Rompimento não-Mecânico 1) Choque Osmótico Não ocorre rompimento total das células; Pode...
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- Rompimento no-Mecnico 1) Choque Osmtico No ocorre rompimento
total das clulas; Pode propiciar a permeabilizao seletiva; As
clulas so mantidas por 30 minutos em meio com concentrao de
sacarose de ~20% (m/v), separadas por centrifugao e ressuspensas em
gua destilada a 4C. Mais indicado para bactrias Gram-negativas,
pois possuem parede celular mais sensvel que as
Gram-positivas.
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- Rompimento total e permeabilizao seletiva
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- Congelamento-descongelamento As clulas passam por repetidos
ciclos de congelamento e descongelamento, formando-se cristais de
gelo que podem perfurar a clula e provocar seu total rompimento ou
lesion-la formando poros permeveis biomolcula-alvo. Fatores que
mais influenciam: tipo e idade da clula; Temperatura Velocidades
dos ciclos de congelamento e descongelamento;
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- Congelamento-descongelamento Mtodo de difcil implantao em
grande escala Enzimas sensveis ao congelamento podem ser
inativadas
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- Termlise Consiste no aquecimento da suspenso celular em banho
termostatizado, com injeo direta de vapor, tambor rotativo ou em
spray-drier. Sos os mais utilizados para rompimento em larga escala
devido sua simplicidade; Principalmente utilizados para algas,
fungos filamentosos, leveduras e bactrias destinadas produo de
protena microbiana; Apresenta a vantagem de gerar fragmentos
celulares com maiores dimenses e, portanto, de mais fcil remoo por
filtrao ou centrifugao.
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- Termlise Exemplos: Rompimento total de clulas de uma suspenso
de E. coli (bactria Gram-negativa), ocorre com aquecimento a 90 C
por 15 minutos com liberao de enzimas intracelulares Uma suspenso
de Bacilus megaterium nas mesmas condies proporciona o rompimento
de menos da metade das clulas (bactria Gram-positiva- camada mais
espessa de peptideoglicano)
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- Rompimento Qumico lcalis: Adequado quando a molcula-alvo estvel
em pH maior que 11 Mtodo simples e de baixo custo; Ocasiona gerao
de poluentes;
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- Rompimento Qumico Detergentes: So capazes de dissociar protenas
e lipoprotenas das paredes celulares, provocando a formao de poros
e liberar a molcula-alvo; A clula pode ser totalmente rompida; Ex.:
lauril sulfato de sdio, Triton, etc. Formao de espuma e desnaturao
e/ou precipitao de protenas
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- Rompimento Qumico Solventes: Consiste na desidratao das clulas,
sendo os solventes mais utilizados o etanol, metanol, tolueno e
acetona; Adequado para biomolculas que no sejam desnaturadas na
presena do solvente empregado;
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- Rompimento Qumico Lise enzimtica: Mecanismo de rompimento:
membrana citoplasmtica rompida pela presso osmtica interna, aps a
parede celular, ou parte dela, ser removida por ao das enzimas,
permitindo que o contedo intracelular seja liberado. Adequado para
recuperao de biomolculas sensveis ao rompimento mecnico,
temperatura, tenso de cisalhamento e elevadas presses. Fatores a
ser considerados: presena de inibidores, possibilidade de reciclo
da enzima.
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- Rompimento Qumico Sistema enzimtico deve ser adequado para cada
tipo de microrganismo: Leveduras: glucanases, proteases e
mananases, as quais hidrolisam componentes especficos da parede,
como glucanas, protenas e mananas. Bactrias Gram-negativas: enzimas
que ajam sobre as ligaes covalentes da estrutura do
peptideoglicano
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- Parede Celular Bacteriana Peptideoglicano Ex.: lisozima,
catalisa a hidrlise das ligaes glicosdicas do peptideoglicano, mais
eficiente no rompimentos de bactrias Gram- positivas.
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- Preservao da Biomolcula-alvo Adio de inibidores de proteases
(para diminuir o efeito da degradao de protenas); Adio de agentes
redutores (para evitar a oxidao dos stios ativos das enzimas aps o
rompimento); Adio de nucleases ou proteases podem melhorar as
caractersticas do meio, desde que no destruam a molcula de
interesse; Alterao de pH pode melhorar a viscosidade do meio.
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- Etapas de um Processo de Purificao Baixa resoluo Alta
resoluo
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- Mtodos de Purificao de Baixa Resoluo Precipitao Separao por
membranas Extrao em sistemas de duas fases lquidas
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- Precipitao
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- Um dos mtodos mais tradicionais de concentrao e purificao; um
mtodo moderado de purificao j que no apresenta elevada capacidade
de separao de diferentes protenas; Mtodos agressivo para recuperao
de protenas, pois sua funo tridimensional modificada, e a funo
bioqumica de uma protena depende de sua estrutura; vivel quando a
funo bioqumica recuperada aps a precipitao
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- Precipitao PrecipitantePrincpioVantagensDesvantagens Sais
neutros (Salting-out) Interaes hidrofbicas pela reduo da camada de
hidratao da protena - Uso universal- Corrosivo - Baixo custo-
Liberao de amnia em pH alcalino Polmeros no-inicosExcluso da
protena da fase aquosa reduzindo a quantidade de gua disponvel para
a solvatao da protena - Uso de pequenas quantidades de precipitante
- Aumento da viscosidade Calorinteraes hidrofbicas e interferncia
das molculas de gua nas ligaes de hidrognio, - Baixo custo- Risco
de desnaturao - Simples Polieletr-litosLigao com a molcula de
protena atuando como agente floculante - Uso de pequenas
quantidades de precipitante - Risco de desnaturao Precipitao
isoeltricaNeutralizao da carga global da protena pela alterao do pH
do meio - Uso de pequenas quantidades de precipitante - Risco de
desnaturao Sais metlicosFormao de complexos- Uso de pequenas
quantidades de precipitante - Risco de desnaturao Solventes
orgnicosReduo da constante dieltrica do meio aumentando as interaes
eletrostticas intermoleculares - Facilidade de reciclagem- Risco de
desnaturao de protenas - Facilidade na remoo do precipitado -
Inflamvel e explosivo
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- Estrutura das Protenas Constituio Aminocidos (aa) com elevada
massa molar (> 6000Da); dos quase 200 aa conhecidos, apenas 20
constituem as protenas. Os 20 aa das protenas se diferenciam pela
cadeia lateral R, que determina o carter cido ou bsico do aa em
soluo.
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- Estrutura das Protenas Estrutura primria: refere-se seqncia dos
aminocidos na cadeia linear peptdica. Estrutura secundria:
refere-se ao grau de ordenao espacial da cadeia polipeptdica. So
estruturas helicoidais ou folhas pregueadas.
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- Estrutura das Protenas Estrutura terciria: refere-se ao arranjo
espacial obtido pelas dobraduras e enrolamentos da estrutura
secundria. Envolve a otimizao de vrias interaes (hidrofbicas,
eletrostticas e de van der Waals) e pontes de hidrognio entre vrios
grupos na estrutura da protena. As estruturas secundria e terciria
conferem protena a sua estrutura tridimensional.
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- Estrutura das Protenas Estrutura quaternria: envolve a associao
de subunidades tercirias de protenas. Para sua estabilizao
concorrem ligaes inicas, pontes de hidrognio, foras de van der
Waals, pontes bissulfeto e interaes hidrofbicas.
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- Solubilidade de Protenas Regio Hidrofbica (Apolar) Regies
Hidroflicas (Polares) Determina sua solubilidade Alm dos aa, ons
ferro e cobre, oligossacardeos e lipdeos conferem diferentes
solubilidades s protenas.
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- Solubilidade: resultado global das interaes atrativas e
repulsivas entre molculas do solvente e soluto; favorecida quando h
interaes repulsivas entre molculas de soluto e atrativas entre
molculas do soluto e solvente; Interaes entre soluto e solvente so
no covalentes => interaes eletrostticas e foras de Van der
Waals;
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- pH: grande influncia => altera o grau de dissociao dos
grupamentos; Carga total zero leva ao da agregao devido repulso
=> perfis de solubilidade em diferentes valores de pH O ponto de
solubilidade mnima igual ou prximo ao ponto isoeltrico (pI), que
corresponde ao valor de pH no qual a protena possui carga global
igual a zero.
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- pH e distribuio de cargas: pI - + De modo geral, o solvente
aquoso, e, alterando-se as propriedades do meio por mudanas na fora
inica e no pH, por adio de solventes orgnicos miscveis e polmeros
orgnicos, altera-se a solubilidade das protenas.
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- Desnaturao X Precipitao A desnaturao compreende a destruio da
estrutura terciria de uma molcula de protena e a formao de cadeias
polipeptdicas ao acaso. - as variveis pH, temperatura e solventes
orgnicos, dependendo dos valores, causam desnaturao das protenas. A
precipitao compreende a modificao da estrutura tridimensional da
molcula de protena. - as mesmas variveis, dependendo dos valores,
causam precipitao das protenas.
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- A precipitao deve permitir que a conformao adequada da protena
seja recuperada, para que a mesma possa exercer sua funo bioqumica
aps o processo.
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- Precipitao por sais Neutralizao das cargas superficiais com
reduo da camada de hidratao Salting-out: adio de sais que promovem
o aprisionamento de molculas de gua que tornam-se escassas e o
consequente consumo das molculas de gua nas regies hidrofbicas, que
expostas interagem e se agregam. Os sais mais adequados so aqueles
que apresentam elevada solubilidade, ex.: citrato de sdio, sulfato
de sdio e sulfato de amnio.
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- Salting-in: reduo na concentrao de sais induz interaes inicas e
agregao entre molculas de protena. Mtodo mais comumente usado para
separao de protenas o da adio de sais neutros (salting out)
Globulinas se precipitam sob fora inica baixa
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- Precipitao por solventes A solubilidade das protenas varia com
a distribuio dos resduos hidroflicos e hidrofbicos na superfcie da
molcula; lcoois de cadeia inferior, acetona, teres e outros:
precipitantes; Deve ser miscvel em gua, no reagir diretamente com
as molculas e ser bom precipitante; Mais usados: metanol, etanol e
acetona;
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- Mecanismo Agregao de protenas por interaes eletrostticas entre
superfcies com cargas de sinal oposto em meio aquoso contendo
solvente orgnico.
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- Variveis que afetam o processo Temperatura: 20 30 C estimulam a
desnaturao < 0 C podem garantir que no haja desnaturao adio do
solvente temperatura => deve ser lenta e sob refrigerao pH:
prximo ao pI favorece a precipitao
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- Precipitao por polmeros PEG (polietilenoglicol), polmero de
alta massa molar, neutro e miscvel em gua, disponvel em diversos
graus de polimerizao; Em geral, propores de polmero (15 a 30%);
4000 g/mol ou mais so os mais eficientes Mecanismo: excluso da
protena do meio aquoso; Concentrao depende do tamanho da molcula a
ser precipitada e da massa molar do polmero, sendo inversamente
proporcional concentrao da protena; Remoo do polmero: ultrafiltrao,
adio de etanol, separao pela formao de duas fases aquosas pela adio
de sais.
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- Polieletrlitos: polmeros inicos solveis em gua; usados devido
ao baixo custo e pouca concentrao residual; Poliction
polietilenoimina e polinion cido poliacrlico, utilizados para
precipitar cidos nuclicos e protenas. Mecanismo: Ocorre a agregao
protena (floculao) ou eletrosttico (neutralizao de cargas); a
protena e o polieletrlito devem ter cargas opostas, por isso,
deve-se operar longe do ponto isoeltrico da protena. Precipitao
pela temperatura Mecanismo:1) diminuio: reduo na solubilidade; 2)
aumento: desnaturao => exposio de grupos hidrofbicos que
interagem e formam complexos insolveis;
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- Precipitao isoeltrica Resulta da atrao eletrosttica das
protenas quando estas esto prximas a seu pI; Mtodo bastante
simples: ajuste do pH Prximo ao pI a repulso eletrosttica mnima
=> precipitao isoeltrica, por interao entre as zonas
hidrofbicas; Vantagem: baixo custo Desvantagem: possibilidade
desnaturao Obs.: Mtodo til para precipitar protenas indesejveis e
otimizar outros tipos de precipitao;