Enzýmová metóda na jednoduché a rýchle stanovenie glyfozátu v

životnom prostredí

Stredná odborná škola chemická, Vlčie hrdlo 50, 821 07 BratislavaČlenovia tímu: Denisa Lukáčová, Gyöngyi

Posztósová Vedúci tímu: Ing. Judita Dömötörová

Od poznania problému k jeho riešeniu

1•Vieme o probléme, ktorý treba riešiť! Pesticídy a geneticky modifikované organizmy, to je vážna téma.

2•Študujeme odbornú literatúru. Ešteže máme biochémiu Ako sa dá stanoviť glyfozát? Nie, s HPLC to robiť nebudeme, potrebujeme jednoduchú metódu!

3•Plánujeme postup. Zisťujeme aké prístroje, pomôcky a chemikálie potrebujeme. Objednávame chemikálie.

4•Realizujeme stanovenie glyfozátu vo vzorke pôdy, kukurice.

5Pripravujeme skúmavku s imobilizovaným enzýmom pre terénne použitie.

2

Glyfozát

Chemicky N-fosfonometyl glycín Herbicíd s veľmi nízkou toxicitou pre

cicavce a hmyz Používa sa na ničenie burín na

nepoľnohospodárskych plochách V poľnohospodárstve sa využíva na

ošetrovanie kultúr GMO plodín – kukurice a sóje

3

Objekt sledovania – glyfozát

Mechanizmus účinku: Zasahuje do syntézy aromatických aminokyselín − fenylananínu, tyrozínu a tryptofánu tak, že inhibuje enzým 5-enolpyruvylšikimát-3-fosfát syntázu (EPSPS), ktorý katalyzuje reakciu

4

Geneticky modifikované rastliny a súvis s projektom Jeho aplikácia súvisí

s pestovaním geneticky modifikovaných plodín – hlavne kukurice a sóje

Takto modifikované rastliny majú v genetickej výbave vnesený gén z Escherichia coli, ktorý zaručuje odolnosť voči účinkom glyfozátu

5

Hrdinovia budúcnosti pomáhajú poľnohospodárom a kontrolórom živ. prostredia

PROBLÉM: Farmári potrebujú odhadnúť množstvo zvyškov glyfozátu v pôde, alebo v ošetrených plodinách

Nevhodná technika môže mať za následok poškodenie nasledujúcich plodín zvyškovým glyfozátom

RIEŠENIE: Pripraviť pre farmárov a poľnohospodárov jednoduchý test na glyfozát – na terénne použitie

6

Stanovenie glyfozátu Používajú sa zložité prístrojové

techniky Využitie biochémie a biotechnológie

ponúka riešenie – cez cielené enzymatické reakcie

NÁŠ CIEĽ: vývoj jednoduchého enzymatického testu na stanovenie glyfozátu v pôde a plodinách

ČO OČAKÁVAME: zrýchlenie hodnotenia zložiek životného prostredia, zníženie zvyškov glyfozátu v pôde a plodinách

7

Postup práce – hlavné časti

1. Izolácia enzýmu EPSP

syntázy z rastlinného materiálu

2. Imobilizácia

enzýmu (nanesenie na steny

polystyrénovej skúmavky)

3. Extrakcia glyfozátu zo

vzorky (fosfátovým

pufrom)

4. Realizácia enzymatické

ho testu glyfozátu

8

Postup práceVypestovanie rastlinného materiálu. Extrakcia kyseliny šikimovej z rastlinného materiálu

Spektrofotometrické stanovenie kyseliny šikimovej v supernatante

9Rastlinný materiál + tekutý dusík + HCl, centrifugácia, oddelenie supernatantu

Určenie koncentrácie, v akej je kys. šikimová prítomná v rastlinách.

Modifikovaná metóda Gaitonde a Gordona – vzorka, HIO4, NaOH a glycín. Meria sa absorbancia pri 380 nm.

Postup práce – enzymatický test glyfozátu v skúmavke

EPSP syntáza imobilizovaný na stenách skúmavky

Pridáme kyselinu šikimovú a fosfoenolpyruvát

Výsledok

•Pozitívny výsledok: •Ak glyfozát nie je prítomný, kyselina šikimová sa spotrebuje pri reakcii s fosfoenolpyruvátom

•Negatívny výsledok: •Ak je glyfozát prítomný, inhibuje enzým EPSP syntázu, ktorý katalyzuje reakciu kyseliny šikimovej s fosfoenolpyruvátom.

•Kyselina šikimová poskytuje s chromogénom farebný produkt (modrý).

• Intenzita zafarbenia sa vyhodnotí pomocou farebnej stupnice.

10

Postup práce

11

1. Chemikálie a pomôcky

2. Izolovaný enzým

Premývací tlmivý roztok (fosfátový tlmivý roztok a tenzid TWEEN

Viazanie enzýmu na steny polystyrénových skúmaviek

Fosfoenolpyruvát reaguje so šikimátom za vzniku enzýmu EPSPS: Fosfoenolpyruvát + 3-fosfošikimát → Fosfát + 5-enolpyruvylšikimát-

3-fosfát

Dôkaz prítomnosti glyfozátu

4. Kys. šikimová s enzýmami 6. STOP roztok

5. TMB (chromogén)

3. Extrakt glyfozátu

Extrakt z pôdy (vzorka pôdy obohatená glyfozátom,

testovanie vhodnosti techniky)

Glyfozát Kyselina šikimová

Fosfoenolpyruvát

Tetrametylbenzidín Enzýmy NADH

Chrenová peroxidáza

Kyselina jodistá Kyselina

chlorovodíková Hydroxid sodný

Polystyrénová skúmavka

Spektrofotometer

Analytické váhy

13

Chemikálie a pomôcky Automatická

pipeta

Na čo sme sa pri realizácii projektu sústredili

Trvalo udržateľný rozvoj

Realizácia a uskutočniteľnosť

Vedecký základ

Hmatateľný produkt

Vplyv projektu na okolie

• Riešenie problému na lokálnej úrovni, v poľnohospodárskych oblastiach (Žitný ostrov), ale aj nepoľnohospodárskych, keďže glyfozát sa používa na ošetrovanie plôch na chodníkoch, krajniciach, železniciach.

• Metóda na stanovenie glyfozátu bola úspešne otestovaná na vzorkách kukurice.

• Projekt začal štúdiom odbornej literatúry. • Článok od autora sme žiadali emailom (nemali sme vzdialený prístup k článku).

• Stanovenie je založené na enzymatickej reakcii.

• Skúmavka s imobilizovaným enzýmom, ktorý je pripravený na terénne použitie

• Realizácia analytickej metódy prispeje k šetrnej aplikácii pesticídu, zníženiu zvyškov glyfozátu v pôde a v ošetrených plodinách a teda aj k menšiemu obsahu v potravinovom reťazci.

14

V čom bol pre nás projekt užitočný

Zručnosti pri

vyhľadávaní

informácií

Práca v tíme

Vedomosti Hľadať riešenia

uplatniteľné v praxi

15

Skúmanie problému – literatúra

I. Zelaya, J. A. H. Anderson, M. D. K. Owen, R. D. Landes: Evaluation of spectrophotometric and HPLC methods for shikimic acid determination in plants: Models in Glyphosate-resistant and sisceptible crops, in: Journal of agricultural and food chemistry, 2011

 B. K. Singh, D. L. Shaner: Rapid determination of glyphosate injury to plants and identification of glyphosate-resistant plants, in: Weed technology, 1998

 G. Forlani, P. Kafarski, B. Lejczak, P. Wieczorek: Mode of action herbicidal derivates of aminomethylenebisphosphonic acid, in: Journal of plant growth regulation, 1997

16

Poďakovanie

Ďakujeme spolužiačkam zo štvrtého ročníka, Veronike Labudovej a Kataríne Adamkovičovej, ktoré s nami spolupracovali, ale vzhľadom na to, že už majú 19 rokov sa súťaže nemohli oficiálne zúčastniť.

17

Ďakujeme za pozornosť!

18