Al T9: nl i d DNA Aula 9: Tecnologia do DNA Recombinante · A descoberta de enzimas de restrição...

A l 9: T n l i d DNA Aula 9: Tecnologia do DNA RecombinanteRecombinante

O que é DNA recombinante?

Recombinação é um processo natural

de troca de informação genética entre

moléculas de DNA com algum grau de

homologia , que resulta em aumento da

variabilidade

Por outro lado, a tecnologia do DNAg

recombinante permite manipular

seqüência de DNA de um organismo e

introduzi-las em outro organismos,

mantendo a funcionalidade da

sequuência

A descoberta de enzimas de restrição possibilitou o desenvolvimento das tecnologias de DNA A descoberta de enzimas de restrição possibilitou o desenvolvimento das tecnologias de DNA

recombinante, pois elas permitem a fragmentação do DNA de uma maneira específica

Enzimas de restrição:

•Uma vez construído o seu vetor (plasmídeos) contendo o DNA recombinante, os vetores são amplificados em mantidos em bactérias

•Mas como você sabe quais colônias contêm bactérias que incorporaram o plasmideo corretamente? E como você sabe se o plasmideo incorporou o pedaço de DNA

b recombinante corretamente?

•Bactérias transformadas com plasmídeos contendo DNA recombinante podem então funcionar como “fabricas” de proteínas recombinantes, se o DNA inserido é um gene que

d f í ífcodifica para uma proteína em específico

Enzimas de restrição podem também ser usadas para criar mapas de restrição de amostras distintas

de DNA - Técnica de RFLP (Restriction fragment lenght polymorphism)( g g p y p )

Pedigrees de RFLPs:Uso forênsico de RFLPs:

Construção de bibliotecas de genes:

•Uma “biblioteca gênica” consiste em um conjunto de clones individuais, cada um contendo um único fragmento de DNA obtido de uma dada amostra (espécie, tecido, etc)

•Essas bibliotecas são utilizadas para a identificação de genes ou fragmentos de DNA específicos, através de screenings pelas características desejadas

•Existem, basicamente, dois tipos de bibliotecas gênicas: a biblioteca genômica, e a biblioteca de cDNA

ô ê•A biblioteca genômica contêm todo o DNA de uma determinada amostra, enquanto a biblioteca de cDNA contem apenas os genes que codificam produtos protéicos

Construção de uma biblioteca genômica:

Construção de uma biblioteca de cDNA:

1° passo: síntese do cDNA 1° passo: construção da biblioteca

Seqüenciamento DNA:Fred Sanger

Quimica, 1958Q i i 1980Quimica, 1980

Nucleotídeos di-deoxy

Atualmente, o método foi modificado para incluir nucleotídeos fluorescentes e a leitura é automatizada

As técnicas de hibridização em membranas :

Southern blot Identificação de DNA

Northern blot Identificação de RNA

Western blot Identificação de proteinas

Construção de organismos transgênicos: