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This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.
Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.
924 NOTIZEN
Zur Kenntnis des Molekulargewichtes von Peptidsynthetasen aus Leber und H efe
J. D imigen, F. K link und D . R ichter
Institut für physiologische Chemie und Physikochemie der Universität Kiel
(Z. Naturforschg. 20 b , 924— 925 [1965] ; eingegangen am 23. Ju li 1965)
Die polysomale Peptidsynthese wird durch mindestens zwei verschiedene Enzyme katalysiert. Aus E. c o l i 1, R eticulocyten2, Leber 3-5 und Hefe 6 wurden bisher je ein sehr labiler und ein wesentlich weniger empfindlicher Transferfaktor angereichert. Bei Reticulocyten2 und L eber7 scheint der labile Faktor die Anlagerung von tRNS 11 an Ribosomen zu beeinflussen, so daß man dem stabileren Enzym die unmittelbar Pep- tid-knüpfende Wirkung zuschreiben darf. Keiner dieser Faktoren wurde bisher soweit gereinigt, daß eine Bestimmung physikochemischer Konstanten möglich war. Gelfiltration an Dextrangelen erlaubt jedoch bei vielen globulären Proteinen eine recht genaue Abschätzung der Molekulargröße auch ohne Reindarstellung 8>9. Wir wendeten diese Methode auf stark angereicherte Präparationen des stabileren Faktors (F I) aus Leber und Hefe an.
Protein Reinheitsgrad Bezugsquelle Mol.-Gew.
j’-Globulin Behring(Rind) trocken, reinst (Marburg) 160 000
Serumalbumin, Behringdimer (Rind) trocken, reinst (Marburg) 134 000
Creatinphospho- Boehringerkinase p. a. (Mannheim) 81 000
Serumalbumin Behring(Rind) trocken, reinst (Marburg) 67 000
Eieralbumin 5-mal krist., Servareinst (Heidelberg) 45 000
Rennin Krist. Nutr. Bioch. Corp., Cleveland, Ohio
34 500
Tab. 1. Standardproteine mit Mol.-Gew. (L iteraturw erte), die zur Eichung der Sephadexsäulen verwendet wurden.
Die Aktivitätsbestimmung von F I wurde durch Inkubation mit Polysomen aus Leber, 14C-Aminoacyl- tRNS, den notwendigen Cofaktoren und Ionen sowie einem Überschuß von F II durchgeführt (Einzelheiten s. Abb. 2 ).
Methoden
Zur Abtrennung des Enzyms von dem labileren Faktor (F II) und zur weiteren Anreicherung verwendeten wir neben den früher beschriebenen chromatographischen Verfahren mit TEAE-Zellulose5 mehrere Ammoniumsulfat-Fraktionierungsschritte und Gelfiltration an Sephadex G 25 und G 200 7.
100
90 Adenosin
^<J 0
c- 7 0 h Renninr - .. . / \ Ser-Albumin Eieralbumm/ \ / ,
F I (Leber)
yy-GlobulinCPK
Ser-Albumin'(dimer)
Abb. 1. Mit Standardproteinen gewonnene Eichkurve zur Bestimmung von Mol.-Gew. durch Gelfiltration an Sephadex G 200. Das durchbrochene Kästchen gibt den Bereich, in dem die für FI aus Ratten- und Kalbsleber in verschiedenen
Experimenten ermittelten W erte liegen.
Ribosomen\
3,4 3,6 3,6 4,0 4,2 4.4 4,6 4fi 5,0 5,2 5.4 5,6 5.8 log Molekulargewicht — ►
Abb. 2. Trennung von FI aus Rattenleber, CPK, y-Globulinund Adenosin an Sephadex G 200. Transparenz ---------- ;Transferenzymaktivität o ------ O. Das Testsystem 11 enthieltin l ml : 8 uMol M g(CH3COO)2; 100 ,uMol KCl; 5 0 //M ol Tris (pn 7,6) ; 30 ,«Mol MEA; 2 ,wMol A T P; 0,33 ^M ol G TP; 4/^M ol P E P ; 25 [xg PK ; 5,0 Ext. Einh. (260 nm )/ lc m Rattenleber-Polysomen; 50 [xg 14C-Aminoacyl—tRNS = 3000 Ipm /m in; 0,2 ml F II aus Hefe; 0,3 ml der bezeich- neten Eluatfraktionen. Aufarbeitung der m arkierten P roteine durch TCE-Fällung, Waschung mit heißer TCE, Alkohol-Äther, Ä ther; Aktivitätsmessung im Methandurchfluß-
zähler.
1 J. E. A l le n d e , R. M onro u . F . L ip m a n , P r o c . n a t . A c a d . S e i. U S A 51, 1211 [1964].
2 R. A r l in g h a u s, J. S h a e f fe r u . R. S ch w eet , P r o c . n a t . A c a d . S e i. U S A 51, 1291 [1964].
3 J. M . F e s s e n d e n u . K. M o l d a v e , J. biol. Chemistry 238, 1479 [1963].
4 S . S l a p ik o f f , J. M . F e s s e n d e n u . K. M o l d a v e , J. biol.Chemistry 238, 3670 [1963].
5 F. K lin k , A . M. N o u r u . K . F. A ep in u s, Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 72, 654 [1963].
8 F. K lin k u . D. R ic h te r , in Vorbereitung.7 G. K ramer, F. K link u. H. G. P etersen , in Vorbereitung.8 P . A n d re w s , Biochem. J. 9 1 , 222 [1964].9 F. A u r ic c h io u . C. B . B ru n i, Biochem. Z. 3 4 0 , 321 [1964].
10 J. B ish op u . R. S c h w e e t , Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 4 9 , 235 [1961].
NOTIZEN 9 2 5
Gelfitration: Sephadex G 200 wurde 72 Stdn. in Puffer (0,05-m. Tris, 0,1-m.KCl, 0,008-m. Mg(CH3COO)2 , PH 7,6) gequollen. Die Säule (Vol. 90 ml; 550 -14 mm) wurde nach dem Gießen 48 Stdn. mit Puffer durchströmt, das äußere Volumen mit Ribosomen oder D extranblau, das innere mit Adenosin bestimmt, die Extinktion des Eluates im Durchflußphotometer bei 254 nm gemessen und die Lage der Gipfel durch zusätzliche Messung bei 280 bzw. 260 nm präzisiert. Zur Kalibrierung der Säulen wurden reine Proteine mit bekanntem Mol.-Gew. verwendet (s. Tab. 1 ). Bei loga- rithmischer A uftragung8 der Mol.-Gew. gegen das Elutionsvolumen (Abb. 1) ergab sich eine über weite Bereiche lineare Abhängigkeit.
Ergebnisse
Abb. 2 zeigt eine Auftrennung eines Gemisches von F I, Creatinphosphokinase (C PK ), y-Globulin und Adenosin an Sephadex G 200. Die Transfer-Enzymaktivität
wurde in einem einheitlichen Gipfel eluiert. Die aktiven Fraktionen hatten in Abwesenheit von F II keine Wirkung im Testsystem. Die Elutionsvolumina für F I-Prä- parate aus Ratten- und Kalbsleber ergaben Mol.-Gew. zwischen 89 000 und 95 000. Bei Anwesenheit von 0,005-m. MEA 11 im Elutionsmedium zeigte sich keine Verschiebung des Aktivitätsgipfels. Ein Einfluß der für die Transferreaktion unentbehrlichen Sulfhydrylsub- stanzen10 auf die Molekulargröße (etwa durch Desaggregation) ist somit nicht feststellbar. Die deutlich geringeren Werte — etwa 80 000 — die an F I aus Hefe gemessen wurden, bedürfen der Sicherung durch weitere Experimente.
Frl. I. L a n g e sind wir für sorgfältige technische M itarbeit, der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t für die Unterstützung dieser Arbeit zu Dank verpflichtet.
11 Abkürzungen: ATP = Adenosintriphosphat. G TP = Gua- nosintriphosphat. PE P = Phosphoenolpyruvat. PK = Pyruvatkinase. tRNS = Transfer-Ribonucleinsäure. TCE = Trichloressigsäure. MEA = 2-Mercaptoaethylamin.
Zur Abhängigkeit der photosynthetischen NADP-Reduktion
von Plastocyanin
A. T rebst und E . E lstner
Pflanzenphysiologisches Institut der Universität Göttingen, Abt. Biochemie der Pflanzen
(Z. Naturforschg. 20 b, 925— 926 [1965]; eingegangen am 3. A ugust 1965)
Hinweise für eine Funktion des von K a t o h und T a- k a m iy a isolierten Plastocyanins 1 in der Photosynthese ergaben sich aus einer Reihe von Ergebnissen. Die photosynthetischen Reaktionen isolierter Chloroplasten wurden durch Cu-Komplexbildner, insbesondere Salicyl- aldoxim 2, gehemmt, die Cytochrom c-Photooxydation in Digitonin-fragmentierten, Plastocyanin-freien Chloroplasten ist Plastocyanin-abhängig 3, die Absorption bei 600 mju (Absorptionsmaximum des Plastocyanins) ändert sich bei Belichtung der Algen unter verschiedenen Bedingungen4 und reduziertes Plastocyanin wird durch das Pigmentsystem 1 der Photosynthese oxydiert 5. Diese Versuche stimmten darin überein, daß
1 S. K a t o h , Nature [London] 1 8 6 , 533 [1960] ; S. K a t o h u. A. T a k a m iy a , N ature [London] 1 8 9 , 665 [1961] ; S . K a t o h , I. S u g a , I. S h ir a t o r i u. A. T a k a m iy a , Arch. Biochem. Biophysics 9 4 , 136 [1961].
2 A. T r e b s t , Z. Naturforschg. 1 8 b, 817 [1963]; A. T r e b s t , H. E c k u . S. W a g n e r , in : „Photosynthetic Mechanism of Green Plants“ , National Academy of Sciences — National Research Council, Washington 1963.
3 S. K a t o h u. A. T a k a m iy a , in: „Photosynthetic Mechanisms of Green P lants“, National Academy of Sciences — National Research Council, W ashington 1963; S. K a t o h
u. A. T a k a m iy a , Plant Cell Physiol. 4, 335 [1963].4 J. d e K o u c h k o v s k y u . D. C. F o r k , Proc. nat. Acad. Sei.
USA 52, 232 [1964] ; D. C. F o r k u . W. U r b a c h , Proc.nat. Acad. Sei. USA 53,1307 [1965].
Plastocyanin als „electron carrier“ zwischen den beiden Lichtreaktionen der Photosynthese einzuordnen ist.
W ir m öchten h ie r ü b e r eine einfache M ethode b e rich ten , die P lasto cy an in -A b h än g ig k e it d e r N A D P -R ed u k tio n zu zeigen. S ie b a u t au f den V ersuchen von N iem an u nd V e n n e s la n d 6, K a t o h 3 u nd K ok 5 m it De- te rg en z-frag m en tie rten C h lo ro p lasten au f. Solche C h lo ro p la sten h ab en die F äh ig k e it zur 0 2-E ntw icklung v e rlo ren , können a b e r — im G egensatz zu u n b e h an d e lten C h lo ro p lasten — redu zierte s Cytochrom c p h o to o xyd ieren . W h a tle y 7 zeig te, d aß d iese C ytochrom c- O x y d a tio n frag m e n tie rte r C h lo ro p lasten auch zu r R e d u k tio n von N A D P verw endet w erden k an n , w enn F e rred o x in u n d F erred o x in -N A D P -R ed u k tase zugesetzt w erden . N iemann u n d V e n n es lan d 6 fan d en , d aß Ä thanol- F ä llu n g solcher f rag m e n tie rte r C h lo ro p lasten zu P a r t i k e ln fü h rt , d ie Cytochrom c e rs t nach Z u g ab e e ines F a k to rs au s dem Ü b ers tan d p h o to o x id ierten , den K a to h u n d T a k a f i y a 3 als P la s to cy an in iden tifiz ie rten . D ie A rb e ite n von K ok 5 zeigen deutlich , d aß d as P ig m en tsystem 1 d e r P h o to syn these nach D e terg enz-B ehand lung in ta k t geb lieben ist u n d daß es P la s to cy an in u n d C ytochrom f bei B elich tung oxydiert. W ir zeig ten kürzlich 8,
5 B. K o k , in: „Photosynthetic Mechanisms of Green Plants“ , National Academy of Sciences — National Research Council, Washington 1963; B. K o k , H . J . R u r a in s k i u . E. A. H a r m o n , Plant Physiol. 39, 513 [1964] ; B. K o k u . H . J . R u r a in s k i , Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 94, 588 [1965].
6 R. H. N ie m a n u . B. V e n n e s l a n d , Plant Physiol. 34, 255 [1959]; R. H. N ie m a n , H. N a k a m u r a u . B. V e n n e s l a n d , Plant Physiol. 34, 262 [1959].
7 F. R. W h a t l e y , in: „Photosynthetic Mechanisms of Green P lan ts“ , National Academy of Sciences — National Research Council, Washington 1963.
8 A. T r e b s t u. E. P is t o r iu s , in: „Beiträge zur Biochemie und Physiologie von Naturstoffen“ , Festschrift zum 65. Geburtstag v. K . M o t h e s , VEB Fischer Verlag, Jena 1965.