Slide 1

Rompimento no-Mecnico 1) Choque Osmtico No ocorre rompimento total das clulas; Pode propiciar a permeabilizao seletiva; As clulas so mantidas por 30 minutos em meio com concentrao de sacarose de ~20% (m/v), separadas por centrifugao e ressuspensas em gua destilada a 4C. Mais indicado para bactrias Gram-negativas, pois possuem parede celular mais sensvel que as Gram-positivas.

Slide 2

Rompimento total e permeabilizao seletiva

Slide 3

Congelamento-descongelamento As clulas passam por repetidos ciclos de congelamento e descongelamento, formando-se cristais de gelo que podem perfurar a clula e provocar seu total rompimento ou lesion-la formando poros permeveis biomolcula-alvo. Fatores que mais influenciam: tipo e idade da clula; Temperatura Velocidades dos ciclos de congelamento e descongelamento;

Slide 4

Congelamento-descongelamento Mtodo de difcil implantao em grande escala Enzimas sensveis ao congelamento podem ser inativadas

Slide 5

Termlise Consiste no aquecimento da suspenso celular em banho termostatizado, com injeo direta de vapor, tambor rotativo ou em spray-drier. Sos os mais utilizados para rompimento em larga escala devido sua simplicidade; Principalmente utilizados para algas, fungos filamentosos, leveduras e bactrias destinadas produo de protena microbiana; Apresenta a vantagem de gerar fragmentos celulares com maiores dimenses e, portanto, de mais fcil remoo por filtrao ou centrifugao.

Slide 6

Termlise Exemplos: Rompimento total de clulas de uma suspenso de E. coli (bactria Gram-negativa), ocorre com aquecimento a 90 C por 15 minutos com liberao de enzimas intracelulares Uma suspenso de Bacilus megaterium nas mesmas condies proporciona o rompimento de menos da metade das clulas (bactria Gram-positiva- camada mais espessa de peptideoglicano)

Slide 7

Rompimento Qumico lcalis: Adequado quando a molcula-alvo estvel em pH maior que 11 Mtodo simples e de baixo custo; Ocasiona gerao de poluentes;

Slide 8

Rompimento Qumico Detergentes: So capazes de dissociar protenas e lipoprotenas das paredes celulares, provocando a formao de poros e liberar a molcula-alvo; A clula pode ser totalmente rompida; Ex.: lauril sulfato de sdio, Triton, etc. Formao de espuma e desnaturao e/ou precipitao de protenas

Slide 9

Rompimento Qumico Solventes: Consiste na desidratao das clulas, sendo os solventes mais utilizados o etanol, metanol, tolueno e acetona; Adequado para biomolculas que no sejam desnaturadas na presena do solvente empregado;

Slide 10

Rompimento Qumico Lise enzimtica: Mecanismo de rompimento: membrana citoplasmtica rompida pela presso osmtica interna, aps a parede celular, ou parte dela, ser removida por ao das enzimas, permitindo que o contedo intracelular seja liberado. Adequado para recuperao de biomolculas sensveis ao rompimento mecnico, temperatura, tenso de cisalhamento e elevadas presses. Fatores a ser considerados: presena de inibidores, possibilidade de reciclo da enzima.

Slide 11

Rompimento Qumico Sistema enzimtico deve ser adequado para cada tipo de microrganismo: Leveduras: glucanases, proteases e mananases, as quais hidrolisam componentes especficos da parede, como glucanas, protenas e mananas. Bactrias Gram-negativas: enzimas que ajam sobre as ligaes covalentes da estrutura do peptideoglicano

Slide 12

Parede Celular Bacteriana Peptideoglicano Ex.: lisozima, catalisa a hidrlise das ligaes glicosdicas do peptideoglicano, mais eficiente no rompimentos de bactrias Gram- positivas.

Slide 13

Preservao da Biomolcula-alvo Adio de inibidores de proteases (para diminuir o efeito da degradao de protenas); Adio de agentes redutores (para evitar a oxidao dos stios ativos das enzimas aps o rompimento); Adio de nucleases ou proteases podem melhorar as caractersticas do meio, desde que no destruam a molcula de interesse; Alterao de pH pode melhorar a viscosidade do meio.

Slide 14

Etapas de um Processo de Purificao Baixa resoluo Alta resoluo

Slide 15

Mtodos de Purificao de Baixa Resoluo Precipitao Separao por membranas Extrao em sistemas de duas fases lquidas

Slide 16

Precipitao

Slide 17

Um dos mtodos mais tradicionais de concentrao e purificao; um mtodo moderado de purificao j que no apresenta elevada capacidade de separao de diferentes protenas; Mtodos agressivo para recuperao de protenas, pois sua funo tridimensional modificada, e a funo bioqumica de uma protena depende de sua estrutura; vivel quando a funo bioqumica recuperada aps a precipitao

Slide 18

Precipitao PrecipitantePrincpioVantagensDesvantagens Sais neutros (Salting-out) Interaes hidrofbicas pela reduo da camada de hidratao da protena - Uso universal- Corrosivo - Baixo custo- Liberao de amnia em pH alcalino Polmeros no-inicosExcluso da protena da fase aquosa reduzindo a quantidade de gua disponvel para a solvatao da protena - Uso de pequenas quantidades de precipitante - Aumento da viscosidade Calorinteraes hidrofbicas e interferncia das molculas de gua nas ligaes de hidrognio, - Baixo custo- Risco de desnaturao - Simples Polieletr-litosLigao com a molcula de protena atuando como agente floculante - Uso de pequenas quantidades de precipitante - Risco de desnaturao Precipitao isoeltricaNeutralizao da carga global da protena pela alterao do pH do meio - Uso de pequenas quantidades de precipitante - Risco de desnaturao Sais metlicosFormao de complexos- Uso de pequenas quantidades de precipitante - Risco de desnaturao Solventes orgnicosReduo da constante dieltrica do meio aumentando as interaes eletrostticas intermoleculares - Facilidade de reciclagem- Risco de desnaturao de protenas - Facilidade na remoo do precipitado - Inflamvel e explosivo

Slide 19

Estrutura das Protenas Constituio Aminocidos (aa) com elevada massa molar (> 6000Da); dos quase 200 aa conhecidos, apenas 20 constituem as protenas. Os 20 aa das protenas se diferenciam pela cadeia lateral R, que determina o carter cido ou bsico do aa em soluo.

Slide 20

Estrutura das Protenas Estrutura primria: refere-se seqncia dos aminocidos na cadeia linear peptdica. Estrutura secundria: refere-se ao grau de ordenao espacial da cadeia polipeptdica. So estruturas helicoidais ou folhas pregueadas.

Slide 21

Estrutura das Protenas Estrutura terciria: refere-se ao arranjo espacial obtido pelas dobraduras e enrolamentos da estrutura secundria. Envolve a otimizao de vrias interaes (hidrofbicas, eletrostticas e de van der Waals) e pontes de hidrognio entre vrios grupos na estrutura da protena. As estruturas secundria e terciria conferem protena a sua estrutura tridimensional.

Slide 22

Estrutura das Protenas Estrutura quaternria: envolve a associao de subunidades tercirias de protenas. Para sua estabilizao concorrem ligaes inicas, pontes de hidrognio, foras de van der Waals, pontes bissulfeto e interaes hidrofbicas.

Slide 23

Solubilidade de Protenas Regio Hidrofbica (Apolar) Regies Hidroflicas (Polares) Determina sua solubilidade Alm dos aa, ons ferro e cobre, oligossacardeos e lipdeos conferem diferentes solubilidades s protenas.

Slide 24

Solubilidade: resultado global das interaes atrativas e repulsivas entre molculas do solvente e soluto; favorecida quando h interaes repulsivas entre molculas de soluto e atrativas entre molculas do soluto e solvente; Interaes entre soluto e solvente so no covalentes => interaes eletrostticas e foras de Van der Waals;

Slide 25

pH: grande influncia => altera o grau de dissociao dos grupamentos; Carga total zero leva ao da agregao devido repulso => perfis de solubilidade em diferentes valores de pH O ponto de solubilidade mnima igual ou prximo ao ponto isoeltrico (pI), que corresponde ao valor de pH no qual a protena possui carga global igual a zero.

Slide 26

pH e distribuio de cargas: pI - + De modo geral, o solvente aquoso, e, alterando-se as propriedades do meio por mudanas na fora inica e no pH, por adio de solventes orgnicos miscveis e polmeros orgnicos, altera-se a solubilidade das protenas.

Slide 27

Desnaturao X Precipitao A desnaturao compreende a destruio da estrutura terciria de uma molcula de protena e a formao de cadeias polipeptdicas ao acaso. - as variveis pH, temperatura e solventes orgnicos, dependendo dos valores, causam desnaturao das protenas. A precipitao compreende a modificao da estrutura tridimensional da molcula de protena. - as mesmas variveis, dependendo dos valores, causam precipitao das protenas.

Slide 28

A precipitao deve permitir que a conformao adequada da protena seja recuperada, para que a mesma possa exercer sua funo bioqumica aps o processo.

Slide 29

Precipitao por sais Neutralizao das cargas superficiais com reduo da camada de hidratao Salting-out: adio de sais que promovem o aprisionamento de molculas de gua que tornam-se escassas e o consequente consumo das molculas de gua nas regies hidrofbicas, que expostas interagem e se agregam. Os sais mais adequados so aqueles que apresentam elevada solubilidade, ex.: citrato de sdio, sulfato de sdio e sulfato de amnio.

Slide 30

Salting-in: reduo na concentrao de sais induz interaes inicas e agregao entre molculas de protena. Mtodo mais comumente usado para separao de protenas o da adio de sais neutros (salting out) Globulinas se precipitam sob fora inica baixa

Slide 31

Precipitao por solventes A solubilidade das protenas varia com a distribuio dos resduos hidroflicos e hidrofbicos na superfcie da molcula; lcoois de cadeia inferior, acetona, teres e outros: precipitantes; Deve ser miscvel em gua, no reagir diretamente com as molculas e ser bom precipitante; Mais usados: metanol, etanol e acetona;

Slide 32

Mecanismo Agregao de protenas por interaes eletrostticas entre superfcies com cargas de sinal oposto em meio aquoso contendo solvente orgnico.

Slide 33

Variveis que afetam o processo Temperatura: 20 30 C estimulam a desnaturao < 0 C podem garantir que no haja desnaturao adio do solvente temperatura => deve ser lenta e sob refrigerao pH: prximo ao pI favorece a precipitao

Slide 34

Precipitao por polmeros PEG (polietilenoglicol), polmero de alta massa molar, neutro e miscvel em gua, disponvel em diversos graus de polimerizao; Em geral, propores de polmero (15 a 30%); 4000 g/mol ou mais so os mais eficientes Mecanismo: excluso da protena do meio aquoso; Concentrao depende do tamanho da molcula a ser precipitada e da massa molar do polmero, sendo inversamente proporcional concentrao da protena; Remoo do polmero: ultrafiltrao, adio de etanol, separao pela formao de duas fases aquosas pela adio de sais.

Slide 35

Polieletrlitos: polmeros inicos solveis em gua; usados devido ao baixo custo e pouca concentrao residual; Poliction polietilenoimina e polinion cido poliacrlico, utilizados para precipitar cidos nuclicos e protenas. Mecanismo: Ocorre a agregao protena (floculao) ou eletrosttico (neutralizao de cargas); a protena e o polieletrlito devem ter cargas opostas, por isso, deve-se operar longe do ponto isoeltrico da protena. Precipitao pela temperatura Mecanismo:1) diminuio: reduo na solubilidade; 2) aumento: desnaturao => exposio de grupos hidrofbicos que interagem e formam complexos insolveis;

Slide 36

Precipitao isoeltrica Resulta da atrao eletrosttica das protenas quando estas esto prximas a seu pI; Mtodo bastante simples: ajuste do pH Prximo ao pI a repulso eletrosttica mnima => precipitao isoeltrica, por interao entre as zonas hidrofbicas; Vantagem: baixo custo Desvantagem: possibilidade desnaturao Obs.: Mtodo til para precipitar protenas indesejveis e otimizar outros tipos de precipitao;