjer snoRNA še ni identificirana.
DOI: 10.1002/wrna.117
Dyskeratosis congenita • Dyskeratosis congenita (DKC) je redka progresivna dedna
bolezen, ki je podobna prezgodnjemu staranju (progeria).
• Sesalski H/ACA ribonukleoprotein ima 4 podenote: diskerin, Gar1,
Nop10 in Nhp2. Mutacije v Nop10, Nhp2 in diskerinu vodijo v
simptome, podobne z DKC.
Možgansko specifične snoRNA
• Majhna skupina snoRNA se izraža samo v možganih.
• Ta skupina nima vloge/tarč pri modifikaciji rRNA/snRNA.
• Kaj je vloga teh snoRNA?
• Kaj so tarče teh snoRNA?
• Ali lahko modificirajo mRNA?
Izražanje (A) MBI‐36, (B) MBII‐48, (C) MBII‐52 in
(D) MBII‐85 v možganih odraslih mišk
Rogelj et al., European Journal of Neuroscience 2003
Dizajn poskusa, s katerim smo ugotavljali uravnavanje
izražanja snoRNA med učenjem pogojnega refleksa
Rogelj et al., European Journal of Neuroscience 2003
Izražanje MBII‐48 se zamnjša in MBII‐52 se
poveča v začetnih stadijih tvorbe spomina
Rogelj et al., European Journal of Neuroscience 2003
Novo okolje ali šok ne vplivata na izražanje
MBII‐48 in MBII‐52.
Rogelj et al., European Journal of Neuroscience 2003
Vpliv snoRNA HBII-52 na RNA procesiranje
Rogelj et al., European Journal of Neuroscience 2003
Izražanje 5‐HT2C receptorja v mišjem hipokampusu med učenjem pogojnega refleksa
Rogelj et al., European Journal of Neuroscience 2003
scaRNA
• So strukturno in funkcijsko podobne snoRNA, vendar namesto
pri rRNA sodelujejo pri modifikacijah spliceosomnih snRNA.
• Modifikacija snRNA poteka v Cajalovih telescih v jedru.
• Vsaj 25 scaRNA.
• V večini primerov so v intronih in se prepisujejo z RNA pol II.
lncRNA
• Več tisoč različno dolgi ncRNA
• Neke so protismileni transkripti, ki običajno ne gredo skozi
proces izrezovanja in spajanja in ki regulirajo smislene
transkripte.
• Nekatere se procesirajo identično kot mRNA, vendar ne nosijo
zapisa za protein. Nekatere imajo zapise za snoRNA ali piRNA.
• Vloga večin lncRNA ni znana.
• Pri nekaterih je znao, da so tkivno specifične ter da so
pomembne pri uravnavanju izražanja genov.
• Pri analizi vezave lncRNA na komplekse, ki modificirajo
kromatin, jih je bilo odkritih 3.300.
• Neke lncRNA sodelujejo pri uravnavanju imprintinga (Npr. H19)
• Analiza izražanja štirih HOX klastrov je ugotovila 39 HOX genov
in 231 lncRNA. Večina deluje v cis. HOTAIR deluje v trans.
• Najbolj hitro evolucija se dogaja pri lncRNA, ki se izražajo v
človeških možganih.
LncRNA pri inaktivaciji
kromosoma X
A. Xist se prepiše z mesta Xic na
neaktivnem kromosomu X. Xist
pokrije cel kromosom. Z
epigenetskimi modifikacijami
histonov in DNA pride do utišanja
genov.
B. Xic regija in lncRNA, ki so tam
kodirani.
C. Pri inaktivacij kromosoma X (XCI)
nastanejo interakcije Xist z
nekaterimi proteini.
BACE1-AS
• BACE1-AS se nahaja na 11q23.3, kjer je v smisleni smeri zapis
za BACE1
• Povečano izražanje BACE1-AS pri Alzheimerjevi bolezni.
• BACE1-AS poveča stabilnost BACE1 mRNA.
• Posredno povečuje koncentracijo beta amiloida – glavnega
konstituenta senilnih plakov.
• Povečano izražanje BACE1-AS je opaženo tudi pri APP
transgenih miškah, kar pomeni, da beta amiloid s povratno
zanko vpliva na BACE1-AS
• Utišanje BACE1-AS zmanjša proizvodnjo amiloida in nalaganje
plakov.
BACE1in tvorba Aβ pri AD
• Uravnavanje izražanja in aktivnosti proteaze BACE1 vpliva na
proizvodnjo Aβ peptida.
• Lahko pride do tvorbe pozitivne povratne zanke, kjer povečanje
Aβ pri AD sproži povečanje izražanja BACE1, ki posledično še
bolj poveča proizvodnjo Aβ peptida.
St. George-Hyslop et al., Nature Medicine 2008
Literatura
• Strachan and Read
• Bratkovič, CMLS 2011
• Chen, WIREs RNA 2010
• Lee, Science 2012
• Rogelj, EJN 2003
