KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS

MEDICINOS FAKULTETAS

BIOCHEMIJOS KATEDRA

NAUJAUSI PASIEKIMAI

BALTYMŲ BIOSINTEZĖS SRITYJE

Mokslinė studija

Kaunas, 2007

TURINYS

1. PROGRAMOS APRAŠYMAS.

2. STUDIJŲ DALYKO „BALTYMŲ BIOSINTEZĖ“ PASKAITŲ KONSPEKTAI:

2. 1. Transliacijos proceso bendra charakteristika. Baltymų biosintezės stadijos.

2. 2. Ribosomos, jų sandara, funkcijos vietos.

2. 3. Transliacijos iniciacija.

2. 4. Polipeptidinių grandinių elongacija. Transliacijos terminacija.

2. 5. Baltymo biosintezės inhibitoriai. Antibiotikų poveikio baltymų sintezei mechanizmai.

3. TEORINĖ-PRAKTINĖ DALIS:

3. 1. Laboratorinių darbų aprašas:

3. 1. 1. Suminių transportinės RNR ir aminoacil-tRNR sintetazių preparatų

išskyrimas iš pelių kepenų ir jų aktyvumo nustatymas.

3. 1. 2. Transliacijos greičio ir lygio nustatymas. neląstelinėje baltymus

sintezuojančioje sistemoje iš pelių kepenų.

3. 1. 3. Baltymų analizė gel-filtracijos, elektroforezės poliakrilamidiniame gelyje

denatūruojančiomis sąlygomis ir imunoblotingo metodais.

3. 2. Studijų dalyko „Baltymų biosintezė“ seminarų temų konspektai:

3. 2. 1. Genetinio kodo bendros savybės ir iššifravimas.

3. 2. 2. Informacinės RNR (mRNR) savybės ir brendimas.

3. 2. 3. tRNR struktūra. Aminoacil-tRNR sintetazės. Aminorūgščių liekanų

akceptavimas (prijungimas) prie tRNR.

3. 2. 4. Potransliacinis baltymų paskirstymas ir modifikavimas.

4. METODINIS DALYKO PROGRAMOS APRŪPINIMAS.

4. 1. Studijoms rekomenduojama pagrindinė literatūra.

4. 2. Savarankiškam darbui rekomenduojama papildoma literatūra.

Biomedicinos mokslų srities

medicinos krypties

Baltymų biosintezės dalyko studijų programa

Medicinos fakulteto II kurso studentams

Modulis (dalykas) – MF/BCM/M-VO1 Biochemija

Studijų programa – Medicina

Dėsto padalinys – Biochemijos katedra

Studijų dalyko programos poreikis:

Aukštos kvalifikacijos medikai ir biologai turi išmanyti genų raiškos molekulinius

mechanizmus, suprasti kaip įvairūs veiksniai gali paveikti svarbiausią genetinės informacijos

realizavimo etapą ląstelėje – baltymų sintezės procesą ir kokios gali būti tų pokyčių pasekmės

organizmo funkcionavimui. Jie taip pat turi suprasti biocheminės, molekulinės biologijos,

biotechnologijos, medicininės genetikos, genų terapijos ir kitas taikomojo pobūdţio

problemas.

Studijų tikslai:

Išnagrinėti gyvybiškai svarbaus proceso – baltymų biosintezės funkcionavimo ypatumus tiek

ţmogaus ir gyvūnų, tiek ir bakterijų ląstelėse bei supaţindinti su šio proceso reguliavimo

būdais.

Studijų rezultatai: Įgytos žinios/mokėjimai/įgūdžiai Programos tikslas yra suteikti medicinos krypties studentams ţinias apie genų raiškos

molekulinius mechanizmus, supratimą kaip įvairūs veiksniai gali paveikti svarbiausią

genetinės informacijos realizavimo etapą ląstelėje – baltymų sintezės procesą ir kokios gali

būti tų pokyčių pasekmės organizmo funkcionavimui. Jie taip pat turi suprasti biocheminės,

molekulinės biologijos, biotechnologijos, medicininės genetikos, genų terapijos ir kitas

taikomojo pobūdţio problemas.

Įgyti gebėjimai Studentai įsisavins molekulinės biologijos tyrimo metodus ir, panaudojant gautas teorines

ţinias, sugebės juos pritaikyti ląstelių transliacijos sistemos tyrimuose.

Studijų apimtis:

Bendras akademinių valandų ir kreditų skaičius: 80 valandų – 2 KMU kreditai

Auditorinių valandų skaičius: 40 val.

Akademinių valandų paskirstymas:

Paskaitos 10 val.

Laboratoriniai darbai 18 val.

Seminarai 12 val.

Savarankiškas darbas 40 val.

Studijų turinys: Programoje aprašyti baltymų biosintezės aparato pagrindiniai komponentai, sudėtingo

daugiastadijinio baltymų biosintezės proceso molekulinis mechanizmas, šio proceso

specifiniai ypatumai prokariotams ir eukariotams, antibiotikų ir toksinų veikimai. Išanalizuoti

transliacijos mechanizmai ląstelėse normoje ir fagų bei virusų įtakoje. Aprašyti klasikiniai

baltymus sintezuojančios sistemos tyrimo eksperimentai.

Studijų metodai: paskaitos (10 val.), laboratoriniai darbai (18 val.), seminarai (12 val.),

studentų savarankiškas darbas (40 val.).

Paskaitos (10 val.)

Eil.

Nr. Paskaitos pavadinimas Trukmė

1. Pagrindinė molekulinės biologijos dogma.

DNR ir jos reikšmė baltymų sintezės procesui.

Transliacijos proceso bendra charakteristika. Baltymų

biosintezės stadijos.

Baltymų biosintezės svarbiausi komponentai.

2 val.

2. Ribosomos, jų sandara, funkcijos vietos. 2 val.

3. Transliacijos iniciacija. 2 val.

4. Polipeptidinių grandinių elongacija. Transliacijos terminacija. 2 val.

5. Baltymo biosintezės inhibitoriai.

Antibiotikų poveikio baltymų sintezei mechanizmai.

2 val.

TEORINĖ-PRAKTINĖ DALIS

Laboratoriniai darbai (18 val.)

Eil.

Nr. Laboratorinio darbo pavadinimas Trukmė

1. Suminių transportinės RNR ir aminoacil-tRNR sintetazių

preparatų išskyrimas iš pelių kepenų ir jų aktyvumo nustatymas.

6 val.

2. Transliacijos greičio ir lygio nustatymas neląstelinėje baltymus

sintezuojančioje sistemoje iš pelių kepenų.

6 val.

3. Baltymų analizė gel-filtracijos, elektroforezės

poliakrilamidiniame gelyje denatūruojančiomis sąlygomis ir

imunoblotingo metodais.

6 val.

Seminarai (12 val.)

Eil.

Nr. Seminaro temos pavadinimas Trukmė

1. Genetinio kodo bendros savybės ir iššifravimas. 3 val.

2. Informacinės RNR (mRNR) savybės ir brendimas. 3 val.

3. tRNR struktūra. Aminoacil-tRNR sintetazės.

Aminorūgščių liekanų akceptavimas (prijungimas) prie tRNR.

3 val.

4. Potransliacinis baltymų paskirstymas ir modifikavimas. 3 val.

SAVARANKIŠKAS DARBAS

Ruošdamiesi seminarams ir egzaminui studentai individualiai studijuoja nurodytą

literatūrą, originalius mokslinius straipsnius pagal nurodytas temas bei savarankiškai vykdo

naujos literatūros paiešką duomenų bazėse.

Studentų savarankiško darbo temos: 1. Baltymų biosintezės (transliacijos) ir ribosomų tyrimų istorija.

2. Bakterijų ir augalų toksinų poveikis baltymų biosintezei.

3. Eukariotų baltymų biosintezės potranskripcinė reguliacija.

4. Baltymai – pagrindinė organizmų struktūrinė ir funkcinė medţiaga.

5. Struktūriniai ribosomų pokyčiai.

6. Ribosomos ir augančio peptido sąveika su membrana.

7. Transliacijos tikslumas. Baltymų sintezės tikslumą apsprendţiantys faktoriai.

8. Baltymų biosintezės eukariotuose ir prokariotuose ypatybės. Baltymų degradavimas

ląstelėje. Baltymų degradavimo eukariotuose ir prokariotuose ypatybės.

9. Biologiškai neaktyvios tRNR molekulės, jų vaidmuo transliacijos reguliacijoje.

10. Eukariotų transliacijos aparato baltymų kompartmentalizacija poliribosomose.

11. Baltymų irimas ląstelėje.

Programą parengė: Dr. Ilona Sadauskienė, KMU Biochemijos katedros lektorė, darbo

telefonas: 302967, vietinis 1345, elektroninio pašto adresas: ilona_sad@med.kmu.lt

Studijų dalyko programos sandara Studijų kursą sudaro: paskaitos (12,5 proc.), laboratoriniai darbai (22,5 proc.), seminarai (15

proc.) ir savarankiškas darbas (50 proc.).

Įvertinimas Suminis balas. 100 proc. balo sudaro: 40 proc. auditorinio darbo + 20 proc. savarankiško

darbo + 40 proc. baigiamojo teorinio ir praktinio patikrinimo.

Studijų dalyko „Baltymų biosintezė“ paskaitų konspektai

1 paskaita

Transliacijos proceso bendra charakteristika.

Baltymų biosintezės stadijos (2 val.)

Genų raiška, kurios dalis yra ir baltymų sintezė – tai sudėtingų biocheminių procesų

visuma. Šiuose procesuose dalyvauja apie 300 biomolekulių. Kiekvienos iš šių molekulių

aktyvumo pakitimas gali vienaip ar kitaip pakeisti genetinės informacijos, uţkoduotos ląstelės

DNR, perdavimo tikslumą ir greitį. lemia visus ląstelės funkcijų aspektus, kontroliuoja visas

ląstelę sudarančias molekules. Todėl baltymų sintezėje dalyvaujančių makromolekulių

pakitimai gali atsispindėti ir atskirų organų funkcijoje, o tuo pačiu paveikti viso organizmo

gyvybinius procesus.

Pagrindinė molekulinės biologijos dogma (1 pav.) teigia, kad aminorūgščių seką

polipeptidinėje grandinėje lemia informacinės RNR (mRNR) struktūra, o šios molekulės

struktūrą koduoja universali genetinė medţiaga. Eukariotinėse ląstelėse – tai deoksiribo-

nukleorūgštis (DNR).

Baltymų sintezė vykdoma transliacijos (angl. translation – vertimas) metu – tai procesas,

kai DNR ir atitinkamos mRNR bazių seka pervedama į aminorūgščių, sujungtų į polipeptidinę

grandinę ir sudarančių pirminę baltymo struktūrą, seką. Pirminė baltymų seka savo ruoţtu

apsprendţia antrinę, tretinę struktūras ir galiausiai – baltymų funkciją. Baltymų sintezė (kaip

DNR bei RNR) apima tris stadijas: iniciaciją, elongaciją ir terminaciją. Kiekvienai

aminorūgščiai specifinis fermentas aminoacil-tRNR sintetazė aktyvina aminorūgštį,

prijungdamas ją prie atitinkamos tRNR molekulės. Kai kuriais atvejais vieną aminorūgštį

atitinka keletas tRNR ir fermentų. Polipeptidinė grandinė ilgėja ant polisominės „surinkimo

linijos“ nuo amino link karboksilinės grupės (NH3+→COO ). Baltymai, pasiţymintys

ypatingai plačiu biologinių funkcijų spektru, iš esmės sąlygoja visus ląstelės medţiagų

apykaitos ir struktūros bruoţus. Šia prasme per baltymų sintezę DNR

Skiriamos 3 baltymų biosintezės stadijos:

1. Iniciacija. Iniciacijos metu iniciacinė tRNR prisijungia prie mRNR starto signalo ir

uţima ribosomos P (angl. peptidyl) vietą.

2. Elongacija. Elongacija prasideda aminoacil-tRNR (aa-tRNR) prisijungimu prie A (angl.

aminoacyl) vietos ribosomoje. Peptidinis ryšys susidaro tarp naujos ateinančios aa-tRNR -

NH2 grupės ir formilmetionino -COOH grupės (fmet atneša iniciacinė tRNR). Gautas

dipeptidil-tRNR pasislenka iš A į P vietą, o iniciacinė tRNR prieš palikdama ribosomą juda į

E (angl. exit) vietą. Šiems procesams energiją teikia GTP. Prie atsilaisvinusios A vietos

prisijungia nauja aa-tRNR molekulė ir vyksta sekantis elongacijos etapas.

1 pav. Pagrindinės molekulinės biologijos dogmos schema.

3. Terminacija. Terminacija vyksta pasiekus ant mRNR esantį terminacijos signalą, kurį

atpaţįsta atpalaidavimo (angl. release) faktoriai, atpalaiduojantys polipeptidą.

Baltymų biosintezės svarbiausi komponentai.

Ribosomos. Tai makromolekuliniai kompleksai, koordinuojantys tRNR, mRNR ir baltymų

tarpusavio sąveiką bei katalizuojantys nuo mRNR priklausomą peptidinių ryšių susidarymą.

Ribosomos sudarytos iš maţojo ir didţiojo subvienetų. Vadinamos ribosomomis, nes apie 2/3

jų masės sudaro rRNR – molekulės, vaidinančios labai svarbų vaidmenį transliacijos procese.

Bakterijų ląstelėse yra apie 20 000 ribosomų, sudarančių apie 20 proc. sausos ląstelės masės,

o rRNR ir jų baltymus koduoja apie 5 proc. E. coli genomo.

Ribosoma disocijuoja į didįjį (50S) ir maţąjį (30S) subvienetus. Visos rRNR įgauna

būdingą struktūrą, kurią suformuoja trumpos susiporavusios sritys. Įrodyta, kad baltymų

sintezėje svarbiausią vaidmenį atlieka rRNR.

Ribosomų struktūros palaikymui labai svarbūs Mg2+

– maţinant jo koncentraciją iš

pradţių vienas po kito atsiskiria abu subvienetai, o paskui pradeda disocijuoti ir patys

subvienetai.

tRNR. Dar Francis Crick numatė, kad turi būti adaptorinės molekulės, kurios būtų lyg tiltas

tarp mRNR, kuriose yra informacija apie būsimo baltymo struktūrą, ir aminorūgščių. Ta

adaptorinė molekulė pasirodė besanti tRNR, atpaţįstanti: a) fermentą, prijungiantį teisingą

aminorūgštį ir b) mRNR antikodoną.

Visos šiuo metu ţinomos tRNR yra sudarytos iš vienos 73-95 nukleotidų ilgio

grandinės, jos turi daug neįprastų, daugiausiai metilintų bazių. Subrendusios tRNR 3' galo

nukleotidų seka yra CCA, prie kurios jungiasi aktyvinta aminorūgštis (prie galinio adenino

3'-OH). Be to, apie pusė tRNR nukleotidų susiporuoja ir sudaro dvigubas spirales.

Aminoacil tRNR sintetazės – ARSazės. Peptidinio ryšio susidarymas tarp vienos

aminorūgšties NH2 galo ir kitos aminorūgšties COOH galo yra termodinamiškai nepalankus.

Šis barjeras įveikiamas aktyvinant aminorūgšties COOH grupę. Baltymų biosintezės aktyvinti

tarpininkai yra aminorūgščių esteriai, kuriuose aminorūgščių karboksi grupė sujungta su

tRNR 3' galu. Toks tRNR aminorūgšties esteris vadinamas aminoaci-tRNR (aa-tRNR),

kartais – pakrauta tRNR. Pačios aminorūgštys negali atpaţinti mRNR kodonų, todėl būtinos

tRNR, atpaţįstančios mRNR kodonus ir nešančios į ribosomą reikalingą aminorūgštį –

adaptorinė tRNR funkcija.

Aminorūgštis aktyvina ir prie tRNR prijungia fermentai – ARS-azės:

Aminorūgštys + ATP + tRNR +H2O ↔ aminoacil-tRNR + AMP + 2Pn

Kiekvienai aminorūgščiai egzistuoja maţiausiai viena ARS-azė ir viena tRNR.

ARSazės yra labai specifiški fermentai ir labai tikslūs atpaţindami tiek aminorūgštis,

tiek tRNR. Šie fermentai pasiţymi savęs pasitikrinimo (angl. proofreading) savybe.

„Svyravimo“ hipotezė.

„Svyravimo“ hipotezė (nevienareikšmio atitikimo, angl. wobble) paaiškina, pirmiausia,

kodėl viena tRNR gali atpaţinti keletą kodonų ir, antra, kadėl dauguma kodonų gali būti

atpaţinti keletu tRNR molekulių rūšių. Tačiau reikia paţymėti, kad kiekviena tRNR gali nešti

tik vienos rūšies aminorūgštį. Tai įmanoma tik todėl, kad ribojimai, kurie yra dėl bazių

poravimo pagal Kriko-Votsono taisyklę nesiderina su 3 (skaičiuojant 5/

3/ kryptimi) kodono

bazės mRNR ir 1 (5/

3/ kryptimi) bazės tRNR antikodono poravimuisi. Tai priverčia

nukleotidus tiesiog suptis, keičia sąveikos kodonas-antikodonas geometriją ir leidţia

susidaryti G-U poroms. Kai kurių rūšių tRNR esantys modifikuoti nukleotidai pirmoje

antikodono padėtyje ar netoli jos taip pat gali sukelti svyravimą ir dėlto sumaţinti apribojimus

poruojantis kodonui su antikodonu. Svarbus modifikuotas nukleotidas pagal

„svyravimo“ hipotezę yra inozino rūgštis, kuri gali sudaryti poras su A, C ir U, kurie yra 3

mRNR kodono padėtyje. Ribojimų sumaţinimas porų susidarymui svyravimo procese

teoriškai reiškia, kad daugybė skirtingų kodonų gali būti atpaţinti santykinai nedideliu kiekiu

tRNR antikodonų. Tačiau gamtoje ši galimybė praktiškai neišnaudojama ir dauguma ląstelių

turi maţdaug tiek tRNR rūšių, kiek egzistuoja aminorūgščių.

2 paskaita

Ribosomos, jų sandara, funkcijos vietos (2 val.)

Baltymų sintezė vyksta ribonukleoproteininėse dalelėse – ribosomose. Ribosoma – tai

kompleksas, sudarytas iš dviejų tarpusavyje surištų pagrindinių subvienetų. Šis kompleksas

koordinuoja baltymų surinkimą.

Ribosoma

Bakterijų ribosomos. Gerai ištirtos bakterijų (pvz. E. coli) ribosomos yra netaisyklingos

formos nukleoproteininės dalelės, kurių sedimentacijos konstanta yra 70S, diametras apie 20

nm ir molekulinė masė apie 2700 kDa.

Eksperimentinėmis sąlygomis ribosomą galima padalinti į didesnį 50S subvienetą ir

maţesnį 30S subvienetą, o toliau kiekvieną jų – į juos sudarančius baltymus ir rRNR (2 pav.).

Ribosomos struktūra ir funkcijos priklauso nuo susisukimo ir sąveikos su baltymais ją

sudarančių rRNR molekulių. Kiekviena bakterijų ląstelė turi maţdaug 20000 ribosomų, kurios

sudaro apie 25 proc. ląstelės masės. Elektroninė mikroskopija leidţia pamatyti laisvas

ribosomas citoplazmoje

Eukariotų ribosomos. Nors ribosomų struktūra bei funkcijos ţinduolių ir E. coli ląstelėse

panašios, egzistuoja atitinkami skirtumai jų sudaryme. Ţinduolių ribosomos sedimentacijos

konstanta 80S, molekulinė masė 4200 kDa ir jos disocijuoja į du subvienetus – 60S bei 40S.

40S subvienetas turi 18S rRNR ir apie 30 su ja surištų baltymų. 60S subvienetas sudarytas iš

5S, 5,8S ir 28S rRNR ir apie 45 su juo susijusių baltymų. Elektroninis mikroskopas leidţia

pamatyti tiek laisvas ribosomas, tiek su endoplazminiu tinklu tvirtai surištas ribosomas.

Paprastai laisvos ribosomos sintezuoja baltymus, kurie skirti naudojimui citoplazmoje, o su

endoplazminio tinklo membrana surištos ribosomos sintezuoja baltymus, kurie eksportuojami

iš ląstelės arba įeina į membranos sudėtį.

2 pav. Prokatiotų ir eukariotų ribosomų erdvinė struktūra

Transliacija

Baltymų sintezės procese prie mRNR molekulės vienu metu gali prisijungti keletas

ribosomų, kurios sudaro poliribosomą arba kitaip vadinamą polisomą (3 pav.).

3 pav. Bendra transliacijos proceso schema

Blogiausiu atveju viena ribosoma tenka kiekvieniems 8 mRNR molekulės nukleotidams.

Atskiros ribosomos, įeinančios į polisomos sudėtį, funkcionuoja nepriklausomai viena nuo

kitos, kiekviena jų formuodama pilną polipeptidinę grandinę. Polipeptidinė grandinė

Prokariotų 70S ribosoma

Eukariotų 80S ribosoma

23S ir 5S rRNR

16S rRNR

28S, 5,8S ir 5S rRNR

Iniciacija Elongacija Terminacija

Ribosomos judėjimo kryptys

18S rRNR

sintezuojama NH3→COOH kryptimi, o mRNR nuskaitoma nuo 5/ į 3

/ galą. Eukariotų

baltymų sintezė vyksta citoplazmoje, kur ir pernešama mRNR iš branduolio. Prokariotų (pvz.,

E. coli) mRNR molekulės transliacija gali prasidėti anksčiau, nei pilnai pasibaigs transkripcija.

Lentelė. Prokariotų ir eukariotų baltymų sintezė (reziume)

Savybė Prokariotai Eukariotai

Didysis ribosomos subvienetas 50S 60S

Maţasis ribosomos subvienetas 30S 40S

Ribosoma 70S 80S

Didţiojo subvieneto rRNR 5S, 23S 5S, 5,8S, 28S

Maţojo subvieneto rRNR 16S 18S

Baltymų skaičius didţiajame subvienete 34 50

Baltymų skaičius maţajame subvienete 21 34

Iniciacijos faktoriai IF1, IF2, IF3 eIF2, eIF3, eIF4a,

eIF4b, eIF4c, eIF5, eIF6,

„cap“ surišantis baltymas

Iniciacinė aminoacil-tRNR fMet-tRNR Met-tRNR

Turtinga purinai priešstartinė seka Šaino-Delgarno seka Nėra

Elongacijos faktoriai EF-G (translokazė) EF1, EF2 (translokazė)

Atpalaidavimo faktoriai RF1, RF2, RF3 RF

3 paskaita

Transliacijos iniciacija (2 val.)

Transliacijos iniciacija prokariotuose.

Prokariotinėje ląstelėje baltymų sintezė prasideda citozolyje nuo iniciacinės tRNR

molekulės, nešančios metionino (Met) aminorūgštį, prisijungimo prie maţojo ribosomos

subvieneto (4 pav.). Iniciacinė tRNR suriša Met reakcijoje, kurią katalizuoja atitinkama

aminoacil-tRNR sintetazė, o su tRNR surištas Met yra formilinamas transformilazės (formilas

– skruzdţių rūgšties liekana, HCOOH). Iniciacinė tRNR ţymima kaip tRNRf.

Su tRNR surištas Met paprastai netampa polipeptidinės grandinės dalimi – baltymų

sintezės pabaigoje jis yra pašalinamas. Su iniciacine tRNR surištas Met paprastai

formilinamas. Tačiau Met, surištas su ta tRNR rūšimi, kuri neša Met, skirtą įjungti į baltymo

molekulę, nėra formilinamas. Šiuo atveju atitinkamą tRNR ţymime kaip tRNRMet arba tRNRm.

Laisvas maţasis 30S subvienetas suriša 3 iniciacijos faktorius (IF): IF1, IF2 ir IF3. IF2

suriša GTP, o taip pat paţįsta kompleksą Met-tRNRf. Be to, reakcija tarp IF2 ir GTP leidţia

4 pav. Transliacijos iniciacijos schema

mRNR molekulei prisijungti prie 30S subvieneto. Kai tik susiformuoja kompleksas 30S-met-

tRNRf, IF3 išlaisvinamas. Prie komplekso prisijungus didţiajam 50S subvienetui, vyksta GTP

hidrolizė, po to atpalaiduojami IF1 ir IF2. Tuo metu formuojasi du surišimo centrai: P-centras

(peptidinis, angl. peptidyl) ir A-centras (aminoacilinis, angl. aminoacyl). Baltymų sintezės

eleongacijos stadijos pradţioje Met-tRNRf molekulė yra ribosomos P-centre, o A-centras

laisvas. Susidaręs 70S kompleksas vadinamas iniciacijos kompleksu.

Šaino-Dalgarno seka.

Met tRNRf molekulės antikodonas – UAC, sugebantis nekovalentiškai sąveikauti su

iniciacijos kodonu AUG ant mRNR molekulės. AUG koduoja Met. E.coli iniciacijos sritis

išsidėsčiusi virš start-kodono AUG purininėmis bazėmis turtingoje srityje. Šią sritį vadina

Šaino-Dalgarno seka (pvz., E. coli lacl ši seka susideda iš 5/-AGGAGG-3

/). Ši seka poruojasi

su komplementaria sritimi, išsidėsčiusia 30S subvieneto 16S rRNR 3/gale.

Taigi, baltymo sintezė prasideda ten, kur antikodonas tRNRf susiriša su iniciacijos

kodonu AUG, o mRNR susiporuoja su komplementaria seka ant 16S rRNR molekulės 3/ galo.

Transliacijos iniciacija eukariotuose.

Transliacijos iniciacijos mechanizmas eukariotų ląstelėse yra toks pat kaip ir prokariotų,

tačiau turi ir skirtumų:

1. Iniciacijos tRNR neša Met, o ne formilmetioniną (fMet). Ji ţymima kaip tRNRi.

2. Egzistuoja ţymiai daugiau iniciacijos faktorių – IF (šiandien jų ţinoma 9 ir, be abejo, bus

nustatyta daugiau):

a) eIF2 suriša GTP ir dalyvauja surišant tRNR su 40S kompleksu;

Prokariotų mRNR

16S RNR

Eukariotų mRNR

40S subvienetas

Šaino-Dalgarno seka

Ribosomų skenavimas

b) „cap“-surišantys baltymai sąveikauja su 5/-kepurėle mRNR, o eIF3 susiriša su

arčiausiai prie „cap“ esančiu start-kodonu AUG dėka ATP energijos, aprūpinamos

eIF4;

c) Met-tRNRi susiriša su start-kodonu AUG, o eIF5 verčia eIF hidrolizuoti GTP, o tai

atpalaiduoja eIF2 ir eIF3 iš iniciacijos komplekso;

d) vyksta 60S subvieneto prijungimas bei pilno iniciacijos komplekso formavimasis.

Eukariotai turi tik vieną start-kodoną – AUG ir neturi purinais turtingos Šaino-Dalgarno

sekos. 40S kompleksas susiriša su 5/ mRNR galu ir, panaudodamas ATP energiją, juda 3

/ galo

kryptimi iki start-signalo AUG.

4 paskaita

Polipeptidinių grandinių elongacija.

Transliacijos terminacija (2 val.)

Po baltymų sintezės iniciacijos vyksta eleongacijos procesas, o po to, kai pasiekiamas

atitinkamas kodonas – terminacija. Peptidas palieka ribosomą ir gali būti keičiamas dėl

potransliacinėss modifikacijos. Baltymo modifikacijos pobūdis priklauso nuo to, ar jis skirtas

kitoms ląstelės organelėms (mitochondrijoms, branduoliui ar lizosomoms), ar struktūriniams

vienetams (ląstelės membranos). Modifikuojami gali būti ir baltymai, eksportuojami iš

ląstelės. Potransliacinių modifikacijų klaidos kartais sukelia įvairius susirgimus.

Elongacija.

Po pirmo metionino sekanti aminorūgštis (komplekse su tRNR) prisijungia prie

ribosomos A centro dėka elongacijos faktoriaus. Labai svarbu, kad į A centrą patektų

„teisinga“ aminoacil-tRNR, todėl kad ląstelė negali nustatyti „neteisingos“ aminorūgšties po

jos įsijungimo į grandinę. Prokariotuose patikrinimą atlieka elongacijos faktorius EF-TU. EF-

TU suriša GTP, po to jis geba susirišti su aminoacil-tRNR ir uţtikrina sąveiką su A centru.

Aminorūgštis negali būti įjungta į augančią grandinę anksčiau, nei EF-TU paliks kompleksą,

o pastarasis negali atsilaisvinti, kol neįvyks GTP hidrolizė iki GDP. Taigi,

„neteisinga“ aminoacil-tRNR turi laiko išeiti iš komplekso kol vyksta GTP hidrolizė ir EF-TU

atsiskyrimas. Eukariotuose elongaciją tikrinančiu faktoriumi yra EF1, kurio EF1 subdalelė

sudaro kompleksą su aminoacil-tRNR.

Elongacijos procesą (5 pav.) sudaro dvi pagrindinės stadijos: peptidinės jungties

susidarymas ir translokacija. Peptidinės jungties susidarymo reakciją katalizuoja

peptidiltransferazė. Ji prijungia aminoacil-tRNR, esančios P centre, karbonilinį atomą prie

aminoacil-tRNR, esančios A centre, -aminogrupės. Po to A centras turi būti išlaisvintas

sekančiai aminoacil-tRNR, todėl nuskaitymo rėmelis pasislenka išilgai mRNR per 3 bazes ir

A centre atsiranda sekantis kodonas. Pasislinkimą uţtikrina kitas elongacijos faktorius –

translokazė, energijos šaltiniu naudojanti GTP hidrolizę. Prokariotams šis faktorius EF-G,

eukariotams – EF2. Šio proceso metu aminorūgštį praradusi tRNR-OH pastumiama į taip

vadinamą ribosomos išėjimo sritį, iš kur ji išlaisvinama atgal į citoplazmą. Eukariotuose buvo

nustatyta eilė kitų elongacijos faktorių, bet tikslus jų vaidmuo neaiškus.

5 pav. Transliacijos elongacijos schema

Terminacija.

Kai tik pasiekiamas terminacijos kodonas arba „stop“ kodonas, A centras daugiau

nesuriša aminoacil-tRNR (6 pav.). Vietoje jo prie kodono prijungiamas išlaisvinimo

faktoriaus ir GTP kompleksas (RF-GTP). Tada peptidiltransferazė atlieka hidrolazės vaidmenį

ir prijungia vandens molekulę prie peptidinės grandinės karbonilinio galo. RF hidrolizuoja

GTP iki GDP ir pakeičia konformaciją. Šie pokyčiai aprūpina energija elongacijos komplekso

disociaciją į mRNR, polipeptidinę grandinę ir ribosomų subvienetus. Prokariotams aprašyti 3

išlaisvinimo faktoriai: RF1, RF2 ir RF3. Du pirmieji atpaţįsta skirtingus stop-kodonus, o RF3

potencijuoja RF1 ir RF2 veikimą.

6 pav. Transliacijos terminacijos schema

5 paskaita

Baltymų biosintezės inhibitoriai.

Antibiotikų poveikio baltymų sintezei mechanizmai (2 val.)

Baltymų biosintezės inhibitoriai.

Baltymų biosintezę inhibuoja antibiotikai ir tam tikri toksinai. Antibiotikai – tai medţiagos,

neleidţiančios mikroorganizmams augti arba daugintis. Todėl jie vartojami uţkrečiamosioms

ligoms gydyti. Antibiotikus gamina mikroorganizmai, pelėsiai arba grybai. Tačiau antibiotikai

veikia pagrindinius, gyvybiškai svarbius molekulinius ląstelės mechanizmus, svarbius ne tik

mikrobo, bet kartais ir ligonio gyvybinėms funkcijoms. Daugeliui antibiotikų būdingos

antikancerogeninės savybės, nes jie ypač veiksmingai veikia greitai besidalijančias ląsteles –

bakterijas, vėţines ląsteles, ląsteles – kraujo kūnelių pirmtakus (tuo aiškinamas tam tikrų

antibiotikų poveikis kraujo gamybai). Antibiotikai daţnai sėkmingai vartojami tiriant

biocheminius procesus, nes jie inhibuoja tik tam tikrus molekulinius mechanizmus.

Puromicinas. Tai vienas iš geriausiai ištirtų antibiotikų – bakterijų baltymų biosintezės

inhibitorių. Jį išskiria Streptomyces alboniger. Puromicinas yra panašus į aminoacil-tRNR

akceptorinio stiebo 3' galą. Todėl jis gali prisijungti ribosomos A centre (50S didţiajame

subvienete) ir sudaryti peptidinį ryšį – peptidil-puromiciną. Tačiau puromicinas neturi aminoacilo

grupės (karboksigrupės), todėl augančią polipeptidinę grandinę pernešus ant šio antibiotiko,

tolesnis polipeptidinės grandinės ilgėjimas tampa neįmanomas. Kai turėtų įvykti peptido

translokacija į P centrą, peptidil-puromicinas disocijuoja iš ribosomos, ir įvyksta priešlaikinė

polipeptidinės grandinės terminacįja. Taip inhibuojama bakterijų baltymo biosintezė.

Tetraciklinas slopina baltymų biosintezę bakterijose, prisijungdamas ribosomos 30S

subvieneto A centre. Jis inhibuoja aminoacil-tRNR prisijungimą prie ribosomos 30S subvieneto.

Yra plataus spektro antibiotikas.

Chloramfenikolis (levomicetinas) jungiasi prie ribosomos 50S subvieneto; slopina

baltymo biosintezę bakterijose, mitochondrijose ir chloroplastuose, inhibuodamas

peptidiltransferazę, t.y. peptidilo pernašą ir peptidinio ryšio susidarymą (eukariotų baltymų

sintezės neveikia). Atvirkščiai, cikloheksimidas slopina eukariotų 80S ribosomos

peptidiltransferazę ir, susijungdamas su ribosomos didţiuoju subvienetu, inhibuoja translokaciją.

Tačiau jis neveikia bakterijų, mitochondrijų bei chloroplastų 70S ribosomos. Panašiai veikia ir

linkomicinas, sparsomicinas bei eritromicinas. Eritromicinas, prisijungdamas prie 50S

subvieneto, inhibuoja ribosomos translokaciją. Veikia gramneigiamąsias ir gramteigiamąsias

bakterijas.

Streptomicinas ir gentamicinas (aminoglikozidai) sutrikdo normalų genetinio kodo

nuskaitymą sukeldami daug translokacijos klaidų. Pavyzdţiui, poli(U) normaliai koduoja

fenilalanino įsijungimą. Esant streptomicinui, polinukleotidas (mRNR) ant ribosomos gali

koduoti ne tik fenilalanil-tRNR, bet ir leucil-tRNR (leucil-tRNR koduoja CUU, UUG) bei

izoleucil-tRNR. Esant šiems antibiotikams, maţėja mRNR tripletų specifiškumas, ir jie gali

sąveikauti su antikodonais, turinčiais tik dvi komplementarias bazes. Antibiotikai inhibuoja

baltymo sintezės iniciaciją ir geriausiai veikia gramneigiamąsias bakterijas. Panašus veikimas

būdingas ir neomicinui, ir kanamicinui.

Veikiant bakterijų populiaciją, pvz., E. coli, buvo gauti mutantai, atsparūs streptomicinui,

nors jų atsiradimo daţnis yra labai maţas – 10-12

. Iš atsparių streptomicinui bakterijų galima

atrinkti mutantų, kurie negali augti ir daugintis, jei terpėje nėra streptomicino. Atsiradusi nauja

savybė priklauso nuo vienintelės taškinės mutacijos, pakeičiančios tik vieną aminorūgštį

bakterijos ribosomos baltyme.

Penicilinas inhibuoja bakterijų sienelių susidarymą. Veikia gramteigiamąsias bakterijas.

Cefalosporinas taip pat veikia bakterijų sienelę. Inhibuoja gramteigiamųjų ir

gramneigiamųjų bakterijų biosintezę.

Antibiotikai neveikia virusų, nes virusai neturi nei transkripcijos, nei baltymus

sintetinančios sistemos. Savo replikacijai, transkripcijai ir transliacijai jie naudoja šeimininko

ląstelės aparatą. Patekus virusui į ląstelę, išjungiama šeimininko RNR, o kartu ir baltymų

biosintezė. Visas baltymus sintetinantis aparatas perjungiamas į viruso nukleorūgščių ir

baltymų sintezę. Būtent šie procesai vyksta uţsikrėtus raupų, poliomielito, gripo ir kt. virusais.

Labai stiprus ţmogaus ir kitų ţinduolių baltymo biosintezės inhibitorius yra difterijos

toksinas. Jis inhibuoja baltymo biosintezės elongacijos faktoriaus eEF2 prisijungimą prie

ribosomos. Difterijos bacila dauginasi ant gerklų gleivinės paviršiaus ir išskiria baltyminės

kilmės toksiną, sudarytą iš vienos polipeptidinės grandinės (molekulinė masė 60 kDa).

Veikiant šeimininko proteazėms, difterijos toksinas suskyla į du fragmentus – A ir B.

Fragmentas A yra fermentas ADP-riboziltransferazė, pernešanti ADP-ribozilinę liekaną nuo

NAD'o ant eukariotų elongacijos faktoriaus 2 (eEF2):

NAD+eEF2→ADP-ribozil-EF2 + nikotinamidas + H+

Taip modifikuotas eEF2 praranda savo galimybę dalyvauti ribosomos translokacijoje.

Transliacija nutrūksta. Tuo ir paaiškinamas toksinis baltymo veikimas.

Inhibitorius Veikimo vieta Inhibuojamas procesas

Chloramfenikolas Prokariotų 50S subvienetas Peptidiltransferazė

Cikloheksimidas Eukariotų 80S ribosoma Elongacija

Eritromicinas Prokariotų 50S subvienetas Translokacija

Fuzido rūgštis Prokariotų EF-G veikimas Translokacija

Neomicinai Prokariotai, daug taikinių Transliacija

Puromicinas Eukariotų ir prokariotų ribosoma Peptido pernešimas

Ricinas Eukariotai Eilė procesų

Streptomicinas Prokariotų 30S subvienetas Iniciacija

Elongacija

Tetraciklinai Prokariotų 30S subvienetas Aminoacil-tRNR surišimas

Laboratorinių darbų aprašas

1 laboratorinis darbas

Suminių transportinės RNR ir aminoacil-tRNR sintetazių

preparatų išskyrimas iš pelių kepenų ir jų aktyvumo nustatymas (6 val.)

Universalus genetinis kodas yra realizuojamas vienos iš pagrindinių biocheminių

reakcijų metu. Ši reakcija – tai tRNR molekulės aminoacilinimas, kurią katalizuoja specifiniai

fermentai – aminoacil-tRNR sintetazės (ARSazės). Kiekvienai aminorūgščiai egzistuoja viena

ARSazė ir viena tRNR. tRNR aminoacilinimo reakcijoje dalyvauja viena iš 20-ies ARSazių,

kurių kiekviena yra specifinė tik vienai aminorūgščiai.

1. Suminių tRNR preparatų išskyrimas.

Transliacijos metu mRNR molekulėje esanti kodonų seka, patekusi į ribosomą, nurodo

aminorūgščių seką polipeptidinėje grandinėje. Tačiau mRNR kodonas tiesiogiai neatpaţįsta

aminorūgšties. Ir aminorūgštį, ir tris ją atitinkančio kodono nukleotidus specifiškai atpaţįsta

RNR molekulė, vadinama transportine RNR (tRNR). tRNR yra pakankamai maţa molekulė,

kurios grandinę sudaro 73-95 nukleotidai, jos molekulinė masė yra apie 25 kDa,

sedimentacijos koeficientas 4S. Eukariotų ląstelių citoplazmoje yra daugiau kaip 100 įvairių

tRNR. Kiekviena aminorūgštis turi jai specifiškas kelias tRNR, vadinamas izoakceptinėmis.

Darbo eiga:

1. Pelių kepenys pasveriamos ir 3 min. homogenizuojamos 1,5 tūrio (lyginant su kepenų

svoriu) buferio (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5; 1,0 M natrio chloridas; 0,005 M

etilendiamintetraacetatas).

2. Į homogenatą įpilama 1,5 tūrio (lyginant su kepenų svoriu) 80 proc. fenolio tirpalo ir

purtoma purtyklėje 5 min.

3. Gautas mišinys centrifuguojamas 15000xg pagreičiu 15 min. K-24 centrifuga.

4. Po centrifugavimo nusiurbiamas vandeninis sluoksnis, į kurį pridedama lygus tūris 80 proc.

fenolio, purtoma purtyklėje 5 min. ir dar kartą centrifuguojama (15000xg pagreičiu 15 min.

K-24 centrifuga).

5. Po centrifugavimo nusiurbiamas vandeninis sluoksnis, pridedamas trigubas tūris šalto 96

proc. etanolio ir laikoma -20 0C temperatūroje 3 val.

6. Nuosėdos surenkamos centrifuguojant 8000xg pagreičiu 5 min. K-24 centrifuga ir

tirpinamos tokiame 0,3 M natrio acetato ml kiekyje, kiek gramų buvo kepenų.

7. Į gautą tirpalą lėtai maišant po truputį pilama iki 0,54 tūrio (lyginant su nuosėdų tirpalo

natrio acetate tūriu) izopropanolio.

8. Po to centrifuguojama 8000xg pagreičiu 5 min. ir nuo nuosėdų nupilamas supernatantas.

9. Į supernatantą po truputį pilama iki 0,44 tūrio izopropanolio (galutinis izopropanolio tūris

turi būti 0,98 lyginant su nuosėdų tirpalo natrio acetate tūriu) ir paliekama nakčiai -20 0C

temperatūroje.

10. Iškritusios nuosėdos surenkamos centrifuguojant 8000xg pagreičiu 5 min., ištirpinamos

bidistiliuotame vandenyje ir gaunamas suminis tRNR preparatas.

11. tRNR koncentracija gautame tirpale nustatoma spektrofotometriškai matuojant sugertį ties

260 ir 280 banga.

2. Aminoacil-tRNR sintetazių preparatų išskyrimas.

ARSazės – tai 20-ties fermentų šeima, atliekanti panašias funkcijas, tačiau pasiţyminti

skirtingu specifiškumu substratui. Viena ypatingų šių fermentų savybių yra ta, kad juos

sudaro skirtingas skaičius įvairaus dydţio subvienetų. ARSazės gali būti ir monomerai, ir

dimerai, ir tetramerai, o jų subdalelių molekulinė masė skiriasi nuo 37 kDa iki 108 kDa.

Darbo eiga:

1. Bemitochondrinio supernatanto išskyrimui pelių kepenys pasveriamos ir

homogenizuojamos trijuose buferio (100 mM Tris-HCl, pH 7,5; 10 mM MgCl2; 10 mM KCl;

250 mM sacharozė; 1 mM ditiotreitolas) tūriuose.

2. Fermentai ekstrahuojami audinių homogenatą 15 min. maišant stikline lazdele ledo vonioje.

3. Ląstelių, branduolių ir mitochondrijų nuolauţos pašalinamos homogenatą centrifuguojant

15000 g pagreičiu 15 min. K-24 centrifuga.

4. Supernatantas filtruojamas per keturgubą sterilios marlės sluoksnį ir gaunamas aminoaci-

tRNR-sintetazių preparatas.

5. Baltymų koncentracija gautame tirpale nustatoma spektrofotometriškai matuojant sugertį

ties 260 ir 280 banga, preparatą praskiedus 100 kartų homogenizacijos buferiu.

3. tRNRLeu

aktyvumo nustatymas.

Darbo eiga:

1. Aminoacilinimo reakcijos mišinys (100 l), kurį sudaro: 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10

mM MgCl2, 10 mM KCl, 4 mM ATP, 0,2 mM [14

C]-leucino, 250 g aminoacil-tRNR-

sintetazių preparato ir 50 g tRNR preparato, inkubuojamas 37oC temperatūroje 20 min.

2. Aminoacilinimo reakcija sustabdoma pridedant 0,2 ml 10 proc. trichloracto rūgšties.

3. Mėginiai laikomi ledo vonioje 20 min., kad susiformuotų nuosėdos.

4. Nuosėdos surenkamos ant nitroceliuliozės filtrų ir praplaunamos 25–30 ml. 5 proc.

trichloracto rūgšties tirpalu.

5. Filtrai išdţiovinami (apie 30 min. po staline lempa).

6. Reakcijos produktų radioaktyvumas kiekybiškai įvertinamas matuojant skysčio

scintiliaciniu skaitikliu ,,Delta 300“ (skaičiavimo efektyvumas – 60 proc.). Pagal [14

C]

leucino prisijungimą prie tRNRLeu

galima spręsti apie tRNRLeu

akceptinį aktyvumą pelių

kepenyse.

4. Leucil-tRNR sintetazės aktyvumo nustatymas.

Darbo eiga:

1. Leucil-tRNR-sintetazės aktyvumo nustatymui mišinys (100 l), kurį sudaro: 100 mM Tris-

HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM KCl, 4 mM ATP, 0,2 mM [14

C]-leucino, 250 g aminoacil-

tRNR-sintetazių preparato, 150 g tRNR preparato, inkubuojamas 3 min. 37o C temperatūroje.

2. Po to reakcija sustabdoma, pridėjus dvigubą tūrį 10 proc. trichloracto rūgšties.

3. Mėginiai laikomi ledo vonioje dar 20 min. nuosėdų susiformavimui.

4. Nuosėdos surenkamos ant nitroceliuliozės filtrų „Synpor Nr. 3“ ir praplaunamos 25-30 ml

5 proc. trichloracto rūgšties tirpalu.

6. Filtrai išdţiovinami (apie 30 min. po staline lempa).

7. Reakcijos produktų radioaktyvumas kiekybiškai įvertinamas matuojant skysčio

scintiliaciniu skaitikliu ,,Delta 300“ (skaičiavimo efektyvumas – 60 proc.).

2 laboratorinis darbas

Transliacijos greičio ir lygio nustatymas

neląstelinėje baltymus sintezuojančioje sistemoje iš pelių kepenų (6 val.)

Transliacijos greičio ir lygio nustatymui yra naudojama neląstelinė sistema, turinti

bemitochondrinį supernatantą. Šios sistemos privalumas yra tas, kad joje baltymų biosintezė

vyksta panašiai kaip intaktinėse ląstelėse. Lyginant su sistema, turinčia ribosomas ir

mikrosomas, sistemoje su bemitochodriniu supernatantu baltymų biosintezė vyksta 25-50

proc. efektyviau.

Darbo eiga:

1. Bemitochondrinio supernatanto išskyrimui pelių kepenys pasveriamos ir

homogenizuojamos trijuose buferio (100 mM Tris-HCl, pH 7,5; 10 mM MgCl2; 10 mM KCl;

250 mM sacharozė; 1 mM ditiotreitolas) tūriuose.

2. Fermentai ekstrahuojami audinių homogenatą 15 min. maišant stikline lazdele ledo vonioje.

3. Ląstelių, branduolių ir mitochondrijų nuolauţos pašalinamos homogenatą centrifuguojant

15000 g pagreičiu 15 min. K-24 centrifuga.

4. Supernatantas filtruojamas per keturgubą sterilios marlės sluoksnį.

5. Nufiltruotas supernatantas centrifuguojamas 30000xg pagreičiu 20 min. MSE centrifuga

(rotorius 10x10 ml): gaunama S-30 frakcija.

6. Baltymų koncentracija gautame tirpale nustatoma spektrofotometriškai matuojant sugertį

ties 260 ir 280 banga, preparatą praskiedus 100 kartų homogenizacijos buferiu.

7. 0,1 ml inkubacinio neląstelinės baltymus sintezuojančios sistemos mišinio, kurį sudaro 30

mM HEPES buferis (pH 7,5), 5 mM magnio acetatas, 100 mM kalio chloridas, 2 mM

adenozintrifosfatas, 0,4 mM guanozintrifosfatas, 20 mM fosfokreatinas, 2 g

fosfokreatinkinazės, 100 M aminorūgščių mišinio, 5 l [14

C]-chlorelos baltymų hidrolizato ir

0,5 optiniai vienetai [A260-A320] S-30 frakcijos, inkubuojama 37 0C temperatūroje 5, 10, 20 ir

30 min.

8. Reakcija stabdoma, pridėjus 0,5 ml 10 proc. trichloracto rūgšties.

9. Po to mėginiai inkubuojami 10 min. 90 0C temperatūroje aminoacil-tRNR hidrolizei.

10. Atšaldţius mėginius 20 min ledo vonioje, nuosėdos rinktos ant nitroceliuliozinių filtrų

“Synpor Nr. 3” (Čekija) ir praplautos 25-30 ml šaltos 5 proc. trichloracto rūgšties.

11. Filtrai išdţiovinami (30 min. po staline lempa).

12. Radioaktyvumas matuotas scintiliaciniu skaitikliu “Delta-300” (Olandija), kurio

efektyvumas 60 proc.

3 laboratorinis darbas

Baltymų analizė gel-filtracijos, elektroforezės poliakrilamidiniame gelyje

denatūruojančiomis sąlygomis ir imunoblotingo metodais (6 val.)

Individualių baltymų išskyrimo metodai pagrįsti skirtingomis fizikinėmis ir

cheminėmis savybėmis. Baltymus galima išskirti tik esant ţemai temperatūrai. Tinkamiausia

temperatūra yra artima tirpalo uţšalimo temperatūrai. Esant ţemai temperatūrai, susilpnėja

mikroorganizmų dauginimasis, nuslopinamas proteazių poveikis.

Tiriant maţai ţinomus baltymus, reikia vengti rūgščių ir šarmų, nes daugelis baltymų

nekinta, kai pH artimas 7, nors esama ir išimčių, pvz.: tripsinas, chimotripsinas, pepsinas ir

histonai yra patvaresni rūgščioje terpėje. Organiniai tirpikliai (etanolis, acetonas) tinka

baltymams išskirti tik esant ţemai temperatūrai (apie -10°C).

Pagrindiniai baltymų išskyrimo etapai:

1. Baltymų ekstrahavimas iš ląstelių ir audinių.

2. Nebaltyminių medţiagų pašalinimas.

3. Baltymų mišinio frakcionavimas.

4. Druskų pašalinimas iš baltymų.

Druskoms ir kitoms maţos molekulinės masės priemaišoms pašalinti iš baltymų

naudojamas dializės metodas, gel-filtracija. Šių metodų pagrindą sudaro tai, kad baltymų

molekulės, turėdamos didelę molekulinę masę, negali prasiskverbti pro membranų poras arba

įsiskverbti į gelio granules.

Baltymams išskirti plačiai taikomas elektroforezės metodas, kuris pagrįstas tuo, kad

skirtingi baltymai nevienodai jonizuojami, įgyja skirtingą krūvį ir todėl nevienodu greičiu juda

elektros lauke.

1. Fermentų molekulinės masės nustatymas chromatografijos gelyje metodu.

Gel-filtracijai naudojami vadinamieji molekuliniai tinkleliai – inertinės hidratuotos

medţiagos: polisacharidai kaip poringos granulės. Jos gaunamos iš bakterijų polisacharidų

(sefadeksai), agaro arba polimerizuotų akrilamido gelių (akrileksas). Nedidelės molekulės

prasiskverbia į granules per poras, todėl pro geliu pripildytą kolonėlę juda lėčiau negu didelės

molekulės, negalinčios patekti į granulių vidų.

Molekulinės masės nustatymas chromatografijos gelyje metodu pagrįstas skirtingu

įvairaus dydţio molekulių sugebėjimu praeiti per sefarozės kolonėlę. Priklausomybė tarp

biologinių molekulių eliucijos greičio ir jų molekulinės masės logaritmo yra tiesinė.

Laisvas sefarozės 6B kolonėlės tūris nustatomas pagal mėlynojo dekstrano 2000

eliucijos tūrį. Kalibravimo kreivė nustatoma pagal ţinomos molekulinės masės baltymų-

ţymių eliucijos tūrius. Skaičiuojamas kiekvieno baltymo-ţymės pasiskirstymo koeficientas

(Kav) ir sudaromas Kav priklausomybės nuo molekulinės masės logaritmo (lg M) grafikas. Kav

apskaičiuojamas pagal formulę: Kav=Ve-Vo/Vt -Vo, kur Ve – baltymo-ţymės eliucijos tūris, Vo

– laisvas kolonėlės tūris, Vt - bendras kolonėlės tūris.

Naudojami ţinomos molekulinės masės baltymai-ţymės: JSA (67 kDa), aldolazė (158

kDa), katalazė (232 kDa), feritinas (440 kDa), tyroglobulinas (669 kDa). Eliucija vykdoma 12

ml/val. greičiu. Aprašytu metodu apskaičiuojama Kav reikšmė tiriamam baltymui ir pagal

kalibravimo kreivę nustatoma jo molekulinė masė.

Darbo eiga:

1. Kolonėlė pripildoma išbrinkinta izotoniniame (0,9 proc.) NaCl tirpale sefaroze 6B.

2. Paruošiamas mišinys frakcionuoti iš dviejų komponentų: sočiojo mėlynojo dekstrano

tirpalo, kurio molekulinė masė yra 107 Da, ir sočiojo K2Cr207 tirpalo, kurio molekulinė masė

yra 294 Da, santykiu 1:1.

3. Ant gelio paviršiaus uţlašinami 2-3 lašai frakcionuoto mišinio ir palaukiama, kol gelis

sugers tirpalą.

4. Atsargiai per stiklinę lazdelę, priglaustą prie sienelės, į kolonėlę įpilama apie 2 ml 0,9 proc.

NaCl tirpalo ir prijungiamas lašintuvas su izotoniniu NaCl tirpalu. Šio tirpalo reikia

išskiriamų medţiagų eliucijai (išplovimui).

5. Perėjęs per kolonėlę mišinys pasiskirsto skirtingų spalvų frakcijomis. Kiekviena frakcija

surenkama į skirtingus mėgintuvėlius.

2. Molekulinės masės nustatymas elektroforezės poliakrilamido gelyje,

denatūruojant fermento molekules, metodu.

Baltymų molekulės elektrinio krūvio dydis ir ţenklas priklauso nuo bazinių ir rūgštinių

jonizuotų grupių santykio molekulėje. Elektriniam laukui susidarius baltymų molekulės

tirpale juda priešingai įkrauto poliaus link.

Baltymų elektroforezė gali vykti natyvinėmis ir denatūravimo sąlygomis. Vykstant

elektroforezei natyvinėmis sąlygomis, baltymų molekulių judėjimo greitis priklauso nuo jų

krūvio, molekulinės masės, hidratacijos laipsnio, molekulių dydţio ir formos. Vykstant

elektroforezei denatūravimo sąlygomis, pridedama natrio dodecilsulfato, todėl baltymo

molekulės tarsi išsitiesia ir jų judėjimas elektriniame lauke priklauso tik nuo jų molekulinės

masės.

Elektroforezė natyvinėmis sąlygomis atliekama, kai norima išvalyti ir išgryninti baltymą,

o denatūravimo sąlygomis – kai norima nustatyti baltymo molekulinę masę.

Elektroforezė vyksta specialiose plokštelėse ar nedideliuose vamzdeliuose, pripildytuose

poliakrilamido gelio. Poliakrilamido gelis yra akrilo rūgšties amido (akrilamido ir ir

bisakrilamido) polimeras.

Darbo eiga: Elektroforezė 15 proc. PAAG, denatūruojant fermento molekules (su 0,2

proc. NDS), atliekama Lemlio metodu.

1. Elektroforezės plokštelės sandariai pritvirtinamos stove guminėmis tarpinėmis ir gnybtais.

2. Paruošiamas mišinys geliui gauti iš akrilamido (akrilo rūgšties amido), bisakrilamido

(N,N'-metilenbisakrilamido), amonio persulfato (NH4)2S2O3 ir TEMED (N>N,NI,N

I

tetrametiletilendiamino).

3. Paruoštas pagrindinio gelio tirpalas (0,75 M Tris-HCl buferio (pH 8,8), 15 proc. PAA

(bisakrilamido/akrilamido santykis 1:37) ir 0,2 proc. NDS) supilamas į ertmę tarp

elektroforezės plokštelių taip, kad viršutinis gelio paviršius būtų 1,5 cm ţemiau uţ viršutinį jų

kraštą. Atsargiai ir lėtai pilant sienele, uţpilamas kelių milimetrų storio distiliuoto vandens

sluoksnis. Turi būti riba, skirianti vandenį ir gelį. Vanduo apsaugo gelį nuo oro deguonies,

kuris yra polimerizacijos inhibitorius, be to, sudaro sąlygas gauti lygų, plokščią paviršių. Gelis

stingsta apie 20 min.

4. Pagrindiniam geliui sustingus, vandens sluoksnis pašalinamas siaura filtrinio popieriaus

juostele.

5. Į ertmę tarp plokštelių uţpilamas koncentruojantis gelis, kuris ruošiamas iš 0,25 M Tris-HCl

buferio (pH 6,8), 3,5 proc. PAA (bisakrilamido/akrilamido santykis 1:37), 20 proc. sacharozės

ir 0,2 proc. NDS. Po to į ertmę tarp plokštelių įstatomos „šukutės“. Gelis stingsta apie 15 min.

6. Sustingus koncentruojančiam geliui, „šukutės“ atsargiai ištraukiamos, gelyje susidarę šulinėliai

praplaunami vandeniu, o po to elektrodiniu buferiu.

7. Baltymų pavyzdţiai elektroforezei ruošti, inkubuojant juos 3 min. 90oC temperatūroje 0,01

M Tris-HCl (pH 8,2), kurio sudėtyje yra 20 proc. glicerolio, 0,01 M MgCl2, 2 proc. NDS ir 5

proc. -merkaptoetanolio. Į PAAG plokštelės griovelius įnešama po 5-20 g baltymo. Į

tiriamą baltymų tirpalą pridedama mėlyno daţo – brom-fenolio mėlynojo, kad galima būtų

stebėti elektroforezės eigą ir matyti jos pabaigą.

8. Apatinė elektrodinė kamera pripildoma elektrodinio buferinio tirpalo ir sujungiama su

viršutine elektrodine kamera. Viršutinė elektrodinė kamera pripildoma elektrodinio buferio ir

uţdengiama dangteliu.

9. Elektroforezė atliekama 0,05 M Tris-HCl buferyje (pH 8,3), kurio sudėtyje yra 0,38 M

glicino ir 0,2 proc. NDS. Elektroforezė vyksta, tekant pastoviai 40 mA/plokštelei srovei.

10. Elektroforezė baigiama, kai mėlyna juosta pasiekia plokštelių apatinį galą. Ji trunka apie

1 val. Pasibaigus elektroforezei, išjungiamas srovės šaltinis, viršutinė kamera atskiriama nuo

apatinės, išpilamas buferinis tirpalas, išimamos plokštelės su geliu.

11. Geliai iš plokštelių atsargiai išimami ir patalpinami į nerūdijančio plieno indą, kur daţomi

specialiais mėlynais daţais (coomasi blue) 60 min.

12. Daţų perteklius nuplaunamas 7 proc. acto rūgšties tirpalu, periodiškai keičiant tirpalą, kol

gelio sritys, kur nėra baltymo, tampa visiškai skaidrios.

13. Gelį nudaţius ir atplovus daţo perteklių, matuojami baltymų-ţymių ir tiriamojo baltymo

pagrindiniame gelyje nueiti atstumai (R). Nustatoma lg10R priklausomybė nuo baltymų-

ţymių molekulinės masės logaritmo. Pagal gautą kalibravimo kreivę nustatoma tiriamų

baltymų molekulinę masę. Naudojami baltymai-ţymės: mioglobinas (17,8 kDa),

chimotripsinogenas (25 kDa), JSA (68 kDa), fosforilazė B (91,5 kDa).

3. Kaspazės 3 aktyvaus subvieneto nustatymas imunoblotingo metodu.

Imunoblotingas (dar vadinamas Western blotingu) yra vienas iš imunocheminės

analizės metodų. Naudojant specifinius antikūnus, šiuo metodu galima identifikuoti tiriamąjį

baltymą kitų baltymų mišinyje, pavyzdţiui, ląstelių lizate, kraujo serume ir pan. Todėl

imunoblotingas plačiai taikomas medicinoje, biotechnologijoje ir moksliniuose tyrimuose.

Pavyzdţiui, šiuo metodu galima nustatyti virusų, tokių kaip ŢIV, tymų, hepatito B, C ir kt.,

baltymus ţmogaus kraujo serume ir patvirtinti diagnozę. Be to, šiuo metodu galima tirti

įvairių baltymų, net ir netirpių, ekspresiją ląstelėse – pavyzdţiui, membranoje esančių

receptorių ir pan. Biotechnologijoje šis metodas gali būti taikomas rekombinantinių baltymų

ekspresijai tirti.

Baltymai poliakrilamidiniame gelyje atskiriami elektroforezės būdu ir pernešami ant

specialios membranos. Po to membrana inkubuojama su specifiniais antikūnais prieš tiriamąjį

baltymą. Prisijungę antikūnai išryškinami, inkubuojant su antriniais antikūnais.

Darbo eiga:

1. Atliekama tiriamų audinių poribosominio supernatanto elektroforezė, kaip aprašyta 3

laboratorinio darbo 2 dalyje 1-10 punktuose.

2. Gelis iš plokštelių atsargiai išimamas, patalpinamas į lėkštelę su pernešimo buferiu (25 mM

Tris, 192 mM glicinas, 20 proc. metanolio) ir plaunamas 15 min.

3. Blotingo membrana 1 min. plaunama metanolyje, po to 1 min. distiliuotame vandenyje ir

perkeliama į lėkštelę su pernešimo buferiu.

4. Iš filtrinio Vatmano popieriaus iškerpami gelio dydţio lapeliai ir pamerkiami į lėkštutę su

pernešimo buferiu.

5. Iš poliakrilamidinio gelio baltymai pernešami ant membranos, naudojant blotingo aparatą,

sudedant tokia tvarka: filtrinis popierius, membrana, gelis, filtrinis popierius. Pernešimas

trunka 1 valandą, esant pastovios srovės stiprumui (40 mA).

6. Toliau atliekamas membranos blokavimas. Tam membrana 5 min. plaunama 50 ml TTBS

buferio, kurio sudėtyje yra 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 0,05 proc. tvino, pH 7,5 ir

inkubuojama 1 val. blokavimo buferyje (TTBS+5 proc. pieno miltelių) kambario

temperatūroje.

7. Membrana 5 min. plaunama 50 ml TTBS buferio.

8. Membrana, patalpinta į plastikinį maišelį su pirminiais antikūnais prieš kaspazę 3

(praskiedimas 1:500 su TTBS+3 proc. pieno miltelių), inkubuojama per naktį 4 0C

temperatūroje.

9. Kitą dieną membrana išimama iš maišelio ir 2 kartus po 5 min. plaunama TTBS buferiu.

10. Inkubacija su antriniais antikūnais. Paruošiama 8,3 µl antrinių antikūnų tirpalo 25 ml

TTBS+3 proc. pieno miltelių. Membrana inkubuojama šiame tirpale 1 val. kambario

temperatūroje.

11. Membrana du kartus po 5 min. plaunama TTBS buferyje.

12 Po to membrana 5 min. plaunama TBS (20 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,5) buferiu.

13. Fermentinės reakcijos išryškinimas. Membrana inkubuojama daţymo buferyje (paruoštas

pagal aprašymą iš imunoblotingo rinkinio), kol išryškėja specifiškai nusidaţiusios juostelės

(apie 30 min.). Daţymas baigiamas membraną pernešus į lėkštelę su dejonizuotu vandeniu

(10 min.). Po to ji dar keletą kartų plaunama dejonizuotu vandeniu, išdţiovinama ir

fotografuojama.

14. Rezultatų įvertinimas. Imunoblotingo rezultatai įvertinami kokybiškai: nustatoma,

kuriame iš tiriamųjų pavyzdţių yra aktyvus kaspazės 3 subvienetas (apie 20kDa).

Laboratorinių darbų rezultatai pateikiami pagal Biochemijos laboratorinių darbų aprašą

(ţiūr. ţemiau).

Biochemijos laboratorinių darbų aprašas

1. Data

2. Darbo pavadinimas

3. Darbo tikslas

4. Darbo principas

5. Tyrimo objektas, reagentai, pagrindinės darbo priemonės

6. Darbo rezultatai ir skaičiavimai

7. Išvados

Studijų dalyko „Baltymų biosintezė“ seminarų temų konspektai

1 seminaras

Genetinio kodo bendros savybės ir iššifravimas (3 val.)

Baltymus sudaro maţiausiai 20 skirtingų aminorūgščių, tuo tarpu DNR ar RNR sudėtyje

yra tik 4 bazės. Buvo nustatyta, kad informaciją apie kiekvieną aminorūgštį neša 3 bazių seka,

vadinama kodonu. Galimų tripletinių kodonų, sudarytų iš 4 bazių, skaičius lygus 43

64.

Eksperimentai parodė, kad iš šių teoriškai galimų variantų 61 tikrai koduoja aminorūgštis.

Jeigu vienoms aminorūgštims (pvz., triptofanui) atitinka tik vienas kodonas, tai kitoms (pvz.,

serinui) – iki 6 kodonų. Nepaisant to, genetinis kodas yra specifinis ir vienareikšmis, vienas

kodonas koduoja tik vieną aminorūgštį.

5' kodono

galas

Vidurinė kodono bazė 3' kodono

galas U C A G

U Phe Ser Tyr Cys U

U Phe Ser Tyr Cys C

U Leu Ser Stop Stop A

U Leu Ser Stop Trp G

C Leu Pro His Arg U

C Leu Pro His Arg C

C Leu Pro Gln Arg A

C Leu Pro Gln Arg G

A Ile Thr Asn Ser U

A Ile Thr Asn Ser C

A Ile Thr Lys Arg A

A Met

(starto kodonas)

Thr Lys Arg G

G Val Ala Asp Gly U

G Val Ala Asp Gly A

G Val Ala Glu Gly C

G Val Ala Glu Gly G

Kodą vadina išsigimusiu, kadangi vieną aminorūgštį paprastai atitinka keletas kodonų.

Be to, kodas yra universalus – praktiškai vienodas kodas buvo nustatytas visiems gyviems

organizmams.

Mitochondrijos yra vienintelė ţinoma išimtis iš universalumo principo – kai kurie

kodonai jose turi neįprastą reikšmę.

Eukariotų baltymų biosintezės starto signalu yra metionino kodonas AUG. Todėl

metioninas yra pirma aminorūgštis peptidinėje grandinėje. Stop signalai UGA, UAA ir UAG

nekoduoja jokios aminorūgšties ir kartais yra vadinami beprasmiais (angl. nonsens)

kodonais.

Kodonas Mitochondrijose Įprasta reikšmė

CUA Thr Leu

AUA Met Ile

UGA Trp Stop

Genetinio kodo savybės:

1. Genetinis kodas yra trinukleotidinis (tripletas). Iš 4 nukleotidų gali susidaryti 64

kodonai (43 = 64). Terminas kodonas reiškia trijų nukleotidų seką mRNR molekulėje, kuris

nurodo specifinės aminorūgšties įjungimą į baltymą. Iš 64 kodonų 61 koduoja

aminorūgštis, o 3 yra nekoduojantys – jie vadinami beprasmiais (angl. nonsens) arba

"stop" kodonais. Tai baltymų biosintezės pabaigos signalai.

2. Genetinis kodas yra išsigimęs (degeneruotas), t.y. tą pačią aminorūgštį gali koduoti

daugiau nei vienas kodonas (taigi ta pati aminorūgštis gali jungtis prie kelių tRNR, turinčių

skirtingus antikodonus). Daugelis aminorūgščių turi po kelis kodonus, tik Met ir Trp – po

vieną.

3. Genetinis kodas labai specifinis, paprastai vienas kodonas koduoja vieną aminorūgštį.

Išimtis iniciacijos kodonai AUG (Met), GUG (Val), UUG (Leu) ir AUU (Ile), tačiau kai jie

lokalizuoti mRNR pradţioje, prie jų jungiasi tRNR, prisijungusi formilmet. Ši aminorūgštis

būna prokariotų baltymų N gale, kol vyksta sintezė. Po to atskeliama arba formilo grupė

(CHO-), arba visas formilmet. Genetinio kodo specifiškumą nulemia pirmi 2 kodono

nukleotidai, o 3-ias galinis nukleotidas ne toks specifinis. Ši savybė ţinoma kaip trečios

bazės išsigimimas. Tas pačias arba panašias aminorūgštis koduojančių kodonų seka yra

panaši.

4. Genetinis kodas yra universalus. Visuose organizmuose tie patys tripletai koduoja

tas pačias aminorūgštis. Išimtis – kai kurie mitochondrijų kodonai, pvz., AUA koduoja ne

Ile, bet Met; UGA čia ne terminacijos kodonas, bet koduoja Trp. Taip pat ţinomos išimtys

kai kuriuose prokariotuose ir ţemesniuosiuose eukariotuose.

5. Genetinis kodas nepersidengiantis (kai kurie kodonai persidengia – mitochondrijų

ir chloroplastų). Prasidėjus baltymo biosintezei, nukleotidiniai tripletai skaitomi vienas po

kito, kol pasiekia terminacijos kodoną.

6. Genetinis kodas yra nesanklotinis, t.y. tarp kodonų nėra jokių skiriamųjų ţenklų,

po vieno tripleto tuoj pat eina kitas.

2 seminaras

Informacinės RNR (mRNR) savybės ir brendimas (3 val.)

Labai svarbią vietą transliacijos procese uţima mRNR. Transkripcijos metu susintetinta

mRNR molekulė yra vadinama pirminiu mRNR transkriptu. Šis transkriptas toliau

modifikuojamas ir brandinamas, vyksta splaisingas, kurį vykdo splaiseosomos – tai

kompleksas, sudarytas iš kelių rūšių ribonukleoproteidų. Splaisingo metu yra iškerpamos

nekoduojančios intronų sekos bei nuosekliai sujungiamos koduojančios egzonų sekos (7 pav.).

Subrendusi mRNR palieka branduolį.

7 pav. DNR transkripcija ir RNR splaisingas

Nustatyta, kad ląstelės branduolyje prie tam tikrų mRNR vietų prisijungia baltymai,

suformuodami informasomas. Branduolio baltymai labai svarbūs mRNR pernešimui.

Priklausomai nuo koduojamo polipeptido dydţio, mRNR molekulės gali būti įvairaus

ilgio. mRNR molekulės yra maţiausiai stabilios iš visų RNR rūšių, todėl nereikalingų

baltymų sintezė ląstelėje gali būti greitai nutraukta. Tačiau ši savybė labai apsunkina mRNR

struktūros tyrimus, todėl iki šiol mRNR antrinė ir tretinė struktūros nėra iki galo aiškios.

mRNR struktūroje yra įvairių reguliacinių sričių, kurios nekoduoja baltymų. Eukariotų mRNR

molekulės 5′ gale yra netransliuojama seka, vadinama “kepure” (angl. “cap”), kurioje yra

modifikuotas guanino nukleotidas, nurodantis, kur turi prisijungti ribosoma, prasidedant

transliacijai. Transliuojama seka prasideda iniciacijos kodonu AUG ir baigiasi vienu iš šių 3

terminacijos kodonu UAA, UAG, UGA. Po transliuojamos sekos mRNR molekulės 3′ gale

yra dar viena nekoduojanti seka, kuri vadinama poli-A uodega. Ji susideda iš 150-200 adenino

(A) nukleotidų grandinės, jos funkcijos nėra pilnai ištirtos. Manoma, kad greičiausiai uodega

palengvina mRNR pernašą iš branduolio ir reguliuoja transliaciją. Taip pat nustatyta, kad

kepurėlė ir poli-A apsaugo mRNR nuo egzonukleazių veikimo ir suteikia šiai molekulei

didesnį stabilumą.

RNR tipas Sintezės vieta, S Funkcija

Informacinė RNR

(mRNR)

Nukleoplazma Baltymų sintezės matrica

Transportinė RNR

(tRNR)

Nukleoplazma, 4S Perneša aminorūgštis prie

mRNR

Maţos branduolio RNR

(snRNR)

Nukleoplazma Reguliacinė chromatinui ir

struktūrinė RNR

Heterogeninė branduolio

RNR (hnRNR)

Nukleoplazma, 30-

100S

Kitų RNR pirmtakai

Ribosominė RNR (rRNR) Nukleoplazma, 5S

Branduolėlis, 5,9-18S

Mitochondrijos, 12-16S

Ribosomos struktūros dalis

Mitochondrijų mRNR (mt

mRNR)

Mitochondrijos, 9-40S Baltymų sintezės matrica

Mitochondrijų tRNR (mt

tRNR)

Mitochondrijos, 3,2-4S Perneša aminorūgštis prie

mRNR

Maţos citoplazmos RNR

(scRNR)

Šiurkštusis

endoplazminis tinklas ir

citozolis, 7S

Atrenka eksportuojamus

baltymus

3 seminaras

tRNR struktūra. Aminoacil-tRNR sintetazės.

Aminorūgščių liekanų akceptavimas (prijungimas) prie tRNR (3 val.)

Transportinė RNR.

Transliacijos metu mRNR molekulėje esanti kodonų seka, patekusi į ribosomą, nurodo

aminorūgščių seką polipeptidinėje grandinėje. Tačiau mRNR kodonas tiesiogiai neatpaţįsta

aminorūgšties. Ir aminorūgštį, ir tris ją atitinkančio kodono nukleotidus specifiškai atpaţįsta

RNR molekulė, vadinama transportine RNR (tRNR). tRNR yra pakankamai maţa molekulė,

kurios grandinę sudaro 73-95 nukleotidai, jos molekulinė masė yra apie 25 kDa,

sedimentacijos koeficientas 4S. tRNR molekulėje susidaro vandeniliniai ryšiai tarp nukleotidų

komplementarių bazių porų toje pačioje grandinėje.

Eukariotų ląstelių citoplazmoje yra daugiau kaip 100 įvairių tRNR. Kiekviena

aminorūgštis turi jai specifiškas kelias tRNR, vadinamas izoakceptinėmis. Kai kuriais atvejais

viena tRNR atpaţįsta tik vieną mRNR kodoną, o kai kada gali atpaţinti iki keturių kodonų.

tRNR molekulėje gali būti 4 spiraliniai fragmentai. Dėl to tRNR įgyja specifinę erdvinę

struktūrą, dvimatėje erdvėje atrodančią kaip “dobilo lapas” (8 pav.). Šiai antrinei struktūrai

yra būdingi 5 regionai: akceptinis stiebas, D domenas, antikodoninis domenas, variabili kilpa

ir T domenas.

8 pav. Schematinis “dobilo lapo” vaizdas

tRNR funkcijai ypač svarbios dvi nesuporuotų nukleotidų vietos: vienoje iš jų yra

nukleotidų tripletas, vadinamas antikodonu, o kitoje – CCA seka. tRNR molekulės akceptinis

stiebas yra sudarytas apytikriai iš septynių bazių porų ir aminorūgščių prisirišimo vietos,

esančios 3 akceptinio stiebo gale – tai CCA seka. Atitinkama aminorūgštis rišasi

kovalentiškai prie tRNR galinio adenozino 3 - arba 2 - OH- galo.

Antikodoninis domenas susideda iš antikodoninio stiebo (5 bazių poros) ir kilpos.

Antikodone esančios bazės yra komplementarios kodono bazėms mRNR molekulėje.

T domenas susideda iš T stiebo (5 bazių poros) ir T C kilpos. T C kilpa yra vadinama

taip dėl joje esančio timino nukleotido, kuris yra randamas DNR ir tRNR molekulėse, bet jo

nėra kitose RNR rūšyse. T C kilpoje visada būna minorinis nukleotidas pseudouridinas.

Manoma, kad ši kilpa svarbi sąveikai su ribosoma.

D domenas yra sudarytas iš D stiebo (4 bazių poros) ir D kilpos. D kilpa yra labai svarbi

fermentų, kurie prisijungia prie aminorūgščių, (aminoacil-tRNR sintetazė, transferazė)

atpaţinimo vieta. D kilpoje yra dihidrouridinas.

Maţoji kilpa vadinama variabilia, nes jos ilgis įvairiose tRNR molekulėse nevienodas.

Variabili kilpa išsikiša apie 45 laipsnių kampu į tRNR L formos plokštumą.

Tarp antrinės struktūros kilpų susidaro vandeniliniai ryšiai, dėl kurių tRNR įgauna dar

kompaktiškesnę tretinę L-formos konformaciją (9 pav.). Antrinės struktūros kilpos D ir T C

svarbios universalios tRNR tretinės struktūros susidarymui. tRNR biologinę funkciją ir lemia

ši tretinė struktūra. Joje aktyviai veikia dvi nesuporuotos nukleotidų vietos, t. y. antikodonas

ir 3 gale esanti CCA seka.

9 pav. tRNR tretinė struktūra.

Aminoacil-tRNR-sintetazės

Universalus genetinis kodas yra realizuojamas vienos pagrindinės biocheminės

reakcijos metu. Ši reakcija – tai tRNR molekulės aminoacilinimas, kurią katalizuoja

specifiniai fermentai – aminoacil-tRNR-sintetazės (ARSazės). Kiekvienai aminorūgščiai

egzistuoja viena ARSazė ir viena tRNR. tRNR aminoacilinimo reakcijoje dalyvauja viena iš

20-ies ARSazių, kurių kiekviena yra specifinė tik vienai aminorūgščiai. Tačiau yra ir išimčių.

ARSazės – tai 20-ties fermentų šeima, atliekanti panašias funkcijas, tačiau pasiţyminti

skirtingu specifiškumu substratui. Viena ypatingų šių fermentų savybių yra ta, kad juos

sudaro skirtingas skaičius įvairaus dydţio subvienetų. ARSazės gali būti ir monomerai, ir

dimerai, ir tetramerai, o jų subdalelių molekulinė masė skiriasi nuo 37 kDa iki 108 kDa. Pagal

aminorūgšties prijungimo vietą ARSazės skirstomos į dvi klases.

Pirmajai klasei priklauso fermentai, kurie katalizuoja specifinės aminorūgšties

prijungimą prie 2 -OH adenozino, esančio 76-oje padėtyje tRNR molekulės 3 -gale.

Daţniausiai šios ARSazės yra monomeriniai baltymai.

Antrosios klasės fermentai jungia aminorūgštį prie atitinkamos tRNR 3 -OH, išskyrus

fenilalanil-tRNR sintetazę, kuri jungia aminorūgštį prie 2 -OH. Šios klasės ARSazės visada

yra oligomeriniai baltymai.

Aminoacilinimo reakcija yra dvipakopė:

ARSazė + aminorūgštis + ATP <-----> ARSazė-(aminorūgštis-AMP) + PPn

ARSazė-(aminorūgštis-AMP) + tRNR <-----> aminorūgštis-tRNR+ ARSazė + AMP

___________________________________________________________________________

Aminorūgštis + ATP + tRNA <---------> aminorūgštis-tRNR + AMP + PPn

Reakciją į produkto pusę perstumia makroerginio neorganinio pirofosfato (PPn) hidrolizė.

Pirmosios pakopos metu aminorūgštis suţadinama (aktyvinama) dalyvaujant ATP

molekulei – susidaro tarpinis junginys – aminoaciladenilatas (aminoacil-AMP) ir pirofosfatas.

Antrosios pakopos metu prie 3 -tRNR galo prijungiama aminorūgštis ir susidaro aminoacil-

tRNR bei AMP. Aminoacil-tRNR (aa-tRNR) – tai aminorūgšties esteris, kuriame

aminorūgšties karboksigrupė sujungta su tRNR 3 galo 2 - ar 3 - OH grupe. Taigi aminoacil-

tRNR susidarymui sunaudojami 2 makroerginiai fosfatiniai ryšiai. Abi pakopas katalizuoja ta

pati ARSazė: aa-AMP tarpininkas nedisocijuoja nuo ARSazės; nekovalentiniais ryšiais jis

stipriai susijęs su fermento aktyviuoju centru.

Daţniausiai tRNR aminoacilinimo reakcijoje dalyvauja viena iš 20-ties ARSazių,

kiekviena iš kurių specifinė tik vienai aminorūgščiai. Tačiau yra išimčių. Buvo išskirtos ir

aprašytos visos 20 ARSazių iš E. coli ir didelė dalis ţemesniųjų bei aukštesniųjų eukariotų

ARSazių. Genų klonavimo ir sekvenavimo metodais buvo nustatyta prokariotinių ARSazių

pirminė seka. Visas jas koduoja skirtingi ir unikalūs genai, išskyrus lizil-tRNR sintetazę, kurią

koduoja du genai – ekspresuojamas genas – lysS ir šilumos indukuojamas genas lysU.

Buvo klonuota ir sekvenuota 20 ţemesniųjų eukariotų genų, koduojančių citoplazmos

ir/arba mitochondrijų ARSazes. Visas mitochondrijų ARSazes koduoja branduolio DNR.

Ţemesniųjų eukariotų ARSazių genai neturi intronų, išskyrus tris genus, sekvenuotus iš

Neurospora crassa. Ţinduolių ARSazių tyrimų progresas vyko lėčiau, tačiau buvo aptikta

visa eilė struktūrinių ir funkcinių ARSazių ypatybių, kurių nėra bakterijų ir mielių

fermentuose. Dalis ţinduolių ARSazių buvo klonuota ir sekvenuota, nustatyta, kad jų genai

yra sudaryti iš kelių egzonų, atskirtų dideliais intronais. Atlikti šių fermentų aktyvumo

reguliacijos tyrimai.

ARSazėms būdingi keturi ketvirtinės struktūros tipai. Jų molekulės gali būti sudarytos iš

vieno subvieneto ( tipo struktūra), dviejų identiškų subvienetų ( 2 tipo struktūra), keturių

identiškų subvienetų ( 4 tipo struktūra), dviejų skirtingų porinių subvienetų ( 2 2 tipo

struktūra).

Evoliucijos eigoje homologinių fermentų subvienetų struktūra praktiškai nekito nuo

prokariotų iki ţemesniųjų eukariotų. Eukariotų ARSazių molekulės polipeptidinė grandinė

vidutiniškai ilgesnė nei jų analogų prokariotų ar ţemesniųjų eukariotų ląstelėse. ARSazės

tarpusavyje arba su kitais baltymus sintezuojančios sistemos komponentais ar ląstelės

struktūromis jungiasi į didelės molekulinės masės kompleksus, todėl kompleksų molekulinė

masė labai didelė. Remdamasis eukariotinių ARSazių hidrofobinėmis savybėmis bei jų

sąveikos ypatybėmis, Deučeris pasiūlė šių fermentų kompleksų organizacijos bendrą modelį.

Pagal šį modelį ARSazių susijungimas į kompleksą vyksta dėl jų hidrofobinių domenų

sąveikos. Šie domenai sudaro komplekso branduolį. Tuo tarpu fermentų aktyvūs centrai

išsidėsto komplekso išorėje. Komplekso branduolyje greičiausiai yra lipidai ar kiti

hidrofobiniai komponentai, stabilizuojantys jo struktūrą. Pagal atliktus tyrimus nustatyta, kad

viena iš komplekso funkcijų yra ARSazių aktyvumo stabilizacija. Dabartiniu metu ARSazių

makromolekuliniai kompleksai išskirti beveik iš visų aukštesniųjų eukariotų organizmų.

ARSazių kompleksų dydis ir sudėtis įvairiose rūšyse skiriasi, be to, priklauso ir nuo

fiziologinės būklės bei nuo amţiaus.

ARSazių kompleksai gali būti asocijuoti su ląstelės membrana ir gali surišti

aminorūgštis iš tarpląstelinės terpės, tuo tarpu laisvi fermentai suriša ląstelės citoplazmoje

esančias aminorūgštis.

ARSazės yra labai specifiški fermentai ir tikslūs atpaţindami tiek aminorūgštis, tiek

tRNR. Šie fermentai pasiţymi savęs pasitikrinimo savybe. Hidrolitinis patikrinimas

ARSazėms yra pagrindinis, tačiau egzistuoja ir kiti savęs pasitikrinimo keliai, pvz., tirozino

ARSazė 104 karto stipriau prijungia minėtą aminorūgštį (dėl turimos OH-grupės) nei

fenilalaniną.

Specifinės ARSazės atlieka daugybę naujų, neįprastų funkcijų, tokių, kaip dalyvavimas

aminorūgščių sintezėje, ląstelės ciklo kontrolėje, RNR splaisinge, tRNR transporte iš

branduolio į citoplazmą eukariotinėse ląstelėse ir DNR replikacijoje. Stebinanti funkcijų

įvairovė parodo šio fermento plastiškumą ir sugebėjimą prisitaikyti baltymų sintezės procese.

4 seminaras

Potransliacinis baltymų paskirstymas ir modifikavimas (3 val.)

Paskutiniojo baltymų biosintezės etapo metu naujai susintetinta polipeptido grandinė

įgauna atitinkamą erdvinę struktūrą ir biologiškai aktyvią formą. Natyvinė baltymo konformacija

susidaro veikiant vandeniliniams ir van der Valso (angl. Waals) ryšiams, joninėms ir

hidrofobinėms sąveikoms. Tačiau dauguma naujai susintetintų baltymų dar nėra biologiškai

aktyvūs – jie daugiau ar maţiau modifikuojami. Tokios modifikacijos vadinamos

posttransliacinėmis modifikacijomis.

Polipeptido N ir C galų modifikacijos. Polipeptido pradţioje yra iniciacijos aminorūgštis

– N-formil-metioninas (bakterijų) arba metioninas (eukariotų). Formilo grupė ar metioninas

(daugiausia ir C galo aminorūgštis) yra pašalinami fermentiniu būdu. Daugiau kaip 50 proc.

eukariotų baltymų N-galinės aminorūgšties aminogrupė po transliacijos yra N-acetilinama. C

galo aminorūgštys kartais taip pat yra modifikuojamos.

Signalinių sekų pašalinimas. Tam tikrų baltymų seka iš 15-30 aminorūgščių, esančių

polipeptido N gale, nukreipia baltymą į jo paskirties vietą ląstelėje. Tokias signalines sekas

brendimo metu galutinai pašalina specifinės peptidazės.

Individualiųjų aminorūgščių modifikacijos. Tam tikrų baltymų aminorūgščių – Ser, Thr

ir Tyr – hidroksigrupės, dalyvaujant ATP, fermentiniu būdu yra fosforilinamos. Fosfatinės

grupės polipeptidui suteikia neigiamąjį krūvį. Funkcinė šios modifikacijos reikšmė įvairiems

baltymams yra įvairi. Pavyzdţiui, pieno baltymas kazeinas turi daug fosfoserino grupių,

sujungiančių Ca2+

. Fosforilinimo-defosforilinimo ciklas valdo daugelio fermentų ir

reguliavimo baltymų aktyvumą.

Prie kai kurių baltymų tam tikrų aminorūgščių, pvz., Glu, prijungiama papildoma

karboksigrupė. Pavyzdţiui, kraujo krešėjimo baltymas protrombinas turi kelis γ-

karboksiglutamatus N-galiniame regione. Karboksigrupių prijungimą katalizuoja fermentas,

kurio aktyvumui būtinas vitaminas K. Šios karboksigrupės sujungia Ca2+

jonus, būtinus kraujo

krešėjimo iniciacijai.

Monometil- ir dimetillizino turi raumenų baltymai ir citochromas c. Daugumos

organizmų Ca2+

sujungiantis baltymas kalmodulinas specifinėje savo struktūros vietoje turi vieną

trimetilliziną. Kitų baltymų metilinant Glu karboksigrupę, pašalinamas neigiamasis molekulės

krūvis.

Sacharidų prijungimas. Po polipeptido biosintezės kovalentiškai prijungiami sacharidai.

Daugumos glikoproteinų sacharidas fermentiniu būdu yra prijungiamas daţniausiai prie Asn

(N-ryšiu prijungtas oligosacharidas) arba prie Ser ar Thr (O-ryšiu prijungtas oligosacharidas).

Dauguma neląstelinių baltymų, pvz., proteoglikanų, turi oligosacharidines grandines.

Izoprenilo grupių prijungimas. Keletas eukariotų baltymų yra modifikuojami prijungiant

prie jų izoprenilo grupes. Tioesterinis ryšys susidaro tarp izoprenilo grupės ir baltymo

aminorūgšties cisteino – Cys. Izoprenilo grupė yra kilusi iš cholesterolio biosintezės

fosforilintų tarpinių produktų, tokių kaip farnezildifosfatas. Vykstant šiai modifikacijai

dalyvauja specialus baltymas Ras (jis yra ras onkogeno ir protoonkogeno produktas), G

baltymas ir baltymai laminai, esantys branduolio matrikse. Tam tikrais atvejais izopreno

grupės padeda baltymui prisitvirtinti membranoje. Transformuotas onkogeno Ras aktyvumas

prarandamas, kai Ras baltymo izoprenilinimas yra blokuojamas šios posttransliacinės

modifikacijos inhibitoriais, vartojamais vėţio chemoterapijai.

Prostetinių grupių prijungimas. Daugumos prokariotų ir eukariotų baltymų aktyvumui

būtinos kovalentiniu ryšiu prijungtos prostetinės grupės. Pavyzdţiui, biotino molekulės

prijungimas prie fermento acetil-CoA karboksilazės ir hemo – prie citochromo c.

Proteolizinis brendimas. Dauguma baltymų sintetinami didelių molekulių baltymų

pirmtakių pavidalu, ir aktyvios jų formos susidaro tik tuomet, kai sumaţėja molekulė. Pavyzdţiui,

insulinas, tam tikri virusų baltymai ir proteazės (tripsinas ir chimotripsinas).

Disulfidinių ryšių susidarymas. Susidarius tretinei struktūrai ir baltymo molekulei

įgavus natyvinę konformaciją, kai kuriuose baltymuose tarp polipeptidinių grandinių susidaro

disulfidiniai ryšiai (tarp Cys liekanų). Jie daţniausiai susidaro baltymuose, kurie eksportuojami

iš eukariotinės ląstelės. Disulfidiniai ryšiai palaiko baltymo molekulės natyvinę konformaciją.

Eukariotų baltymų nukreipimas į jų paskirties vietą

Kad ląstelės normaliai funkcionuotų ir galėtų sudaryti savo struktūras bei organeles,

būtinas tam tikras baltymų ir fermentų rinkinys. Beveik visi baltymai sintetinami ant citozolio

ribosomų ir po transliacijos nukreipiami į jų paskirties vietą. Vieni sekretuojami iš ląstelės, kiti

integruojami į plazminę membraną, tam tikri patenka į lizosomas, mitochondrijas ar branduolius

arba pasilieka citozolyje. Jei naujai susintetinti baltymai skirti mitochondrijoms, chloroplastams

(augalų) ar branduoliams, tai jie iš pradţių yra atitinkamai modifikuojami. Modifikacijos

prasideda endoplazminiame tinkle (ET). Jos yra susijusios su trumpa aminorūgščių seka –

signaline seka. Nustatyta šimtai tokių sekų. Jų struktūrą, savybes ir funkcijas 1970 m. nustatė D.

Sabatinis ir G. Blobelis. Signalinė seka nukreipia baltymą į jo paskirties vietą. Ji yra

polipeptido N gale. Šią seką daţniausiai turi lizosominiai, membraniniai ir sekreciniai baltymai.

Signalinę seką pašalina signalinė peptidazė, nutraukdama peptidinį ryšį sekos C gale (iš

karboksi-grupės pusės) po to, kai baltymas jau patenka į ET. Signalinė seka sudaryta iš 13-36

aminorūgščių. Jai būdingos tam tikros bendros savybės: 1) signalinė seka turi apie 10-15

hidrofobinių aminorūgščių; 2) N gale prieš hidrofobinę seką yra viena ar daugiau aminorūgščių,

turinčių teigiamąjį krūvį; 3) prie C galo (netoli kirpimo vietos) yra trumpa polinė seka, turinti

trumposios grandinės aminorūgščių (pvz., Ala). Baltymai, turintys signalines sekas, sintetinami ant

ribosomų, prisitvirtinusių prie ET. Tokių baltymų N galo signalinė seka nurodo, kad sintetinamas

polipeptidas, atsiskyręs nuo ribosomos, pateks į ET spindį. Polipeptidinė grandinė aktyviai

pertempiama pro endoplazminio tinklo membraną. Naujai sintetinamo polipeptido kelias nuo

ribosomos į ET jau prasideda baltymo biosintezės iniciacijos ant laisvųjų ribosomų metu.

Signalinė seka sintetinama pirmiausia, nes ji turi N galą. Kai tik signalinė seka pasirodo iš

ribosomos, ji tuoj pat sujungiama su didele signalinę seką atpažįstančia dalele – SRP (angl.

signal recognition particle). SRP yra lazdelės formos kompleksas. Jį sudaro 300 nukleotidų

ilgio RNR (7SL-RNR) ir šeši skirtingi baltymai (bendra molekulinė masė 325 kDa). Vienas

SRP subvienetas tiesiogiai jungiasi prie signalinės sekos ir, blokuodamas aminoacil-tRNR

įsijungimą, inhibuoja elongaciją ir peptidiltransferazę. Kiti baltyminiai SRP subvienetai (α- ir

β-) jungiasi su GTP ir ją hidrolizuoja. SRP receptorius yra heterodimeras: jį sudaro α- (mol.

masė 69 kDa) ir β-subvienetai (mol. masė 30 kDa).

Paskui SRP jungiasi su GTP. Polipeptido elongacija sustabdoma, kai jo ilgis pasiekia apie

70 aminorūgščių, o signalinė seka yra nutolusi nuo ribosomos. GTP ir SRP nukreipia ribosomą

(vis dar susijungusią su mRNR) ir neuţbaigtą sintetinti polipeptidą SRP receptoriaus link,

esančio ET citozolinėje pusėje. Naujai susintetintą polipeptidą jau ET spindyje atskiria

peptidtranslokacijos kompleksas, kuris tiesiogiai sąveikauja su ribosoma. SRP disocijuoja

nuo ribosomos; disociacijos metu įvyksta GTP hidrolizė.

Signalinę seką ET viduje pašalina signalinė peptidazė, esanti ET spindyje. Ribosomos

disocijuoja ir ciklas prasideda iš naujo.

ET spindyje vyksta naujai susintetinto baltymo modifikacijos. Pašalinus signalinę seką,

susiformuoja atitinkama erdvinė polipeptido struktūra, susidaro disulfidiniai ryšiai, ir daugelis

baltymų yra glikozilinami. Beveik prie visų baltymų, susintetintų ant susijusių su membranomis

polisomų, kovalentiškai prisijungia viena ar keletas sacharidinių grupių. Per Asn N-ryšiu

daţniausiai prijungiami įvairūs oligosacharidai (N-acetilgliukozaminas, manozė, gliukozė).

Baltymams būdingas vienas bendras poţymis – visi jie jungiasi prie bendros oligosacharidinės

šerdies, savo ruoţtu prisijungusios prie dolicholio fosfato.

Baltymo glikozilinimą katalizuoja fermentas transferazė, esanti ET spindţio paviršiuje.

Ją slopina kai kurie antibiotikai, pvz., tunikamicinas. Iš ET pernašos pūslelės susidariusius

glikoproteinus perneša į Goldţio kompleksą, kur oligosacharidinės liekanos trumpinamos ir

galutinai glikozilinamos. Goldţio komplekse glikoproteinai rūšiuojami, paruošiami sekrecijai pro

plazminę ląstelės membraną ir siunčiami pagal paskirtį arba patenka į lizosomas (pvz., baltymų,

patenkančių į lizosomas, signalas N-ryšiu prijungtuose oligosachariduose yra viena ar daugiau

manozės-6-fosfato liekanų).

Baltymų pernaša į branduolį.

Baltymai, nešami iš citozolio į branduolį, taip pat turi nukreipiančias signalines sekas.

Pavyzdţiui, ribosominiai baltymai yra sintetinami laisvose citozolinėse ribosomose ir

pernešami į branduolį. Čia, susijungę su rRNR, sudaro didįjį (60S) ir maţąjį (40S)

ribosomos subvienetus. Ribosomų subvienetai iš branduolio grąţinami atgal į citozolį. Įvairūs

branduolio baltymai (RNR ir DNR polimerazės, histonai, topoizomerazės, genų ekspresiją

valdantys baltymai ir kt.) sintetinami citozolyje ir tik paskui siunčiami į branduolį. Pernašą

atlieka sistema, kurią sudaro atitinkami molekuliniai signalai ir pernašos baltymai.

Branduolio apvalkalas ląstelės dalijimosi metu suskyla (būdinga daugumai daugialąsčių

eukariotų). Po ląstelės dalijimosi jis vėl atsinaujina, o išsibarstę branduolio baltymai vėl

reimportuojami atgal į branduolį. Branduolio baltymai turi specialią signalinę seką (NLS;

angl. nuclear localization sequence), kuri tam tikrą baltymą nukreipia į branduolį. Skirtingai

nuo sekų, kurios baltymą nukreipia į ET, sekos, nukreipiančios baltymą į branduolį,

neatskeliamos ir nepašalinamos.

Vykstant baltymo pernašai į branduolį dalyvauja baltymas importinas (sudarytas iš a-

ir β-subvienetų) ir maţa GTPazė, vadinama Ran. Tarp citozolio ir branduolio vyksta ciklinis

baltymų pernašos procesas. Heterodimerinis importinas atlieka baltymų, nešamų į branduolį,

receptoriaus funkciją. Jo a- subvienetas citozolyje jungiasi su nešamo baltymo NLS seka.

Prisijungus β-subvienetui, susidaro kompleksas – NLS-nešamas baltymas-importinas ir,

dalyvaujant Ran (GTPazei; pernašos mechanizmas priklauso nuo energijos), įvyksta šio viso

komplekso translokacija pro branduolio poras (jas sudaro specialūs baltymai) į branduolio

vidų. Translokacijos metu iš komplekso disocijuoja importino subvienetai, ir baltymas,

turintis signalinę seką, patenka į nukleoplazmą. a- ir β-importino subvienetai pro branduolio

poras vėl išeina atgal į citozolį, ir ciklas kartojasi iš naujo.

Baltymų pernaša į ląstelę receptorinės endocitozės būdu.

Tam tikri baltymai, pvz., maţo tankio lipoproteinai (MTL), geleţį pernešantis baltymas

feritinas, peptidiniai hormonai, baltymai, skirti suardyti ląstelės viduje ir kt. – iš ląstelę supančios

aplinkos patenka į jos vidų. Nešamas baltymas jungiasi prie plazminės membranos receptorių

(receptorinių baltymų), kuriems, koncentruojantis plazminės membranos paviršiaus vienoje

vietoje, susidaro dangalinė įduba, kurią citoplazmos pusėje dengia uţdarosios struktūros

poliedrinio baltymo klatrino sluoksnis. Klatrinas padengia nuo Goldţio aparato atsiskiriančias

pūsleles. Receptorinės endocitozės būdu citoplazmoje atsidūrusios pūslelės yra nepatvarios ir per

kelias sekundes suyra, atskirdamos klatrino apvalkalą ir plazmine membrana apgaubtą vidinį turinį.

Klatrinas vėl įsiterpia į plazminę membraną, o vidinis turinys susilieja su endosomomis. Klatrinas

yra būtinas atrankiajai stambiamolekulinių junginių pernašai, vykstančiai tarpininkaujant

receptoriams. Pūslelės ir jos turinio naudojimas priklauso nuo to, kuris ligandas (makromolekulė,

prisijungianti prie receptoriaus) yra jos viduje. Jei į ląstelę patenka hormonas, kurio funkcija

ląstelėje yra reguliacinė, jis suvirškinamas kartu su visu receptoriumi, vos tik pūslelė susilieja su

endosoma. Jei į ląstelę patenka cholesterolis (MTL sudėtinė dalis), pūslelės membrana, o kartu su

ja ir receptoriai, grąţinami į plazminę membraną arba pūslelė gali keliauti prie kitų membraninių

darinių. Receptorinės endocitozės būdu į ląstelę patenka toksinai ir virusai. Pavyzdţiui, šiuo būdu

patenka difterijos toksinas, choleros toksinas, gripo virusas.

Baltymų pernaša į mitochondrijas.

Beveik visus mitochondrijų baltymus koduoja branduolio DNR. Po transliacijos

citoplazmoje jie pernešami į mitochondrijas. Baltymų pirmtakai, skirti mitochondrijoms, N gale

turi seką, prie kurios jungiasi citozoliniai baltymai šaperonai.

Mitochondrijų baltymų signalinę seką sudaro apie 20-35 aminorūgščių seka, kurioje yra

daug Ser, Thr ir bazinių aminorūgščių. Mitochondrinių baltymų pirmtakai prijungiami prie

Hsp 70 baltymo (šiluminio šoko baltymo 70) arba prie specifinio mitochondrijų baltymo MSF

(patekimą į mitochondrijas skatinantis faktorius). Šie abu baltymai priklauso šaperonų klasei.

Jie stabilizuoja nesulankstytą baltymų pirmtakų konformaciją. MSF baltymai yra specifiniai

mitochondrijoms; Hsp 70 priklauso bendrai šaperonų baltymų klasei; jų turi bakterijos ir

eukariotų ląstelės.

Susijungę su šaperonais, mitochondrijų baltymų pirmtakai pernešami ant baltymų

komplekso, vadinamo Tom – mitochondrinis receptorius (pernašai pro išorinę membraną).

Tom kompleksas sukuria kanalą pro išorinę membraną. Antrasis baltyminis kompleksas,

ţinomas kaip Tim (skirtas pernašai pro vidinę membraną), perkelia baltyminį pirmtaką į

mitochondrijų matriksą. Translokacijai būtina energija, kuri išsiskiria sąveikaujant

mitochondriniam Hsp 70 baltymui (mHsp 70) su ATP arba GTP; kartais translokaciją lengvina

transmembraninis elektrocheminis potencialas. Mitochondrijų viduje baltymai įgauna tam tikrą

erdvinę struktūrą su tam tikrų šaperonų (tarp jų ir mHSP 70) pagalba, o signalinę seką pašalina

specifinė brendimo proteazė, esanti matrikse.

Mitochondrinio signalo sekos turi „stop“ pernašos signalų. Kai šis signalas, pernešant

mitochondrinį baltymą pirmtaką pro membranos kanalą atpaţįstamas ir kai hidrofobinė

aminorūgščių dalis atsiranda tarp išorinės ir vidinės membranų, translokaciją trumpam

sustabdoma. Tuomet baltymas atsiskiria ir integruojasi į membraninius baltymus. Kitais

atvejais sekos, atsiradusios vidinėje membranoje, yra skaidomos ir sudaro tarpmembraninio

tarpo tirpius baltymus.

Metodinis dalyko programos aprūpinimas

Studijoms rekomenduojama pagrindinė literatūra:

Eil.

Nr.

Leidinio

pavadinimas Leidinio autorius

Leidimo metai ir

leidykla

1. Biochemija Praškevičius A., Ivanovienė L.,

Stasiūnienė N. ir kt.

2003, KMU Spaustuvė

2. Biochemija Praškevičius A., Ivanovienė L.,

Stasiūnienė N. ir kt.

2006, Vitae Litera

3. Textbook of

biochemistry with

clinical correlations

Devlin T. 1997, Wiley and sons

4. Principles of

biochemistry with a

human focus

Garrett R., Grisham C. 1997, Thomson

learning

5. Biochemistry Stryer L. 1998, Freeman and Co

6. Fundamental of

biochemistry

Voet D., Voet J., Pratt C. 1999, John Wiley and

sons

7. Molecular biology

techniques

Ream W., Field K. 1999, Academic press

8. Molecular biology of

the cell

Alberts B., Johnson A., Lewis J.,

Raff M., Roberts K., Walter P.

2002, Garland science

9. Biochemistry Berg J., Tymoczko J., Stryer l. 2002, Freeman and Co

Savarankiškam darbui rekomenduojama papildoma literatūra:

Eil.

Nr.

Leidinio pavadinimas Leidinio autorius Leidimo metai ir

leidykla

1. Protein synthesis and

ribosome structure.

Nierhaus K.H., Wilson D.N. 2004, Wiley-VCH

Verlag GmbH&Co.

KGaA

2. The structure and

function of initiation

factors in eukaryotic

protein synthesis.

Pestova T. V., Hellen C. U. T. Cellular and Molecular

Life Sciences. 2000. Vol.

57. P. 651-674.

3. The new aspects of

aminoacyl-tRNA

synthetases.

Szymanski M., Deniziak M.,

Barciszewski J.

Acta Biochim. Polon.

2000. Vol. 47. P. 821-

834.

4. Protein synthesis:

twenty three amino

acids and counting.

Ibba M., Stathopoulos C., Soll

D.

Current Biology. 2001.

Vol. 11. P. R563-R565.

5. Molecular mechanisms

of translation initiation

in eukaryotes.

Pestova T. V., Kolupaeva V.

G., Lomakin I. B., Pilipenko E.

V., Shatsky I. N., Agol V. I.,

Hellen C. U. T.

Proc. Natl. Acad. Sci.

USA. 2001. Vol. 98. P.

7029-7036.

6. The ribosome in focus. Maguire B. A., Zimmermann

R. A.

Cell. 2001. Vol. 104. P.

813-816.

7. Aminoacyl-tRNA

synthetases and

aminoacylation of

tRNA in the nucleus.

Mucha P. Acta Biochim. Polon.

2002. Vol. 49. P. 1-10.

8. Regulation of

mammalian translation

factors by nutrients.

Proud C. G. Eur.J. Biochem. 2002.

V. 269. P. 5338-5349.

9. After the ribosome

structure: how are the

subunits assembled?

Williamson J. R. RNA. 2003. Vol. 9. P.

165-167.

10. After the ribosome

structure: how does

translocation work?

Moore P.B., Steitz T.A. RNA. 2003. Vol. 9. P.

155-159.

11. After the ribosome

structure: how does

translocation work?

Joseph S. RNA. 2003. Vol. 9. P.

160-164.

12. Aminoacyl-tRNA

synthetase complexes:

beyond translation.

Lee S.W., Cho B.H., Park

S.G., Kim S.

J. Cell Sci. 2004. Vol.

117. P. 3725-3734.

13. tRNA maturation:

RNA polymerization

without a nucleic acid

template.

Weiner A.M. Current Biology. 2004.

Vol. 14. P. R883-R885.

14. Ribozymes:

applications to

functional analysis and

gene discovery

Shiota M., Sano M.,

Miyagishi M., Taira K.

J. Biochem. 2004. Vol.

136. P. 133-147.

15. Mechanisms of

elongation on the

ribosome: dynamics of

a macromolecular

machine.

Wintermeyer W., Peske F.,

Beringer M., Gromadski K.B.,

Savelsbergh A., Rodnina M.V.

Biochemistry Society

Transactions. 2004. Vol.

32 (part 5). P.733-737.

16. Mammalian target of

rapamycin inhibition

Dutcher J. P. Clinical Cancer

Research. 2004. Vol. 10.

P. 6382s-6387s.

17. Recent progress of

structural biology of

tRNA processing and

modification.

Nakanishi K., Nureki O. Mol. Cells. 2005. Vol.

19. P. 157-166.

18. Occurrence of the

aminoacyl-tRNA

synthetases in high-

molecular weight

complexes correlates

with the size of

substrate amino acids.

Wolfson A., Knight R. FEBS Lett. 2005. Vol.

579. P. 3467-3472.

19. Aminoacyl-tRNA

synthesis.

Cochella L., Green R. Curr. Biol. 2005. Vol.

15. P. R536-R540.

20. Prospects for

aminoacyl-tRNA

synthetase inhibitors as

new antimicrobial

agents.

Hurdle J.G., O'Neill A.J.,

Chopra I.

Antimicrob. Agents

Chemother. 2005. Vol.

49. P. 4821-4833.

21. Antibiotics and the

ribosome.

Tenson T., Mankin A. Molecular Microbiology.

2006. Vol. 59. P. 1664-

1667.

25. Mitochondrial DNA

medicine.

Dimauro S. Biosci. Rep. 2007. Vol.

27: 5-9.

26. Aminoacyl-tRNA

synthetases: essential

and still promising

targets for new anti-

infective agents.

Ochsner U.A., Sun X., Jarvis

T., Critchley I., Janjic N.

Expert. Opin. Investig.

Drugs. 2007. Vol. 16:

573-593.

27. Ribozyme catalysis of

metabolism in the RNA

world.

Chen X, Li N, Ellington AD. Chem. Biodivers. 2007.

Vol. 4: 633-655.

28. http://www.accessexce

llence.org/RC/VL/GG/

protein_synthesis.html

29. http://www.emc.maric

opa.edu/faculty/farabee

/biobk/BioBookPROTS

Yn.html

30. http://web.indstate.edu

/thcme/mwking/protein

-synthesis.html

31. http://users.rcn.com/jki

mball.ma.ultranet/Biolo

gyPages/T/Translation.

html#polysomes