1

Replikasi DNAPurely translated and interpretated from Lehninger Biochemistry 4 th edition 1. Inisiasi

a. Inisiasi Area Origin of ReplicationTahap ini adalah pengenalan titik awal replikasi DNA yang disebut Origin of Replication

oleh ARS (Autonomously Replicating Sequences/Sekuens Replikasi Otonom)b. Pembentukan Replication Fork

Untuk dapat melakukan sintesis double-strand DNA (dsDNA), maka enzim Helikase akan memisahkan parent-strand (dsDNA) menjadi 2 untai terpisah dengan menggunakan energi dari ATP. Pemisahan ini akan memberi tekanan topologi pada struktur helix DNA, oleh karena itu tekanan ini akan diperingan oleh enzim Topoisomerase. Untai yang telah terpisah lalu distabilkan oleh Single Strand Binding Proteins (SSBs). Enzim Helikase tadi memulai pembuatan Replication Fork pada daerah Origin of Replication. Bila SSBs dan DNA Gyrase (enzim Topoisomerase II) sudah menempel pada untai maka pemisahan untai oleh enzim Helikase dapat dilakukan dengan cepat. Fungsi SSBs selain untuk menstabilkan DNA, juga berfungsi untuk mencegah renaturasi saat enzim Gyrase/Topoisomerase II memperingan tekanan topologi pada helix yang dihasilkan saat pemisahan untai oleh enzim Helikase. Pengaturan waktu/timing inisiasi ini dipengaruhi oleh metilasi DNA.

Sebelum enzim DNA Polimerase dapat melakukan sintesis pada DNA template, primer (RNA Primer) harus sudah menempel terlebih dahulu pada template (primer = segmen pendek dari RNA yang disintesis oleh enzim Primase sehingga dapat disebut juga RNA Primer). Setelah itu Primase akan di buang dan diganti dengan DNA oleh enzim DNA Polimerase I. Pergantian Primase oleh DNA ini akan menyisakan segmen pendek berupa ikatan Fosfodiester yang rusak, lalu segmen pendek ini akan ditambal oleh enzim Ligase.

2. ElongasiPada tahap ini terdapat Leading/Forward Strand dan Lagging/Retrograde Strand sebagai

hasil pembentukan Replication Fork. Sintesis pada Leading Strand berjalan dari arah 5’ ke 3’ (searah dengan pergerakan enzim Helikase dalam membuka Replication Fork yang dari ujung 5’ ke 3’ juga). Namun sintesis pada Lagging Strand justru berjalan terbalik, yaitu dari ujung 3’ ke ujung 5’.

Sintesis pada Leading Strand dimulai dengan sintesis oleh enzim Primase pada RNA Primer sepanjang 10-60 nukleotida pada sekuens Origin of Replication. Lalu DNA Polimerase III datang (menempel pada DNA template) sekaligus mendatangkan deoksinukleotida pada RNA Primer tersebut. Sintesis pada Lagging Strand hampir sama sampai pada tahap penambahan deoksinukleotida pada RNA Primer, namun sintesisnya putus-putus dan membentuk celah (celah = bagian yang tidak tersintesis pada Lagging Strand) yang disebut dengan Fragmen Okazaki.

Pada saat sintesis berlangsung, enzim Helikase (DnaB Helikase) dan enzim Primase (DnaG Primase) secara bersama-sama membentuk suatu replication complex yang disebut dengan Primosom. Primosom ini berperan untuk membantu sintesis untai DNA template oleh enzim DNA Polimerase III. DNA Polimerase III menggunakan salah satu subunit Primosom ini untuk mensintesis Leading Strand secara continue dan subunit-subunit lainnya berpindah dari satu Fragmen Okazaki ke Fragmen Okazaki lainnya pada Lagging Strand. Ketika sintesis pada Fragmen Okazaki telah selesai, maka inti subunit dari Primosom DNA Polimerase III akan dibuang

2

(dilepaskan) dari Beta-Sliding Clamp dan dari fragmen Okazaki yang baru. Keseluruhan kompleks yang bertanggung jawab pada koordinasi sintesis DNA pada Replication Fork yaitu Repliosome.

3. TerminasiTerminasi atau pengakhiran sintesis DNA template terjadi saat sintesis mulai memasuki

sekuens Terminus dengan cara menyambungkan Replication Fork dari satu arah, lalu enzim Topoisomerase II atau DNA Topoisomerase tipe IV mulai memisahkan 2 double helix yang baru terbentuk (satu double helix baru terdiri dari 1 untai DNA baru dan 1 DNA template/parent-strand DNA/single-strand DNA/ssDNA) dan masih saling menyatu pada saat sintesis. Kemudian Fragmen Okazaki yang terbentuk saat sintesis Lagging Strand akan ditambal oleh enzim Ligase, sehingga setelah proses elongasi selesai, maka pada Leading Strand dan Lagging Strand akan terbentuk suatu untai DNA baru.

Reverse Transcription (Version 1)Purely translated and interpretated from Lehninger Biochemistry 4 th edition Reverse Transcription mengkatalisis 3 jenis reaksi berbeda :1. RNA-dependent DNA synthesis2. RNA degradation3. DNA-dependent DNA synthesisRNA-dependent DNA synthesis serta DNA-dependent DNA synthesis menggunakan sisi aktif yang berbeda dengan RNA degradation pada protein.Reverse Transcriptase menggunakan Kofaktor ion Zn2+. Salah satu jenis enzim Reverse Transcriptase adalah enzim RNA Polimerase yang tidak mempunyai proofreading eksonuklease dari ujung 3’ ke 5’.

Mekanisme apoptosis diatur oleh mitokondriaMitokondrial DNA hanya mengandung 37 gen sajaMutasi tidak hanya dapat terjadi pada DNA di dalam nukleus saja, namun juga pada DNA di dalam mitokondria. Bila hal ini terjadi maka regulasi energi akan terganggu, dan organ-organ penting yang butuh energi besar seperti otak, jantung, dan otot akan mengalami gangguan, bahkan kerusakan, dengan kata lain kerusakan pada DNA mitokondria akan berpengaruh langsung terhadap pertumbuhan dan perkembangan seseorang. Mutasi pada DNA mitokondria ini tidak diturunkan (not inherited) pada sel sperma karena akrosomnya hanya mengandung nukleus, sedangkan mutasi DNA mitokondria ini diturunkan (inherited) pada Sel Ovum. Mekanisme repair DNA pada mitokondria berjalan sangat lambat dibandingkan DNA pada nukleus, sehingga kemungkinan mutasi pada mitokondria menyebabkan kanker menjadi sangat besar dan cepat.Promoter adalah sekuens tertentu pada DNA yang diperlukan untuk mengaktifkan atau menonaktifkan sebuah gen. Proses inisiasi dimulai dari sekuens Promoter ini. Promoter biasanya ditemukan pada bagian awal dari sebuah gen, dan Promoter mempunyai

3

binding site yang digunakan oleh enzim dengan cara membentuk ikatan enzim-promoter untuk membuat sebuah molekul mRNA.Polimorfisme

DNA Fingerprinting adalah sebuah teknik laboratorium yang digunakan untuk membentuk sebuah hubungan/relasi antara bukti biologis dan tersangka dalam sebuah inverstigasi kasus kriminal. Sebuah sampel DNA diambilkasus kriminal lalu dibandingkan dengan sampel DNA dari tersangka. Bila kedua profil DNA sama maka bukti datang dari tersangka tersebut, namun bila tidak tentu tersangka tersebut bukan tidak dapat menjadi buktinya. DNA Fingerprinting juga digunakan untuk mencari asal-usul seorang ayah. Karyotype

Genome adalah set DNA lengkap dari sebuah organisme, termasuk seluruh dari gennya. Masing-masing genome mengandung semua informasi yang diperlukan untuk membangun dan memelihara hidup organisme tersebut. Pada manusia, sebuah copy

4

dari keseluruhan genome—lebih dari 3 triliun pasangan basa DNA—terdapat di dalam semua sel yang memiliki nukleus.RNA Interference (RNAi) adalah sebuah proses alamiah dimana sel membungkam aktivitas dari gen spesifik tertentu. RNAi bekerja dengan cara menghancurkan pembawa molekul yang membawa informasi yang dikode oleh gen untuk dalam proses sintesis protein. Pembawa molekul ini, disebut mRNA, melaksanakan fungsi yang sangat penting karena tanpa mRNA pada dasarnya sebuah gen adalah inaktif. Sesaat setelah memasuki sel, double-stranded RNA (jarang sekali ditemukan) akan memicu RNAi untuk dipotong menjadi fragmen-fragmen kecil oleh enzim yang disebut Dicer. Fragmen kecil tersebut kemudian berperan sebagai pemandu, mengarahkan mesin RNAi pada mRNA yang mencocokkan sekuens genetik dari fragmen-fragmen. RNAi tersebut kemudian memotong-motong mRNA ini, yang secara efektif menghancurkan semua informasi yang terkandung di dalamnnya dan mematikan gen-gen yang sesuai.

Dalam dunia medis RNAi digunakan untuk memblok atau menonaktifkan aktivitas dari sebuah atau beberapa gen tertentu dalam RNAi-based therapy. Kanker contohnya, yang sering disebabkan oleh overactivity dari sebuah atau beberapa gen, dapat diblok aktivitasnya oleh RNAi dalam terapi RNAi-based tersebut. Selain itu juga dapat dimanfaatkan untuk mematikan aktivitas gen utama dalam viral infections, karena mematikan aktivitas gen virus tersebut ternyata dapat menyembuhkan penyakit yang ditimbulkannya.http://www.nigms.nih.gov/News/Extras/RNAi/factsheet.htm

Epigenetik dan EpigenomikVersion 1

Modifikasi DNA yang tidak mengubah sekuens DNA dapat berpengaruh terhadap aktivitas gen. Senyawa kimia yang ditambahkan (modifikasi) pada sebuah gen dapat mengatur aktivitasnya; modifikasi ini disebut sebagai perubahan epigenetik. Epigenomik meliputi semua dari zat kimia yang ditambahkan ke dalam keseluruhan dari satu DNA (genome) sebagai sebuah cara untuk mengatur aktivitas ekspresi dari semua gen di dalam genome. Senyawa kimia dari epigenomik tersebut bukanlah bagian dari sekuens DNA namun “ditempelkan” pada DNA. Modifikasi epigenomik dapat tertinggal saat pembelahan sel dan diwariskan pada generasi berikutnya bila lolos dari proses reprogramming oleh sel tersebut. Pengaruh lingkungan, seperti pola makan dan ekspose terhadap polutan juga dapat berdampak pada epigenomik.

Perubahan epigenetik dapat membantu menentukan apakan gen-gen diaktifkan atau dinonaktifkan dan dapatkah berpengaruh pada produksi protein pada sel tersebut, untuk memastikan bahwa hanya protein yang diperlukan saja yang diproduksi, Misalnya, protein yang meningkatkan pertumbuhan tulang tentu tidak diproduksi di dalam sel otot. Pola modifikasi epigenomik berbeda satu individu dengan individu lainnya, berbeda antar jaringan dalam satu individu, bahkan pada tingkat sel.

5

Bentuk umum dari modifikasi epigenomik disebut sebagai metilasi DNA. Metilasi DNA melibatkan penempelan molekul kecil yang disebut gugus metil (CH3) pada segmen DNA. Ketika gugus metil ditempelkan pada sebuah gen tertentu, maka gen tersebut dinonaktifkan atau dibungkam sehingga tidak ada protein yang diproduksi dari gen tersebut.

Karena terjadi error dalam proses epigenetik, seperti modifikasi pada gen yang salah atau kegagalan dalam penambahan senyawa pada sebuah gen, dapat menyebabkan pada abnormalitas aktivitas gen atau kenonaktifan yang dapat berakibat pada terjadinya kelainan genetik. Kondisi seperti kanker, kelainan metabolisme dan kelainan degeneratif telah ditemukan berhubungan dengan error epigenetik.Version 2Mekanisme epigenetik (terutama pada modifikasi kromatin) : 1. Metilasi DNA

Metilasi ini terjadi pada ikatan kovalen atom karbon kelima pada DNA, terutama terjadi pada kompleks dinukleotida CpG islands.Reprogramming (demetilasi dan remetilasi) dari pola-pola metilasi ini terjadi selama 2 tahap perkembangan, yaitu pada tahap di sel-sel germinal dan pada tahap-tahap preimplantasi embrio, sehingga genome pada sel-sel sperma dan ovum mengandung lebih banyak metilasi dari gen-gen pada sel tubuh misalnya. Enzim yang bertanggung jawab pada proses metilasi DNA (metilasi dan demetilasi pada fase reprogramming) ini yaitu enzim De Novo Metil Transferase (DNMT)

2. Modifikasi HistonModifikasi Histon tepatnya terjadi pada N-terminal dari masing-masing histon yang terdapat pada oktamer inti nukleosom. Modifikasi histon ini meliputi metilasi, metilasi arginin, asetilasi, ubiquitinasi sumoylasi lisin, serta fosforilasi serin dan threonin. Di antara jenis-jenis modifikasi tersebut, yang berperan utama adalah metilasi dan asetilasi lisin karena memegang kunci sebagai penanda dari proses aktivasi transkripsional.

Version 3Pewarisan epigenetik merupakan teori yang melawan ide bahwa pewarisan

terjadi hanya melalui kode DNA dari parental kepada keturunannya. Artinya hal apapun yang dialami oleh parentalnya (berupa tanda epigenetik/epigenetic tags) dapat diturunkan pada generasi-generasi berikutnya.

Kebanyakan organisme kompleks berkembang dari spesialisasi sel reproduksi (ovum dan sperma). 2 jenis sel reproduksi ini bertemu, kemudian bertumbuh dan terbagi untuk membentuk setiap jenis sel dari organisme dewasa. Agar proses ini dapat terjadi, maka epigenomic tags tersebut harus dihapus melalui sebuah proses yang disebut reprogramming.

Reprogramming merupakan hal penting karena ovum dan sperma berkembang dari sel yang terspesialiasi dengan profil ekspresi gen yang stabil. Dengan kata lain, informasi genetiknya akan ditandai dengan epigenetic tags. Sebelum organisme baru

6

tersebut dapat tumbuh menjadi embrio yang sehat, maka epigenetic tags tersebut haruslah dihapus terlebih dahulu.

Pada saat tertentu selama perkembangan embrio, sel yang terspesialisasi tersebut akan menggerus genomenya dan menghapus epigenetic tags dalam rangka untuk mengembalikan sel menjadi sebuah “batu tulis kosong” genetis. Kemudian untuk sebuah gen minoritas, epigenetic tags akan membuatnya seperti ini melalui proses tersebut dan membiarkannya tidak berubah dari parental menuju keturunan-keturunan berikutnya.

7

GLOSSARYCopy Number Variation (CNV) adalah suatu keadaan dimana copy dari gen tertentu bervariasi dari satu individu ke individu lain. Sudah jelas bahwa gen tentu mengalami proses insersi dan delesi materi genetik. Sampai sejauh mana CNV berpengaruh terhadap proses terjadinya penyakit pada manusia sampai saat ini belum diketahui, namun sudah lama diketahui bahwa terjadinya kanker sebenarnya berkaitan dengan peningkatan jumlah copy dari gen-gen tertentu.(http://ghr.nlm.nih.gov/glossary=copynumbervariation)

Copy Number Variation (CNV) adalah sumber dari keberagaman genetik manusia. Bentuk-bentuk susunan CNV terjadi baik pada mekanisme rekombinasi dan replikasi DNA serta angka mutasi spesifik-lokus de novo terlihat sangat tinggi pada CNV jika dibandingkan dengan SNP. SNP memang dapat menyebabkan penyakit-penyakit kompleks, namun CNV juga menunjukkan variasi polimorfisme yang jinak dan tidak berbahaya. CNV, terutama pada duplikasi gen dan pengacakan ekson (coding sekuens) dapat menjadi mekanisme utama penggerak gen dan evolusi genome. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19715442CNV pada manusia sebesar 20% dari keseluruhan rantai DNA dan mempengaruhi gen pengkode protein, oleh karena itu CNV berpengaruh terutama pada coding sekuens dan cenderung mempengaruhi gen fungsional spesifik seperti respon terhadap lingkungan dan tidak mempengaruhi proses seluler dasar.http://icb.med.cornell.edu/faculty/demichelis/labSingle Nucleotide Polymorphisms (SNP) adalah perubahan satu basa pada sekuens DNA yang terjadi dalam sebuah proporsi yang signifikan (lebih dari 1%) dari sebuah populasi besar. Sebuah basa nukleotida dapat digantikan oleh apapun dari 3 jenis basa nukleotida lainnya. Misalnya, pada sekuens DNA TAGC, sebuah SNP terjadi bila basa G berubah menjadi C, sehingga sekuensnya menjadi TACC.

8

SNP tersebar pada genome manusia dan ditemukan baik pada sekuens coding (ekson) dan noncoding (intron). SNP dapat menyebabkan terjadinya pembungkaman ekspresi gen, efek laten, membahayakan, bahkan hingga tidak membahayakan sama sekali. SNP terjadi pada 1 per 1000 basa hingga 1 per 100-300 basa. Ini berarti bahwa mungkin ada jutaan SNP pada setiap genome manusia. Kebanyakan SNP terjadi sekuens noncoding/intron dan tidak mengubah gen-gen. Beberapa SNP bahkan memiliki fungsi penting. Jika SNP sering ditemukan dekat dengan sebuah gen tertentu maka SNP ini bertindak sebagai penanda untuk gen tersebut (terutama pada noncoding sekuens).

Contoh konkret : pada paru-paru perokok aktif terdapat zat prekarsinogen. Zat prekarsinogen ini dapat menjadi zat karsinogen yang sangat berbahaya bagi tubuh, namun mekanisme perubahan zat prekarsinogen menjadi karsinogen ini sangat tergantung dari protein hasil ekspresi SNP pada sekuens ekson. Bila yang dihasilkan dari sintesis protein adalah fast carcinogen-making protein, maka proses perubahan zat prekarsinogen menjadi zat karsinogen akan terjadi dengan sangat cepat dan hal ini sangat berbahaya bagi tubuh karena karsinogen tersebut menjadi larut air dan merusak struktur DNA sel dan dapat menimbulkan kanker. Namun bila yang dihasilkan oleh SNP adalah slow carcinogen-making protein, maka proses pengubahan zat prekarsinogen menjadi karsinogen akan berjalan dengan lambat dan meminimalisir dampak kerusakan DNA sel pulmo sehingga probabilitas terjadinya kanker akan menjadi kecil.

Ada juga ekspresi SNP yang menghasilkan enzim detoksifikasi zat karsinogen. Bila yang dihasilkan enzim fast detoxifying-carcinogen maka proses eliminasi zat karsinogen akan berlangsung dengan cepat, namun bila yang dihasilkan adalah enzim sluggish detoxifying-carcinogen maka proses eliminasinya akan berjalan dengan lamban dan mungkin akan tetap tersisa zat-zat karsinogen di dalam pulmo.http://www.cancer.gov/cancertopics/understandingcancer/geneticvariation/page13Jenis-jenis mutasi Gen :

9

10

11

Genomic ImprintingManusia mendapat warisan 2 copy pada gen mereka—satu dari ibunya dan satu lagi dari ayahnya. Biasanya kedua copy tersebut bersifat aktif di dalam sel. Namun begitu pada sejumlah kasus hanya satu dari 2 copy yang aktif dalam kondisi normal, dimana copy yang aktif bergantung pada asal-usul orangtuanya. Beberapa gen hanya aktif saat diwariskan dari ayahnya, beberapa lagi dari ibunya, sehingga fenomena ini disebut sebagai Genomic Imprinting. Genomic Imprinting terjadi pada satu dari 2 alel parental. Ekspresi dari imprinted gen (gen yang tercetak) tersebut diatur oleh elemen cis-acting pada imprinting control region (ICR). ICR adalah daerah yang mengandung banyak CpG islands dan termetilasi pada 1 dari 2 gamet parental serta membawa informasi genetik parental.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18985277

X-InactivationX-Inactivation adalah sebuah proses dimana manusia menstabilkan jumlah gen supaya seimbang antara dua kromosom X pada wanita. Karena pria hanya mempunyai 1 kromosom X dan wanita memiliki 2, maka potensi terjadinyaketidakseimbangan ekspresi akan makin besar, oleh karena itu pada wanita hal ini dicegah dengan cara menonaktifkan semua kecuali 1 kromosom X autosomal. X-inactivation ini berlangsung pada 3 tahap, yaitu inisiasi, spreading, dan maintenance. Proses inisiasi terjadi selama tahap perkembangan embrionik. Setiap kromosom X memiliki pusat inaktivasi, yang disebut Xic (X inactivation centre), berupa region-region tertentu pada kromosom. Kemudian jumlah Xic dalam satu kromosom dihitung, lalu 1 kromosom X dipilih secara acak untuk dipertahankan agar tetap utuh dan aktif sementara semua kromosom X lainnya dinonaktifkan. Fase spreading adalah fase mengecilkan ukuran dan menonaktifkan semua kromosom X kecuali 1 yang disisakan tadi. Sebuah gen bernama Xist mengatur proses spreading ini, dengan cara mengecilkan ukuran kromosom X dari kedua ujungnya ke arah tengah menuju sentromer. Setelah proses pengecilan selesai maka ukuran kromosom menjadi kompak dan disebut sebagai Barr Body. Setelah Barr Body terbentuk maka dilanjutkan dengan proses maintenance yang dipertahankan selama hidup menjadi dewasa. Bila terjadi pembelahan sel maka Barr Body juga akan ikut tereplikasi namun tetap dalam bentuk yang kompak dan inaktif tersebut.

DNA Rekombinan (Application Examples)

12