Universidade Federal de São CarlosCentro de Ciências Agrárias - Campus de Araras

DBV – Departamento de Biotecnologia Vegetal

Splincing Alternativo na Geração Variabilidade

Curso: Biotecnologia

Professor: Ane Hackbart de Medeiros

Disciplina: Biologia Molecular

André Ohara RA: 314501

Kaidu Barrosa RA: 314463

Lucas Fachine Dato RA: 314439

Paulo Moisés R. Alexandrino RA: 314463

Araras, 30 de outubro de 2009.

Índice

Introdução...................................................................................................................................3

Identificação de Splicing Alternativo.......................................................................................5

Função do splicing alternativo e regulação............................................................................6

Splicing alternativo e variabilidade..........................................................................................7

Splicing Alternativo e Diversidade Proteômica............................................................................9

Células ciliadas.........................................................................................................................9

Drosophila................................................................................................................................9

Formação de sinapses..............................................................................................................9

Em plantas..............................................................................................................................10

Splicing Alternativo e Evolução..................................................................................................12

Noise em Splicings......................................................................................................................13

Conclusão...................................................................................................................................17

Glossário....................................................................................................................................18

Referências Bibliográficas:.........................................................................................................19

2

Introdução

Após a transcrição, o pré-mRNA sofre “splicing”, ou seja, remoção dos

introns, através de um grande complexo de proteínas e RNA designado por

spliceossomo. Este complexo reconhece sequências consenso, locais de

splice, localizadas nas extremidades dos exons e introns e une os exons

removendo os introns. Entretanto um gene pode originar diversas proteínas

funcionalmente diferentes, por um processo chamado splicing alternativo, já

que existem diversas formas de retirar os introns do pré RNAm, resultando em

mais de um RNA maduro por gene. Não necessariamente o processo ocorre

em relação aos introns, mas também baseia-se na possibilidade de retirada de

exons ou parte deles (Fardilha, da Cruz e Silva, & da Cruz e Silva, 2008).

Existem basicamente três tipos de splicing alternativo mas que podem ser

subdivididos e originarem cinco (Fardilha, da Cruz e Silva, & da Cruz e Silva,

2008):

1 Inclusão alternativa de exon (também denominado “exon skipping”,

“cassete exon”): no qual um ou mais exons podem ser excluídos junto

com os introns flanqueantes, resultando em transcritos alternativos mais

curtos ( Sakabe, 2006).

2 Sítio de splice alternativo (5’ou 3’): engloba os eventos de splicing

alternativo que envolvem junções exon/intron diferentes daquelas

normalmente utilizadas, resultando em um encurtamento ou

alongamento do exon ( Sakabe, 2006).

3 Retenção de intron ( uso alternativo de intron): envolve os casos em

que um intron é mantido no transcrito final. Para estes casos, observa-se

duas populações de RNAm: uma que inclui um trecho de DNA genômico

flanqueado por “exons” (exon+intron+exon) nos RNAms maduros e outra

população na qual o mesmo trecho de DNA genômico é excisado como

um intron qualquer, sendo também flanqueado por exons (exon+exon)

(Sakabe, 2006).

3

A classificão em cinco classes feita por alguns autores ocorrem quando

subdividem a classificação 2 em dois grupos, sendo um referente à “isoforma

do exon” e o outro, à “isoforma do intron”. A classe faltante para a divisão em

cinco grupos provém da classificação do mutuamente exclusivo de exons como

outro grupo e não um caso específico de 1 ( Sakabe, 2006).

Um termo importante de ressalvar e frequentemente utilizada é “exon

constitutivo” que define exons que aparecem sempre da mesma forma no

RNAm maduro. A utilização do termo é flexível, pode se considerar constitutivo

aquele exon que é sempre incluído mesmo que sofra aumento ou diminuição

de seu tamanho pelo uso de sítios de splice alternativo, por exemplo ( Sakabe,

2006).

Nos últimos anos tem sido realizado um número grande de trabalhos

envolvendo splicing alternativo por isso existe uma literatura que abrange

desde a frequência do fenômeno em diversos organismos, seu possível

impacto funcional, até as formas de regulação e sua relação com a evolução

(Sakabe, 2006). O objetivo do trabalho é focar na relação entre splicing

alternativo gerando variabilidade tanto fenotípica quanto genética e, a partir

disso, uma possível relação com aspectos da evolução.

4

Identificação de Splicing Alternativo

A identificação da ocorrência de splicing alternativo, resumidamente,

ocorre pela determinação das sequências dos transcritos, o armazenamento

em formato digital, alinhamento das sequências com o genoma e assim

consegue-se além de identificar a ocorrência do splicing alternativo reconhecer

exons, introns e sítios de splice ( Sakabe, 2006).

O transcriptoma é o conjunto de transcritos gerados a partir de um

genoma. Os avanços moleculares permitiram seqüenciamento de milhares de

sequências expressas (cDNAs), lembrando que essas sequências podem ser

parciais e originarem os ESTs (Expressed Sequence Tags) ou completas, os

RNAms. As sequências dos transcritos obtidas são armazenadas em formato

digital e posteriormente utilizadas como fonte de evidências do fenômeno

(Sakabe, 2006).

Com o sequênciamento de genomas inteiros como de humanos e

camundongos entre outros, permitiu-se o alinhamento das sequências

expressas e a identificação de qual gene cada transcrito provém. É esse

alinhamento que permite identificar os introns, os exons e os sítios de splice,

este último por programas específicos de bioinformática. Os clusters de cDNA

são grupos que surgiram pela sobreposição dos alinhamentos e então, um

agrupamento indireto gene a gene de cDNAs. Esse agrupamento indireto se dá

pela comparação das coordenadas, utilizando-se critérios de sobreposição

mínimos para considerar duas sequências como parte de um mesmo gene. Ou

seja, um cluster é a coleção conhecida de transcritos parciais e completos de

um dado gene ( Sakabe, 2006).

Dentro de cada grupo de transcritos de um gene é então possível

identificar eventos de splicing alternativo buscando-se sequências que

apresentem certas diferenças. Por exemplo, um evento de inclusão alternativa

de exons pode ser detectada ao se encontrar um par de cDNAs alinhados em

que haja ausência de um exon em uma sequência e a presença do mesmo em

outra. De forma similar, um evento de retenção de introns é evidenciado pela

5

presença de um segmento em um cDNA entre dois exons que em outra

sequência esteja ausente. Por isso, os cDNAs ou transcritos conhecidos de um

gene são também denominados evidências de splicing alternativo ( Sakabe,

2006).

Como o tamanho do cluster representa o número de transcritos

produzidos por um gene, há uma certa relação deste valor com o nível de

expressão gênica. Com base na idéia de que características conservadas entre

organismos estão sob pressão seletiva e são portanto indicativos de função

biológica, a comparação de características biológicas entre organismos é

extremamente útil e recebe o nome de Genômica Comparativa ( Sakabe,

2006).

Função do splicing alternativo e regulação

Pelo menos duas funções podem ser observadas:

Alteração da estrutura das proteínas codificadas ( Sakabe, 2006).

Regulação dos níveis dos transcritos produzidos ( através da

inserção de códon de parada prematuro ou através da alteração da

estabilidade do RNAm) ( Sakabe, 2006).

A inserção ou deleção de partes da proteína por eventos de splicing

alternativo pode gerar mudanças na sua estrutura, nas propriedades de

ligação, na atividade enzimática, localização celular, estabilidade, carga e

modificações pós-traducionais. Além disso, uma simples inserção de um códon

de parada na região codificadora pode resultar em proteínas mais curtas, com

funções diferentes das isoformas completas ( Sakabe, 2006).

Ao analisar o possível impacto no potencial codificador do transcrito

nota-se que o splicing alternativo é um mecanismo importante na geração de

variabilidade protéica. Especula-se até que essas modificações poderiam

alterar o repertório de proteínas expressas a tal ponto de expandir o proteoma

de um dado organismo. No entanto, o impacto do fenômeno de splicing

alternativo poderia afetar desigualmente as proteínas ( freqüências distintas),

6

ocorrendo preferencialmente em grupos funcionais específicos onde a

variabilidade é crucial. Por exemplo, observou-se uma alta taxa do processo

em receptores com funções no sistema imune e no nervoso, já enzimas

estariam menos sujeitas ao fenômeno. Vale lembrar ainda que em alguns

tecidos não nota-se diferença quanto a freqüência de ocorrência do processo

(Sakabe, 2006).

Em relação ao splicing, há evidências de que ele ocorre junto com a

transcrição, mas não compulsoriamente. O splicing alternativo está fortemente

acoplado à iniciação da transcrição ( escolha alternativa de promotores) e à

taxa de transcrição. Ou seja, nota-se que diferentes isoformas são geradas

dependendo do promotor utilizado para transcrever o gene ou da taxa de

transcrição ( Sakabe, 2006).

Os mecanismos de regulação do processo de splicing alternativo estão

envolvidos com diversos fatores, como o promotor, a taxa de transcrição,

elementos cis e trans, entre outros. As quatro classes de elementos em cis

( ESEs, ISEs, ESSs, ISSs) possuem um importante papel na regulação do

splicing e na geração de formas de RNAm alternativo, já que sua presença ou

ausência pode levar à remoção de exons inteiros, ao reconhecimento de sítios

de splice alternativo ou até à retenção de introns no RNAm maduro ( Sakabe,

2006).

Outro fator de influência é a força dos sítios de splice, quando mais

fracos ( menos conservados) estão associados a ocorrência de splicing

alternativo; quando mais fortes ( mais conservados) menor é a freqüência de

remoção ou retenção ( Sakabe, 2006).

Splicing alternativo e variabilidade

O processo de splicing alternativo explica a diversidade existente entre

organismos com um conjunto de genes semelhates, além de permitir que

diferentes tipos de tecidos tenham diferentes funções com base nos mesmos

genes, já que basta eles serem editados de formas diferentes para produzir

proteínas diferentes (Fardilha, da Cruz e Silva, & da Cruz e Silva, 2008). O

7

processo explica tanto a maior diversidade protéica em mamíferos como

também está envolvido em vários processos fisiológicos complexos como, por

exemplo, a determinação de sexo em Drosophilas, reconhecimento do som,

entre outros ( Sakabe, 2006). Portanto, a prevalência do splicing alternativo

aumenta com a complexidade do organismo. Evidenciando isso, tem-se que

mais de 60% dos genes humanos sofrem o processo enquanto que na

levedura, Saccharomyces cereviseae, nunca foi descrito (Fardilha, da Cruz e

Silva, & da Cruz e Silva, 2008).

Embora seja tentador tomar a ausência de splicing alternativo em

leveduras como uma evidencia da direcionalidade da evolução do fenômeno, já

que este é abundante em mamíferos, é possível que esses organismos, os

menos complexos, tenham sofrido um processo de perda de variabilidade por

razões de “economia”, já que seria mais interessante uma menor variabilidade

em favorecimento do racionamento energético. Ou seja, por serem organismos

de crescimento rápido onde erros são menos tolerados, a ocorrência de

splicing alternativo pode ter sido selecionada negativamente, já que é um

processo que poda gerar proteínas não funcionais ( Sakabe, 2006).

As variantes de uma proteína produzida por splicing alternativo, podem

ser específicas de um determinado órgão ou tipo celular, sendo assim, tornam-

se alvos terapêuticos ideais para o desenvolvimento de novos fármacos.

Portanto, as novas drogas não afetariam mecanismos semelhantes em outros

tecidos que envolvem as outras isoformas dessa proteína (Fardilha, da Cruz e

Silva, & da Cruz e Silva, 2008). Outro ponto importante é que o splicing

alternativo coloca em cheque a premissa do Dogma Central da Biologia

Molecular, o qual diz que um gene leva à uma enzima. Frente a essa

variabilidade, a frase deveria ser um gene, varias enzimas, ou melhor ainda,

um gene podendo gerar diversas proteínas ( Sakabe, 2006).

Outro ponto relevante é o paradoxo do Valor C, no qual é observado a

controvérsia entre o tamanho do genoma e número de genes dos organismos,

variando essa razão em função do organismo observado. Caso ele seja

considerado mais complexo esperava-se um número maior de gene mas isso

não é sempre observado, por exemplo, em um nematóide observa-se 19,500

genes, no milho, 40,000 e no genoma humano que se esperava 100,000 antes

8

do seqüenciamento completo, observou-se 30,000 genes (Fardilha, da Cruz e

Silva, & da Cruz e Silva, 2008). Essa discrepância entre o tamanho do genoma

e do proteoma é explicado pelo mecanismo do splicing alternativo.

Splicing Alternativo e Diversidade Proteômica

Células ciliadas A percepção dos sons pela audição ocorre devido à habilidade do ouvido

interno de detectar uma série notável de freqüências sonoras. A cóclea (porção do

ouvido interno) possui terminações nervosas compostas de células ciliadas individuais

organizadas em quatro fileiras ao longo de sua membrana basal. Cada uma destas

células é ajustada para responder a uma única e estreita faixa de freqüência de som,

desta forma irá existir um gradiente tonotópico no comprimento da membrana basilar

(Gravely, 2001)

A diferença de tons detectada pelas células ciliadas é mediada, em partes, pelo

splicing alternativo realizado nos transcritos do gene SLO, ativador do canal

cálcio/potássio. Desta maneira, algumas proteínas codificadas pelo gene SLO são

analisadas para demonstrar suas propriedades fisiológicas. Por exemplo, os

transcritos do gene SLO que possuem o STREX EXON sintetizam proteínas

responsáveis por desativar lentamente o fluxo cinético do canal de sódio/potássio,

aumentando a sensibilidade pelo cálcio. Contudo, as seqüências que não possuem o

STREX EXON sintetizam outra forma de proteína, capaz de desativar rapidamente o

fluxo cinético no canal e diminuir a sensibilidade pelo cálcio. Infelizmente, pouco se

sabe sobre como o splicing alternativo regula a transcrição do gene SLO (Gravely,

2001)

DrosophilaA determinação do sexo em Drosophila ocorre devido a um sistema de splicing

alternativo em cascata envolvendo os transcritos de vários genes (Sxl, tra, tra-2 e dsx).

Sendo assim, a presença dos cromossomos X da fêmea irão induzir o splicing

alternativo do gene Slx, desta forma este splicing no macho é inativo. O produto do

gene Slx irá induzir o splicing do gene tra e tra-2, estes genes produzirão proteínas

9

que direcionarão a inclusão de um exon 4 produzindo uma variação do gene dsx que

especificará o fenótipo feminino (Herbert & Rich, 1999) (Boue, Letunic, & Bork, 2003)

Formação de sinapsesAs neuroxinas são a família das proteínas nervosas presentes nos vertebrados

que possuem função importante como receptoras de neuropeptídios (neuropeptídeos

são substâncias químicas produzidas e liberadas pelas células cerebrais e outras) e

junção de moléculas que participam da origem de sinapses. A observação de múltiplos

cDNAs de ratos e vacas revelou que mais de 1000 neuroxinas diferentes poderiam ser

potencialmente sintetizadas por três genes devido ao splicing alternativo. As proteínas

codificadas por esses splicing alternativos são especificas para cada tipo de ligante,

por exemplo, sabe-se que a interação entre β neuroxina presente nas células pré-

sinapticas e as neuroliginas presentes nas células pós sinápticas é suficiente para a

formação de sinapse. Importante ressaltar que esta interação ocorre apenas se a β

neuroxina é codificada por um RNAm que não possui o exon 20 – proteínas

sintetizadas de transcritos contendo o exon 20 não interagem com as neuroliginas.

Apesar de a função exata das β neuroliginas que possuem o exon 20 não ser

conhecida, pode-se especular que os dois tipos de proteínas podem determinar a

formação ou a quebra de sinapses nervosas. Desta forma, o splicing alternativo dos

transcritos da neuroxina pode ter influencia direta na formação e manutenção de

sinapses, sendo assim a elucidação de como o splicing da neuroxina é regulado

promove um significativo avanço nas pesquisas sobre o sistema nervoso dos

vertebrados (Gravely, 2001)

Em plantas

Antes, o splicing alternativo era dado como menos relevante para as

plantas em comparação com os eucariotos superiores. Contudo, novos estudos

baseadas em análises computacionais em Arabidopsis thaliana provaram

diferente: a partir de livrarias de cDNAs e ESTs, mapeando um gene que

produzia uma sequencia de mRNA diferente da esperada (evidência de splicing

alternativo), estimou-se que dos 27.170 locus codificantes, 1267 sofrem

splicing alternativo gerando 2678 proteínas. (Kazan, 2003)

10

Apesar da aparente pequena proporção, apenas 5% de todo os genes

sofrerem o splicing alternativo, acredita-se que tal valor é subestimado devido a

falta de informação disponível referente a ESTs e cDNAs, que possuem

apenas metade do total de genes da Arabidopsis. (Kazan, 2003)

Traçando um paralelo com o genoma humano, a maioria dos genes

identificados na planta que realizam splicing alternativo estão, assim como no

homem, relacionados com genes regulatórios e, muito possivelmente, a genes

relacionados com respostas a estresses. Alguns exemplos recentes foram duas

isoformas produzidas pelo gene SOS4(salt overly sensitive 4) da Arabidopsis

regulados pelo estresse de sal e o OsIM da Oryza sativa que produz sob

estresse oxidativo uma oxidase e, sob estresse salino, uma oxidase alternativa.

(Kazan, 2003)

Perspectivas futuras, para melhor aprofundar o conhecimento sobre

plantas, é necessário maior disponibilidade de informações sobre sequencias

genômicas, cDNAs e ESTs. Em curto prazo, contudo, há uma abordagem que

permitiria a melhor análise de splicing alternativo em vegetais: uma técnica

utilizada em leveduras seria adaptada para a Arabidopsis, que envolveria chips

de DNA e micro-array que identificariam RNA em tecidos específicos nos

diferentes estágios de desenvolvimento a procura de splicing alternativo.

(Kazan, 2003)

Os resultados adquiridos referente à Arabidopsis foram baseados em

análises computacionais, quase nenhuma ainda foi verificada e comprovada

experimentalmente. Algumas abordagens que poderiam identificar o processo

seriam a superexpressão ou silenciamento do gene em plantas transgênicas e,

posteriormente, analisar seu fenótipo. As diferenças de característica entre

organismos seriam atribuídas ao gene/splicing alternativo modificado. (Kazan,

2003)

11

Tabela 1. Exemplos recentes de genes de plantas que possuie splicing alternativo por estresse abimental. Fonte: (Kazan, 2003)

Splicing Alternativo e Evolução

A complexidade do ser humano em relação às outras espécies, costuma ser

associada ao genoma. Contudo, inesperadamente, um pequeno número de genes,

revelados pelo seqüenciamento do genoma humano codificam as proteínas

responsáveis pelo complexo funcionamento da maquinaria humana (Boue, Letunic, &

Bork, 2003)

Desta forma o splicing alternativo é considerado um evento que aumenta a

diversidade protéica, sendo um mecanismo capaz de aumentar a complexidade nos

organismos (Boue, Letunic, & Bork, 2003)

Para evidenciar a afirmação acima, utiliza-se de comparações entre a

conservação do splicing alternativo entre duas espécies, neste caso humano e rato.

Para tanto analisou-se o splicing alternativo em genes ortólogos de ambas as

12

espécies. Genes ortólogos são genes que codificam proteínas correspondentes em

diferentes organismos (Boue, Letunic, & Bork, 2003)

Uma análise comparativa de 117 genes homólogos de humanos e ratos,

mostrou que 95% destes genes possuem o mesmo número de exons. Além disso, o

comprimento dos exons correspondentes é fortemente conservado (idêntico em 73%

dos casos), no entanto o comprimento dos introns varia consideravelmente (a maioria

dos introns humanos são 1,5 vezes maior que os introns de ratos). Desta forma, diante

da similaridade entre o conteúdo genético de ambos os indivíduos analisados, o

splicing alternativo explicaria o ganho de complexidade (Boue, Letunic, & Bork, 2003)

Para demonstrar o papel do splicing alternativo, deve-se primeiro distinguir

exons alternativos de exons constitutivos. Exons constitutivos, como já foi definido, são

encontrados em todos os transcritos de um gene, enquanto que os exons alternativos

estão ausentes em pelo menos um transcrito que seja longo o bastante para contê-lo

(Boue, Letunic, & Bork, 2003)

Analisando 9.434 genes ortólogos de humanos e ratos verificou-se que os

exons apresentam alto grau de similaridade (87% idênticos). Esta analise introduz uma

diferenciação dentro dos exons alternativos: “forma majoritária” do exon alternativo se

o exon aparece em pelo menos 50% dos transcritos e "forma minoritária” se o exon

aparece em menos de 50% dos transcritos. Na comparação dos exons de humanos e

ratos ocorre conservação de 98% de exons constitutivos, bem como a conservação de

98% dos exons alternativos de forma majoritária. Entretanto as formas minoritárias dos

exons alternativos são menos conservadas (apenas 25%). Estas formas estão ligadas

a perdas ou ganhos de exons que contribuem para a evolução das espécies (Boue,

Letunic, & Bork, 2003)

Desta forma, alguns conceitos anteriormente considerados absolutos como a

mutação de um gene originando um novo fenótipo e este podendo ser ou não

selecionado pelo meio causando a especiação e posteriormente a seleção, podem ser

explicados com maior profundidade com a biologia molecular, sendo que a

modificação de apenas uma parte do gene (perda ou ganho de exon) pode produzir

proteínas díspares originando fenótipos distintos o que contribui para a origem de

complexidade e evolução (Boue, Letunic, & Bork, 2003)

Noise em Splicings

13

O evento de splicing alternativo, como estimado, pode gerar dezenas de

centenas a dezenas milhares de diferentes RNAm que, por sua vez, produzirá

inúmeras proteínas isoformes. Contudo, não é possível aferir quantas das

diversas variações de RNAm e proteínas serão utilizadas no organismo, ou

seja, contribuirão para fenótipos. A produção de proteínas defeituosas ou não

funcionais a partir de splicing alternativo é chamado de noise no sistema.

(Gravely, 2001)

A maioria dos erros de splicing documentadas são causadas por

mutações no DNA genômico que destroem pontos de sinalização de splicing ou

criam um novo. Especula-se que mutações também podem ocorrer no RNAm

pré-maturo, criando ou destruindo sítios de splice durante a transcrição,

gerando erros de splicing. Outra causa poderia ser a mutação em proteínas

regulatórias do splicing ou seus locais específicos de associação. Em todos os

casos, o maquinário protéico responsável, o spliceossomo, não é inteiramente

culpado pelos erros. Na verdade, não há pesquisas que indicam tal fato.

(Gravely, 2001)

Assim como outros complexos protéicos, como RNA e DNA polimerase,

acredita-se que ela possua uma taxa de erro. Considerando o spliceossomo

com uma fidelidade de ação semelhante ao do ribossomo, que comete um erro

a cada 10 000 códons e levando em consideração que cada gene humano

possui 10 introns, ocorreria a falha de um a cada 1000 transcritos (Gravely,

2001). Contudo, tais dados apresentandos na pesquisa de Brenton R.

Gravely, do Department of Genetics and Developmental Biology, da University

of Connecticut, são um tanto quanto especulativos. Um diferente estudo foi

realizado por Eugene Melamud e John Moult, no Center for Advanced

Research in Biotechnology, University of Maryland Biotechnology Institute, para

tentar analisar e quantificar os casos de “stochastic noise”, termo para quando

o splicing alternativo produz uma proteína não funcional ao acaso, ou seja, não

influenciada por outros fatores (Melamud & Moult, 2009)

O trabalho fez algumas observações sobre a hipótese levantada sobre o

“noisy splicing” : o número de proteínas isoformes, ou seja, proteínas

provenientes de splicings alternativos teria relação com o nível de expressão

do gene e o número de introns existentes no gene. Estimou-se 1 a 10 % de

14

erro dependendo dos fatores citados anteriormente. A hipótese foi testada

através da simulação e amostragem experimental de transcritos de uma

biblioteca virtual de cDNA. (Melamud & Moult, 2009)

Apesar da baixa frequência de erros, quando ocorre uma falha no

sistema de splicing alternativo, o material transcrito erroneamente pode ser

degradado ou traduzido em proteína. Na maioria dos casos a proteína, devido

a sua mal conformação, não possuiria uma função portanto não afetaria a

célula. Contudo, se o RNAm for correspondente a uma característica

dominante, os efeitos podem ser alarmantes. Por tal fato é conveniente a célula

possuir uma frequência baixíssima de erro. (Gravely, 2001)

Para evitar a tradução de proteínas prejudiciais ao organismo, a célula

possui um mecanismo de segurança que monitora os RNAm recém

sintetizados procurando por códons de términos precoces, que quando

identificados, degrada o RNAm defeituoso. Casos de erros de splicing podem

gerar os códons de terminação, seja com a inclusão errônea de um exon ou a

falta de eliminação de um íntron que contenham o códon de terminação,

encaminhando o RNAm para a degradação pelo sistema de segurança celular.

(Gravely, 2001)

Devido à gigantesca capacidade de produzir diferentes proteínas a partir

de um mesmo gene, ainda não existe pesquisas ou métodos de estudos

eficientes para identificar ou diferenciar tantos casos de noise em splicing,

quando um splicing gera uma proteína funcional ou não. (Gravely, 2001)

Uma maneira realizada para analisar um splicing alternativo real ou

noise foi a comparação do evento entre espécies relacionadas. Uma sequência

do material genético referente a um exon não funcional muito provavelmente

não seria selecionado pela pressão ambiental e possivelmente não estaria

presente em um indivíduo de uma outra espécie, desaparecendo em meio a

evolução e seleção. Contudo, uma sequência que produzisse um exon

funcional e relevante – produzisse um fenótipo de fato – muito provavelmente

estaria presente no material genético de outro organismo da outra espécie.

Estudos foram conduzidos comparando o verme C. elegans com o C. briggsae

revelando uma certa sequência de introns entre um exon específico

conservada em ambas as espécies. (Gravely, 2001)

15

Pretende-se fazer estudos semelhantes entre o homem e o rato, assim

que o seqüenciamento do genoma do animal esteja completo. Ainda sim, deve-

se ressaltar que exons alternativos que não foram conservados entre a

evolução de espécies não necessariamente seriam desprovidos de relevância

– poderia indicar apenas uma evolução diferente, mais recente, uma vez que

mutações de um único nucletídeo (SNP) pode criar novos pontos de splicing,

potencialmente gerando um novo exon alternativo. (Gravely, 2001)

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Conclusão

O splicing alternativo mostrou-se de mister importância para a

compreensão celular, genética e fisiológica do indivíduo: gera a grande

variabilidade proteomica que explica o paradoxo do valor C ; a vasta gama de

diferentes proteínas e fenótipos decorrentes do evento, sob ação da pressão

ambiental seletiva, é a chave para a evolução do indivíduo que,

consequentemente, leva a diferenciação em espécies.

A compreensão do splicing alternativo proporcionaria o entendimento de

diversas funções fisiológicas de diversos organismos, o que poderia trazer

incontáveis vantagens e benefícios ao homem. Para tal, é necessário investir

em pesquisas de sequenciament genético e ampliar as informações disponíveis

dos organismos estudados referente ao seu cDNAs e ESTs, principais bases

de dados para estudos do splicing alternativo. Adaptações de técnicas já

existentes para estudos de caso também são viáveis.

Os estudos de splicing alternativo mostraram-se tão impactantes a ponto

de interpretar diferentemente o dogma central da biologia: um gene através da

transcrição e splicing alternativo produziria diferentes transcritos, logo,

diferentes proteínas.

17

Glossário

cDNA: Molécula similar ao DNA, porém esta é sintetizada no laboratório. Sua

síntese é realizada pela transcriptase reversa, uma enzima de origem viral que tem a capacidade de produzir uma molécula de DNA dupla fita a partir da cópia de uma molécula de RNA.

ESE: Exonic Splicing Enhancer

ESS: Exonic Splicing Silencer

ESTs: Seqüências curtas de DNA geradas a partir do seqüenciamento

aleatório de uma biblioteca de cDNA

Genes Homólogos: Sequências de DNA com similaridade atribuída

devido à descendência de um ancestral comum

Genes Ortólogos: Genes que codificam proteínas correspondentes em

diferentes organismos.

ISE: Intronic Splicing Enhancer

Isoformas ou Variantes de RNA: Proteínas muito similares capazes

de desempenharem as mesmas funções das originais já que diferenças discretas nas sequências de aminoácidos geram diferentes propriedades estruturais e funcionais.

ISS: Intronic Splicing Silencer

18

Referências Bibliográficas:

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