1 / 3

Table of Contents

No. Title Page

1 The identification of Streptococcus mutans epitopes to secretory Immunoglobulin Asaliva

-

2 Titanium bracket -

3 Recurrent of hyperplastic gingivitis after gingivectomy -

4 Removable partial denture as foreign body in trachea -

5 Reversibility of bone calcification on pre and post natal protein deficiency -

6 The role of interpersonal communication integrated with medical dental care -

7 Primary prevention in children with high caries risk -

8 In vitro antibacterial activity of flavonoids Trigona sp propolis againstStreptococcus mutans

-

9 The treatment of maxillary anterior impacted teeth in adolescent -

10 The surface hardness of type II conventional glass ionomer cement conventionalbecause of the length of storage

-

11 The isolation of Streptococcus mutans cariogenic gtf BC gene fromchildren’s tooth plaque

-

12 Tensile strength and shear strength models bonds in between copper alloy andacrylic resin after tin plating

-

2 / 3

Vol. 38 - No. 3 / 2005-07TOC : , and page : -

The isolation of Streptococcus mutans cariogenic gtf BC gene from children’s tooth plaque

Isolasi gen kariogenik gtf BC Streptococcus mutans dari plak gigi anak

Author :Yetty Herdiyati Soemantadiredja |Department of Pediatric Dentistry, Faculty of Dentistry Padjadjaran University, Bandung-IndonesiaMieke Hemiawati Satari |Department of Microbiology, Faculty of Dentistry Padjadjaran University, Bandung-Indonesia

Abstract

The aim of this research was to prove that Streptococcus mutans isolated from children ‘s tooth plaque was cariogenic.Glf BC which is glycosiltransferase producer gene has had a role in caries development. This gene was isolated fromStreptococcus mutans. The specimens were analyzed using Wizard Genomic DNA Purification Kit from Promega. Inconclusion, S. mutans isolatedfrom children’s tooth plaque truly had cariogenic gtf BC gene.

Keyword : streptococcus, mutans, gen, 16s, rRNA, gen, gtf,

Daftar Pustaka :1. JS Chia, (1998). Functional analysis of a conserved region in glucocyltransferase of Streptococcus Mutans. : JInfection and Immunity2. A. Ivic, (1989). The use of DNA probes for the identification of oral Streptococci Caries. : Res3. RRB Russel, (1989). The use of DNA probes for the identification of oral Streptococci Caries. : Res4. MG Newman, (1988). Oral Microbiology and immunology. Philadelphia : WB Saunders Co5. R Nisengard, (1988). Oral Microbiology and immunology. Philadelphia : WB Saunders Co6. GC Baker, (1999). Identification of Indonesian hyperthermoghiles using16 sr RNA Sequencing. Bandung : PPAU Bioteknologi ITB7. MT Madigan, (2000). Biology of Microorganisms. New Jersey : Prentice Hall Inc8. JM Martinko, (2000). Biology of Microorganisms. New Jersey : Prentice Hall Inc9. J Parker, (2000). Biology of Microorganisms. New Jersey : Prentice Hall Inc10. CS Yang, (1998). Functional analysis of a conserved region in glucocyltransferase of Streptococcus Mutans. : JInfection and Immunity11. JY Chen, (1998). Functional analysis of a conserved region in glucocyltransferase of Streptococcus Mutans. : JInfection and Immunity12. Y Yamashita, (1992). Molecular analysis of a Streptococcus mutans strain exhibitmg polymorphism in the tandem gtfBang gtf BC genes. : J Infection and Immunity13. WH Bowen, (1992). Molecular analysis of a Streptococcus mutans strain exhibitmg polymorphism in the tandem gtfBang gtf BC genes. : J Infection and Immunity14. HK Kuramitsu, (1992). Molecular analysis of a Streptococcus mutans strain exhibitmg polymorphism in the tandemgtf Bang gtf BC genes. : J Infection and Immunity

Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

3 / 3

151

Isolasi gen kariogenik gtf BC Streptococcus mutans dari plak gigianak

(The isolation of Streptococcus mutans cariogenic gtf BC gene from children’stooth plaque)

Yetty Herdiyati Soemantadiredja* dan Mieke Hemiawati Satari**** Bagian Ilmu Kedokteran Gigi Anak** Bagian MikrobiologiFakultas Kedokteran Gigi Universitas PadjadjaranBandung - Indonesia

ABSTRACT

The aim of this research was to prove that Streptococcus mutans isolated from children ‘s tooth plaque was cariogenic. Glf BCwhich is glycosiltransferase producer gene has had a role in caries development. This gene was isolated from Streptococcus mutans.The specimens were analyzed using Wizard Genomic DNA Purification Kit from Promega. In conclusion, S. mutans isolatedfromchildren’s tooth plaque truly had cariogenic gtf BC gene.

Key words: Streptococcus mutans, gen 16s rRNA, gen gtf BC

Korespondensi (correspondence): Yetty Herdiyati Soemantadiredja, Bagian Ilmu Kedokteran Gigi Anak, Fakultas Kedokteran GigiUniversitas Padjadjaran. Jln. Sekeloa Selatan I Bandung 40132, Indonesia.

PENDAHULUAN

Karies gigi merupakan suatu penyakit umum yangsering ditemukan sejak pertama terdapat sejarah kehidupanmanusia. Dr. WD Miller (1980) merupakan orang pertamayang menggambarkan karies sebagai aksi dari asam organikterhadap kalsium fosfat pada gigi. Ia memperlihatkan bilagigi diinkubasi dengan saliva dan karbohidrat, asam akanterbentuk dan menguraikan bagian gigi yangtermineralisasi. Ia menyimpulkan bahwa asam yangdibentuk oleh bakteri dalam saliva menguraikan gigi. Daripenelitian ini ia merumuskan teori “kemo-parasitik” darikaries gigi. Sejak saat itu banyak data yang mendukungteori menurunnya pH oleh produksi asam bakteri akanmenghasilkan penguraian email. Penelitian Dr. Miller telahmembentuk dasar untuk teori “plak-tuan rumah-substrat”dari pembentukan karies. Proses pembentukan karies gigidisebabkan oleh multifaktor, pada dasarnya dapatdisederhanakan menjadi hubungan yang tidak seimbangantara daya tahan gigi dengan faktor kariogenik.1

Email yang 95% terkalsifikasi merupakan struktur yangsangat termineralisasi dari tubuh manusia. Mayoritasmineralnya adalah hidroksiapatit yang merupakan keluargagaram kalsium fosfat. Formula umum yang diungkapkanuntuk hidroksiapatit adalah Ca10(PO4)6OH2.Hidroksiapatit murni merupakan struktur yang unik,terdapat sumbu simetris enam kali lipat di sekeliling suatusumbu simetris tiga kali lipat. Kristalnya tersusun dalamkonfigurasi heksagonal dengan atom kalsium dan fosforpada kristal terluar. Di bagian tengah kristal, kelompokhidroksil dikelilingi oleh tiga atom kalsium. Hubungan

dari masing-masing kelompok hidroksil berperan pentingdalam kestabilan kristal. Bahkan penggantian sejumlahkelompok hidroksil murni dengan atom dalam sepertifluoride menghasilkan peningkatan stabilitas kristal.Kristal heksagonal ini dikelompokkan bersama menjadisebuah batang. Email terbentuk dari banyak batang yangdipadatkan bersama menjadi sebuah batang. Batang initerbentang dari permukaan email ke dental junction.Ukuran kepadatan atau densitas dari email menunjukkanbahwa permukaan luar memiliki densitas yeng sedikit lebihtinggi daripada struktur lain. Ruang antar batang emailmerupakan matriks organik. Meskipun email kelihatannyasangat keras dan termineralisasi dengan baik,permukaannya berpori dengan adanya ion kecil sepertisodium, potassium, magnesium dan fluoride. Keberadaanruang interprismatik ini telah digunakan untukmenjelaskan permeabilitas yang terlihat pada email.1

Hidroksiapatit memiliki konstanta kemampuan untuklarut yang pasti bergantung pada temperatur, pH dankekuatan ionik dari pelarut yang mengelilingi kristal. Dirongga mulut, saliva mengalami supersaturasi dalam halkalsium dan fosfat yang menguntungkan bagi keadaankristal email dan dengan demikian gigi tidak terurai secarabertahap seumur hidup. Akibat dari sifat reaksi seimbangdalam rongga mulut, email berada dalam keadaanmineralisasi konstan dan demineralisasi pada kondisifisiologis (Ca2PO4, pH 6,8). Pada pH ini kemampuan untuklarut sangat kecil.

Meskipun demikian, jika pH diturunkan sampai sekitar1,3 log unit sampai 5,5 maka kemampuan untuk larutmeningkat sampai penguraian terjadi produksi asam dari

152 Maj. Ked. Gigi. (Dent. J.), Vol. 38. No. 3 Juli–September 2005: 151–153

bakteri dan pembentukan karies gigi yang terjadisetelahnya merupakan titik puncak dari suatu proses yangsangat selektif dari perlekatan bakteri dan kolonisasibakteri pada permukaan gigi. Bila hal ini terus berlanjutakan mengarah pada pembentukan plak. Plak gigi terdiridari sekumpulan sel besar dan kecil atau sel individualdari berbagai spesies bakteri yang berbeda serta matriksinterbakterial dengan komposisi heterogenous danbervariasi. Meskipun demikian, organisme asidogenikspesifik, yaitu yang berasal dari kelompok Streptococcusmutans (S. mutans) saat ini secara umum dianggapmemiliki peranan khusus dalam etiologi karies gigi.S. mutans merupakan salah satu pemicu karies karenabakteri ini memiliki enzim glikosiltransferase yangberperan sebagai prekursor dalam perkembangan plak gigi,namun tidak semua plak gigi dapat menyebabkan kariesgigi.’

BAHAN DAN METODE

Rancangan penelitian adalah observasional yangbersifat eksploratif yaitu dengan uji diagnostik laboratorisuntuk menentukan bahwa deteksi kuman Streptococcusmutans dapat menggunakan gen 16srRNA dengan PCR,dari 15 sampel yang digunakan dalam penelitian ini hanya1 yang berhasil terdeteksi sebagai Streptococcus mutans.

Bahan penelitian adalah plak gigi anak yang dicampurdalam bulyon kemudian campuran ini diencerkan hingga10-3 →10-5. Pembiakan dilakukan pada media TYCSBkemudian diinkubasikan secara anaerob selama 3 × 24jam. Ekstraksi DNA dengan metode Wizard GenomicDNA Purification Kit dari Promega.2,3

Adapun larutan yang harus disiapkan: EDTA 50 mMpH 8,0; lysozim 10 mg/mL; isopropanol; etanol 70.Peralatan yang digunakan berupa Tabung mikro 1,5 mL;Waterbath 37° C dan 80° C.

Cara kerja: hasil ekstrasi DNA ditambahkan 1 mlovernigth kultur ketabung 1,5 ml kemudian disentrifugasiselama 2 menit pada kecepatan 13.000-16.000 × g,supernatan dibuang, selanjutnya sel di resuspensi kedalamlarutan 480 μL EDTA 50 mM. Tambahkan 60 μL lysoziml0 mg/mL dengan menggunakan pipet secara hati-hatihingga semua sel tersuspensi, kemudian di inkubasi padasuhu 80° C selama 5 menit untuk melisis sel danselanjutnya didinginkan di dalam suhu ruang. Tambahkan3 μL larutan RNAse ke dalam tabung kemudian sampeldicampur dengan menginversi tabung sebanyak 2–5 kali,setelah itu diinkubasi selama 15–60 menit pada suhu37° C, biarkan sampel mencapai suhu ruang, selanjutnyaditambahkan larutan 200 μL protein precipitation danvortex pada kecepatan tinggi selama 20 detik lalu diinkubasi di dalam es selama 5 menit, kemudiandisentrifugasi selama 3 menit pada kecepatan 13.000–16.000× g.

Supernatan yang mengandung DNA dipindahkan ketabung 1,5 mL yang mengandung 600 μL isopropanol suhuruang, campurkan larutan dengan inversi sampai terlihatrantai DNA yang seperti benang halus. Lalu sentrifugasiselama 2 menit pada kecepatan 13.000-16.000× g,kemudian dengan hati-hati dekantasi supernatan dankeringkan tabung dengan membalikkan di atas kertas tissueyang bersih. Tambahkan 300 μL etanol 70 temperaturruang dan inversi tabung beberapa kali untuk mencuciDNA pelet, kemudian dilakukan sentrifugasi selama2 menit pada kecepatan 13.000–16.000× g, buang etanoldengan hati-hati. Keringkan tabung dengan konsentrator,atau balikan tabung pada kertas tissue bersih selama10–15 menit. Tambahkan 50 μL larutan DNA rehidrasiselanjutnya DNA disimpan pada suhu 2–8° C.

PCR gen l6s rRNAPrimer yang digunakan adalah untuk Universal reverse

primer: Uni B: 5'– GGTTC(G/C) TTGTTACGACTT-3'dan Eubacterial forward primer: BactFl: 5'–AGAGTTTGATC (A/C)TGGCTAC-3'.

Hasil optimasi PCR, dilakukan Denaturasi awal padasuhu 94° C selama 2 menit, Siklus amplikasi 30 siklus,kemudian di Denaturasi 94° C selama 1 menit, Annealing48° C selama 1 menit, Elongation 72° C selama 1 menit,pasca Elongation 72° C selama 10 menit. Melaluielektroforesis hasil PCR dengan menggunakan AgaroseDNA, diperoleh sebuah larik, dengan ukuran 1400 pb.

Reaksi sekuensing: 16s rRNAPrimer yang digunakan : 357 F: 5'- TAG GGG AGG

CAG CAG-3'; 807 F: 5' GAT TAG ATA CCC TGG TAG-3'; 1114F: 5' - GCA ACG AGC GCA ACC A -3'; 519 R:5' - GTA TTA CCG CGG CTG CRG-3'; 909 R: 5' - CCGTCA ATT CAT TTG AGT-3'.

Prosedur kerja: Isolasi kromosom Streptococcusmutans dengan menggunakan metode lisis cepat.Tujuannya adalah untuk memperoleh template yang akandigunakan pada amplifikasi gen glikosltransferase denganmetode PCR.

PCR gen gtf BCHasil optimasi PCR, dilakukan denatiirasi awal 94° C

selama 2 menit, siklus amplifikasi 40 siklus, denaturasi94° C selama 1 menit, Annealing 50° C selama 1 menitElongasi 72° C selama 1 menit, pasca elongasi 72° C10 menit.

HASIL

Hasil isolasi gen 16s rRNA yang diperoleh memilikipanjang 1400 pb. Setelah dilakukan homologi denganStreptococcus mutans UA 101 melalui program komputerDNA star, maka diyakini bahwa bakteri hasil isolat gigianak tersebut adalah Streptococcus mutans, tampak padagambar 1 dan 2.

153Herdiyati: Isolasi gen kariogenik gtf BC

Gambar 1. Hasil elektroforesis DNA 16s rRNa.1. Marka DNA puc HIN F, pita pertama berukuran

1419 pb, pita kedua berukuran 517 pb.2. Hasil PCR, 16s rRNA berukuran 1400 pb.

Gambar 3. Hasil Analisa SEQUENSING gen 16s rRNA

Gambar 2. Hasil elektroforesis DNA gtf BC.No. 1–3 Hasil PCR gen gtf BCNo. 4 Marka DNA puc HIN F, pita pertamaberukuran 1419 pb, pita kedua berukuran 517 pb.

PEMBAHASAN

Untuk dapat mengisolasi S. mutans secara tepat makasaat ini dapat digunakan deteksi Streptococcus mutanssecara molekuler yaitu dengan mengamplifikasi 16s rRNA.Setiap bakteri memiliki 16srRNA yang merupakan suatusubunit dari RNA ribosom. Subunit ini memiliki daerahkonservatif yang berguna untuk menentukan alignmentyang tepat dari suatu prokariot. Disamping itu daerah inimengandung pula sejumlah mutan yang bervariasi ditempat lain yang menjadi ciri khas untuk filogenetik suatubakteri.

Gen gtf BC adalah suatu polimer glukosa ekstraseluleryang bersifat tidak larut dalam air yang dikenal sebagaisalah satu faktor virulensi dalam karies. Gen gtf BC adalahsalah satu gen yang mengkode enzim yang bertanggungjawab untuk sintesis glukan yang tidak larut dalam air yangdikenal sebagai IG (insoluble glukan).2, 4-6

Penggunaan Streptococcus mutans UA 101 sebagaikontrol disebabkan bakteri ini memperlihatkan sifatkariogenik, karena memiliki gen gtf B atau gtf BC. Hasilisolasi gtf BC dengan panjang 517 pb menunjukkan bahwahasil isolat Streptococcus mutans dari gigi anak ini bersifatkariogenik. Streptococcus mutans secara konstitutif akanmensekresikan GTF yang dikode oleh gen gtf. Gen gtf inimembentuk suatu operon yang terdiri dari gtf A, B, C, D

dan yang berperan dalam pembentukan karies adalah gtfB dan gtf BC, glukan ini bersifat tidak larut dalam air,karena itu adanya kedua gen ini menunjukkan bahwabakteri Streptococcus mutans tersebut mampumenyebabkan terjadinya karies.

Berdasarkan penelitian ini disimpulkan bahwa, hasilisolat Streptococcus mutans dari plak gigi anakmenunjukkan adanya gen gtf BC yang dapatmengekspresikan glukan yang tidak larut air dan bersifatkariogenik.

DAFTAR PUSTAKA

1. Newman MG, Nisengard R. Oral Microbiology and immunology.Philadelphia: WB Saunders Co; 1988. p. 432–8.

2. Baker GC. Identification of Indonesian hyperthermoghiles using16 sr RNA Sequencing. Bandung: PPAU Bioteknologi ITB; 1999.

3. Madigan MT, Martinko JM, Parker J. Biology of Microorganisms9th ed. New Jersey: Prentice Hall Inc, 2000.

4. Russel RRB, Ivic A. The use of DNA probes for the identificationof oral Streptococci Caries. Res 1989; 23:110–2.

5. Chia JS, Yang CS, Chen JY. Functional analysis of a conservedregion in glucocyltransferase of Streptococcus Mutans. J Infectionand Immunity 1998; 66(10):4747–903.

6. Yamashita Y, Bowen WH, Kuramitsu HK. Molecular analysis of aStreptococcus mutans strain exhibitmg polymorphism in the tandemgtf Bang gtf BC genes. J Infection and Immumty 1992;60(4):1618–24.