principios de interpretacion del hemograma automatizado

PRINCIPIOS DE INTERPRETACION DEL

HEMOGRAMA AUTOMATIZADO

Lic. TM Boris Valdivia VizarragaServicio de Hematología

Hospital Nacional “ Guillermo Almenara Irigoyen “ESSALUD

Introducción • El desarrollo de los Autoanalizadores hematológicos

comenzó en la década de los 50 con los hermanos Wallace y Joseph Coulter, quienes inventaron en 1956 el primer contador automático de células sanguíneas

• Hasta 1973 los hermanos coulter mantuvieron sus diseños en forma exclusiva, desarrollándolos y mejorándolos

• Posteriormente otros fabricantes introducen nuevos modelos basados en el mismo principio

• En 1980 se introduce el diferencial 3 Diff además del estudio de la serie roja con los cómputos de eritocitos, la determinación de la hemoglobina y el cálculo de los índices eritrocitarios

Hermanos Wallace y Joseph Coulter

Parámetros del Hemograma Automatizado 5 Diff

Parametro Abreviarura Unidades

Recuento total de glóbulos blancos WBC x 103 / ul

Porcentaje de neutrófilos NEUT % %

Porcentaje de linfocitos LYNPH % %

Porcentaje de monocitos MONO % %

Porcentaje de eosinófilos EO % %

Porcentaje de basofilos BASO % %

Valor absoluto de neutrófilos NEUT # x 103 / ul

Valor absoluto de linfocitos LYNPH # x 103 / ul

Valor absoluto de monocitos MONO # x 103 / ul

Valor absoluto de eosinófilos EO # x 103 / ul

Parámetros del Hemograma Automatizado 5 Diff

Parametro Abreviarura Unidades Valor absoluto de basófilos BASO # x 103 / ul

Recuento total de glóbulos rojos RBC x 106 / ul

Hemoglobina HGB G / dl

Hematocrito HCT %

Volumen Corpuscular Medio MCV fL

Hemoglobina Corpuscular Media HCM pg

Concentración de HGB Corpuscular Media MCHM g / dl

Ancho de Distribución Eritrocitaria RDW - SD fL

Ancho de Distribución Eritrocitaria – CV RDW – CV %

Parámetros del Hemograma Automatizado 5 Diff

Parametro Abreviarura Unidades

Recuento total de Plaquetas PLT x 106 / ul

Volumen Plaquetario Medio MPV fL

Ancho de Distribución Plaquetario PDW %

Estudio de la Serie Roja• Los años y evaluaciones han dado total

aprobación a la impedancia eléctrica para el estudio de las serie roja, en la obtención del computo de eritrocitos

• Hematocrito electrónico• Hemoglobina • VCM, HCM, CHCM• Nuevos índices como RDW y PDW• Gráficos de distribución de la población eritroide,

histogramas que se obtienen de los parámetros de volumen celular Vs distribución de frecuencia

• En el hemograma automatizado por la metodología usada el valor de Hto es menor al método del capilar. Disminuye 5% ( 1 – 2 unidades del Hto )

• La CHCM deja el significado del método manual debido a la menor variabilidad debido a que el Hto se obtiene electrónicamente

• Solo es significativa si presenta variaciones muy importantes ( < 29% ) o elevaciones extremas ( > de 37% ) como se observa en la esferocitosis

• Entonces en un caso de anemia la clasificación inicial se realiza con las cifras de HB, Hto, constantes corpusculares , RDW y el histograma

• Toda esta información muy valiosa para el clínico debe ser corroborada por el examen microscópico de la serie roja, atendiendo a las alarmas que estos equipos mostrarán en sus pantallas .

Para tener en cuenta :

• A pesar del avance tecnológico alcanzado, los autoanalizadores hematológicos presentan limitaciones :

1. No detectan poiquilocitosis

2. No detectan inclusiones eritrocitarias

3. Lo que nos presentan los fabricantes son distintos tipos de alarmas con diversa sensibilidad, que tienen que ver con el tamaño celular, línea celular, error intra-método y/o de proceso.

4. Finalmente, no se debe por ningún motivo, dejar de realizar el examen microscópico de las células

Estudio de la Serie Roja

• Por lo tanto, la observación microscópica nos permite confirmar lo señalado por los índices hemáticos, asi como, establecer la presencia de anormalidades

• Deben considerarse además una serie de interferencias que alteran el hemograma automatizado :

• 1. lipemia • 2. ictericia severa• 3. hemólisis• 4. auto-aglutinación por anticuerpos fríos• 5. plaquetas gigantes• 6. leucemias• 7. otras anormalidades

ANEMIA MCV RDW CV RDW SD

Deficiencia de B12/folato, hemólisis elevado elevado elevadoCausa inmune, aglutinación de GRPor anticuerpos fríos, anemia aplásica

Insuficiencia severa de fierro bajo elevado elevado

Hemoglobinopatías heterocigóticas normal normal bajo

Hemoglobinopatías homocigótas normal elevado elevado

Mielofibrosis / anemia sideroblástica normal elevado elevado

Anemia hemolítica normal normal elevado

Anemia secundaria normal normal normal

Talasemia y Hemoglobina S combinada bajo elevado elevado

Talasemia bajo normal bajo

Principio de Medición por el Método

de la Impedancia Eléctrica

El número de pulsos eléctricos indica la

cantidad de partículas que pasan a través de la apertura y el tamaño de

los pulsos es proporcional al volumen

de las partículas

Un pequeño voltaje apareceA travez de los electródos

Señal celular

Apertura

Cuando una célula suspendida en una solución electrolítica pasa a través De la apertura, el cambio de la impedancia eléctrica es detectado como un Pulso. El número total de pulsos corresponde al conteo total de células yLa altura de cada pulso es proporcional al correspondiente volumen celular

Apertura

Apertura

Célula 1

Célula 2

Cuando 2 o mas células son detectadas enLa apertura, la célula 1 y célula 2 son Detectadas como un gran pulso, por lo tantoUna de las células no es contada ( perdidaDe coincidencia ). El grado de perdida deCoincidencia depende de la concentración Celular .

VOLUMETRIA

No se puede obtener el recuento celular absoluto a menos que se conozca el volumen preciso de sangre total diluida que atraviesa la abertura durante el ciclo de recuento

Talasemia

Estudio de la Serie Blanca• Es en el estudio diferencial de leucocitos donde se han

desarrollado mas y nuevas tecnologías, con el fin de detectar con mayor precisión : tamaño, forma, morfología nuclear, granularidad y estructuras complejas.

• La cuenta total de leucocitos se da con la impedancia en la mayoría de aparatos

• Algunos aparatos usan la impedancia para medir el volumen nuclear y realizar un diferencial 3 Diff, que muestra linfocitos, granulocitos y células mixtas

• Estos diferenciales se acompañan de histogramas y deben ser tomados en cuenta, pero nunca ser los definitivos. Mas usados en pacientes saludables

Estudio de la Serie Blanca

• Los datos mas confiables para el leucograma electrónico los ofrecen los diferenciales 5 Diff

• Estos ofrecen análisis por medi de :• 1. rayo láser ( scatter light )• 2. radiofrecuencia• 3. impedancia• 4. citoquímica• 5. canales de lobularidad

• La utilización de citoquímica para detectar los granulocitos se encuentra en algunos instrumentos, con el uso de la peroxidasa, en conjunto con un canal de lobularidad, para basófilos

• Análoga a la especificidad de los antígenos, la composición y cantidad relativa de diferentes clases de lípidos en la membrana de los leucocitos, muestra patrones característicos, que son diferentes para cada tipo de célula

• Una reacción cito-química, basada en estas características de la membrana es la mejor forma de estos instrumentos para diferenciar granulocitos maduros de los inmaduros

• Causas de interferencia en serie blanca :

• 1. crioglobulinas

• 2. criofibrinógeno

• 3. proteínas monoclonales

• 4. eritroblastos

• 5. agregados plaquetarios

• 6. eritrocitos no lisados

• 7. microcoagulos

• 8. heparina circulante

Estudio de las Plaquetas

• El computo se hace habitualmente por impedancia

• La condición de una muestra en circunstancias de tiempo, temperatura, homogenización, relación sangre total / anticoagulante, y la no formación de hemólisis y espuma. Son indispensables para un resultado confiable

Histogramas de Plaquetopenias

•COULTER utiliza su tecnología patentada de SWEET FLOW que consiste en hacer circular una corriente de diluyente en la parte inmediatamente posterior de la apertura de eritrocitos, a fin de que las plaquetas como son tan pequeñas no permanezcan en el área de recuento y por lo tanto no se cuenten más de una vez

• Ante un recuento plaquetario disminuido, se debe de hacer un examen microscópico de toda la lámina y/o recuento en cámara.

• Las plaquetas se comportan de manera particular, ya que cambian de forma desde el momento de su extracción, para luego estabilizarse, despues de varias horas pierde confiabilidad.

• Los cambios reales dependen de la alteración en la generación medular de plaquetas

• Presenta alteraciones en pacientes con plaquetas gigantes

• El PDW o ancho de distribución plaquetaria, corresponde a la amplitud de distribución o anisocitosis plaquetaria y se encuentra alterado en PTI, Mielodisplasia, Mieloproliferación

• Debe tenerse presente que algunas condiciones con producción defectuosa medular liberan plaquetas muy pequeñas y entonces el PDW, VPM y P-LCR presentan valores muy bajos

• En trombocitopenias es muy útil el histograma, ya que el equipo no realiza los cálculos

• Es definitivo que toda alteración plaquetaria debe realizarse al examen microscópico

• Alteraciones en el recuento automatizado :• 1. pseudotrombicitopenia• 2. microcitos• 3. fragmetos eritrocitarios• 4. inclusiones eritrocitarias• 5. microcoagulos• 6. heparina

• Los sistemas COULTER poseen 2 baños, uno de eritrocitos y otro de leucocitos, en el baño de eritrocitos se encuentra una apertura de 50 µm y en el de los leucocitos otra de 100 µm.

HISTOGRAMAS

Método de Conteo Celular por Dispersión de la Luz

• Medida a 0º

sirve para medir el tamaño celular

• Medida a 10º

mide la complejidad celular• Medida a 90º

mide la superficie celular y la estructura interna

( granularidad )• Medida a 90ºD

mide determinados tipos de

granularidad celular

FOCALIZACIÓN HIDRODINÁMICA

• A medida que las células penetran en el área de visualización específica, se produce la interacción con el rayo láser con ángulos diferentes, que suministran información sobre el tamaño de la célula, la estructura interna, la granularidad y la morfología de la superficie.

• CITOMETRIA DE FLUJO

“ Una subdisciplina de la citología analítica, con orientación metodológica, que mide las células en suspensión, dentro de un vehículo líquido, a su paso por una estación de medida ”

NCCLS

RADIOFRECUENCIA ( Conductividad )

La conductividad de las ondas de radioA través de las células, nos revelan su composición interna

Una frecuencia alta, generada por un oscilador de cristal, sobreimpuesta a la corriente directa, que incide sobrelas células para medir su densidad.

TECNOLOGÍAVCS

• IMPEDANCIA• SCATTER LIGHT• RADIOFRECUENCIA

RF

DC

Centroide inicialDe los granulocitos

Centroide inicial deMonocitos

Centroide inicialDel estroma

CentroideInicial deLinfocitos

Eosinófilos

NeutrófilosPolinucleados

Linfocítos

MonocítosBasófilos

PARAMETRO PRINCIPIO

WBC Impedancia

RBC/PLT Corriente Directa/ enfoque hidrodinámico

HGB Lauril Sulfato de sodio (SLS ) Cianmetahemoglobia. Fotométrico

HCT Acumulación de la altura de los pulsos

LY, MO, GRAN Citometria ( MAPSS ), CD,

Radiofrecuencia ( RF )- VCS

EO CD

BASO CD

IMI RF, DC, RF

Retic % Citometria de flujo & fluorescencia

Todo conteo celular comparte tres pasos básicos :

1. Dilución de la sangre2. Toma de muestra de una cantidad medida3. Enumeración de partículas

Ventajas de los métodos electrónicos :

1. Velocidad 2. Precisión3. Cálculo automatizado del Hematocrito y constantes4. Impresión de resultados

•

• El MCV es calculado sobre las bases de la sumatoria de la altura de los pulsos de las células rojas y dividido por el conteo de G.R.

• El volumen del paquete celular es calculado del MCV multiplicado por el conteo de células rojas

• El MCH es calculado del valor de la Hemoglobina y el conteo de G.R.

• El MCHC es calculado del valor de Hemoglobina y el Hematocrito

1. La turbidez producida por conteos elevados de células blancas, pueden alterar el valor de la Hemoglobina, MVC, y Hematocrito.

2. En LLC y otras leucemias las células son fácilmente dañadas por la apertura, pudiendo aparecer falsos conteos bajos de leucocitos ( WIC / WOC )

3. Títulos altos de aglutininas frías, que agregan los GR a temperaturaambiente, son responsables de macrocitosis y valores altos de MCHM

Hematocrito :

Se mide en % y representa la proporción total de GR en la sangre.

• No se mide directamente con los citómetros de flujo y se calcula a partir del VCM y en número de GR. Tiene menor presición

• El hematocrito es medido electrónicamente :“ el pulso que es generado cuando los GR pasan a través de la abertura es proporcional a su volumen “. Se determina comparando el volumen total o acumulado de GR al volumen total de sangre en los 11.7ul de la dilución 1:500

El conteo diferencial manual está sujeto a varios errores

• Errores en la preparación del frotis

• Errores en la tinción del frotis

• Distribución celular

• Interpretación celular

• Número de células contadas

Un buen diferencial automatizado debe ser capaz de :

1. Identificar células normales y anormales2. Resultados reproducibles en conteos repetitivos3. El conteo debe exceder largamente ( 8,000 – 32,000 cel. )

al tradicional conteo manual ( 100 – 200 células )1. El conteo debe llevarse a cabo en un mínimo lapso

de tiempo1. Se debe tener capacidad de almacenamiento de datos

Solo un ejemplo : Tinción Citoquímica

1. eosinófilos y neutrófilos son identificados por su contenido de perooxidasa

2. una mezcla de peróxido de hidrógeno y 4 - cloro - 1 – naftol se adiciona para colorear los gránulos peroxidasa positivos

3. los neutrófilos se tiñen en varios tonos de gris4. los eosinófilos se tiñen de negro5. los neutrófilos con alta actividad peroxidasa son

contados como juveniles6. la esterasa monocítica reacciona con el alfa naftil

butirato, el alfa naftol se libera y se combina con la fucsina básica diazotizada en la mezcla para formar precipitado rojo intracelular

7. la heparina de los gránulos del basófilo reacciona con el azul alciano, una tinción usada para demostrar mucopoliscaridos

8. Los linfocitos permanecen sin ser coloreados

+ 3%

0%

-3%

HCM

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 +3%

0%

- 3%

+ 3%

0%

-3%

VCM

CCMH

Gráfica de Control de los Indices Eritrocitarios

+ 3%

0%

-3%

+3%

0%

- 3%

+ 3%

0%

-3%

Desplazamiento del VCM yHCM en la misma dirección, signo deobturación parcial del orificio de recuento

VCM

HCM

CCMH

+ 3%

0%

-3%

+3%

0%

- 3%

+ 3%

0%

-3%

VCM

HCM

CCMH

Desviación de la HCM y CCMH en el mismo sentido decreciente,causada por desajustes en la calibración de la Hb o recuento de hematíes

+ 3%

0%

-3%

+3%

0%

- 3%

+ 3%

0%

-3%

VCM

HCM

CCMH

Patrón con un pico de desviación positiva del VCM y HCM, causada por la incorporación de muestras de enfermos con marcada macrocitosis.

10 -

8 -

6 -

4 -

2 -

0 -

-2 -

-4 -

-6 -

-8 -

-10 -

- 12 -

0 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 12.0 24.0 48.0

Effect of specimen storage at room temperature ( 18º - 20ºC ) 0n the completeblood count parameters of the Abbott CD 3500 blood analyzer.

WBC

RBC

HB

MCV

PLT

HCT

Ch

ange

( %

)

Time ( h )

Efecto del almacenamiento a temperatura ambiente ( 18 -20 ºC ) sobre el conteodiferencial de leucocítos, resultados del autoanalizador hematológico Abbott CD 3500

Ch

ange

( %

)

Time ( h )

10

0

-10

-20

-30

-40

-50

-60

20

0 0.5 1 2 4 8 12 24 48

v

Eosinófilos

Monocitos

Basófilos

Neutrófilos

Linfocitos

ADVIA 60 Algunas de sus Características

•18 Parámetros: WBC, RBC, PLT, Hgb, Hct, MCV, MCHC, Pct, MPV, PDW, RDW, Linfocitos, Monocitos, Granulocítos, (% y conteo absoluto).

•Histogramas de WBC, RBC & PLT.Muestreo: 10 ul sangre total en tubo cerrado con limpieza automática del capilar de muestreo.

•Capacidad: 55 muestras/hora con identificación por teclado alfanumérico y reporte de alarmas por fallas en el conteo o por resultados patológicos.

•Tarjetas de Memoria "Smart Cards", para resultados, calibración y control de calidad. Interfase: salida RS 232

Sismex SF - 3000

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