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  • This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift fr Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

    Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift fr Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Frderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz verffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

    STRUKTURUNTERSUCHUNGEN AM KALLIKREIN-INAKTIVATOR AUS RINDERLUNGE I 4 5 7

    Nr. System [IpM]

    1 komplett 4332 - ATP, GTP, UTP 2103 - GTP, UTP 4724 - UTP 4705 0 Min. inkubiert 326 + Ribonuelease 10 y 35

    Tab. 2. Einbau von Cytosin in Polynucleotide durch berstnde aus Blattextrakten. Einflu der anderen Nucleosid-

    triphosphate.

    Diskussion

    Die Um w andlung von A TP in Adenin durch das angereicherte E nzym prparat aus T abakblttern e rfolgt offenbar in einer m ehrstufigen Reaktion, an der sowohl Phosphatasen als auch eine Nucleosidase beteiligt sind. Die Reaktion kann schematisch folgenderm aen beschrieben w erden :

    A TP > ADP > AM P > Adenosin > Adenin + Ribose

    H ierfr spricht, da der A bbau vermieden werden kann, wenn der erste Schritt, nmlich die Um wand

    lung von ATP in ADP, verhindert w ird. Bei Beachtung dieser Vorsichtsm aregel lie sich eine schwache Polym erase-W irkung in Tabakblttern nachweisen, die an Zellkerne oder auch an andere grere, nicht nher charakterisierte Partikel gebunden ist. In den Partikel-freien berstnden lie sich, zum indest mit ATP als Substrat, keine Polym erase nachweisen.

    Im berstand scheint jedoch ein Enzym vorhanden zu sein, das einen Einbau von CTP in Polynucleotide bewirkt. Es handelt sich aber w ahrscheinlich nicht um eine Polym erase, da n u r das Fehlen von ATP, nicht aber der anderen Nucleosid-Triphos- phate den CTP-Einbau verhindert. Es kommt ein endstndiger Anbau von CTP in Transfer-R N S oder andere Polynucleotide in Frage.

    Die K onzentration der Polym erasen in den P flanzenextrakten ist gegenber der in Bakterien sehr gering. Diese Tatsache sowie die Schwierigkeiten, sie von greren Partikeln abzutrennen, bildet ein wesentliches H indernis f r ihre genaue U ntersuchung.

    Wir danken dem US P u b l i c H e a l t h S e r v i v e fr finanzielle Untersttzung.

    S tru k tu ru n te rsu ch u n g en am K allik re in -In ak tiv a to r aus R inderlunge

    I. Molekulargewicht, Endgruppenanalyse und Aminosure-Zusammensetzung

    F. A . A n d e r e r und S. H r n le

    Max-Planck-Institut fr Virusforschung, Tbingen

    (Z. Naturforschg. 20 b, 457 4-62 [1965] ; eingegangen am 28. Januar 1965)

    By determination of the sedimentation and diffusion constant a molecular weight of 6500 can be calculated for the kallikrein-inactivator from bovine lung. Under certain conditions the molecule has a tendency to dimerize. A mechanism for dimerisation is proposed. The peptide chain contains58 amino acids; it starts with H-Arg-Pro and ends with Gly-AlaOH.

    Der K allikrein-Inaktivator (KI) * konnte 1928 von K r a u t et a l . 1 zum ersten Mal in R inder-Parotis nachgewiesen werden. A uer K allikrein wird auch T rypsin und C hym otrypsin2 sowie F ib rin o ly sin 3 durch den K allikrein-Inaktivator gehemmt. Die

    * Der Kallikrein-Inaktivator ist unter dem Warenzeichen Trasylol der Farbenfabriken Bayer AG., Leverkusen, im Handel.

    1 H. K r a u t , E. K . F r e y u. E. B a u e r , Hoppe-Seylers Z. physiol. Chem. 175, 97 [1928].

    2 E. W e r l e , L. M a i e r u . E. R i n g e lm a n n , Naturwissenschaften 39 ,328 [1952],

    Reindarstellung aus R inder-Parotis gelang jedoch erst I 9 6 0 4. In einer neueren A rbeit w urde die D arstellung des gleichen Inaktivators aus Rinderlunge beschrieben 5 und die Identitt m it dem aus Rinder- Parotis isolierten P rodukt sichergestellt.

    3 R. M a r x , P. C l e m e n t e , E. W e h r l e u . W . A p p e l , Blut V, 3 6 7[ 1 9 5 9 ] ; H. K r a u t u . N. B h a r g a v a , Hoppe-Seylers Z. physiol. Chem. 334, 2 3 6 [ 1 9 6 3 ] .

    4 H. K r a u t , W. K r b e l , W. S c h o l t a n u . F . S c h u l t z , Hoppe- Seylers Z. physiol. Chem. 321, 9 0 [ 1 9 6 0 ] .

    5 H. K r a u t u . N. B h a r g a v a , Hoppe-Seylers Z. physiol. Chem. 338, 2 3 1 [ 1 9 6 4 ] .

  • 4 5 8 F. A. ANDERER UND S. HRNLE

    Die in der vorliegenden A rbeit durchgefhrte chemische und physikalisch-chemische C harakterisierung des KI aus R inderlunge diente als G rundlage fr die Sequenzanalyse, die in einer folgenden A rb e it6 beschrieben werden soll.

    Das Mol.-Gew. des K I aus R inder-Parotis w ird in einer A rbeit von K r a u t et a l .4 m it 1 1 6 0 0 angegeben. Aus den in der vorliegenden A rbeit durchgefhrten Endgruppenbestim m ungen sowie aus Bestim m ungen der Sedim entations- und D iffusionskonstante lieen sich ebenfalls Mol.-Gew. berechnen, die im wesentlichen m it dem von K r a u t et al. gefundenen W ert bereinstim m en. Die in der II. M itteilung beschriebene Sequenzanalyse ergib t jedoch ein Mol.-Gew. M = 6511. Es waren daher weitere Versuche ntig, um diese Unterschiede zu klren.

    Material und Methoden

    Kallikrein-Inaktivator aus Rinderlunge wurde von der Farbenfabriken Bayer AG., Werk Elberfeld, zur Verfgung gestellt. Die Oxydation der Disulfidbrcken im KI mit Perameisensure wurde nach der Methode von H irs 7, die Reduktion durch /^-Mercaptothanol in8-m. Harnstoff mit anschlieender Alkylierung der entstandenen SH-Gruppen durch Jodacetat oder Jodacet- amid nach der Methode von W h it e j r . 8 durchgefhrt.

    ReinigungBei K l-Prparaten aus Rinderlunge mit einer spe

    zifischen Aktivitt von 0,14 y/KIE konnten keine Verunreinigungen nachgewiesen werden. Weniger aktive Prparate wurden durch Chromatographie an Anionen- austauscher-Sulen (60 5 cm) von Begleitstoffen abgetrennt: Dowex 1-2 in der Acetatform wurde mit l/o Collidin (pn 9,8 10,0) quilibriert, die Substanz bei PH 9,5 9,8 auf die Sule gebracht und mit 1% Collidin (300 ml) und Collidinacetat p h 7,0 eluiert.

    Aminosure-ZusammensetzungNativer KI und dessen oxydiertes Derivat wurden

    auf konstantes Gewicht getrocknet und aliquote Teile in geschlossenen Rhren unter N2 mit 6-n. HCl 20, 30, 50 und 80 Stdn. bei 110 C hydrolysiert und anschlieend im automatischen Aminosure-Analysator untersucht. Der Tryptophangehalt wurde nach der Methode von W in k l e r 9 bestimmt. Als Eichsubstanz wurde hierzu das Protein des Tabakmosaikvirus bentzt. Zur Korrektur des Aminosurezerfalls whrend der Hydrolyse wurde eine lineare Extrapolation der verschiedenen Aminosurewerte auf die Hydrolysenzeit null durchgefhrt.

    6 F. A . A n d e r e r , Z. Naturforsdig., im Druck.7 C. H . W . H i r s , J. biol. Chemistry 219, 6 1 1 [ 1 9 5 6 ] .8 F. H. W h i t e j r . , J. biol. Chemistry 236, 1 3 5 5 [ 1 9 6 1 ] .9 S. W i n k l e r , Hoppe-Seylers Z. physiol. Chem. 228. 5 0 6

    [ 1 9 3 4 ] ,10 A . L. L e v y , Nature [London] 174, 1 2 6 [ 1 9 5 4 ] ,

    E n d g r u p p e n a n a l y s e

    Dinitrophenylierung: Reduzierter, carboxy- oder carbamidomethvlierter KI wurde in 8-m. Harnstoff gelst, mit 0,1-n. NaOH auf pn 8,8 eingestellt und bei 40 C 2 Stdn. unter Rhren mit einem berschu an2.4-Dinitrofluorbenzol umgesetzt. Whrend der Reaktion wurde das pn mit einem automatischen Titrator (Radiometer, Copenhagen) konstant gehalten. In einem anderen Ansatz wurde oxydierter KI bei den gleichen Bedingungen, jedodi ohne Harnstoff, mit 2.4- Dinitrofluorbenzol umgesetzt. Nach Reaktionsende wurden die Gemische gegen Wasser dialysiert. Die lyophilisierten Proben wurden im geschlossenen Rohr unter N2 mit 6-n. HCl 18 Stdn. bzw. 12-n. HCl 7 Stdn. bei110 C hydrolysiert und danach im Vakuum ber tznatron eingedampft. Die Essigesterextrakte wurden durch 2-dimensionale Papierchromatographie 10, die in der wrigen Phase verbliebenen DNP-Aminosuren durch Hochspannungs-Elektrophorese (100V/cm) bei PH 2,0 (2-m. Essigsure/0,6-m. Ameisensure) aufgetrennt und durch Referenzsubstanzen identifiziert.

    Phenylthiohydantoin-Methode nach E d m a n : Die oxydierten und die reduzierten alkylierten Derivate des KI wurden nach den von E r ik s s o n und S j q u is t 11 genannten Bedingungen mit Phenylisothiocyanat umgesetzt. Die als Phenylthiohydantoin abgespaltene iV-ter- minale Aminosure wurde aus dem eingetrockneten Reaktionsgemisch mit Methanol extrahiert und papierchromatographisch identifiziert12. Mit dem verbliebenen Protein wurde ein zweiter Abbaucyclus durchgefhrt. Nach der quantitativen Bestimmung der Phenyl- thiohydantoine wurden diese im geschlossenen Rohr unter N2 mit 6-n. HCl 40 Stdn. bei 110 C zu den freien Aminosuren zurckgespalten und letztere mit dem automatischen Aminosure-Analysator (Beckman- Spinco) identifiziert.

    Hydrazinolyse: KI wurde 48 Stdn. im Vakuum ber P20 5 und tznatron bei 40 getrocknet und anschlieend im geschlossenen Rohr mit wasserfreiem Hydrazin (Fluka, Schweiz) unter N2 10 Stdn. bei 100 behandelt. Fr die weitere Aufarbeitung wurden die Vorschriften von B r a u n it z e r 13 bentzt. Die freien Aminosuren wurden im automatischen Aminosure-Analysator (Beckman-Spinco) identifiziert und quantitativ bestimmt.

    Carboxypeptidase A : Die oxydierten und die reduzierten alkylierten Derivate des K l wurden in 0,01-n. NaOH gelst und mit 0,1-n. HCl auf ph 9,2 eingestellt. Das Carboxypeptidase-Prparat (Sigma Chemical Company) wurde vor der Anwendung nach einer Vorschrift von H i r s et al. 14 behandelt. Nach 20, 60 und 180 Min. Einwirkung der Carboxypeptidase wurden gleiche

    11 S . E r i k s s o n u. J. S j q u i s t , Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 45,290 [I960].

    12 J. S j q u i s t , Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 4 1 , 20[I960],

    13 G. B r a u n i t z e r , Chem. Ber. 88. 202