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This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.
Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.
STRUKTURUNTERSUCHUNGEN AM KALLIKREIN-INAKTIVATOR AUS RINDERLUNGE I 4 5 7
Nr. System [IpM]
1 komplett 4332 - ATP, GTP, UTP 2103 - GTP, UTP 4724 - UTP 4705 0 Min. inkubiert 326 + Ribonuelease 10 y 35
Tab. 2. Einbau von Cytosin in Polynucleotide durch Überstände aus Blattextrakten. Einfluß der anderen Nucleosid-
triphosphate.
Diskussion
Die Um w andlung von A TP in Adenin durch das angereicherte E nzym präparat aus T abakblättern e rfolgt offenbar in einer m ehrstufigen Reaktion, an der sowohl Phosphatasen als auch eine Nucleosidase beteiligt sind. Die Reaktion kann schematisch folgenderm aßen beschrieben w erden :
A TP —> ADP —> AM P —> Adenosin —>■ Adenin + Ribose
H ierfür spricht, daß der A bbau vermieden werden kann, wenn der erste Schritt, nämlich die Um wand
lung von ATP in ADP, verhindert w ird. Bei Beachtung dieser Vorsichtsm aßregel ließ sich eine schwache Polym erase-W irkung in Tabakblättern nachweisen, die an Zellkerne oder auch an andere größere, nicht näher charakterisierte Partikel gebunden ist. In den Partikel-freien Ü berständen ließ sich, zum indest mit ATP als Substrat, keine Polym erase nachweisen.
Im Ü berstand scheint jedoch ein Enzym vorhanden zu sein, das einen Einbau von CTP in Polynucleotide bewirkt. Es handelt sich aber w ahrscheinlich nicht um eine Polym erase, da n u r das Fehlen von ATP, nicht aber der anderen Nucleosid-Triphos- phate den CTP-Einbau verhindert. Es kommt ein endständiger Anbau von CTP in Transfer-R N S oder andere Polynucleotide in Frage.
Die K onzentration der Polym erasen in den P flanzenextrakten ist gegenüber der in Bakterien sehr gering. Diese Tatsache sowie die Schwierigkeiten, sie von größeren Partikeln abzutrennen, bildet ein wesentliches H indernis fü r ihre genaue U ntersuchung.
Wir danken dem US P u b l i c H e a l t h S e r v i v e für finanzielle Unterstützung.
S tru k tu ru n te rsu ch u n g en am K allik re in -In ak tiv a to r aus R inderlunge
I. Molekulargewicht, Endgruppenanalyse und Aminosäure-Zusammensetzung
F. A . A n d e r e r und S. H ö r n le
Max-Planck-Institut für Virusforschung, Tübingen
(Z. Naturforschg. 20 b, 457— 4-62 [1965] ; eingegangen am 28. Januar 1965)
By determination of the sedimentation and diffusion constant a molecular weight of 6500 can be calculated for the kallikrein-inactivator from bovine lung. Under certain conditions the molecule has a tendency to dimerize. A mechanism for dimerisation is proposed. The peptide chain contains58 amino acids; it starts with H-Arg-Pro and ends with Gly-AlaOH.
Der K allikrein-Inaktivator (KI) * konnte 1928 von K r a u t et a l . 1 zum ersten Mal in R inder-Parotis nachgewiesen werden. A ußer K allikrein wird auch T rypsin und C hym otrypsin2 sowie F ib rin o ly sin 3 durch den K allikrein-Inaktivator gehemmt. Die
* Der Kallikrein-Inaktivator ist unter dem Warenzeichen Trasylol® der Farbenfabriken Bayer AG., Leverkusen, im Handel.
1 H. K r a u t , E. K . F r e y u. E. B a u e r , Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem. 175, 97 [1928].
2 E. W e r l e , L. M a i e r u . E. R i n g e lm a n n , Naturwissenschaften 39 ,328 [1952],
Reindarstellung aus R inder-Parotis gelang jedoch erst I 9 6 0 4. In einer neueren A rbeit w urde die D arstellung des gleichen Inaktivators aus Rinderlunge beschrieben 5 und die Identität m it dem aus Rinder- Parotis isolierten P rodukt sichergestellt.
3 R. M a r x , P. C l e m e n t e , E. W e h r l e u . W . A p p e l , Blut V, 3 6 7[ 1 9 5 9 ] ; H. K r a u t u . N. B h a r g a v a , Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem. 334, 2 3 6 [ 1 9 6 3 ] .
4 H. K r a u t , W. K ö r b e l , W. S c h o l t a n u . F . S c h u l t z , Hoppe- Seyler’s Z. physiol. Chem. 321, 9 0 [ 1 9 6 0 ] .
5 H. K r a u t u . N. B h a r g a v a , Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem. 338, 2 3 1 [ 1 9 6 4 ] .
4 5 8 F. A. ANDERER UND S. HÖRNLE
Die in der vorliegenden A rbeit durchgeführte chemische und physikalisch-chemische C harakterisierung des KI aus R inderlunge diente als G rundlage für die Sequenzanalyse, die in einer folgenden A rb e it6 beschrieben werden soll.
Das Mol.-Gew. des K I aus R inder-Parotis w ird in einer A rbeit von K r a u t et a l .4 m it 1 1 6 0 0 angegeben. Aus den in der vorliegenden A rbeit durchgeführten Endgruppenbestim m ungen sowie aus Bestim m ungen der Sedim entations- und D iffusionskonstante ließen sich ebenfalls Mol.-Gew. berechnen, die im wesentlichen m it dem von K r a u t et al. gefundenen W ert übereinstim m en. Die in der II. M itteilung beschriebene Sequenzanalyse ergib t jedoch ein Mol.-Gew. M = 6511. Es waren daher weitere Versuche nötig, um diese Unterschiede zu klären.
Material und Methoden
Kallikrein-Inaktivator aus Rinderlunge wurde von der Farbenfabriken Bayer AG., Werk Elberfeld, zur Verfügung gestellt. Die Oxydation der Disulfidbrücken im KI mit Perameisensäure wurde nach der Methode von H irs 7, die Reduktion durch /^-Mercaptoäthanol in8-m. Harnstoff mit anschließender Alkylierung der entstandenen SH-Gruppen durch Jodacetat oder Jodacet- amid nach der Methode von W h it e j r . 8 durchgeführt.
ReinigungBei K l-Präparaten aus Rinderlunge mit einer spe
zifischen Aktivität von 0,14 y/KIE konnten keine Verunreinigungen nachgewiesen werden. Weniger aktive Präparate wurden durch Chromatographie an Anionen- austauscher-Säulen (60 • 5 cm) von Begleitstoffen abgetrennt: Dowex 1-2 in der Acetatform wurde mit l/o Collidin (pn 9,8 — 10,0) äquilibriert, die Substanz bei PH 9,5 — 9,8 auf die Säule gebracht und mit 1% Collidin (300 ml) und Collidinacetat p h 7,0 eluiert.
Aminosäure-ZusammensetzungNativer KI und dessen oxydiertes Derivat wurden
auf konstantes Gewicht getrocknet und aliquote Teile in geschlossenen Röhren unter N2 mit 6-n. HCl 20, 30, 50 und 80 Stdn. bei 110 °C hydrolysiert und anschließend im automatischen Aminosäure-Analysator untersucht. Der Tryptophangehalt wurde nach der Methode von W in k l e r 9 bestimmt. Als Eichsubstanz wurde hierzu das Protein des Tabakmosaikvirus benützt. Zur Korrektur des Aminosäurezerfalls während der Hydrolyse wurde eine lineare Extrapolation der verschiedenen Aminosäurewerte auf die Hydrolysenzeit null durchgeführt.
6 F. A . A n d e r e r , Z. Naturforsdig., im Druck.7 C. H . W . H i r s , J. biol. Chemistry 219, 6 1 1 [ 1 9 5 6 ] .8 F. H. W h i t e j r . , J. biol. Chemistry 236, 1 3 5 5 [ 1 9 6 1 ] .9 S. W i n k l e r , Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem. 228. 5 0 6
[ 1 9 3 4 ] ,10 A . L. L e v y , Nature [London] 174, 1 2 6 [ 1 9 5 4 ] ,
E n d g r u p p e n a n a l y s e
Dinitrophenylierung: Reduzierter, carboxy- oder carbamidomethvlierter KI wurde in 8-m. Harnstoff gelöst, mit 0,1-n. NaOH auf pn 8,8 eingestellt und bei 40 C 2 Stdn. unter Rühren mit einem Überschuß an2.4-Dinitrofluorbenzol umgesetzt. Während der Reaktion wurde das pn mit einem automatischen Titrator (Radiometer, Copenhagen) konstant gehalten. In einem anderen Ansatz wurde oxydierter KI bei den gleichen Bedingungen, jedodi ohne Harnstoff, mit 2.4- Dinitrofluorbenzol umgesetzt. Nach Reaktionsende wurden die Gemische gegen Wasser dialysiert. Die lyophilisierten Proben wurden im geschlossenen Rohr unter N2 mit 6-n. HCl 18 Stdn. bzw. 12-n. HCl 7 Stdn. bei110 C hydrolysiert und danach im Vakuum über Ätznatron eingedampft. Die Essigesterextrakte wurden durch 2-dimensionale Papierchromatographie 10, die in der wäßrigen Phase verbliebenen DNP-Aminosäuren durch Hochspannungs-Elektrophorese (100V/cm) bei PH 2,0 (2-m. Essigsäure/0,6-m. Ameisensäure) aufgetrennt und durch Referenzsubstanzen identifiziert.
Phenylthiohydantoin-Methode nach E d m a n : Die oxydierten und die reduzierten alkylierten Derivate des KI wurden nach den von E r ik s s o n und S j ö q u is t 11 genannten Bedingungen mit Phenylisothiocyanat umgesetzt. Die als Phenylthiohydantoin abgespaltene iV-ter- minale Aminosäure wurde aus dem eingetrockneten Reaktionsgemisch mit Methanol extrahiert und papierchromatographisch identifiziert12. Mit dem verbliebenen Protein wurde ein zweiter Abbaucyclus durchgeführt. Nach der quantitativen Bestimmung der Phenyl- thiohydantoine wurden diese im geschlossenen Rohr unter N2 mit 6-n. HCl 40 Stdn. bei 110 °C zu den freien Aminosäuren zurückgespalten und letztere mit dem automatischen Aminosäure-Analysator (Beckman- Spinco) identifiziert.
Hydrazinolyse: KI wurde 48 Stdn. im Vakuum über P20 5 und Ätznatron bei 40° getrocknet und anschließend im geschlossenen Rohr mit wasserfreiem Hydrazin (Fluka, Schweiz) unter N2 10 Stdn. bei 100° behandelt. Für die weitere Aufarbeitung wurden die Vorschriften von B r a u n it z e r 13 benützt. Die freien Aminosäuren wurden im automatischen Aminosäure-Analysator (Beckman-Spinco) identifiziert und quantitativ bestimmt.
Carboxypeptidase A : Die oxydierten und die reduzierten alkylierten Derivate des K l wurden in 0,01-n. NaOH gelöst und mit 0,1-n. HCl auf ph 9,2 eingestellt. Das Carboxypeptidase-Präparat (Sigma Chemical Company) wurde vor der Anwendung nach einer Vorschrift von H i r s et al. 14 behandelt. Nach 20, 60 und 180 Min. Einwirkung der Carboxypeptidase wurden gleiche
11 S . E r i k s s o n u. J. S j ö q u i s t , Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 45,290 [I960].
12 J. S j ö q u i s t , Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 4 1 , 20[I960],
13 G. B r a u n i t z e r , Chem. Ber. 88. 2025 [1955].14 C. H . W . H ir s , S . M o o r e u . W . H . S te i n , J. biol. Chemistry
235,633 [I960].
STRUKTURUNTERSUCHUNGEN AM KALLIKREIN-INAKTIVATOR AUS RINDERLUNGE I 4 5 9
Teile entnommen und nach Zusatz von 1 Tropfen 1-n. Essigsäure im Hochvakuum eingedampft. Die abgespaltenen Aminosäuren wurden im automatischen Aminosäure-Analysator bestimmt.
Ultrazentrifugierung
Zur Bestimmung der Sedimentationskonstante wurde eine Spinco-Ultrazentrifuge Modell E mit Schlierenoptik benützt und die photographischen Aufnahmen mit einem Meßmikroskop ausgemessen. Die Sedimentation wurde in verschiedenen Puffern bei 42 040 bis59 780 UpM (Konzentrationen 0,75%, 0,5%, 0,25%) durchgeführt. Die Präparate wurden 4 —10 Stdn. vor Meßbeginn gelöst und während dieser Zeit auf 20 °C gehalten.
Für die bei verschiedenen KI-Konzentrationen durchgeführten Diffusionsmessungen wurde die Kapillarzelle der Spinco-Ultrazentrifuge Modell E (bei 6995 bis 9341 UpM) benützt. Die erhaltenen Gradienten wurden nach dem Verfahren von E lias 15 ausgewertet.
Für die Bestimmung des Mol.-Gew. nach der Methode von A r c h i b a l d (modifiziert nach S c h a c h m a n n 16) wurden die Proteinkonzentrationen 1%, 0,66%, 0,33% bzw. 1% und 0,5% in verschiedenen Puffern bei 12 590 bis 15 220 UpM untersucht.
Alle Messungen wurden bei 20,0 +0,1 °C ausgeführt. Für wäßrige Puffer wurde die Dichte o = l,0 , für 4-m. Guanidinchlorid Q = 1,102 und für 8-m. Harnstoff0 = 1,126 eingesetzt. Für das spezifische Volumen des Proteins in wäßrigen Puffern wurde £ = 0,75, für Puffer in 4-m. Guanidinchlorid und 8-m. Harnstoff wurde in Analogie zum Tabakmosaikvirus-Protein 17 v = 0,787 gesetzt.
Ergebnisse
Die Untersuchungen wurden, wenn nicht besonders bem erkt, m it einem reinen P rä p a ra t (spezifische Aktivität von 0,14 y /K IE) durchgeführt, fü r das physikalisch ein m ittleres Mol.-Gew. von 11500 bestim m t wurde.
Am inosäure-Zusam m ensetzung
Zur Bestim m ung der A m inosäure-Zusam m ensetzung des KI w urde das native und das oxydierte D erivat jeweils 20, 30, 50 und 80 Stdn. hydrolysiert, um möglichen Am inosäurezerfall durch Extrapolation oder In terpolation zu korrig ieren . Die Analysendaten sind in Tab. 1 wiedergegeben. Der KI enthält kein T ryptophan und kein H istidin. Aus Tab. 1 ist zu entnehm en, daß der KI aus 58 A m inosäuren oder
15 H. C. E l i a s , Theorie und Praxis der Ultrazentrifugentech- nik, Beckman Instrum ents, München.
16 H. K. S c h a c h m a n , Ultracentrifugation, diffusion and viscosi-metry in Methods in Enzymology, IV, Acad. Press, NewYork 1957.
einem Vielfachen davon besteht. Bem erkenswert ist der zeitliche Anstieg des Ileu-W ertes, was darauf zurückzuführen ist, daß m indestens ein Ileu-Rest an einer schwer hydrolysierbaren P eptidbindung beteiligt ist. Wie die spätere Sequenzanalyse zeigte, liegen die extrapolierten W erte von Phe und Tyr zu niedrig. Möglicherweise g ibt die hier durchgeführte lineare Extrapolation nicht den richtigen V erlauf des Am inosäurezerfalls wieder. Die W erte fü r die als NH3 bestimm ten A m idgruppen liegen vermutlich auch zu niedrig, da die A m idgruppen nach der Hydrolyse als Am m onchlorid vorliegen, das beim Eindam pfen des H ydrolysats im Hochvakuum teilweise sublim ieren kann 18. Der in Tab. 1 angeführte
Aminosäure
20
Sydrolysedauer[Stdn.]
30 50 80
extrapoliert[jitMol]
molares * Verhält
nis
Lys 0,545 0,538 0,565 0,550 0,548 4,00n h 3 0,642 0.671 0,683 0,688 0,673 4,92Arg 0,730 0,790 0.801 0,823 0,823 6,01Asp 0,692 0,675 0.685 0,683 0,684 4,99Thr 0,383 0,362 0,336 0.252 0,410 2,98Ser 0,136 0,125 0,118 0,109 0,139 1,03Glu 0,395 0,407 0,412 0,404 0,411 3,00Pro 0,510 0,485 0,444 0,413 0,532 3,90Gly 0,829 0,802 0,827 0,796 0.831 6,08Ala 0,812 0,778 0,804 0,798 0,804 5,87HCys 0,784 0,747 0,721 0,678 0,796 5,81Val 0,137 0,134 0,142 0,113 0,137 1,00Met 0,112 0,102 0,096 0,077 0,123 0,90Ileu 0,146 0,165 0,226 0,241 0,241 1,76Leu 0,255 0,267 0,270 0,264 0,270 1,97Phe 0,498 0,490 0,481 0,452 0,512 3,74Tyr 0,445 0,468 0,455 0,426 0,498 3,63
Tab. 1. Aminosäure-Zusammensetzung des nativen Kallikrein- Inaktivators in /^Mol nach verschiedener Hydrolysendauer.* Der extrapolierte Wert von Valin wurde als Grundeinheit
gesetzt.
Gehalt an H albcystinresten (HCys) stim m te mit dem bei der H ydrolyse des oxydierten KI-D erivats erm ittelten Gehalt an Cysteinsäure (5,91 M oläquivalente) überein.
Die N-terminale Am inosäure wurde nach zwei verschiedenen M ethoden erm ittelt.
a) Bei der D initrophenylierung konnten die redu zierten, alkylierten D erivate des KI wegen der geringen Löslichkeit n u r in 8-m. H arnstoff m it 2.4-D initro- fluorbenzol umgesetzt werden, während das oxydierte
17 F. A. A n derer, O. K ratk y u. R. Lo, Z. Naturforschg. 19 b, 906 [1964].
18 F. A. A nderer u. B. W ittm ann-L iebold, Z. Naturforschg., in Vorbereitung.
460 F. A. ANDERER UND S. HÖRNLE
P räp ara t bei pn 8,8 gut löslich war. Mit zunehm ender Substitution w urde das oxydierte P räp ara t in w äßrigen Puffern unlöslich. Nach Isolierung und folgender Totalhydrolyse der beiden DNP-Derivate wurde als /V-terminale A m inosäure nur D NP-Arginin gefunden. In verschiedenen Analysen konnten 0,61 bis 0 ,76 //M ol D N P-Arginin, bezogen auf 10 mg D N P-Protein, isoliert werden. Der fü r f-DNP-Lysin bestim m te K orrek turfak tor fü r die Zerstörung bei der H ydrolyse / = 100/68 — 100/78 19 ist auch für D N P-Arginin gefunden worden. U nter Berücksichtigung dieses Faktors läßt sich für DNP-KI ein Mol.- Gew. von 9000 — 12 800 errechnen.
b) Phenyllh iohydantoin-M ethode: Die oxydierten wie die reduzierten alkylierten Derivate waren bei den von E r i k s s o n und S j ö q u i s t 12 beschriebenen Bedingungen gut löslich. Nach der Cyclisierungs-Reak- tion konnte nur das Phenylthiohydantoin des Argi- nins identifiziert werden. In verschiedenen Analysen w urden 0,85 — 0,98 //M ol A rginyl-Phenylthiohydan- toin pro 10 mg des eingesetzten P roteinderivats gefunden. W enn man als K orrek turfak tor die Ausbeute von 90 — 97% bei der Ü berführung von freiem A rginin in das Phenylthiohydantoin berücksichtigt, erhält m an fü r das oxydierte K I-D erivat ein Mol.- Gew. von 9 2 0 0 - 1 1 2 0 0 .
Bei der Rückspaltung zur freien Am inosäure betrug die Ausbeute an freiem A rginin 30 — 50%, bezogen auf das eingesetzte Phenylthiohydantoin. Nach dem zweiten A bbaucyclus wurden 0,41 —0,68 //M ol P rolylphenylthiohydantoin pro 10 mg eingesetzten P roteins isoliert. Die Ausbeute bei der Rückspaltung zur freien A m inosäure schwankte zwischen 20 bis 80 Prozent.
c) m it Am inopolypeptidase aus Schweinenieren 20 w urden aus dem nativen, dem oxydierten oder dem reduzierten, alkylierten KI keine A m inosäuren abgespalten.
C-terminale Am inosäure
a) H ydrazinolyse: Nach der Behandlung von nativem KI mit H ydrazin wurde in der Hauptsache A lanin neben geringen Mengen Glycin gefunden. In verschiedenen Analysen w urden 0,65 — 0,92 //M ol A lanin und 0,04 — 0,12 //M ol Glycin pro 10 mg P ro tein isoliert. Da der KI einen hohen Gehalt an Glycin besitzt (s. A m inosäure-Zusam m ensetzung), ist es
19 F. A . A n d e r e r , Z. Naturforschg. 14 b, 363 [1959].
wahrscheinlich, daß die Menge an Glycin aus der sekundären Hydrolyse des G lycinhydrazids stammt, das wesentlich schneller als die H ydrazide der anderen Am inosäuren hydrolysiert wird.
b) Carboxypeptidase A : Sie spaltet aus dem nativen KI keine A m inosäuren ab. Die A bspaltung aus dem oxydierten oder reduzierten, alkylierten D erivat erfolgt sehr langsam , da wegen der geringen Löslichkeit oberhalb pn 9,0 gearbeitet werden mußte. Nach 3 Stdn. Inkubation bei 4 0 ° wurden 0,55 — 0,65 //M ol A lanin pro 10 mg Protein neben geringen Mengen Glycin gefunden.
B e s t i m m u n g d e s M o l e k u l a r g e w i c h t s
Unter physiologischen Bedingungen w urde in verschiedenen Versuchen fü r nativen KI ein Mol.-Gew. zwischen 1 0 3 0 0 und 1 1 8 0 0 erm ittelt. Zusätze von Harnstoff uund M ercaptoäthanol oder Säure und Guanidinchlorid änderten das Mol.-Gew. nicht (s. Tabelle 2 /1). Bei bestim m ten Bedingungen, z .B . beim isoelektrischen Punkt, pn 10,5, w ird das Mol.- Gew. kleiner und bei Zusatz von H arnstoff oder in 0,1-m. Essigsäure liegt ein Mol.-Gew. von 6500 vor (Tab. 2 / I I ) .
Puffer Mol.-Gew.
I
0,8-proz. NaCl/0,02-m. Phosphat pH 7,30,8-proz. NaCl/0,02-m. Phosphat pH 7,3/8-m. Harnstoff/ 0,1-m. Mercaptoäthanol 0,1-m. Ameisensäure/4-m. Guanidinchlorid
1 0 3 0 0 -11800
10600
11900
II
0,1-m. Glycin/NaOH p h 10,5 0,1-m. Glycin/NaOH PH 10,5/8-m. Harnstoff 0,1-m. Essigsäure
8 4 0 0 -1 1 0 0 0
65006700
Tab. 2. Mittlere Mol.-Gew. des dimeren Kallikrenin-Inaktiva- tors (für c = 0) in verschiedenen Puffern.
Als beste Methode, KI vom m ittleren Mol.-Gew. 115 0 0 quantitativ in das Mol.-Gew. 6500 überzuführen, erwies sich die C hrom atographie an Sephadex G 25-Säulen in 0,1-m. Essigsäure. Nach der Lyophilisierung zeigte diese K I-F raktion auch unter physiologischen Bedingungen (0,8% N aC l/0,02 m Phosphat Ph 7,3) ein Mol.-Gew. von 6500. Die spezifische Aktivität, gemessen an der Hemm ung von Trypsin, war bei diesem P räp ara t gleich wie bei dem P räpara t mit einem m ittleren Mol.-Gew. von 11 500.
20 R. L. H i l l u . E. L. S m i t h , J. biol. Chemistry 228, 577 [1957],
STRUKTURUNTERSUCHUNGEN AM KALLIKREIN-INAKTIVATOR AUS RINDERLUNGE I 461
Die Tatsache, daß un ter physiologischen Bedingungen das m onom ere M olekül m it dem Mol.-Gew. 6500 wie auch ein Dim eres (bzw. ein Gleichgewicht m it ca. 90% Dim erem ) stabil sind, läßt ein Aggrega- tions-Gleichgewicht ausschließen, das sich vom Monom eren ausgehend spontan einstellt. Es muß ein spezieller Mechanismus fü r den D im erisierungsvorgang angenom m en w erden, der in 8 -m. Harnstoff, Ph 10,5, und in 0,1-m. Essigsäure nicht m ehr w irksam ist. Die einfachste A nnahm e wäre die Vernetzung durch ein niederm olekulares Bindeglied, das durch C hrom atographie in 0,1-m. Essigsäure auf Sephadex G 25 abgetrennt werden kann.
Ein experim enteller H inweis fü r diese Annahme ergibt sich durch das V erhalten des KI in Anwesenheit von V ersenat (D i-natrium salz der Äthylen- d iam in te traessigsäure). In einer Lösung von 0,1-m. Essigsäure und 0,01-m . V ersenat dissoziierte das ursprüngliche KI nicht m ehr in das M onomere, sondern behielt sein Mol.-Gew. von 11 500 bei, währenddas M onomere unter dem Einfluß von Versenat
Puffer Zusatz PH Mol.-Gew.
I
0,1-m. Essigsäure0,1-m. Essigsäure0,1-m. Essigsäure
0,01-m. Versenat
0,01-m. Versenat + 0,l-m. Arginin- HCl
2,9
3,5
3,8
6500
1 2 1 0 0 -133008300
0,1-m. Essigsäure
0,01-m. Versenat + 0 ,l-m . Lysin HCl 3,5 8300
II
0,1-m. Gly- cin/NaOH 0,1-m. Gly- cin/NaOH 0,1-m. Gly- cin/NaOH 0,1-m. Gly- cin/NaOH
0,1-m. Versenat
8-m. Harnstoff
8-m. Harnstoff + 0,1-m. Versenat
10.5
10.5
10.5
10.5
8800
8200
6500
6600
0,1-m. Essigsäure
[0,01-m.]Citronensäure 3,4 8200
0,1-m. Essigsäure Weinsäure 3,3 8400
III
0,8-proz.NaCl Citrat 6,6 81000,8-proz.NaCl Tartrat 6,4 82000,8-proz.NaCl Malonat 6,4 85000,8-proz.NaCl Oxalacetat 6,5 8700
Tab. 3. Mittleres Mol.-Gew. des monomeren Kallikrein-Inak- tivators (für c = 0) unter dem Einfluß di-, tri- und tetra
valenter Anionen.
dim erisierte. Diese Assoziation kann jedoch durch Zusatz von basischen A m inosäuren fast vollständig gehemmt werden (s. Tab. 3 /1 ). Dem V ernetzungseffekt des Versenats dürfte daher eine W echselwirkung der vier C arboxylgruppen des V ersenats m it basischen Gruppen des KI zugrunde liegen. Beim isoelektrischen Punkt des KI (pn 10,5) ist das V ersenat nicht m ehr w irksam (Tab. 3 /I I ) .
Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß V ersenat nicht das Bindeglied im ursprünglichen dim eren KI sein kann, da ein solches V ernetzungsprodukt in0,1-m. Essigsäure stabil sein müßte. Es w urden d aher die Effekte von einigen Di- und T ricarbonsäuren auf den m onom eren KI untersucht. Die untersuchten Säuren erreichten jedoch nicht die V ernetzungskapazität von V ersenat (Tab. 3 /I I I ) . E in um gekehrtes System einer heteropolaren Brückenbildung wäre durch eine W echselwirkung von divalenten K ationen m it den C arboxylgruppen des K I denkbar. Wie Tab. 4 zeigt, gelingt eine weitgehende D im erisierung des m onom eren KI m it zweiwertigen K ationen in physiologischer Kochsalzlösung. Die resultierenden V ernetzungsprodukte sind jedoch in 0,1-m. Essigsäure weniger stabil und das Gleichgewicht ist zugunsten der m onom eren KI-Kom ponente verschoben.
Puffer Zusatz PHMol.-Gew.
0,1-m. Essigsäure 0,01-m. Mangan (II) -sulfat 2,9 8600
0,1-m. Essigsäure 0,01-m. 1.3-Diamino-propan 4,0 8400
0,1-m. Essigsäure 0,01-m. Bis- (3-amino-propyl) amin 3,8 8300
0,8-proz. NaCl 0,01-m. Magnesiumacetat 6,9 9200
0,8-proz. NaCl 0,1-m. Magnesiumacetat 6,85 9800
0,8-proz. NaCl 0,01-m. 1.3-Diamino-propan 6,9 10500
0,8-proz. NaCl 0,01-m. Bis-(3-amino-propyl) amin 6,85 10300
Tab. 4. Mittleres Mol.-Gew. des monomeren Kallikrein-Inak- tivators (für c = 0) unter dem Einfluß von divalenten
Kationen.
Diskussion
Das fü r unsere U ntersuchungen benützte K l-Prä- para t besaß unter physiologischen Bedingungen ein mittleres Mol.-Gew., dem im wesentlichen ein dim eres Aggregat der durch Sequenzanalyse bestimm ten
462 F. A. ANDERER
Pep tidkette6 mit dem Mol.-Gew. 6511 zugrunde liegt. Das m ittlere Mol.-Gew. von 10 3 0 0 — 1 1 8 0 0 kommt dadurch zustande, daß unter den gegebenen Bedingungen geringe M engen der m onom eren Komponente mit im Gleichgewicht vorliegen können. Nach den vorliegenden U ntersuchungen scheint es sicher, daß dieses dim ere A ggregat durch ein niederm olekulares Bindeglied zusam m engehalten w ird. Der Komplex ist jedoch auch dann noch stabil, wenn das Molekül in 8 -m. H arnstoff reduziert w ird. Bei der Oxydation mit Peram eisensäure kann der Komplex m öglicherweise dissoziieren, b ildet sich aber zurück, sobald die mit W asser verdünnte Peram eisensäure durch Lyo- philisieren entfernt w orden ist (unveröffentlichte E rgebnisse) .
Die Tatsache, daß der dim ere Komplex bei allen Bedingungen, unter denen die Endgruppenbestim - m ungen durchgeführt wurden, relativ stabil ist, e rklärt letztlich auch die niederen Ausbeuten bei der Identifizierung der term inalen Am inosäuren.
Der ursprünglich vorliegende dim ere KI-Komplex zerfällt einerseits teilweise beim isoelektrischen Punkt (pn 10,5) und andererseits vollständig in 0,1-m. Essigsäure. Unter den letztgenannten Bedingungen kann die brückenbildende Substanz an Sephadex G25-Säulen abgetrennt werden und das so erhaltene K l-P räpara t ist dann unter physiologischen Bedingungen als Monomeres stabil. Das niederm olekulare Brückenglied konnte noch nicht identifiziert werden. Die angestellten Versuche zeigen jedoch, daß für die D im erisierung des m onom eren KI divalente kationische wie polyvalente anionische V erbindungen möglicherweise auch Zwitterionen in Frage kommen können. Über die im KI-M olekül an der Komplexbildung beteiligten Gruppen kann daher noch nichts ausgesagt werden.
Wir danken Herrn Prof. Dr. G. S c h r a m m für anregende Diskussion und Förderung der Arbeit, Frl.H. v . S c h ü t z und Herrn U. R u d o l p h für technische Assistenz und der F a r b e n f a b r i k e n B a y e r AG. für materielle Unterstützung.
S tru k tu ru n te rsu ch u n g e n am K a llik rein-T naktivator aus R inderlunge
II. Bestimmung der AminosäuresequenzF. A . A n d e r e r
Max-Planck-Institut für Virusforschung, Tübingen
(Z. Naturforschg. 20 b, 462— 472 [1965] ; eingegangen am 28. Januar 1965)
The tryptic, chymotryptic, and peptic hydrolysates of reduced, carboxy- and carbamido- methylated kallikrein-inactivator from bovine lung were separated on Dowex 1 X2 ion-exchange columns. After structural analysis of the resulting peptides the complete sequence of 58 amino acids was established.
In der vorausgegangenen A rb e it1 wurde der K allikrein-Inaktivator (K I) * durch physikalische und chemische M ethoden näher charakterisiert. Das Mol.- Gew. beträg t ungefähr 6500 und setzt sich aus 58 A m inosäuren zusamm en. Die TV-terminale A m inosäurefolge H-Arg-Pro w urde durch E d m a n - A bbau, die C-term inale Folge Gly-Ala-OH durch Behandlung m it Carboxypeptidase A festgelegt. Da keine freien SH-Gruppen nachzuweisen sind 2, m üssen alle 6 H alb-Cystinreste im Molekül als Disulfid- brücken vorliegen.
* Der Kallikrein-Inaktivator ist unter dem Warenzeichen Trasylol® der Farbenfabriken Bayer AG., Leverkusen, im Handel.
1 F. A . A n d e r e r u . S. H ö r n l e , Z. Naturforschg., im Druck.
Die im folgenden besprochene Sequenzanalyse wurde m it den reduzierten bzw. oxydierten Derivaten des KI durchgeführt.
Material und Methoden
KI aus Rinderlunge wurde von der Farbenfabriken Bayer AG., Werk Elberfeld, zur Verfügung gestellt. Die Reduktion der Disulfidbrücken wurde nach einer Vorschrift von W h i t e j r . 3 durchgeführt, und die entstandenen SH-Gruppen mit Jodacetat oder Jodacet- amid alkyliert. Die Oxydation der Disulfidbrücken erfolgte mit Perameisensäure nach einer Vorschrift von H i r s 4 .
2 In Vorbereitung.3 F. H . W h ite j r . , J. biol. Chemistry 236, 1353 [1961],4 C. W . H ir s , J. biol. Chemistry 219, 611 [1956].