Upload
fathmasari
View
498
Download
7
Embed Size (px)
Citation preview
SOUTHERN BLOTTING DAN NORTHERN BLOTTING
Oleh : Kelompok VI
Almaun (F1C1 13 044) Andi Amalia Hamka (F1C1 13 084) Debby Zulfitri Cahyuni (F1C1 13 012) Fathmasari Fitrianingsih (F1C1 13 058) Wasiara (F1C1 13 090)
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HALU OLEO
KENDARI
2016
Pendahuluan
Southern Blotting (DNA)
Northern Blotting (RNA)
Western Blotting (Protein)
Blot/Blotting
Teknik memindahkan atau mentransfer DNA, RNA, atau protein ke lembaran tipis atau matriks membran. Teknik ini berupa lanjutan dari penggunaan elektroforesis gel.
Pengertian
Berdasarkan Tipenya, terdiri atas :
1 2 3
Southern Blotting (DNA)
Southern Blotting (DNA)
Pengertian dan Sejarah Komponen-
Komponen
Tahapan dan Mekanisme
Kerja
Pengertian dan Sejarah Southern Blotting (DNA)
Southern Blotting (DNA) Pengertian
Sejarah
Metode ini ditemukan oleh seorang ahli biologi dari Inggris yang bernama Edward M. Southern, yang mengembangkan prosedur ini pada tahun 1975 di Universitas Edinburgh
Sebuah metode yang sering digunakan dalam bidang Biologi Molekular untuk menguji keberadaan dari suatu sekuen DNA dalam suatu sampel DNA.
Edward M. Southern Southern Blotting (DNA)
Komponen-Komponen utama pada Southern Blotting (DNA)
Membran Nitroselulos
a
DNA probe
Membran Nitroselulosa digunakan sebagai tempat hasil jiplakan fragmen DNA dari gel agarosa
Merupakan sutau fragmen dna yang berfungsi sebagai pelacak target gen
Harus bersifat spesifik dan komplemen terhadap DNA target
Struktur Nitroselulosa
DNA Probe
Lanjutan…
Larutan Buffer
DNA
Larutan buffer berfungsi untuk membawa DNA dari gel dan mengimobilisasi DNA pada membran (Larutan akan bergerak dari konsentrasi tinggi ke konsentrasi rendah)
Merupakan materi atau molekul yang akan diidentifikasi pada tekhnik Southern Blotting
Berfungsi untuk memotong DNA menjadi suatu fragmen tertentuEnzim
Retriksi
Tahapan Southern Blotting
Tahap- tahap Southern Blotting (DNA)
Isolasi DNA dan Pemotongan DNA
Fragmentasi DNA dengan Elektroforesis
Hibridisasi DNA
1 2Transfer DNA ke Membran (Blot)
4
Deteksi DNA
3
5
Tahap untuk memperoleh DNA yang akan dideteksi. Pemotongan DNA yang ingin diperoleh dilakukan dengan menggunakan enzim retriksi (endonuklease retriksi) yang bersifat spesifik terhadap DNA
EcoR I EcoR I EcoR I EcoR I
Isolasi DNA dan Pemotongan DNA
1
Merupakan tahap dimana Fragmen-fragmen dari DNA akan terpisah berdasarkan ukuran berat molekulnya.
Berdasarkan prinsip elektroforesis, Fragmen DNA yang ukuran berat molekulnya lebih kecil akan lebih cepat bergerak dari kutub negatif kekutub positif dibandingkan dengan fragmen DNA dengan berat molekul lebih besar.
Fragmentasi DNA dengan Elektroforesis gel
2
Denaturasi DNAProses denaturasi DNA dilakukan dengan
merendam gel dalam larutan denaturan (NaOH )
NaOH bersifat basa sehingga dapat menyebabkan rusaknya ikatan hidrogen antar untai DNA
Ikatan hidrogen antar untai DNA yang putus menyebabkan struktur DNA yang semula double heliks menjadi DNA single strand
A C AT T G
T G A A TC
DNA yang telah diperoleh kemudian ditransfer ke membran nitroseluloasa, tahap inilah yang disebut dengan blotting.
Transfer DNA ke Membran nitroselulosa
4
Tahap ini dapat dilakukan dengan 2 pilihan metode, yaitu:
Berdasarkan prinsip Kapilaritas Berdasarkan prinsip elektroforesis
Gel agarosa dijiplak pada membran nitroselulosa
Fragmen DNA yang telah terjiplak pada membran nitroselulosa kemudian dipanaskan pada suhu 60oC kemudian membran diberi radiasi UV agar terbentuk ikatan kovalen dan permanen antara pita-pita DNA dengan membran
Merupakan salah satu metode tahapan transfer DNA ke membran nitroselulosa yang berdasarkan pada prinsip Kapilaritas
Kapilaritas adalah peristiwa naiknya zat cair pada pembuluh, celah atau pori-pori kecil
Hibridisasi DNA adalah proses pembentukan molekul double helix dari single strand DNA probe dan single strand DNA target
Tahap ini terjadi ketika membran nitroselulosa direndam dalam larutan yang berisi probe DNA Ss* (diberi radioisotop)
Hibridisasi DNA6
Fragmen Single Strand DNA
Probe yang cocok untuk Single strand DNA Label isotop
atau fluoroscense
Merupakan tahap lanjutan dari proses hibridisasi DNA yang menggunakan pelacak/probe
Probe biasanya merupakan DNA yang dimurnikan dan bisa ditandai dengan aktifitas spesifik radionukletida.
Pada tahap deteksi DNA digunakan Autoradiogram untuk melihat lokasi sinyal DNA
Deteksi DNA7
Northern Blotting (RNA)
Northern Blotting (RNA)
Pengertian dan Sejarah
Komponen-Komponen
Tahapan dan Mekanisme Kerja
Pengertian dan Sejarah Northern Blotting (RNA)
Northern Blotting (RNA)
Pengertian
Sejarah
Northern Blot atau RNA Blot dikenalkan pertama kali oleh Alwin pada tahun 1977
Secara umum teknik ini mirip dengan Southern Blot, akan tetapi sampel yang digunakan, yaitu RNA.
Prinsip northern blot adalah memisahkan RNA berdasarkan ukuran dan terdeteksi pada membran menggunakan probe hibridisasi dengan urutan basa komplementer untuk semua, atau sebagian, dari urutan mRNA target
Komponen-Komponen utama pada Northern Blotting (RNA)
Membran digunakan sebagai tempat hasil jiplakan fragmen RNA dari gel agarosa formaldehid
Membran yang digunakan pada Northern blooting adalah nilon
Probe atau RNA probe adalah fragmen yang digunakan untuk hibridisasi asam nukleat
Probe dilengkapi semua, atau sebagian, urutan basa komplementer dari urutan mRNA target.
Formaldehid
Membran
Probe
Nilon
Tahap- tahap Northern Blotting (RNA)
Isolasi RNA Elektroforesis
Prehibridisasi dan hibridisasi dengan probe
Pencucian
1 2
5
Transfer ke membran dan imobilisasi
3
Deteksi 6
4
Isolasi RNA1
Isolasi RNA dapat dilakukan dengan beberapa tahap berikut, yaitu :
Penghancuran dinding sel
Penghilangan protein dan DNA
Pemurnian RNALisis dilakukan menggunakan detergen
Pengotor akibat lisis sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi
Kemudian molekul nukleotida (DNA dan RNA) dipisahkan dari protein menggunakan fenol
Enzim DNAase digunakan untuk menghancurkan DNA sehingga RNA diisolasi secara utuh
Purifikasi RNA dapat dilakukan dengan mencampur larutan tersebut dengan PCl yang berfungsi memekatkan, memisahkan RNA dari larutan, dan mengendapkan.
Elektroforesis2
Gel dapat diwarnai dengan ethidium bromide (EtBr) dan dilihat di bawah sinar UV untuk mengamati kualitas dan kuantitas RNA sebelum blotting.
Merupakan tahap dimana RNA dielektroforesis menggunakan gel agarosa formaldehida
Formaldehida
Transfer ke membran dan imobilisasi
3 Tahap dimana RNA yang sebelumnya telah berhasil diisolasi kemudian ditransfer ke membran nilon
Membran nilon dengan muatan positif paling efektif untuk digunakan dalam northern blot karena asam nukleat bermuatan negatif sehingga memiliki afinitas tinggi.
Transfer buffer yang digunakan mengandung formamida karena menurunkan suhu dari interaksi probe-RNA yang dapat menyebabkan degradasi RNA.Setelah RNA ditransfer ke membran,
maka membran harus segera disiapkan untuk crosslink RNA dengan sinar UV Tujuan crosslink RNA adalah untuk membuat RNA terikat kuat di membran Nilon Formamida
Prehibridisasi dan hibridisasi dengan probe
4 Tujuan dilakukannya prehibridisasi sebelum hibridisasi adalah memblok bagian nonspecific untuk mencegah probe yang single strand dari mengikat sembarang bagian pada membran.
Hibridisasi asam nukleat mensyaratkan bahwa probe ini melengkapi semua atau sebagian, dari urutan mRNA target
Probe harus diberi label baik dengan isotop radioaktif (32P) atau dengan chemiluminescence di mana alkali fosfatase atau horseradish peroxidase (HRP) memecah chemiluminescent substrat menghasilkan emisi terdeteksi cahaya
Horseradish peroxidase (HRP) Alkali fosfatase
Pencucian5
Tujuan dari pencucian membran adalah untuk memastikan bahwa probe telah terikat secara khusus dan untuk mencegah sinyal balik yang timbul
Hal ini juga dilakukan untuk menghilangkan unhibridisasi probe, dengan larutan buffer misalnya dengan Sodium Citrate
Sodium Citrate
Deteksi6
Tahapan deteksi dalam Northern Blot dapat dilakukan dengan 2 cara yaitu :
Radioaktivitas Non-radioaktif
Probe ditandai dengan 32P (atau
33p)
Deteksi dilakukan dengan pewarnaan, misalnya dengan
teknik chemiluminescence
Jika probe radiolabeled selesai digunakan, blot disimpan dalam bungkus pastik agar tidak kering
kemudian membran di autoradiografi dengan X-ray
Perbedaan Tekhnik Southern dan Northern Blotting
Southern Blotting Northern Blotting
Deteksi molekul DNA (ds) mRNA (ss)
Membran Nitroselulosa Nilon
Elektroforesis gel Gel agarosa Gel agarosa formaldehid
Perawatan gel Pemurnian, denaturasi dan netralisasi
-
Metode blotting Transfer melalui kapiler Transfer melalui kapiler
Probes DNA (radioaktif dan nonradioaktif)
cDNA, cRNA (radioaktif dan nonradioaktif)
Sistem deteksi Autoradiography, ChemiluminescentColorimetric
AutoradiographyChemiluminescentColorimetric
DANKE SCHőN !!!