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Universidad de Oriente
Núcleo de Sucre
Escuela de Ciencias
Departamento de Biología
Cátedra: Bioquímica General
PROPIEDADES IONICAS DE LOS AMINOACIDOS.
EXTRACCIÓN, CUANTIFICACIÓN Y AISLAMIENTO DE PROTEINAS,
GLUCÓGENO, ADN Y ARN EN DIVERSOS TEJIDOS DE POLLO Gallus gallus.
Bachilleres:
Bermúdez, Mariana C.I: 19.979.803
Cedeño, Roberkis C.I: 19.707.784
Cova, Jennifer C.I: 19.893.583
Espinoza, Rainer C.I: 19.537.148
Vicent, Luis C.I: 18.416.955
Reyes, Carmen C.I: 18.417.004
Salazar, Vanessa C.I: 16.997.605
Rengel, Emily C.I: 18.903.138
Veneris, Vicmaris C.I:12.741.757
Sec: 02
Prof. Rosa Martínez.
Cumaná, Marzo 2012
INTRODUCCIÓN
Todos los seres vivos estamos formados por 20 elementos de la tabla periódica, los cuales
son considerados bioelementos, estos en conjunto forman moléculas entre las que
encontramos el agua, lípidos, proteínas, y los ácidos nucleícos, los cuales van a formar las
biomoléculas que no son más que las moléculas que forman parte de los seres vivos. A
primera vista podría pensarse en las proteínas, estos son polímeros lineales de aminoácidos
unidos entre sí por medio de enlaces peptídicos. Sin embargo, la secuencia lineal de
aminoácidos puede adoptar múltiples conformaciones en el espacio. La estructura primaria
viene determinada por la secuencia de aminoácidos en la cadena proteica, es decir, el
número de aminoácidos presentes y el orden en que están enlazados. La conformación
espacial de una proteína se analiza en términos de estructura secundaria y estructura
terciaria. La estructura secundaria es el plegamiento que la estructura primaria adopta
gracias a la formación de puentes de hidrógeno entre los átomos que forman el enlace
peptidicos. La estructura terciaria, en cambio, se refiere a la disposición tridimensional de
todos los átomos que componen la proteína. (Enciclopedia de la vida, 2002)
Estas se encuentran en diversos organismos que son consumidos por el hombre,
entre estos destacan las aves. Según Clements,(2007), Gallus es un género de aves
galliformes de la familia Phasianidae que incluye la especie doméstica Gallus gallus o gallo
rojo. Son aves de mediano tamaño con la coloración del plumaje del macho iridiscente. Es
difícil verlas en la vegetación densa donde ellos habitan debido a su coloración críptica que
las confunde con el entorno. Son comedores de semillas, insectos, particularmente los
jóvenes. En nuestro continente este tipo aves es criado en corrales y fincas, que luego las
llevan a lugares especializados en su comercialización. Esta ave es fuente de múltiples
proteínas, carbohidratos y un sin fin e nutrientes esenciales para el organismo humano.
Dentro del este conseguimos por ejemplo de diversas cantidades de glucógeno, ADN y
ARN, que son de muchas maneras en el análisis bioquímico de estas estructuras.
La base del análisis químico es la bioquímica, esta se puede definir como el estudio
de las bases moleculares de la vida, que nos va a permitir estudiar las estructuras químicas
de los componentes de la vida, mediante procedimientos experimentales que nos ayudan a
obtener resultados basados en las teorías que rigen esta ciencia.
Las proteínas son bioquimoleculas orgánicas más abundantes en la células, que
contienen una o varias cadenas polipeptidicas, cada una de las cuales posee más de cien
aminoácidos alfa, estas pueden ser simples, conjugadas, globulares y fibrosas las cuales
cada una desempeñan un papel estructural e independiente en el organismo, (Briceño,
1999). Estas biomoleculas son extremadamente complejas, con el fin de mantener la
multiplicidad de sus funciones, cada una tiene una estructura funcional, lógica y propia, así
como determinada características comunes con todas las demás proteínas, las estructuras
que pueden parecer exclusivamente complejas se comprenden fácilmente cuando se
entiende el modo en el que están dictadas, su forma por sus funciones. Para la
determinación de proteínas existen métodos de cuantificación y extracción, que nos van
permitir saber en qué concentraciones se encuentra en distintos organismos, los más usuales
son: Biuret basado en la formación de complejos Cu++
-péptidos, utilizado frecuentemente
en el análisis químico, está hecho de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico (CuSO4),
junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC4O6•4H2O). El reactivo, de color azul, cambia
a violeta en presencia de proteínas, y vira a rosa cuando se combina con polipéptidos de
cadena corta. La intensidad de la coloración es directamente proporcional a la cantidad de
proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante específica, de manera que pocas
sustancias interfieren. (Mathews, y Van Holde, 2004).
Por otra parte se debe destacar otro tipo de polisacárido útil en el análisis
bioquímico como lo es el glucógeno. Este es la forma de almacenamiento de la glucosa en
los tejidos animales. Se encuentra principalmente en el hígado y en el músculo
representando hasta un 10% y un 1-2% de su peso húmedo, respectivamente. Las
propiedades físicas y químicas de muchos polisacáridos neutros difieren lo bastante de las
de otras biomoléculas, para permitir su fácil aislamiento. El glucógeno se puede liberar del
hígado por calentamiento con una base fuerte, hasta la destrucción total del tejido. Al añadir
ácido tricloroacético al homogeneizado anterior, precipitan numerosas sustancias de peso
molecular elevado, como las proteínas y los ácidos nucleícos, en tanto que el glucógeno
continúa disuelto. El glucógeno puede separarse de los monosacáridos y otros compuestos
hidrosolubles por precipitación con alcohol, porque los polisacáridos son mucho menos
solubles en alcohol acuoso que los monosacáridos. La determinación del grado de pureza
de la preparación obtenida se puede realizar mediante el tratamiento con antrona y
comparando con una solución estándar de glucógeno. (Dapena, Padilla, Martínez, Bárcena
y García, (s/f)).
Por consiguiente Mathews y Van Holde, 2004, establece que el glucógeno
constituye la principal fuente de energía para la contracción del musculo esquelético. Dado
que el hígado obtiene la mayor parte de su energía metabólica de la oxidación de los ácidos
grasos y el glucógeno hepático, el cual tiene una función muy distinta como fuente de
glucosa sanguínea que se transporta a otros tejidos para su catabolismo. Este actúa
fundamentalmente como regulador de las contracciones sanguíneas de glucosa, en parte
mediante el control de su glucógeno sintetasa y fosforilasa. En el hígado la conversión de
glucosa almacenada en forma de glucógeno a glucosa libre en sangre, está regulada por la
hormona glucagón y adrenalina. En las células este se almacena dentro de vacuolas en el
citoplasma de las células que lo utilizan para la glucólisis. Estas vacuolas contienen las
enzimas necesarias para la hidrólisis de glucógeno a glucosa.
Por otra parte los ácidos nucleídos, son moléculas formadas por la unión de
nucleótidos, unidos por fuentes fosfodieste entre el grupo 3 hidroxilos y el 5 hidroxilo del
siguiente de los cuales los principales son ADN y el ARN. Desatancado el ADN (acido
desoxirribonucleicos) contiene solamente desoxirribonucleotidos y desempeñan el papel de
almacenar la información genética, la mayor parte de ellos poseen pesos moleculares
extremadamente elevados. El ARN (acido ribonucleico), contiene tres tipos principales de
ARN, uno que contiene la secuencia complementaria de los genes en el ADN, y
consecuentemente la información para la síntesis de proteínas, considerado ARN
mensajero, otro transporta los aminoácidos de forma activa para la formación de los enlaces
peptidicos en los ribosomas durante la síntesis de proteínas, llamado ARN de transferencia,
y el ARN ribosómico que es el principal componente de los ribosomas y es el más
abundante entre los tres tipos. (Mathews y Van Holde, 2004).
El metabolismo energético en las aves, está relacionado con la reserva de energía
para poder realizar posteriormente diversas funciones dentro del ecosistema, al igual que
esta energía puede ser obtenida de diversas formas, dependiendo del tipo de animal.
De igual forma se tiene entendido que los organismos toman del alimento ingerido
la energía necesaria para la reproducción y la almacenan en órganos y/o tejidos de reserva
(glándula digestiva, músculo aductor y manto). Una vez que el organismo canaliza estas
reservas, principalmente en forma de carbohidratos, lípidos y proteínas, puede suceder lo
siguiente: 1) utilización inmediata, 2) almacenamiento en órganos especializados y/o 3)
utilización y almacenamiento, según las necesidades. En líneas generales, la movilización
de reservas entre los tejidos somáticos, varía durante el crecimiento y de acuerdo a los
requerimientos reproductivos. Por lo tanto evaluar los cambios en la composición
bioquímica en diferentes tejidos permite conocer como es la transferencia de energía que se
produce dentro del organismo en un momento determinado. (Gabbott, 1976; 1983).
Pero no solo proteínas, glucógeno, AND y ARN, se encuentra en nuestro
organismo, también se observa una serie de aminoácidos que son importantes para el buen
funcionamiento de nuestro organismo, entre estos destacan el HCL y el NaOH, los cuales
tiene propiedades iónicas, que varían dependiendo las reacciones de acido-base. En el caso
del HCL es uno de los principales componentes de los jugos gástricos los cuales son vitales
en el proceso de digestión, cumpliendo la función de digerir lo mas posibles los alimentos,
y el NaOH actúa como base, la cual es muy corrosiva, y le va a ser frente a los cambios de
ph del HCL, durante la evaluación de sus propiedades iónicas. (S. Mahan, K. Escott 1996)
OBJETIVOS
Determinar las propiedades iónicas de los aminoácidos.
Aplicar el método de valoración de Biuret.
Construir una recta de calibración con la solución de albumina de suero bovino
para cada uno de los métodos de colorímetro de biuret.
Aislar el glucógeno del tejido del hígado de Gallus gallus.
Cuantificar por el reactivo de Antrona los niveles de glucógeno en el tejido
(hígado de Gallus gallus).
Aislar ADN a partir del tejido del hígado de Gallus gallus.
Aislar ARN a partir del tejido del hígado de un Gallus gallus.
Determinar colorimétricamente la concentración de ADN y ARN a través de
la reacción de la difeniamina y orcinol.
MATERIALES
Determinación de la solubilidad de los diferentes aminoácidos
Aminoácidos:
Glicina, histidina y lisina (100 mmol/l)
Acido glutaminico (50 mmol/l)
HCl (100 mmol/l)
Naoh (100 mmol/l)
Etanol
Cloroformo
Buretas
pH-metro
Agitadores
Tubos de ensayo
Cuantificación de proteínas
Hígado de pollo (tejido)
Albumina de suero Bovino(10mg/ml)
Biuret
Agua destilada
Sol salina (ml)
Balanza analítica
Beaker 50ml
Homogenizador
Pipetas
Gradillas
Espectrofotómetro
Centrifuga
Tubos de ensayo
Extracción y cuantificación de glucógeno
Agua destilada
Sal salina(ml)
Balanza analítica
Beaker 50ml
Homogenizador
Pipetas
Gradillas
Espectrofotómetro
Centrifuga
Baño de María
NaOH
Tubos de ensayo
Glucosa
Reactivo de Antrona: 2g/1000ml de H2SO4
Aislamiento de ADN y ARN
ADN estándar (0,2 mg/ml).
ARN estándar (0,2 mg/ml).
Buffer salino (NaCL 0,15mol/l; Citrato de Sodio o,o15 mol/l, pH7).
Reactivo de difenilamina (1g de difenilamina/100 ml de Acido aceticoglacial, 2, 5
ml de acido sulfúrico concentrado).
Reactivo de orcinol: 0,1 gr de FeCl3.6h20 en 100 ml de HCl concentrado y 3,5 ml
de orcinol en alcohol al 6 % p/v.
Baño de Maria.
Sal salina (ml).
Tubos de ensayo y gradilla
Beaker 50ml
Homogenizador
Gradillas
Espectrofotómetro
METODOLOGÍA
Determinación de la solubilidad de los diferentes aminoácidos
1. Se tomo 50 ml de un aminoacido problema en un vaso precipitado y se le determino
su pH.
2. Se tituló de 0,5- 0,5 ml (1ml-1ml), añadiendo 0.5ml por vez y observando los
cambios de pH hasta aproximadamente 1.5.
3. Se construyo las curvas de titulacion en papel milimetrado colocando en el eje de
las Y cambio de pH en funcion de mEq de acido o base.
4. Se señalo en la grafica las zonas posibles de pK y comparamos con los valores
teoricos, para el calculo del el punto isiselectrico.
Cuantificación de proteínas
Para la determinación de proteínas se utilizo el método de Biuret
1. Se realizo una solución con la albumina de suero bovino (10mg/ml). Para esta se
peso 1g de tejido, se homogenizo en 9ml de solución salina, y luego se centrifugo a
una velocidad máxima por 5min, para tomar el sobrenadante que fue el suero que
utilizamos.
2. Se colocaron en una gradilla 8 tubos de ensayos limpios y secos.
3. Los tubos de ensayos fueron numerados del uno al seis con un rotulador
permanente así como también los muestras problemas
4. Seguidamente con las pipetas se adiciono cada uno de los volúmenes de la
disolución patrón de albumina de suero bovino al 10mg/ml (BSA) y de agua
destilada, posteriormente se agregaron los reactivos en el siguiente orden:
albumina, agua destilada, solución alcalina o biuret.
5. Cada uno de los tubos se agito suavemente y se dejaron reposar durante un periodo
máximo de 20 minutos, luego se procedió a medir en el espectrofotómetro en la
longitud de onda de 540 nm ajustando el cero de absorbancia con él con la solución
blanco exenta de proteínas (tubo 1).
6. A continuación se midieron las absorbancia de los tubos 2 a 6, luego se procedió a a
medir la concentración de la muestra problema (tubo 7).
Extracción y cuantificación de glucógeno
1. Se tomo una muestra del tejido del hígado de un organismo, esta fue pesada,
fragmentada y homogeneizada en una solución salina en proporción (1 g: 10ml de
agua), se procedió a tomar un 1 ml del homogeneizado y se paso rápidamente en un
tubo de ensayo con 2ml de KOH al 60%.
2. Se calentaron las muestran en un baño de agua hirviendo por un periodo de tiempo
de 20 minutos mientras se cumplía la digestión, la cual fue acelerada agitando el
matraz.
3. Luego fue añadido 1ml de sulfato de sodio y 4 ml de alcohol etílico al 95%,debido
a que el método presenta una alta tasa de interferencia se hizo necesario realizar un
una precipitación con acido tricloroacético (TCA).
4. Para acelerar la precipitación de glucógeno la muestra fue sometida a ebullición,
teniendo cuidado de no dejar botar la muestra.
5. Una vez terminada la ebullición de la muestra, esta fue sometida a centrifugación
durante 15 minutos a 7000rpm. Se descarto el sobrenadante y se eliminaron con
esto las proteínas que contaminan la muestra.
6. Se dejo enfriar las muestras y se procedió a realizar las lecturas de absorbancia en el
espectrofotómetro u una longitud de onda de 620nm.
Aislamiento de ADN
El proceso de aislamiento de ADN consta de los siguientes pasos.
1. Se picaron nuestras muy pequeñas de tejido de un órgano animal, 1,0g de tejido y
fueron homogeneizado en 10ml de buffer salino frio durante un tiempo de 1 minuto
aproximadamente, se centrifugo la suspensión a 5000rpm por 5 minutos.
2. Una vez terminado el ciclo de centrifugado se descarto el sobrenadante y el
sedimento fue re-suspendido en NaCL 2mol/L hasta obtener un volumen total de
2ml.
3. El precipitado fue descartado y el sobrenadante colocado en un tubo de ensayo con
2ml de agua destilada
4. Con la aparición del precipitado fibroso se retira el exceso de agua con un papel de
filtro.
5. Se disolvió la desoxirribonuproteina en 2ml de NaCl 2mol/l, luego se agregó un
volumen igual de mezcla de cloroformo: alcohol amílico y se homogenizo por
30seg.
6. Se centrifugó la emulsion a 5000g por 15 minutos, y se recogio la capa superior
acuosa. Esta se hizo por succion con mucho cuidado para no mezclar la prteina que
estaba presente en la interfase.
7. Se añadio el doble de 2ml de alcohol frio para precipitar las fibras de ADN.
8. Se dejó evaporar el eter remanente colocando el ADN en un vidrio de reloj por 10
minutos.
9. Se reservo para ser luego utilizado.
Aislamiento de ARN
1. Se suspendió 10g de tejido en 40ml de agua a 37o
C y se espero 15 minutos.
2. Se agrego 50ml de solución concentrada de fenol.
3. Se agito mecánicamente la suspensión durante 30 minutos a temperatura ambiente.
4. Luego se centrifugo en frio a 3000g durante 15 minutos.
5. Con una pipeta pasteur se removió cuidadosamente la capa superior acuosa y se
centrifugo a 10.000g por 5 minutos para separar la proteína desnaturalizada.
6. Se agregó acetato de potasio al sobrenadante hasta obtener una concentración final
de 20g/l y precipito el ARN añadiendo 2 vol de etanol y dejándolo enfriar en hielo
por una hora.
7. Se recogió el precipitado por centrifugacion a 2000g por 5 minutos.
8. Se lavo el ADN con una mezcla de etanol-agua (3:1), luego con etanol y finalmente
con eter. Se dejo secar y se peso.
RESULTADOS
Propiedades iónicas de los aminoácidos
TABLA Nº 01. Titulación de los aminoácidos en solución de NaOH diluida.
pH (NaOH)
1ml = 8,64 16ml= 9,64 31ml= 10,27 46ml= 11,11
2ml= 8,83 17ml= 9,70 32ml= 10,27 47ml= 11,26
3ml= 8,56 18ml= 9,73 33ml= 10,34 48ml= 11, 26
4ml= 8,72 19ml= 9,79 34ml= 10,39 49ml= 11,41
5ml= 8,82 20ml= 9,82 35ml= 10,42 50ml= 11,53
6ml= 8,96 21ml= 9,86 36ml= 10,49 51ml= 11,61
7ml= 9,04 22ml= 9,87 37ml= 10,51 52ml= 11,69
8ml= 9,14 23ml= 9,92 38ml= 10,58 53ml= 11,75
9ml= 9,23 24ml= 9,94 39ml= 10,57 54ml= 11,85
10ml= 9,30 25ml= 10,02 40ml= 10,72 55ml= 11,91
11ml= 9,35 26ml= 10,70 41ml= 10,78 56ml= 11,95
12ml= 9,43 27ml= 10,11 42ml= 10,83 57ml= 11,96
13ml= 9,46 28ml= 10,11 43ml= 10,88 58ml= 11,99
14ml= 9,52 29ml= 10,17 44ml= 10,88 59ml= 11,99
15ml= 9,58 30ml= 10,22 45ml= 11,06 60ml=12,07
TABLA Nº 02. Titulación de los aminoácidos en solución de HCl diluida.
pH (NaOH)
1ml= 3,42 6ml= 2,03 11ml= 1,78 16ml= 1,62
2ml= 2,80 7ml= 1,99 12ml= 1,74 17ml= 1,57
3ml= 2,24 8ml= 1,94 13ml= 1,72 18ml= 1,55
4ml= 2,24 9ml= 1,88 14ml= 1,68 19ml= 1,52
5ml= 2,06 10ml= 1,84 15ml= 1,64 20ml= 1,50
Cuantificación de proteínas por el método de Biuret
TABLA Nº 01. Determinación de la solubilidad de los diferentes aminoácidos
Albúmina 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0,5 0,5
Agua 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 1,5 1,5
Biuret 3 3 3 3 3 3 3 3
TABLA Nº 02. Lectura del espectrofotómetro de las diferentes concentraciones de
aminoácidos
Concentraciones Transmitancia Absorbancia
Tubo 01
Muestra en blanco
- -
Tubo 02 65 0,1870
Tubo 03 53 0,2757
Tubo 04 31 0,5086
Tubo 05 27 0,5686
Tubo 06 25 0,6020
Tubo 07
Muestra problema
19 0,7212
Extracción y cuantificación de glucógeno.
TABLA Nº 05. Curva de calibración del glucógeno.
Tubos
Glucosa
10mg/100ml
Agua
destilada
(ml)
Antrona
(ml)
Transmitancia
Absorbancia
01 0 1.0 4.0 0 -
02 2 0.8 4.0 34 0,4685
03 4 0.6 4.0 9 1,0457
04 6 0.4 4.0 3 1,5228
05 08 0.2 4.0 1 2
06 10 0 4.0 0 -
07 - 0,5 4.0 0 -
Nota: los mg/ml fueron transformados por la relación 10mg --- 1ml
Extracción y cuantificación de ADN y ARN
Tabla N° 01. Resultados curva patrón del aislamiento de ADN en un tejido de hígado de
pollo.
Patrón
Tubos
1 2 3 4 5 6
Estándar 0,2
mg/ml
0 0,25 0,50 1 2 1
Buffer
2 1,75 1,50 1 0 0
Difenilamina 4 4 4 4 4 4
Transmitancia
(595nm)
0 54 14 1 __ 1
Absorbancia
0 1,73 1,15 0 __ 0
Tabla N° 02. Resultados curva patrón del aislamiento de ARN en un tejido de hígado de
pollo.
Patrón
Tubos
1 2 3 4 5 6
Estándar 0,2
mg/ml
0 0,25 0,50 1 2 2
Buffer
2 1,75 1,50 1 0 0
Orcinol
3 3 3 3 3 3
Transmitancia
(595nm)
0 57 34 8 1 12
Absorbancia
0 1,73 1,53 0,90 0 1,08
Grafica 1: curva patrón de las concentraciones obtenidas en la Cuantificación de
proteínas por el método de Biuret
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0 2 4 6 8 10 12
Valores Y
Valores Y
Linear (Valores Y)
Grafica 2: curva patrón de las concentraciones obtenidas en la extracción y
cuantificación de glucógeno.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 2 4 6 8 10 12
Valores Y
Valores Y
Linear (Valores Y)
Grafica 3: curva patrón de las concentraciones obtenidas en el aislamiento de ADN en
un tejido de hígado de pollo.
Grafica 4: curva patrón de las concentraciones obtenidas en el aislamiento de ARN en
el tejido de hígado de pollo.
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
0 5 10 15 20 25
Valores Y
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
0 5 10 15 20 25
Valores Y
CALCULOS Y TRANSFORMACIONES DE LA PENDIENTE:
y= mx + b m=
Proteínas y glucógeno
Transformaciones:
Tubo N° 1: 0 muestra patrón
Tubo N° 2
10mg 1ml X= 0,2mlx10mg/1ml= 2 mg
X 0,2ml
Tubo N° 3
10mg 1ml X= 0,4mlx10mg/1ml= 4 mg
X 0,4ml
Tubo N° 4
10mg 1ml X= 0,6mlx10mg/1ml= 6 mg
X 0,6ml
Tubo N° 5
10mg 1ml X= 0,8mlx10mg/1ml= 8 mg
X 0,8ml
Tubo N° 6
10mg 1ml X= 1mlx10mg/1ml= 10 mg
X 1 ml
Tubo N° 7 y 8
10mg 1ml X= 0,5mlx10mg/1ml= 5mg
X 0,5ml
ADN:
Datos:
X1= 2,5 mg y1= 1,73
X2= 5 mg y2= 1,15
Cálculos:
y= mx + b m=
m= = 0,232 y= 0,232 + 0 = 0,232
Transformaciones:
Tubo N° 1: 0 muestra patrón
Tubo N° 2
10mg 1ml X= 0,25mlx10mg/1ml= 2,5 mg
X 0,25ml
Tubo N° 3:
10mg 1ml X= 0,50mlx10mg/1ml= 5 mg
X 0,50ml
Tubo N° 4:
10mg 1ml X= 1mlx10mg/1ml= 10 mg
X 1ml
Tubo N° 5: No se realizó.
Tubo N° 6:
10mg 1ml X= 1mlx10mg/1ml= 10 mg
X 1ml
ARN:
Datos:
X1= 2,5 mg y1= 1,76
X2= 5 mg y2= 1,53
Cálculos:
y= mx + b m=
m= = 0,092 y= 0,092 + 0 = 0,092
Transformaciones:
Tubo N° 1: 0 muestra patrón
Tubo N° 2
10mg 1ml X= 0,25mlx10mg/1ml= 2,5 mg
X 0,25ml
Tubo N° 3:
10mg 1ml X= 0,50mlx10mg/1ml= 5 mg
X 0,50ml
Tubo N° 4:
10mg 1ml X= 1mlx10mg/1ml= 10 mg
X 1ml
Tubo N° 5:
10mg 1ml X= 2mlx10mg/1ml= 20 mg
X 2ml
Tubo N° 6:
10mg 1ml X= 2mlx10mg/1ml= 20 mg
X 2ml
DISCUSIÓN
Las propiedades iónicas de los aminoácidos radican de su comportamiento acido-básico,
en esa curva se puede observar que al agregar NaOH el pH cambia rápidamente al principio
y luego se estabiliza de tal manera que casi no varía al agregar más NaOH (zona plana).
Después de esta región de estabilización ocurre un cambio brusco de pH por adición de más
NaOH. La región "estable" es una sigmoidea, cuyo centro se encuentra a un pH
correspondiente al valor de pKa. Una molécula ionizable se caracterizará siempre por un
pKa y también por un rango de pH (pKa -1< pH < pKa + 1) en el cual toda variación de pH
será amortiguada. (Harris, 2004). En el caso de esta práctica no se obtuvieron los
resultados que esperábamos por diversos factores, entre estos la falta de aminoácidos, ya
que trabajamos con 15ml en vez de 50ml de HCL, además el pH-metro presento errores
desde un comienzo afectando directamente los resultados de esta experiencia. (Harris,
2004)
En la cuantificación de proteínas por el método de Biuret, el reactivo de color azul, cambia
a violeta en presencia de proteínas, cualitativamente se observo un cambio de azul a violeta
notablemente a simple vista principalmente en los tubos 4, 5 y 6 correspondiente a la
albumina lo que se corrobora en ya que a mayor absorbancia mayor concentración de
proteínas sin embargo tanto cualitativa como cuantitativamente la mayor absorbancia y por
ende mayor concentración lo presenta la muestra problema en el tubo 7 como se indica en
la tabla 2 de esta experiencia(tejido de hígado de pollo). Esta grafica nos muestra cómo va
en aumento la concentración de glucógeno a medida que se acerca a la muestra problema la
cual es el tubo 6 a pesar que la recta no corta dos puntos, si podemos notar cómo pasa muy
pero muy cerca de dos de ellos, donde está la mayor concentración de este, confirmando lo
dicho teóricamente por Dapena, Padilla, Martínez, Bárcena y García, (s/f), que el
glucógeno es la mayor fuente de energía en el organismo no solo en animales si no también
en los humanos.
Durante la experiencia de extracción y cuantificación de glucógeno, En los valores se tenía
que observar que cuando hay mayor absorbancia hay mayor concentración de carbohidrato,
esto se debe que cuando la muestra reacciona con la solución de antrona es directamente
proporcional a la concentración de carbohidratos presentes en la muestra, por lo tanto la
muestra se torna de un color que a medida que se oscurece se puede notar a simple a vista
que hay mayor concentración de carbohidrato, pero en este caso la muestra no fue leída por
el espectrofotómetro, ya que se torno demasiado oscura y no pasaban los rayos de luz a
través de dicha muestra. En la grafica podemos observar una curva de calibración casi
perfecta, donde en los puntos altos se encuentra la mayor cantidad de proteínas de la
muestra, y por lo menos uno de estos puntos es cortado por la pendiente, dando a entender
que en este tejido es alta la concentración de las mismas, teniendo en cuenta que el pollo,
en especial su hígado es uno de los alimentos ricos en proteína de nuestra dieta.
En la extracción y cuantificación de ARN, la absorbancia de la muestra problema que es la
del tubo 6 no es representativa con respecto a las demás soluciones, esto quiere decir que
no se encontraba una gran concentración de ARN en la muestra del tejido, además que en el
transcurso de la experiencia se presentaron muchos inconvenientes dentro del laboratorio,
como falta de materiales y entre uno y otro error que influyeron en los resultados obtenidos.
En esta grafica se observa claramente los errores de la experiencia, ya que en las muestras 5
y 6 se muestra una línea recta la cual no debería existir en esta curva patrón, la cual tendría
que ser ascendente en estos puntos y la recta no corta a ninguno de estos.
En cambio en la extracción y cuantificación de ADN, no se conto la la solución estándar
necesaria para poder terminar el ejercicio, por lo cual en el tubo número 5 no hubo lectura
de la Transmitancia y el la muestra problema se leyó con lo poco que quedaba, afectando
en el resultado final de nuestra experiencia. Esto también se refleja en la grafica donde la
muestra se vuelve constante después de los valores del tubo 4, y no se muestra como tal la
curva de calibración adecuada para la lectura del ADN, ya que esta debería ser ascendente
con respecto a las demás muestras en los puntos 5 y 6, y la recta debería cortar por lo
menos a dos puntos en esta grafica.
CONCLUSIÓN
En la determinación de las propiedades iónicas de los aminoácidos, no se
obtuvieron los resultados deseados debido a fallas con el pH-Metro y la falta de
aminoácidos dentro del laboratorio, ya que se trabajo con la mitad de la cantidad
necesaria para llevar a cabo con éxito la experiencia.
En la aplicación el método de valoración de Biuret, se obtuvo la coloracion
necesaria para la identificacion de proteinas pero no era la mas adecuada para la
lectura en el espectofotometro, debido a que resulto muy oscura a la hora de ser
leida por el espectofotometro.
En la elaboración de la recta de calibración con la solución de albumina de suero
bovino para cada uno de los métodos de colorímetro de biuret, se obtuvo a pesar de
los errores una muy buena recta de calibracion que nos permitio reflejar los datos
obtenidos en la practica.
Al aislar el glucógeno del tejido del hígado de Gallus gallus, se conto con los
materiales deseados, lo cual nos permitió obtener los resultados un poco más
próximos a la realidad, logrando confirmar el fundamento teórico de esta actividad.
En el momento de cuantificar por el reactivo de Antrona los niveles de glucógeno
en el tejido (hígado de Gallus gallus), se pudo notar las altas concentraciones de
este polisacárido, vital en el organismo de esta especie.
A la hora de aislar ADN y ARN a partir del tejido del hígado de Gallus gallus, no se
pudo obtener los resultados deseados debido a la falta de material en el laboratorio,
esta práctica se realizo solo como piloto para las demás secciones, ya que no se
contaba con los reactivos necesarios para su realización.
La determinación colorimétrica de las concentraciónes de ADN y ARN a través de
la reacción de la difeniamina y orcinol, no se observo adecuadamente por la falta de
reactivos a la hora de aislar estas estructuras del tejido.
BIBLIOGRAFÍA
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Murray, R; Mayes, P; Granner, D y Rodwell, V. (2001). Bioquímica de Harper. 15a
edición.
ANEXOS
Fig.1 Cuantificación de proteínas por el método de Biuret.
Fig.2 identificación de la proteína mediante Biuret.
Fig.3 Extracción y cuantificación de glucógeno.
Fig.4 Cambio de coloración al someterse al calor la muestra de glucógeno.
