Biomol jjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjj

5/20/2018 Biomol jjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjj

1/4

GAMBAR EKSPERIMENTAL 9-28 Beberapa protein eukariotik dapat diproduksi dalam sel E. coli dari

vektor plasmid yang mengandung promotor lac. (A) Ekspresi plasmid vektor berisi fragmen dari

kromosom E. coli yang mengandung promotor lac dan gen lacZ tetangga . Dalam kehadiran IPTG

analog laktosa, RNA polimerase mentranskripsi biasanya gen lacZ, memproduksi lacZ mRNA, yang

diterjemahkan ke dalam protein yang dikode,-Galaktosidase. (B) Gen lacZ dapat dipotong dari

vektor ekspresi dengan enzim restriksi dan digantikan oleh cDNA kloning, dalam hal ini satu

encoding granulosit colony-stimulating factor (G-CSF). Ketika plasmid yang dihasilkan

ditransformasikan ke dalam sel E. coli, penambahan IPTG dan transkripsi berikutnya dari promotor

lac menghasilkan G-CSF mRNA, yang diterjemahkan ke dalam protein G-CSF

dimasukkannya promotor, urutan DNA yang transkripsi cDNA dapat dimulai. Perhatikan, misalnya,

sistem yang relatif sederhana untuk mengekspresikan G-CSF yang ditunjukkan pada Gambar 9-28.

Dalam hal ini, G-CSF dinyatakan dalam E. coli yang ditransformasi dengan vektor plasmid yang

mengandung promotor lac berdekatan dengan kloning cDNA yang mengkode G-CSF. Transkripsi dari

lacpromoter terjadi pada tingkat tinggi hanya ketika laktosa, atau analog laktosa seperti

isopropylthiogalactoside (IPTG), ditambahkan ke dalam media kultur. Jumlah yang lebih besar dari

protein yang diinginkan dapat diproduksi dalam lebih rumit E. coli sistem ekspresi

Untuk membantu dalam pemurnian protein eukariotik diproduksi dalam sistem ekspresi E.coli,

peneliti sering memodifikasi cDNA yang mengkode protein rekombinan untuk memfasilitasi

pemisahan dari endogen protein E. coli. Sebuah modifikasi yang umum digunakan jenis ini adalah

dengan menambahkan urutan nukleotida pendek ke ujung cDNA, sehingga protein menyatakan akan

memiliki enam residu histidin di C-terminus. Protein dimodifikasi dengan cara mengikat erat matriks

afinitas yang berisi atom nikel chelated, sedangkan sebagian besar protein E. coli tidak akan

mengikat matriks tersebut. Protein yang terikat dapat dilepaskan dari atom nikel dengan

mengurangi pH dari medium sekitarnya. Dalam kebanyakan kasus, prosedur ini menghasilkan

protein rekombinan murni yang fungsional, karena penambahan sekuens asam amino pendek ke

salah satu C-terminus atau N-terminus protein biasanya tidak mengganggu aktivitas biokimia

protein.

Plasmid Ekspresi Vektor Bisa Dirancang untuk Penggunaan di Sel Hewan

Salah satu kelemahan dari sistem ekspresi bakteri adalah bahwa banyak proteineukariotik mengalami berbagai modifikasi (misalnya, glikosilasi, hidroksilasi) setelahsintesis mereka pada ribosom (Bab 3). Ini modifikasi pasca-translasi umumnyadiperlukan untuk fungsi sel protein yang normal, tetapi mereka tidak dapatdiperkenalkan oleh sel E. coli, yang tidak memiliki enzim yang diperlukan. Untukmenyiasati keterbatasan ini, gen kloning diperkenalkan ke dalam sel hewanberbudaya, proses yang disebut transfeksi. Dua metode umum untuk transfecting selhewan berbeda dalam apakah DNA vektor rekombinan adalah atau tidak terintegrasike dalam DNA genom sel inang.Dalam kedua metode, sel-sel hewan berbudaya harus diperlakukan untuk memfasilitasi penyerapanawal mereka dari vektor plasmid rekombinan. Hal ini dapat dilakukan dengan mengekspos sel untuk

persiapan lipid yang menembus membran plasma, meningkatkan permeabilitas terhadap DNA. Atau,menundukkan sel sengatan listrik singkat beberapa ribu volt, teknik yang dikenal sebagaielektroporasi, membuat mereka secara transien permeabel terhadap DNA. Biasanya DNA plasmid


2/4

ditambahkan dalam konsentrasi yang cukup untuk memastikan bahwa sebagian besar dari sel-selberbudaya akan menerima setidaknya satu salinan dari DNA plasmid.

GAMBAR EKSPERIMENTAL 9 - 29Transient dan transfeksi stabil dengan vektor plasmid dirancang

khusus memungkinkan ekspresi gen kloning pada sel hewan berbudaya. Kedua metode

menggunakan vektor plasmid yang mengandung unsur - biasa ORI , penanda dipilih ( misalnya ,AMPR ) , dan polylinker - bahwa penjalaran izin di E. coli dan penyisipan cDNA kloning dengan hewan

promotor yang berdekatan . Untuk mempermudah , elemen-elemen ini tidak digambarkan . ( a)

Dalam transfeksi transien , vektor plasmid berisi asal replikasi untuk virus yang dapat bereplikasi

dalam sel-sel hewan berbudaya . Karena vektor tidak dimasukkan ke dalam genom sel kultur ,

produksi cDNA dikodekan protein terus hanya untuk waktu yang terbatas . ( b ) Dalam transfeksi

stabil , vektor membawa penanda dipilih seperti r neo , yang memberikan resistensi terhadap G -

418 . Relatif sedikit sel-sel hewan transfected yang mengintegrasikan DNA eksogen ke dalam genom

mereka dipilih pada medium yang mengandung G - 418 . Ini secara stabil transfected , atau diubah ,

sel akan terus memproduksi protein cDNA - dikodekan asalkan budaya dipertahankan . Lihat teks

untuk diskusi .

Media Transient paling sederhana dari dua metode ekspresi, yang disebut transfeksi transien,

mempekerjakan vektor mirip dengan vektor shuttle ragi dijelaskan sebelumnya. Untuk digunakan

dalam sel mamalia, vektor plasmid direkayasa juga untuk membawa asal replikasi berasal dari virus

yang menginfeksi sel mamalia, promotor yang kuat diakui oleh mamalia RNA polimerase, dan cDNA

kloning pengkodean protein yang akan diungkapkan berdekatan dengan promotor ( Gambar 9-29a).

Setelah seperti vektor plasmid memasuki sel mamalia, asal virus replikasi memungkinkan untuk

mereplikasi efisien, menghasilkan banyak plasmid dari mana protein diungkapkan. Namun, selama

pembelahan sel plasmid tersebut tidak setia dipisahkan menjadi dua sel anak dan dalam waktu

sebagian besar dari sel-sel dalam suatu budaya tidak akan mengandung plasmid, maka nama

transien transfeksi.

Transfection Stabil ( Transformasi ): Jika vektor diperkenalkan terintegrasi ke dalam genom sel inang

, genom secara permanen diubah dan sel dikatakan berubah . Integrasi yang paling mungkin dicapai

oleh enzim mamalia yang berfungsi secara normal dalam perbaikan DNA dan rekombinasi . Karena

integrasi adalah peristiwa langka , vektor ekspresi plasmid dirancang untuk mengubah sel-sel hewan

harus membawa penanda dipilih dalam rangka untuk mengidentifikasi sebagian kecil dari sel-sel

yang mengintegrasikan DNA plasmid . umum digunakan penanda dipilih adalah gen untukphosphotransferase neomycin ( ditunjuk neo r ) , yang memberikan resistensi terhadap senyawa

beracun kimia yang berkaitan dengan neomycin dikenal sebagai G - 418 . Prosedur dasar untuk

mengekspresikan cDNA dikloning oleh transfectionis stabil diuraikan dalam Gambar 9 - 29b . Hanya

sel-sel yang telah terintegrasi vektor ekspresi ke dalam kromosom inang akan bertahan dan

menimbulkan clone dengan adanya konsentrasi tinggi G - 418 . Karena integrasi terjadi di lokasi acak

dalam genom , klon berubah individu resisten terhadap G - 418 akan berbeda dalam tarif mereka

menyalin disisipkan cDNA . Oleh karena itu, transfectants stabil biasanya disaring untuk

mengidentifikasi orang-orang yang menghasilkan protein bunga pada tingkat tertinggi .

Epitop Tagging Selain penggunaannya dalam memproduksi protein yang diubah setelah terjemahan,vektor ekspresi eukariotik menyediakan cara mudah untuk mempelajari lokalisasi intraseluler


3/4

protein eukariotik. Dalam metode ini, cDNA kloning dimodifikasi dengan menggabungkan ke urutan

DNA pendek pengkodean urutan asam amino dikenal dengan antibodi monoklonal. Seperti peptida

pendek yang terikat oleh antibodi disebut epitop, maka metode ini dikenal sebagai epitop tagging.

Setelah transfeksi dengan plasmid vektor ekspresi yang mengandung menyatu cDNA, bentuk

epitope-tag yang dinyatakan protein dapat dideteksi dengan imunofluoresensi pelabelan sel dengan

antibodi monoklonal spesifik untuk epitop tersebut. Gambar 9-30 menggambarkan penggunaan

metode ini untuk melokalisasi protein adaptor AP1, yang berpartisipasi dalam pembentukan clathrin

dilapisi vesikel yang terlibat dalam perdagangan protein intraseluler (Bab 17). Epitop penandaan

protein sehingga terdeteksi dengan antibodi monoklonal yang tersedia menyingkirkan tugas yang

memakan waktu memproduksi antibodi monoklonal baru khusus untuk protein alami.


4/4

Ringkasan

G-CSF dinyatakan dalam E. coli yang ditransformasi dengan vektor plasmid yang mengandung

promotor lac berdekatan dengan kloning cDNA yang mengkode G-CSF. Transkripsi dari lacpromoter

terjadi pada tingkat tinggi hanya ketika laktosa, atau analog laktosa seperti isopropylthiogalactoside(IPTG), ditambahkan ke dalam media kultur. Jumlah yang lebih besar dari protein yang diinginkan

dapat diproduksi dalam lebih rumit sistem ekspresi E. coli.

Sebuah modifikasi yang umum digunakan jenis ini adalah dengan menambahkan urutan nukleotida

pendek ke ujung cDNA, sehingga protein menyatakan akan memiliki enam residu histidin di C-

terminus. Protein dimodifikasi dengan cara mengikat erat matriks afinitas yang berisi atom nikel

chelated, sedangkan sebagian besar protein E. coli tidak akan mengikat matriks tersebut.

Plasmid Ekspresi Vektor Bisa Dirancang untuk Penggunaan di Sel Hewan

Salah satu kelemahan dari sistem ekspresi bakteri adalah bahwa banyak protein eukariotik

mengalami berbagai modifikasi (misalnya, glikosilasi, hidroksilasi) setelah sintesis mereka

pada ribosom. Untuk menyiasati keterbatasan ini, gen kloning diperkenalkan ke dalam sel hewan

berbudaya, proses yang disebut transfeksi. Dua metode umum untuk transfecting sel hewan

berbeda dalam DNA vektor rekombinan atau tidak terintegrasi ke dalam DNA genom sel inang.

Dalam kedua metode, sel-sel hewan berbudaya harus diperlakukan untuk memfasilitasi penyerapan

awal mereka dari vektor plasmid rekombinan. Hal ini dapat dilakukan dengan mengekspos sel untuk

persiapan lipid yang menembus membran plasma, meningkatkan permeabilitas terhadap DNA. Atau,

menundukkan sel sengatan listrik singkat beberapa ribu volt, teknik yang dikenal sebagai

elektroporasi, membuat mereka secara transien permeabel terhadap DNA.

Media Transient paling sederhana dari dua metode ekspresi, yang disebut transfeksi transien,

mempekerjakan vektor mirip dengan vektor shuttle ragi dijelaskan sebelumnya. Untuk digunakandalam sel mamalia, vektor plasmid direkayasa juga untuk membawa asal replikasi berasal dari virus

yang menginfeksi sel mamalia, promotor yang kuat diakui oleh mamalia RNA polimerase, dan cDNA

kloning pengkodean protein yang akan diungkapkan berdekatan dengan promotor.

Transfection Stabil ( Transformasi ): Jika vektor diperkenalkan terintegrasi ke dalam genom sel inang

, genom secara permanen diubah dan sel dikatakan berubah . Integrasi yang paling mungkin dicapai

oleh enzim mamalia yang berfungsi secara normal dalam perbaikan DNA dan rekombinasi .penanda

yang umum digunakan adalah gen untuk phosphotransferase neomycin ( ditunjuk neo r ) , yang

memberikan resistensi terhadap senyawa beracun kimia yang berkaitan dengan neomycin dikenal

sebagai G - 418 .

Epitop penandaan memfasilitasi lokalisasi selular protein yang diungkapkan dari kloning genes. cDNA

kloning pengkodean satu subunit dari protein adaptor AP1 telah diubah dengan penambahan urutan

pengkodean epitop untuk antibodi monoklonal . Vektor ekspresi plasmid dibangun untuk

mengandung epitop - tagged AP1 cDNA

Documents

Biomol jjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjjj