UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA E MEDICINA LEGAL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA
KELLY ROVERAN GENGA
ESTUDO DA IMUNOEXPRESSÃO DE PROTEÍNAS RELACIONADAS AO PONTO DE
CHECAGEM MITÓTICO (CDC20 e MAD2) E AO FUSO MITÓTICO (AURORA A
E AURORA B) EM PACIENTES PORTADORES DE SÍNDROME MIELODISPLÁSICA
FORTALEZA
2014
KELLY ROVERAN GENGA
ESTUDO DA IMUNOEXPRESSÃO DE PROTEÍNAS RELACIONADAS AO PONTO DE
CHECAGEM MITÓTICO (CDC20 e MAD2) E AO FUSO MITÓTICO (AURORA A
E AURORA B) EM PACIENTES PORTADORES DE SÍNDROME MIELODISPLÁSICA
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Patologia da Universidade
Federal do Ceará, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Ronald Feitosa Pinheiro
Co-orientador: Profa. Dra. Fabíola Heredia
Fernandes
FORTALEZA
2014
KELLY ROVERAN GENGA
FICHA CATALOGRÁFICA
Genga, Kelly Roveran Estudo da imunoexpressão de proteínas relacionadas ao ponto de checagem mitótico (CDC20 e MAD2) e ao fuso mitótico (AURORA A e AURORA B) em pacientes portadores de síndrome mielodisplásica / Kelly Roveran Genga – Fortaleza, 2014.
146p. Tese (Mestrado) – Universidade Federal do Ceará. Programa de Pós-Graduação em Patologia.
Orientador: Prof. Dr. Ronald Feitosa Pinheiro
Descritores: 1. SÍNDROMES MIELODISPLÁSICAS. 2. EXPRESSÃO PROTEICA. 3. FUSO MITÓTICO.
KELLY ROVERAN GENGA
ESTUDO DA IMUNOEXPRESSÃO DE PROTEÍNAS RELACIONADAS AO PONTO DE
CHECAGEM MITÓTICO (CDC20 e MAD2) E AO FUSO MITÓTICO (AURORA A
E AURORA B) EM PACIENTES PORTADORES DE SÍNDROME MIELODISPLÁSICA
Dissertação apresentada ao Curso de
Pós-Graduação em Patologia da Universidade
Federal do Ceará, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em Ciências.
Aprovada em: ___/___/______.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________
Prof. Dr. Ronald Feitosa Pinheiro (Orientador)
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________
Prof. Dra. Sílvia M.M. Magalhães
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________
Prof. Dra. Romélia Pinheiro Gonçalves
Universidade Federal do Ceará (UFC)
_________________________________________
Dr. Alex Freire Sandes
Grupo Fleury - São Paulo
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Ronald Feitosa Pinheiro, pelo apoio essencial para a elaboração e conclusão
do presente trabalho e pela oportunidade e confiança depositadas em mim.
À Dra. Fabíola Fernandes Heredia, pela colaboração, disponibilidade e compromisso no
desenvolvimento deste trabalho. A prova disso é poder separar algum tempo para me ouvir e
ajudar, mesmo se encontrando num momento especial de sua vida, o nascimento do seu primeiro
filho.
Ao Prof. Dr. Francisco Dário Rocha Filho e ao Prof. Dr. Francisco Valdeci de Almeida
Ferreira, pela inestimável ajuda na leitura das amostras do estudo, e, ao mesmo tempo, pelos seus
ensinamentos. Além disso, gostaria de salientar o meu profundo agradecimento por terem
permitido a utilização das instalações do laboratório Labtech.
À Juliana Cordeiro, que em muito me auxiliou em todas as etapas do meu projeto, e, em
especial, durante a captura das imagens do meu projeto.
À Francimeire, Débora e Margaret, que, em muito me ajudaram, durante o processamento
das amostras do estudo.
Ao meu marido, Fernando Sergio, pelo seu apoio sempre incondicional e, ao mesmo
tempo, por me fazer sorrir mesmo nos instantes mais difíceis.
À CAPES e FUNCAP, pelo apoio financeiro.
RESUMO
Síndrome mielodisplásica (SMD) representa um grupo de doenças hematopoéticas heterogêneas,
que se caracterizam por alterações morfológicas de dispoese, medula óssea hiperproliferativa,
citopenias no sangue periférico e risco aumentado de evolução para leucemia mieloide aguda. A
patogênese da SMD envolve múltiplas etapas, com destaque para alterações citogenéticas, porém
ainda não está claramente definido como a doença progride. Nesse contexto, o estudo da
imunoexpressão de proteínas relacionadas ao ponto de checagem mitótico (CDC20 e MAD2) e ao
fuso mitótico (AURORA A e AURORA B) mostra-se promissor. Essas proteínas foram
associadas à instabilidade cromossômica, aneuploidia e progressão tumoral em tumores sólidos e
neoplasias hematológicas, contribuindo para o surgimento de anormalidades citogenéticas. Na
literatura, existem poucos artigos publicados avaliando o impacto da expressão dessas proteínas na
evolução de pacientes com SMD. O presente estudo, de caráter retrospectivo, teve como objetivo
avaliar a imunoexpressão de CDC20, MAD2, AURORA A e AURORA B em pacientes com
SMD e investigar sua relação com variáveis clínicas e laboratoriais. O estudo da expressão
proteica foi realizado por imunoistoquímica (microscopia óptica), em 40 biópsias de medula óssea
de pacientes portadores de SMD e 10 controles (biópsias de medula óssea para estadiamento de
linfoma sem infiltração pela doença). A expressão proteica foi interpretada de forma qualitativa
(expressão positiva versus negativa) e quantitativa (% de células positivas após análise de 10
campos em aumento de 400x, assim como pela categorização das amostras positivas em grupos de
expressão leve - < 10%, moderada – 10 a 49% e alta - ≥ 50%). Identificou-se, de forma
significativa, maior expressão das proteínas CDC20, MAD2 e AURORA B nos pacientes
portadores de SMD, quando comparados com os controles (p < 0,05). A análise qualitativa
mostrou os seguintes resultados (p < 0,05): 1) maior frequência de expressão negativa de MAD2
em pacientes com duas a três citopenias; 2) maior frequência de expressão negativa de CDC20 em
pacientes com plaquetopenias mais graves (<50.000/mm3); 3) maior frequência de expressão
positiva de AURORA B entre os pacientes que evoluíram para óbito; 4) menor sobrevida global
entre os pacientes com expressão positiva de AURORA B; 5) maior frequência de expressão
positiva de AURORA A entre os pacientes com dependência transfusional, citogenética
aneuploide, cariótipo complexo e/ou anormal. A análise quantitativa (média ± DP, em %) mostrou
os seguintes resultados (p < 0,05): 1) maior expressão de MAD2 e CDC20 em pacientes com
plaquetopenias mais graves (<50.000/mm3); 2) maior expressão de MAD2 e CDC20 entre os
pacientes que evoluíram para óbito; 3) maior expressão de CDC20 entre os pacientes com três
displasias e cariótipo complexo; 4) maior expressão de AURORA B nos pacientes com
citogenética alterada. A análise quantitativa por grupos revelou (p < 0,05): 1) maior frequência de
alta expressão de CDC20 e MAD2 em pacientes com contagens plaquetárias < 50.000/mm3 e
entre os pacientes que evoluíram para óbito durante o período do estudo; 2) menor sobrevida
global no grupo de pacientes com expressão ≥ 50% de MAD2 e CDC20 e ≥ 10% de AURORA B.
em comparação aos pacientes com expressão negativa e/ou expressão positiva < 50% e < 10%,
respectivamente. Tais dados sugerem que expressões alteradas dessas proteínas (hipo ou
hiperexpresssão) podem estar relacionadas ao processo de tumorigênese e à progressão da SMD,
contribuindo, desse modo, para melhor estratificação de risco e abordagem terapêutica.
Palavras-chave: Síndrome mielodisplásica. Expressão proteica. Fuso mitótico.
ABSTRACT
Myelodysplastic syndrome (MDS) represents a heterogeneous group of hematopoietic disorders,
which are characterized by dysplastic morphological changes, hyperproliferative bone marrow and
peripheral blood cytopenias, being associated with greater risk of progression to acute myeloid
leukemia. The pathogenesis of MDS involves multiple steps and it’s still not clearly defined how
the disease progresses. In this context, researches involving expression of proteins related to the
mitotic checkpoint (MAD2 and CDC20) and mitotic spindle (AURORA A e AURORA B) are
promising. These proteins were associated to chromosomal instability, aneuploidy and progression
in solid tumors and hematologic malignancies, contributing to the appearance of cytogenetics
abnormalities. In the literature, there are few published studies evaluating how these protein
expressions are associated to MDS progression. Thus, this retrospective study aimed to evaluate
the expression of those proteins in MDS patients, and to investigate its relation to clinical and
laboratory variables. Protein expression was analyzed by immunohistochemistry in bone marrow
tissue samples (optical microscopy) from 40 MDS patients and 10 controls (bone marrow samples
for lymphoma staging without disease infiltration). Immunohistochemistry was analyzed
qualitatively (positive versus negative expression) and quantitatively (by percentage of positive
cells in a total of ten fields in 400-fold magnification, and by categorization of positive samples in
mild - < 10%, moderate - 10 to 49% and high expression groups - ≥ 50%). This present study
showed that MDS patients had significantly greater expression of CDC20, MAD2 and AURORA
B proteins compared to control samples (p < 0.05). Qualitative analysis showed the following
results (p < 0.05): 1) greater frequency of negative MAD2 expression among patients who
presented with two or three cytopenias; 2) greater frequency of negative CDC20 expression
among patients who presented with more severe thrombocytopenia (platelets < 50x109/L);
3) greater frequency of positive AURORA B expression among patients who did not survive;
4) lower overall survival among patients with positive AURORA B expression; 5) greater
frequency of positive AURORA A expression among transfusional dependent patients, aneuploid
cytogenetics, complex and/or abnormal karyotype. Quantitative analysis (mean ± SD) showed the
following results (p < 0.05): 1) higher MAD2 and CDC20 expression among patients with more
severe thrombocytopenia (platelets < 50x109/L); 2) higher MAD2 expression among patients who
did not survive; 3) higher CDC20 expression among patients who presented with three dysplasias
as in those with complex karyotype; 4) higher AURORA B expression among patients with
abnormal karyotype. Quantitative analysis by groups showed (p < 0.05): 1) greater frequency of
high CDC20 and MAD2 expression among patients who presented with platelet count < 50x109/L
and who died during the study period; 2) lower overall survival among patients with MAD2 and
CDC20 expression ≥ 50% and AURORA B expression ≥ 10%, compared to patients with negative
or positive expression < 50% or 10%, respectively. These data suggest that altered expression
(hypo or overexpression) of these proteins may be related to MDS tumorigenesis and progression,
contributing to a better risk stratification and therapeutic approach.
Keywords: Myelodysplasic Syndrome. Protein expression. Mitotic spindle.
LISTA DE FIGURAS
Figura 01 Mecanismos envolvidos na patogênese da SMD..................................... 08
Figura 02 Cromossomo conectado ao fuso mitótico na região do cinetócoro......... 12
Figura 03 Esquema de mudança conformacional de MAD2................................... 14
Figura 04 Ciclo do centrossomo............................................................................... 17
Figura 05 Amplificação dos centrossomos decorrente de superexpressão de
AURORA A............................................................................................. 20
Figura 06 Dinâmica das proteínas envolvidas na biorientação dos
cromossomos........................................................................................... 22
Figura 07 Distribuição dos pacientes do grupo SMD de acordo com a
classificação da OMS............................................................................... 34
Figura 08 Distribuição dos pacientes do grupo SMD de acordo com o
IPSS......................................................................................................... 34
Figura 09 Distribuição dos pacientes do grupo SMD de acordo com o resultado
da citogenética......................................................................................... 35
Figura 10 Distribuição do resultado da citogenética dos pacientes do grupo SMD
de acordo com a classificação prognóstica do cariótipo pelo
IPSS......................................................................................................... 35
Figura 11 Gráfico em barras mostrando a porcentagem de casos de citopenias
(0/1 versus 2/3) no grupo SMD com expressão positiva ou negativa da
proteína MAD2........................................................................................ 39
Figura 12 Gráfico em barras mostrando a porcentagem de casos de citogenética
normal e alterada no grupo SMD com expressão positiva ou negativa
da proteína MAD2................................................................................... 40
Figura 13 Contagem plaquetária entre os pacientes do grupo SMD no momento
do diagnóstico conforme expressão positiva ou negativa da proteína
CDC20..................................................................................................... 43
Figura 14 Gráfico em barras mostrando a porcentagem de pacientes
com contagem plaquetária < 50.000/mm3 e ≥ 50.000/mm
3
no grupo SMD conforme expressão positiva ou negativa da
proteína CDC20....................................................................................... 44
Figura 15 Gráfico em barras mostrando a evolução dos pacientes (óbito ou em
tratamento) no grupo SMD conforme expressão positiva ou negativa
da proteína AURORA B.......................................................................... 47
Figura 16 Gráfico em barras mostrando a porcentagem de pacientes com
cariótipo complexo e não complexo no grupo SMD conforme
expressão positiva ou negativa da proteína AURORA A........................ 51
Figura 17 Gráfico em barras mostrando a porcentagem de pacientes com
cariótipo normal ou alterado no grupo SMD conforme expressão
positiva ou negativa da proteína AURORA A......................................... 51
Figura 18 Gráfico em barras mostrando a porcentagem de pacientes com
euploidia e aneuploidia no grupo SMD conforme expressão positiva
ou negativa da proteína AURORA A...................................................... 52
Figura 19 Gráfico em barras mostrando a porcentagem de pacientes com e sem
dependência transfusional no grupo SMD conforme expressão positiva
ou negativa da proteína AURORA A...................................................... 52
Figura 20 Imunoistoquímica mostrando diferentes graus de expressão da proteína
AURORA A em BMO de pacientes portadores de SMD (400x).
A) Expressão negativa; B) Expressão positiva........................................ 53
Figura 21 Gráfico em barras mostrando a porcentagem de casos de expressão
positiva e negativa da proteína MAD2 nos grupos SMD e
controle.................................................................................................... 54
Figura 22 Gráfico em barras mostrando a porcentagem de casos de expressão
positiva e negativa da proteína CDC20 nos grupos SMD e
controle.................................................................................................... 55
Figura 23 Gráfico em barras mostrando a porcentagem de casos de expressão
positiva e negativa da proteína AURORA B nos grupos SMD e
controle.................................................................................................... 55
Figura 24 Gráfico em barras mostrando a porcentagem de casos de expressão
positiva e negativa da proteína AURORA A nos grupos SMD e
controle.................................................................................................... 56
Figura 25 Expressão quantitativa da proteína MAD2 (em %) entre os pacientes
do grupo SMD com plaquetas < ou ≥ 50.000/mm3................................. 59
Figura 26 Expressão quantitativa da proteína MAD2 (em %) entre os pacientes
do grupo SMD que se encontram em tratamento ou que evoluíram para
óbito......................................................................................................... 59
Figura 27 Expressão quantitativa da proteína CDC20 (em %) entre os pacientes
do grupo SMD com plaquetas < ou ≥ 50.000/mm3................................. 62
Figura 28 Expressão quantitativa da proteína CDC20 (em %) nos pacientes do
grupo SMD conforme o número de displasias......................................... 62
Figura 29 Expressão quantitativa da proteína CDC20 (em %) nos pacientes do
grupo SMD conforme presença ou não de
cariótipo complexo.................................................................................. 63
Figura 30 Expressão quantitativa da proteína CDC20 (em %) nos pacientes do
grupo SMD com contagem de neutrófilos < ou ≥
800/mm3................................................................................................... 63
Figura 31 Expressão quantitativa da proteína CDC20 (em %) nos pacientes do
grupo SMD conforme presença de euploidia ou
aneuploidia............................................................................................... 64
Figura 32 Expressão quantitativa da proteína AURORA B (em %) nos pacientes
do grupo SMD conforme presença de citogenética normal ou
alterada..................................................................................................... 67
Figura 33 Distribuição dos pacientes com expressão positiva de acordo com o
grau de expressão para a proteína MAD2 (baixa, moderada
ou alta)..................................................................................................... 69
Figura 34 Distribuição dos pacientes com expressão positiva de acordo com o
grau de expressão para a proteína CDC20 (baixa, moderada
ou alta)..................................................................................................... 69
Figura 35 Distribuição dos pacientes com expressão positiva de acordo com o
grau de expressão para a proteína AURORA B (baixa ou
moderada)................................................................................................ 70
Figura 36 Porcentagem de casos com plaquetas < 50.000/mm3 ou ≥ 50.000/mm
3
no grupo SMD conforme o grau de expressão da proteína MAD2
(<10%, 10-49% e ≥ 50%)........................................................................ 73
Figura 37 Porcentagem de casos que evoluíram para óbito ou que se encontram
em tratamento no grupo SMD conforme o grau de expressão da
proteína MAD2........................................................................................ 73
Figura 38 Imunoistoquímica mostrando diferentes graus de expressão da proteína
MAD2 em BMO de pacientes portadores de SMD (400x).
A) Expressão negativa; B) Expressão fraca (< 10%); C) Expressão
moderada (10-49%); D) Expressão forte (> 50%).................................. 74
Figura 39 Idade no momento do diagnóstico nos pacientes do grupo SMD
conforme o grau de expressão da proteína CDC20................................. 76
Figura 40 Porcentagem de casos com plaquetas < 50.000/mm3 ou ≥ 50.000/mm
3
no grupo SMD conforme o grau de expressão da proteína CDC20
(<10%,10-49% e ≥ 50%)......................................................................... 79
Figura 41 Porcentagem de casos que evoluíram para óbito ou que se encontram
em tratamento conforme o grau de expressão da proteína CDC20
(<10%,10-49% e ≥ 50%)......................................................................... 80
Figura 42 Porcentagem de casos com idade ≤ 60 anos ou > 60 anos no grupo
SMD conforme o grau de expressão da proteína CDC20........................ 81
Figura 43 Porcentagem de casos com cariótipo complexo ou não complexo no
grupo SMD conforme o grau de expressão da proteína CDC20 (<10%,
10-49% e ≥ 50%)..................................................................................... 81
Figura 44 Imunoistoquímica mostrando diferentes graus de expressão da proteína
CDC20 em BMO de pacientes portadores de SMD (400x).
A) Expressão negativa; B) Expressão fraca (< 10%); C) Expressão
moderada (10-49%); D) Expressão forte (> 50%)................................... 82
Figura 45 Imunoistoquímica mostrando diferentes graus de expressão da proteína
AURORA B em BMO de pacientes portadores de SMD (400x).
A) Expressão negativa; B) Expressão fraca (< 10%); C) Expressão
moderada (10-49%)................................................................................. 86
Figura 46 Sobrevida global de acordo com a análise qualitativa das proteínas
MAD2, CDC20, AURORA B e AURORA A ........................................ 90
Figura 47 Sobrevida global de acordo com a análise quantitativa das proteínas
MAD2, CDC20 e AURORA B (entre os pacientes com expressão
positiva) .................................................................................................. 91
Figura 48 Sobrevida global de acordo com a análise quantitativa das proteínas
MAD2, CDC20 e AURORA B (entre todos os pacientes) ..................... 91
Figura 49 Possível associação entre hiperexpressão de AURORA A e surgimento
de aneuploidia em SMD.......................................................................... 98
Figura 50 Provável associação entre hiperexpressão de CDC20 e surgimento de
cariótipo complexo em SMD................................................................... 103
Figura 51 Provável associação entre expressão alterada de MAD2 e CDC20 e
desenvolvimento de plaquetopenias mais grave em SMD
(< 50.000/mm3)........................................................................................ 103
Figura 52 Provável associação entre hiperexpressão de AURORA B e
surgimento de alterações citogenéticas em SMD.................................... 104
Figura 53 Efeitos da expressão aumentada de proteínas associadas ao ponto de
checagem mitótico (MAD2 e CDC20) e ao fuso mitótico
(AURORA A e AURORA B), suas associações já demonstradas em
neoplasias sólidas e as prováveis implicações dessas expressões
aumentadas em portadores de SMD........................................................ 107
LISTA DE TABELAS
Tabela 01 Classificação SMD (OMS, 2008) .................................................... 04
Tabela 02 Critérios de inclusão e exclusão....................................................... 27
Tabela 03 Caracterização dos anticorpos utilizados.......................................... 27
Tabela 04 Celularidade da medula óssea de acordo com a idade..................... 29
Tabela 05 Expressão proteica por grupos conforme grau de expressão
(Baixa - < 10%, Moderada – 10-49% e Alta - ≥ 50%)..................... 68
LISTA DE QUADROS
Quadro 01a IPSS (1997).............................................................................................. 05
Quadro 01b IPSS – pontuação e evolução................................................................... 06
Quadro 02a IPSS revisado........................................................................................... 07
Quadro 02b IPSS-R - classificação de risco e pontuação............................................ 07
Quadro 03 Características clínico-epidemiológicas dos pacientes portadores de
SMD......................................................................................................... 32
Quadro 04 Caracterização das citopenias e da citogenética dos pacientes
portadores de SMD................................................................................... 33
Quadro 05 Frequência em % de expressão positiva e negativa de MAD2, CDC20,
AURORA B e AURORA A..................................................................... 36
Quadro 06 Idade, grau de citopenias e porcentagem de blastos, conforme
expressão positiva versus negativa da
proteína MAD2......................................................................................... 37
Quadro 07 Variáveis clínicas, laboratoriais e classificação IPSS
conforme expressão positiva versus negativa da
proteína MAD2......................................................................................... 38
Quadro 08 Idade, grau de citopenias e porcentagem de blastos,
conforme expressão positiva versus negativa da
proteína CDC20........................................................................................ 41
Quadro 09 Variáveis clínicas, laboratoriais e classificação IPSS
conforme expressão positiva versus negativa da
proteína CDC20........................................................................................ 42
Quadro 10 Idade, grau de citopenias e porcentagem de blastos,
conforme expressão positiva versus negativa da
proteína AURORA B............................................................................... 45
Quadro 11 Variáveis clínicas, laboratoriais e classificação IPSS
conforme expressão positiva versus negativa da
proteína AURORA B............................................................................... 46
Quadro 12 Idade, grau de citopenias e porcentagem de blastos,
conforme expressão positiva versus negativa da
proteína AURORA A............................................................................... 48
Quadro 13 Variáveis clínicas, laboratoriais e classificação IPSS
conforme expressão positiva versus negativa da proteína
AURORA A.............................................................................................
49
Quadro 14 Expressão quantitativa em % da proteína MAD2 conforme
características clínico-laboratoriais.......................................................... 58
Quadro 15 Expressão quantitativa em % da proteína CDC20 conforme
características clínico-laboratoriais.......................................................... 61
Quadro 16 Expressão quantitativa em % da proteína AURORA B conforme
características clínico-laboratoriais.......................................................... 66
Quadro 17 Expressão quantitativa da proteína MAD2 por grupos (< 10%, 10-49%
e ≥ 50%) conforme idade, grau de citopenias e porcentagem
de blastos.................................................................................................. 71
Quadro 18 Características demográficas, clínicas, laboratoriais e classificação
IPSS conforme grau de expressão da proteína MAD2 (<10%, 10-49%
ou ≥ 50%)................................................................................................. 72
Quadro 19 Expressão quantitativa da proteína CDC20 por grupos (< 10%, 10-49%
e ≥ 50%) conforme idade, grau de citopenias e porcentagem
de blastos.................................................................................................. 75
Quadro 20 Características demográficas, clínicas, laboratoriais e classificação
IPSS conforme grau de expressão da proteína CDC20 (<10%, 10-49%
e ≥ 50%)................................................................................................... 78
Quadro 21 Expressão quantitativa da proteína AURORA B por grupos
(< 10% e 10-49%) conforme idade, grau de citopenias e porcentagem
de blastos.................................................................................................. 83
Quadro 22 Características demográficas, clínicas, laboratoriais e classificação
IPSS conforme grau de expressão da proteína AURORA B
(<10% e 10-49%)..................................................................................... 85
Quadro 23 Análise do tempo de sobrevida dos pacientes portadores de SMD de
acordo com a expressão de MAD2 .......................................................... 87
Quadro 24 Análise do tempo de sobrevida dos pacientes portadores de SMD de
acordo com a expressão de CDC20 ......................................................... 88
Quadro 25 Análise do tempo de sobrevida dos pacientes portadores de SMD de
acordo com a expressão de AURORA B ................................................ 89
Quadro 26 Análise do tempo de sobrevida dos pacientes portadores de SMD de
acordo com a expressão de AURORA A ................................................ 90
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
ºC Graus Celsius
AIRK Aurora/Ipl1 Related Kinase
ALIP Abnormal Localization of Immature Precursors Cells
AR Anemia Refratária
AREB Anemia Refratária com Excesso de Blastos
AREB-T AREB em Transformação
ARSA Anemia Refratária com Sideroblastos Em Anel
AURKA Aurora Quinase A
AURKB Aurora Quinase B
BMO Biópsia de Medula Óssea
BRCA Breast Cancer 1
BUB Budding Uninhibited By Benzimidazoles
BUBR1 (BUB1B) BUB1 Beta
CCM Complexo de Checagem Mitótico
CD Cluster of Differentiation
CDC20 Cell Division Cycle20
CDK Cyclin-Dependent Kinase
CDKI Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor
C-MAD2 Closed-MAD2
CPA Complexo Promotor de Anáfase
CRDM Citopenia Refratária com Displasia Multilinhagem
CRDM-SA CRDM com Sideroblastos em Anel
CRDU Citopenia Refratária com Displasia Unilinhagem
CTH Células-Tronco Hematopoéticas
DAB Diaminobenzidine Tetrahydrochloride
Del Deleção
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido Desoxirribonucleico
Dl Decilitros
DNMT DNA Methyltransferase
EGR1 Early Growth Response1
FAB Franco-Americano-Britânico
H3 Histona 3
Hb Hemoglobina
HDAC Histone Deacetylases
HE Hematoxilina-Eosina
HP1 Heterochromatin Protein 1
HPN Hemoglobinúria Paroxística Noturna
HRP Horseradish Peroxidase
ICUS Idiopathic Cytopenia of Undetermined Significance
Ikb Nuclear Factor Kappa-B Inhibitor
INCENP Inner Centromere Protein
INT Intermediário
IPSS International Prognostic Score System
IPSS-R Revised International Prognostic Score System
LMA Leucemia Mieloide Aguda
LMMC Leucemia Mielomonocítica Crônica
MAD Mitotic Arrest Defective
MCAK Mitotic Centromere-Associated Kinesin
MDA-CSS MD Anderson Comprehensive Scoring System
MiR Micro-RNA
Mm Milímetros
MLL Myeloid/Lymphoid or Mixed-Lineage Leukemia
Mm Milimolar
MO Medula Óssea
NF-Κb Nuclear Factor Kappa-B
NR Neutropenia Refratária
O-MAD2 Open-MAD2
OMS Organização Mundial da Saúde
P53 Protein53
PBS Phosphate Buffered Saline
PCR Polymerase Chain Reaction
PP1 Phosphoprotein Phosphatase1
RPS14 40S Ribosomal Protein S14
SIDA Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
SMD Síndrome Mielodisplásica
SMD-U SMD Unclassified
SPARC Secreted Protein Acidic And Rich In Cysteine
TACC Transforming Acidic Coiled-Coil-Containing Protein
TP53 Tumor Protein53
TR Trombocitopenia Refratária
WPSS WHO based Prognostic Scoring System
ÍNDICE
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................ 01
1.1 Epidemiologia .................................................................................................... 02
1.2 Classificação e Estratificação de risco ............................................................... 02
1.3 Prognóstico ........................................................................................................ 05
1.4 Patogênese ......................................................................................................... 07
1.4.1 Alterações epigenéticas ..................................................................................... 09
1.4.2 Alterações cromossômicas ................................................................................. 10
1.4.3 Microambiente medular ..................................................................................... 11
1.4.4 Proteínas associadas ao ponto de checagem mitótico ................................... 12
1.4.5 Proteínas relacionadas ao fuso mitótico ......................................................... 18
1.5 Análise histológica e imunoistoquímica em SMD. ........................................... 23
2 OBJETIVOS ..................................................................................................... 25
2.1 Objetivo Geral ................................................................................................... 25
2.2 Objetivos Específicos ....................................................................................... 25
3 MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................... 26
3.1 Seleção da amostra ........................................................................................... 26
3.2 Imunoistoquímica .............................................................................................. 27
3.3 Interpretação da imunoistoquímica ................................................................... 28
3.4 Análise estatística ............................................................................................... 29
3.5 Aspetos Éticos .................................................................................................... 30
4 RESULTADOS ................................................................................................. 31
4.1 Características epidemiológicas, clínicas e laboratoriais dos pacientes ............ 31
4.2 Expressão proteica .............................................................................................. 36
4.2.1 Expressão qualitativa no grupo SMD ................................................................. 36
4.2.1.1 MAD2 ................................................................................................................. 36
4.2.1.2 CDC20 ................................................................................................................ 41
4.2.1.3 AURORA B ....................................................................................................... 45
4.2.1.4 AURORA A........................................................................................................ 48
4.2.2 Expressão qualitativa nos grupos SMD e controle ............................................. 54
4.2.2.1 MAD2 ................................................................................................................. 54
4.2.2.2 CDC20 ................................................................................................................ 54
4.2.2.3 AURORA B ....................................................................................................... 55
4.2.2.4 AURORA A........................................................................................................ 56
4.2.3 Quantitativa - expressão em porcentagem de marcação .................................... 56
4.2.3.1 MAD2 ................................................................................................................. 56
4.2.3.2 CDC20 ................................................................................................................ 60
4.2.3.3 AURORA B ....................................................................................................... 65
4.2.4 Expressão quantitativa - categorização em grupos conforme porcentagem de
marcação (< 10%, 10-49%, ≥ 50%) ...................................................................
68
4.2.4.1 MAD2 (expressão por grupos < 10%, 10-49%, ≥ 50%) .................................... 70
4.2.4.2 CDC20 (expressão por grupos < 10%, 10-49%, ≥ 50%) ................................... 75
4.2.4.3 AURORA B (expressão por grupos < 10%, 10-49%, ≥ 50%) ........................... 83
4.3 Análise de sobrevida .......................................................................................... 87
4.3.1 MAD2 ................................................................................................................. 87
4.3.2 CDC20 ................................................................................................................ 88
4.3.3 AURORA B ....................................................................................................... 88
4.3.4 AURORA A ....................................................................................................... 89
5 DISCUSSÃO ..................................................................................................... 92
5.1 Dados epidemiológicos....................................................................................... 92
5.2 Dados clínicos..................................................................................................... 93
5.3 Expressão proteica qualitativa............................................................................. 95
5.3.1 MAD2 ................................................................................................................. 95
5.3.2 CDC20 ............................................................................................................... 96
5.3.3 AURORA B ....................................................................................................... 97
5.3.4 AURORA A ....................................................................................................... 97
5.4 Expressão proteica quantitativa........................................................................... 99
5.4.1 MAD2.................................................................................................................. 99
5.4.2 CDC20................................................................................................................. 100
5.4.3 AURORA B........................................................................................................ 104
5.5 Sobrevida ............................................................................................................ 105
5.6 Limitações .......................................................................................................... 108
6 CONCLUSÃO .................................................................................................. 110
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................ 112
1
1. INTRODUÇÃO
Síndrome mielodisplásica (SMD) representa um grupo de doenças clonais hematopoéticas
heterogêneas, que se caracterizam por alterações morfológicas de dispoese em uma ou mais linhagens,
medula óssea hiperproliferativa, citopenias no sangue periférico e risco aumentado para transformação
leucêmica (SWERDLOW et al., 2008). Tais achados são manifestações secundárias a anormalidades em
células clonais (em expansão), que podem ser modificadas por fatores extrínsecos, como o sistema
imune e o microambiente medular (BEJAR, 2013). Além disso, hematopoese ineficaz se faz presente
devido à susceptibilidade anormal das células progenitoras à apoptose, e limitada resposta destas aos
fatores de crescimento (TEFFERI; VARDIMAN, 2009).
As citopenias (anemia, leucopenia e plaquetopenia) são as principais complicações relacionadas a
esta doença, podendo levar os pacientes a necessidades frequentes de transfusões de hemocomponentes,
sangramentos e infecções recorrentes. A transformação em leucemia aguda ocorre em aproximadamente
30% dos pacientes (GREENBERG, P. et al., 1997).
Anemia isolada é a apresentação clínica e laboratorial mais frequente, sendo macrocítica em 80%
dos casos, normocítica ou, raramente, microcítica. Aproximadamente 50% dos casos apresentam outras
citopenias associadas (neutropenia e/ou plaquetopenia) e, menos de 5% dos casos se apresentam com
neutropenia ou plaquetopenia isoladas (NGUYEN, 2009), essa última relacionada a risco aumentado de
sangramentos. A neutropenia leva a um aumento na susceptibilidade a infecções, sendo um importante
fator associado a complicações fatais (DAYYANI et al., 2010).
O diagnóstico de SMD deve ser realizado avaliando-se em conjunto o hemograma, o
mielograma, a biópsia de medula óssea e o cariótipo de medula óssea por banda G (GERMING et al.,
2008). O critério morfológico mínimo para o diagnóstico de SMD é a presença de displasia em 10% ou
mais das células em uma ou mais linhagens hematopoéticas (SWERDLOW et al., 2008; TEFFERI;
VARDIMAN, 2009).
Doenças não clonais reversíveis e outras condições clínicas podem levar a quadros semelhantes
às síndromes mielodisplásicas, tanto à análise do sangue periférico, quanto à análise medular. Portanto, é
de extrema importância a exclusão dessas condições para o seu diagnóstico. Como exemplo, podemos
citar as deficiências vitamínicas (vitamina B12 e/ou ácido fólico), doenças inflamatórias crônicas,
doenças autoimunes, infecções virais (hepatite B, hepatite C), alterações hormonais, etilismo crônico,
exposição a metais pesados, uso prévio de agentes citotóxicos e síndrome da imunodeficiência adquirida.
De acordo com alguns pesquisadores (MAGALHÃES; LORAND-METZE, 2004; TEFFERI;
VARDIMAN, 2009), todos os pacientes com citopenias e alterações displásicas medulares devem ser
submetidos a um protocolo para exclusão de tais condições clínicas, antes da definição do diagnóstico
2
definitivo de SMD. Anemia aplásica e hemoglobinúria paroxística noturna (HPN), doenças que afetam a
célula-tronco, são outros importantes diagnósticos diferenciais, pois podem se apresentar de forma
semelhante à SMD (hipoplásica ou não) e/ou constituírem quadro de sobreposição à mesma. Em vista
disso, muitas vezes outros exames complementares podem ser úteis, como imunoistoquímica de biópsia
de medula óssea, hibridização in situ (FISH) ou reação em cadeia da polimerase (PCR) para
determinadas anormalidades genéticas.
1.1. Epidemiologia
SMD acomete habitualmente idosos, com idade, ao diagnóstico, entre 60 e 75 anos, e sua
prevalência aumenta com a idade. A incidência em pacientes acima de 70 anos é maior que 20 casos por
100.000 pessoas/ano, podendo acarretar sérias complicações aos pacientes dessa faixa etária (MUFTI,
2004). Segundo dados americanos, SMD ocorre em 3 a 4 indivíduos a cada 100.000 habitantes e, no
Leste Europeu, estima-se uma incidência de 3,3 a 4,5/100.00 habitantes. Há, ainda, dados que favorecem
diferenças na incidência de acordo com a distribuição étnica da população (GARCIA-MANERO, 2011).
SMD é, em geral, duas a três vezes mais frequente do que leucemia mieloide aguda e ocorre mais
comumente em homens (NGUYEN, 2009).
A incidência de SMD está em ascensão pelo nítido envelhecimento da população mundial, pelas
melhores condições de tratamento da população geriátrica e, também, pela maior frequência de
indivíduos expostos a tratamentos quimio e/ou radioterápicos (MUFTI, 2004; SOLE et al., 2005;
VASSALO J., 2009).
1.2. Classificação e Estratificação de risco
A SMD se classifica como primária (de novo) ou secundária (associada à terapia prévia), sendo
80 a 90% dos casos classificados como do tipo primário (LUKACKOVA et al., 2013; MUFTI, 2004;
PEDERSEN-BJERGAARD; ANDERSEN; ANDERSEN, 2007). SMD secundária é relacionada à
exposição prévia a agentes quimioterápicos e/ou radiação (como no tratamento das neoplasias sólidas),
sendo as principais drogas envolvidas os inibidores da topoisomerase II e os agentes alquilantes (LOOK,
2005; PINHEIRO, R.F.; CHAUFFAILLE, 2006). De forma geral, possui pior prognóstico, quando
comparada à SMD primária, acomete pacientes mais jovens, possui maior grau de citopenias e maior
risco de transformação leucêmica (MUFTI, 2004; TEFFERI; VARDIMAN, 2009).
A primeira classificação de SMD foi realizada em 1982 pelo grupo franco-americano-britânico
(FAB) e se baseou, principalmente, nas características clínicas, morfológicas e na porcentagem de
blastos em sangue periférico e medula óssea. De acordo com a classificação FAB, temos os seguintes
grupos: a) Anemia Refratária (AR); b) Anemia Refratária com Sideroblastos em anel (ARSA); c)
3
Anemia Refratária com Excesso de Blastos (AREB); d) AREB em transformação (AREB-t); e)
Leucemia Mielomonocítica Crônica (LMMC). Suas principais limitações são a não inclusão de
alterações citogenéticas e a não quantificação do número de citopenias, ambas características
sabidamente muito importantes para terapia e prognóstico da SMD. Entretanto, ela é capaz de diferenciar
pacientes de alto e baixo risco para transformação leucêmica (BENNETT et al., 1982).
Em 2001, a Organização Mundial de Saúde (OMS) criou uma outra classificação para SMD, com
a criação de novos grupos, o da citopenia refratária com displasia multilinhagem (CRDM) e CRDM com
sideroblastos em anel (CRDM-SA), os quais englobam pacientes com displasia em linhagens mieloide
e/ou megacariocítica associada à diplasia na linhagem eritroide e o grupo com citopenias em linhagem
única ou bilinhagem (mieloide e/ou mecacariocítica), na ausência de alterações displásicas no setor
eritroide, chamado grupo SMD inclassificável (“unclassified”) (SMD-U). Além disso, outras alterações
foram feitas, sendo: introdução de um novo grupo, com uma alteração citogenética específica, no caso, a
presença de deleção 5q isolada e menos que 5% de mieloblastos (após percepção de que tais pacientes
possuíam bom prognóstico e baixo risco de evolução para LMA); exclusão do grupo AREB-t; divisão do
grupo AREB em AREB I e AREB II (sendo suas definições a presença de 5 a 9% de blastos na medula
óssea e 10 a 19% de blastos, também na medula óssea, respectivamente); redução do limiar da
porcentagem de blastos na medula óssea para o diagnóstico de LMA de 30% para 20% (pela observação
de que pacientes do grupo AREB-t se comportavam de forma semelhante aos pacientes com diagnóstico
de LMA, em relação à resposta terapêutica); e inclusão da LMMC em outra categoria de doenças
hematopoéticas (o grupo das doenças mielodisplásicas/mieloproliferativas) (JAFFE et al., 2001).
Esta classificação foi revisada em 2008 (Tabela 1), a qual resultou na unificação do grupo de
citopenias em apenas uma linhagem, chamado citopenias refratárias com displasia unilinhagem (CRDU),
constituindo os grupos: Anemia Refratária (AR); Neutropenia Refratária (NR) e Trombocitopenia
Refratária (TR); inclusão de pacientes com citopenia(s) persistente(s) por mais de 6 meses na presença
de alterações citogenéticas, porém, na ausência de displasia(s), no grupo SMD inclassificável (SMD-U)
(SWERDLOW et al., 2008); e criação de outro grupo, o qual engloba pacientes portadores de citopenias
persistentes, de etiologia indefinida e sem critérios mínimos para SMD, classificados com a
denominação de citopenias de significado indeterminado (ICUS - idiopathic cytopenia of undetermined
significance). Este grupo possui risco de evoluir para SMD, apesar de não necessariamente ser uma
doença clonal (VALENT et al., 2012).
4
TABELA 1. CLASSIFICAÇÃO SMD (OMS, 2008)
Classificação Sangue periférico Medula óssea
Citopenia Refratária com
Displasia Unilinhagem (CRDU)
Anemia refratária (AR)
Neutropenia refratária
(NR)
Plaquetopenia refratária
(PR)
Citopenia em uma ou duas
linhagens
Ausência de blastos ou raros
(< 1%)
Displasia em uma linhagem em
≥ 10% das células
< 5% de blastos
< 15% de sideroblastos em anel
Anemia Refratária com
Sideroblastos em Anel (ARSA)
Anemia
Ausência de blastos
≥ 15% de sideroblastos em anel
Displasia eritroide isolada
< 5% de blastos
Citopenia Refratária com
Displasia Multilinhagem
(CRDM)
Citopenia (s)
Ausência de blastos ou raros
(< 1%)
Ausência de bastonetes de
Auer
Monócitos < 1.000/mm3
Displasia em ≥ 10% das células
em ≥ duas linhagens
<5% de blastos
Ausência de bastonetes de Auer
Presença ou ausência de
sideroblastos em anel
Anemia Refratária com
Excesso de Blastos-1 (AREB-1)
Citopenia (s)
< 5% de blastos
Ausência de bastonetes de
Auer
Monócitos < 1.000/mm3
Displasia uni ou multilinhagem
5 a 9% de blastos
Ausência de bastonetes de Auer
Anemia Refratária com
Excesso de Blastos-2 (AREB-2)
Citopenia (s)
5 a 19% de blastos
Bastonetes de Auer presentes
ou ausentes
Monócitos < 1.000/mm3
Displasia uni ou multilinhagem
10 a 19% de blastos
Bastonetes de Auer presentes ou
ausentes
SMD inclassificável (SMD-U) Citopenia (s)
≤ 1% de blastos
Displasia em menos de 10% das
células em uma ou mais linhagens
quando acompanhada de alteração
citogenética considerada preditora
para o diagnóstico de SMD*
< 5% de blastos
SMD associada à deleção 5q
isolada (5q-)
Anemia
Contagem plaquetária normal
ou aumentada
Ausência de blastos ou raros
(< 1%)
Megacariócitos de tamanho
normal a aumentado com núcleos
hipolobulados
<5% de blastos
Alteração citogenética isolada –
del(5q)
Ausência de bastonetes de Auer
* Principais alterações citogenéticas que favorecem o diagnóstico de SMD: trissomia do cromossomo 8, deleções
envolvendo o braço longo dos cromossomos 5, 7 ou 13, deleção do braço longo do cromossomo 20, nulissomia do Y,
isocromossomo 17q, t(11;16), t(3;21)
5
1.3. Prognóstico
O estabelecimento do prognóstico dos pacientes portadores de SMD é um elemento chave para o
seu manejo clínico. Isso ocorre pelo fato de que esta doença, assim como outras síndromes, possui certo
grau de incerteza diagnóstica, heterogeneidade na apresentação clínica e etiologia ainda não
completamente compreendida (BEJAR, 2013).
O IPSS (International Prognostic Score System) foi o primeiro escore prognóstico criado para
SMD, em 1997. Ele foi validado após avaliação das características clínicas, ao diagnóstico, de 816
pacientes, no qual foram determinadas associações com sobrevida global. Não inclui pacientes
portadores de SMD relacionada à terapia, leucemia mielomonocítica crônica ou pacientes que receberam
terapia, seja quimioterapia ou transplante de células hematopoéticas. É amplamente utilizado e inclui três
variáveis: porcentagem de blastos, alterações citogenéticas e número de citopenias em sangue periférico
(Quadros 1a e b). O IPSS determina quatro grupos de risco com diferenças significantes na sobrevida
global e no risco para evolução para leucemia aguda. É simples de ser calculado e não requer outros
exames complementares além dos já realizados para o diagnóstico de SMD (GREENBERG, P. et al.,
1997). Suas limitações incluem impossibilidade de uso em pacientes previamente tratados, uso apenas ao
diagnóstico, consideração isolada do número de citopenias sem levar em conta a gravidade das mesmas,
inclusão de somente cinco alterações citogenéticas e inclusão de pacientes antes diagnosticados como
AREB-t (com contagem de blastos entre 20% e 30%), posteriormente definidos como portadores de
LMA. Além disso, ele pode subestimar os pacientes que apresentam apenas citopenia(s), sem outros
fatores de risco, fato importante para o prognóstico, como demonstrado recentemente (BEJAR, 2013;
GREENBERG, P. L. et al., 2012; KOMROKJI; ZHANG; BENNETT, 2010; STEENSMA, 2009).
QUADRO 1a - IPSS (1997)
Pontos 0 0,5 1,0 1,5 2,0
Blastos MO (%) <5 5-10 - 11-20 > 20
Cariótipo* Favorável Intermediário Desfavorável - -
Citopenias** 0-1 2-3 - - -
* Cariótipo de prognóstico favorável: cariótipo normal ou com anormalidades isoladas 5q-, 20q-, -Y;
Cariótipo de prognóstico desfavorável: alteração envolvendo o cromossomo 7 ou cariótipo complexo (presença de 3 ou mais
anormalidades);
Cariótipo intermediário: demais alterações
** Citopenias: Hb < 10g/dl, neutrófilos <1.800/mm3, plaquetas <100.000/mm
3
6
QUADRO 1b - IPSS – PONTUAÇÃO E EVOLUÇÃO
Grupo de risco Pontos Sobrevida geral (anos) 25% de risco de evolução
para LMA (em anos) ≤ 60 anos > 60 anos
Baixo 0 11,8 4,8 9,4
Intermediário 1 0,5 - 1,0 5,2 2,7 3,3
Intermediário 2 1,5 - 2,0 1,8 1,1 1,1
Alto ≥ 2,5 0,3 0,5 0,2
O WPSS (World Health Organization Prognostic Scoring System) é um escore baseado na
classificação OMS, ou seja, incorpora o número de linhagens celulares com displasia e a porcentagem de
blastos. O risco associado às alterações citogenéticas é o mesmo do IPSS e a presença de anemia grave é
considerado outro fator de risco. De acordo com esse escore, existem cinco grupos de risco, com
diferenças significativas na sobrevida global. Foi validado para uso de forma dinâmica, ou seja, não
apenas ao diagnóstico e, assim como o IPSS, é fácil de ser realizado e não exige outros exames
complementares (MALCOVATI et al., 2005).
O IPSS-R (IPSS revisado) constitui uma revisão do IPSS original, o qual avaliou 7012 pacientes
portadores de SMD em 11 países, incluindo o Brasil. A principal modificação desse escore foi a inclusão
de várias outras alterações cromossômicas, que foram estratificadas em cinco grupos de risco. Deu-se
menor importância à porcentagem de blastos, em comparação com o escore original, embora valores
acima de 2% foram reconhecidos como um fator de risco adverso. O IPSS-R leva em conta cada
citopenia individualmente e, assim, atribui um risco adicional de acordo com a sua gravidade.
(GREENBERG, P. L. et al., 2012) (Quadros 2a e b). Além desses escores citados, existem outros como o
MD Anderson Comprehensive Scoring System (MDA-CSS) e o escore criado para SMD de baixo risco
(KANTARJIAN et al., 2008), o LR-PSS (Lower-Risk MDS Prognostic Scoring System) (GARCIA-
MANERO et al., 2008).
7
QUADRO 2a - IPSS REVISADO
Variável/ pontuação 0 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0 4,0
Cariótipo* Muito
bom
Bom Interme-
diário
Ruim Muito
ruim
Blastos (%) ≤ 2 > 2 a < 5 5 a 10 > 10
Hb (g/dL) ≥ 10 8 as < 10 < 8
Neutrófilos
(céls/mm3)
≥ 800 < 800
Plaquetas
(céls/mm3)
≥ 100.000 50.000 a
100.000
< 50.000
* Muito bom: del(11q), -Y; Bom: Normal, del(20q), del(5q) isolada e dupla, del(12p); Intermediário: +8, 7q-, i(17q), +19,
+21, qualquer outra alteração isolada ou dupla, clones independentes; Ruim: inv(3)/t(3q)/del(3q), -7, anormalidades duplas
incluindo -7/del(7q), presença de 3 anormalidades; Muito ruim: presença de > 3 anormalidades
QUADRO 2b - IPSS-R - CLASSIFICAÇÃO DE RISCO E PONTUAÇÃO
Classificação de risco Pontuação Sobrevida Média
(anos)
Tempo médio para evolução
para LMA (anos)
Muito baixo ≤ 1,5 8,8 > 14,5
Bom > 1,5 a 3,0 5,3 10,8
Intermediário > 3,0 a 4,5 3,0 3,2
Alto > 4,5 a 6 1,6 1,4
Muito alto > 6 0,8 0,7
Outros marcadores prognósticos já foram estudados, como lactato desidrogenase sérica,
performance status, ferritina sérica, β2-microglobulina, albumina, fibrose medular, expressão de
proteínas à análise imunoistoquímica, expressão gênica e mutações somáticas (BEJAR, 2013) porém,
ainda necessitam de evidências mais consistentes e não são realizadas na rotina clínica.
1.4. Patogênese
As causas da SMD ainda não estão bem definidas, assim como sua evolução clínica
(AGGARWAL et al., 2011; KITAGAWA et al., 2011). Sabe-se que, para que ela se manifeste
clinicamente, um único clone deve sofrer vários processos biológicos e que uma mutação, isoladamente,
deve contribuir para a transformação neoplásica, atuando em mais de um desses processos, embora a
8
grande maioria das neoplasias pareça requerer a aquisição de múltiplas anormalidades genéticas para se
manifestar (Figura 1). Podemos citar alguns passos associados à patogênese da SMD: 1. auto-renovação
da célula-tronco hematopoética ou aquisição desta propriedade numa célula progenitora; 2. aumento da
capacidade proliferativa no clone neoplásico e/ou em sua progênie mais diferenciada; 3.
comprometimento ou bloqueio da diferenciação celular; 4. instabilidade genética e epigenética; 5.
presença de mecanismos antiapoptóticos no clone neoplásico; 6. evasão ao sistema imune; 7. supressão
da hematopoese normal (BEJAR; LEVINE; EBERT, 2011; MUFTI, 2004). É importante salientar que a
capacidade de auto-renovação deve estar presente na célula iniciadora da SMD para que a doença seja
gerada (NIMER, 2011). Surge um aumento na capacidade proliferativa e de resistência à apoptose com
consequente expansão do clone neoplásico, fato que pode ser favorecido por um microambiente medular
alterado. No mínimo, uma alteração molecular deve ocorrer (no clone dominante ou em seu
microambiente) para que a SMD tenha origem. Neste momento, ocorre diferenciação displásica em uma
ou mais linhagens mieloides, iniciando-se, então, a hematopoese ineficaz (BEJAR et al., 2011).
FIGURA 1. MECANISMOS ENVOLVIDOS NA PATOGÊNESE DA SMD.
Legenda: CTH: células-tronco hematopoéticas. Fonte: Adaptado de TEFFERI e VARDIMAN (2009).
9
De forma geral, a manifestação clínica da doença (tipo e gravidade das citopenias e tempo para
progressão da mesma) dependerá do grau de prevalência de cada um destes processos enumerados
anteriormente (BEJAR et al., 2011).
As alterações genéticas na SMD são bastante complexas e envolvem interações com o
microambiente alterado e com outras mutações, sendo tais fatores importantes para sua patogênese
(BEJAR et al., 2011).
1.4.1. Alterações Epigenéticas
O componente hereditário do fenótipo celular que não se modifica por mudanças na sequência
genômica do DNA é referido como epigenético. Na SMD, os processos epigenéticos mais importantes,
são: a metilação de resíduos de citosina no DNA (levando ao bloqueio da expressão gênica) e a
modificação covalente de histonas (BEJAR et al., 2011; SANTINI et al., 2013).
Na SMD, existe um padrão de metilação de resíduos de citosina nas sequências de nucleotídeos
CpG (que difere das células normais da medula óssea). As DNA metiltransferases (DNMTs) convertem
as bases de citosina em 5-metilcitosina, quando estas encontram-se na primeira base dos dinucleotídeos
CpG. Essas ilhas CpGs estão localizadas agrupadas próximo ou nas próprias regiões promotoras dos
genes (SANTINI et al., 2013).
Sabe-se que vários genes que regulam a metilação do DNA encontram-se mutados de forma
somática na SMD e que o estado de metilação da citosina influencia na transcrição gênica e contribui
para diferenciação celular alterada nesta doença (GRAUBERT; WALTER, 2011). De modo geral, a
metilação das ilhas CpGs leva a um silenciamento gênico e representa um dos mecanismos de perda da
expressão dos genes supressores tumorais. Nos casos de SMD de alto risco, a hipermetilação de alguns
genes supressores tumorais está associada à pior sobrevida e aumento de risco de transformação para
leucemia (AGGARWAL et al., 2011; BEJAR et al., 2011; SHIH; LEVINE, 2011; TEFFERI;
VARDIMAN, 2009).
As histonas são proteínas que também participam da regulação da expressão gênica, organizando
o DNA em zonas de cromatina ativa (aberta) e não ativa (fechada). Esta regulação ocorre através de
alterações pós-translacionais (pela sua desacetilação) (GRAUBERT; WALTER, 2011). Na SMD, a
desacetilação das histonas se associa com redução da atividade transcripcional (silenciamento), já que
sua acetilação permite o acesso à cromatina, levando a um aumento na atividade transcricional.
Normalmente, ocorre um balanço dinâmico entre acetilação e desacetilação pelas histonas deacetilases
(HDACs) (AGGARWAL et al., 2011; SANTINI et al., 2013; SHIH; LEVINE, 2011).
10
Outros genes frequentemente inativados por alterações epigenéticas são os genes inibidores de
quinase dependente de ciclina (CDKIs), p15INK4B e p16INK4A (genes supressores tumorais). Eles
inibem o crescimento celular através da formação de complexos com as CDKs (quinases dependentes de
ciclinas). O gene pINK4B inibe CDK4 e CDK6 e se encontram metilado em 30 a 50% dos casos de
SMD, aproximadamente. Correlaciona-se com a porcentagem de blastos na medula, evolução para LMA
e pior prognóstico (HIRAI, 2003; SANTINI et al., 2013).
1.4.2. Alterações cromossômicas
Estudos vêm demonstrando a importância das alterações citogenéticas na patogênese da SMD,
assim como para seu diagnóstico, tratamento e prognóstico (GRAUBERT; WALTER, 2011; HIRAI,
2003; MUFTI, 2004).
As anormalidades cromossômicas são observadas em 30% a 60% dos casos de SMD primária
(BERNASCONI, 2008; CHEN, B. et al., 2005; ROMEO et al., 2002; SOLE et al., 2005). As alterações
numéricas são as mais frequentes e os cromossomos 5, 7 e 8 são envolvidos em 50% dos casos anormais.
Aproximadamente 50% dos pacientes com SMD possuem cariótipo normal, grupo de pacientes com
desfechos clínicos bastante variáveis (SHIH; LEVINE, 2011).
A incidência de anormalidades cromossômicas em pacientes com SMD é variável a depender
do grupo de pacientes em estudo (alto risco x baixo risco), possivelmente com influência da etnia e
distribuição geográfica. Estudo realizado no Brasil com 44 pacientes portadores de SMD revelou
anormalidades cromossômicas em 20,4% dos mesmos, ao diagnóstico, em 25% aos 6 meses e em
31% aos 12 meses (PINHEIRO, R. F.; CHAUFFAILLE, 2009). No estado do Ceará, estudo recente
realizado com 102 pacientes (dos quais 78 obtiveram metáfases) mostrou, de acordo com IPSS
revisado, os seguintes resultados citogenéticos (ao diagnóstico): prognóstico muito bom - 1,96%;
bom - 53,92%; intermediário - 14,7%; ruim - 1,96%; e muito ruim - 3,92% (COSTA et al., 2013).
A deleção e amplificação de parte ou todo o cromossomo 5, 7, 20 e trissomia do cromossomo 8
ocorrem, em SMD, em aproximadamente 20%, 10%, 5% e 8%, respectivamente (BEJAR et al., 2011;
HIRAI, 2003). Sabe-se que os genes codificados por essas regiões contribuem para a patogênese da
doença.
A deleção intersticial de uma cópia do cromossomo 5q (isolada ou associada a outras alterações
citogenéticas complexas) é a alteração genética mais comum em SMD primária. A região 5q31.2
(proximal), quando deletada, confere um alto risco de evolução para LMA e, de forma distinta, a deleção
da região 5q33.1 (distal) leva a um baixo risco de transformação leucêmica. Estudos prévios não
identificaram a presença de mutação bialélica em nenhuma destas duas deleções, o que sugere que exista
11
um mecanismo de haploinsuficiência para o mecanismo genético de contribuição desta alteração na
SMD, principalmente para seu início e progressão (GRAUBERT; WALTER, 2011). Dentre os genes
envolvidos na deleção da região 5q, podemos citar: RPS14, SPARC e EGR1, todos associados à
patogênese da SMD (AGGARWAL et al., 2011; BEJAR et al., 2011; TEFFERI; VARDIMAN, 2009).
Além disso, sabe-se que a região 5q contém micro-RNAs, como miR-145 e miR-146 (SHIH; LEVINE,
2011) e que alterações na regulação de alguns micro-RNAs são envolvidos em sua patogênese
(RHYASEN; STARCZYNOWSKI, 2012).
Deleção e monossomia do braço longo do cromossomo 7 se associam a pior prognóstico tanto
quando presente de forma isolada quando associada a alterações citogenéticas complexas (BEJAR et al.,
2011).
Alterações citogenéticas associadas a melhores prognósticos em SMD são: deleção 20q isolada e
nulissomia do cromossomo Y (BEJAR et al., 2011; GREENBERG, P. et al., 1997). É importante
lembrar que a nulissomia do Y pode ser uma alteração citogenética associada ao fenômeno de
senescência e, portanto, não associada a alguma doença clonal (TEFFERI; VARDIMAN, 2009). A
trissomia do cromossomo 8 é a única amplificação cromossômica recorrente em SMD, considerada
alteração citogenética de risco intermediário (BEJAR et al., 2011). Outras alterações citogenéticas que
ocorrem menos comumente em SMD são: deleções no braço longo dos cromossomos 11, 12 e 13
(HIRAI, 2003), translocações envolvendo a região 11q23 (locus do gene MLL) e translocações e
inversões no cromossomo 3 (3q26), esta última associada a mau prognóstico (BEJAR et al., 2011).
1.4.3. Microambiente medular
A hematopoese é regulada por elementos do nicho na medula óssea. Esses nichos são
constituídos por diferentes tipos de células estromais, tais como células epiteliais, macrófagos,
adipócitos, fibroblastos, osteoblastos e condrócitos, e também possuem vasos sanguíneos e elementos da
matriz extracelular. Essas células estromais participam da regulação da hematopoese através da secreção
de vários tipos de citocinas e proteínas ligantes para as células hematopoéticas imaturas (AGGARWAL
et al., 2011).
A angiogênese, por exemplo, é mediada por macrófagos, os quais produzem citocinas pró-
inflamatórias, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e fator de crescimento de fibroblasto.
Esses fatores angiogênicos estão elevados em SMD de alto risco quando comparados com SMD de baixo
risco, o que resulta no aumento da vascularização e densidade de microvasos. Além disso, alguns fatores
angiogênicos, incluindo o VEGF, provavelmente, contribuem para o microambiente imunossupressor
nos casos de SMD de alto risco (AGGARWAL et al., 2011).
12
É conhecido que muitas células tumorais “modificam” seu nicho adjacente tornando-o um local
mais adequado para a progressão tumoral, através de fatores de crescimento, interleucinas e proteases,
liberadas pelas próprias células tumorais. Entretanto, acredita-se que haja outros mecanismos do
microambiente medular que colaborem para a patogênese da doença.
1.4.4. Proteínas associadas ao ponto de checagem mitótico
As neoplasias hematológicas, dentre elas SMD, assim como os tumores sólidos caracterizam-se
pela presença de instabilidade cromossômica e aneuploidia (LI, J. J.; LI, 2006), fatores de extrema
importância em SMD. Instabilidade cromossômica gera anormalidades cromossômicas e essas são
consideradas as características mais importantes à avaliação prognóstica desta doença. Aneuploidia
muito provavelmente relaciona-se à sua patogênese, embora ainda não esteja bem estabelecido quais são
as suas causas.
Partindo desse fato, a segregação inapropriada dos cromossomos durante a mitose pode ser um
dos fatores associados à aneuploidia, assim como a outras alterações cromossômicas, comportando-se
como um fator importante na patogenia da SMD. A divisão celular possui mecanismos de checagem, ou
seja, mecanismos que permitem que apenas as células adequadamente "preparadas" para entrarem em
mitose, consigam completar sua divisão.
Para que as células se dividam, há necessidade de que seus cromossomos estejam segregados e
alinhados corretamente no interior do núcleo celular. O ponto de checagem mitótico evita que a mitose
progrida frente a um desalinhamento e/ou segregação inadequada cromossômica. O complexo proteico
presente ao redor do centrômero é denominado cinetócoro (Figura 2). O alinhamento correto dos
cromossomos de faz pela ligação um único cinetócoro a um único microtúbulo do fuso mitótico.
FIGURA 2. CROMOSSOMO CONECTADO AO FUSO MITÓTICO NA REGIÃO DO
CINETÓCORO
13
O ponto de checagem mitótico assegura que exista um alinhamento e segregação (dos
cromossomos) de forma correta, para que a mitose seja finalizada, evitando que células com
cromossomos não ligados corretamente aos microtúbulos do fuso mitótico completem esta fase do ciclo
celular. Existem três componentes nesta checagem: um sensor, um transdutor de sinais e um inibidor. O
primeiro detecta a presença de desalinhamento cromossômico; o segundo amplifica o sinal gerado pelo
sensor; e o terceiro cessa o ciclo celular até o correto alinhamento dos cromossomos (SUDAKIN;
CHAN; YEN, 2001). Quando acionado, o ponto de checagem mitótico impede a progressão da metáfase
para anáfase através da inibição do Complexo Promotor da Anáfase (CPA), proteína ubiquitina ligase
(ACQUAVIVA; PINES, 2006). Isso faz com que quando alguma ligação dos cinetócoros aos
microtúbulos ocorra de forma errônea e/ou não ocorra, surjam sinais inibitórios que cessam o ciclo
celular e evitam que a célula prossiga a mitose (SUDAKIN et al., 2001).
Um dos principais eventos para que a mitose progrida é a degradação de securina (inibidor de
separase) e ciclina B (regulador mitótico) ambos substratos para o CPA - que ocorre somente após a
conexão correta entre as cromátides-irmãs e o fuso mitótico (PINES, 2006). Por outro lado, a ativação do
CPA se faz pela sua fosforilação por CDK1/ciclina B (FARRUGGIO; TOWNSLEY; RUDERMAN,
1999; PATRA; DUNPHY, 1998), que leva a uma maior afinidade entre CPA e CDC20, este último, um
cofator de reconhecimento proteico (LI, Y. et al., 1997). O complexo CPA/CDC20 permite a transição
entre metáfase e anáfase após adição de subunidades de ubiquitina ao mesmo e posterior reconhecimento
de quais proteínas deverão ser degradadas para a progressão do ciclo celular (PETERS, 2006).
Portanto, o ponto de checagem mitótico é ativado pela inibição do CPA, essa realizada pelo
denominado complexo inibitório CCM (Complexo de Checagem Mitótico). BUB1, BUBR1 (BUB1B),
BUB3, MAD1 (MAD1L1) e MAD2 (MAD2L1) são as proteínas constituintes do CCM e atuam
inibindo, indiretamente, o CPA, pelo sequestro de moléculas de CDC20, impedindo sua ativação até que
haja alinhamento completo e adequado dos cromossomos ao fuso mitótico (BRAUNSTEIN et al., 2007;
MONDAL et al., 2007; MUSACCHIO; SALMON, 2007; SUDAKIN et al., 2001).
Moléculas de MAD2, na mitose, ligam-se à MAD1 (por receptores presentes nos cinetócoros) e,
tal ligação forma um complexo estável - MAD1-MAD2, responsável por subsequentes mudanças em
moléculas de MAD2 não ligadas, livres no citoplasma celular. MAD2 possui duas conformações
distintas, chamadas open-MAD2 (O-MAD2) e closed-MAD2 (C-MAD2), ambas envolvidas nas
interações entre essa molécula e MAD1 e CDC20. Cinetócoros inadequadamente alinhados ou não
conectados aos microtúbulos recrutam moléculas de O-MAD2, pela sua interação com MAD1. Com
isso, há uma mudança conformacional de O-MAD2 para C-MAD2, com formação do complexo
C-MAD2-MAD1, bastante estável. Este complexo recruta moléculas de O-MAD2, que se ligam aos
cinetócoros, levando a maior conversão de O-MAD2 para C-MAD2. Como vimos, o complexo
14
C-MAD2-MAD1 é muito importante para a mudança conformacional da molécula MAD2. A formação
do complexo C-MAD2-MAD1 e a maior disponibilização de C-MAD2 levam a um aumento na ligação
entre esta proteína e CDC20 (já que CDC20 só se liga à C-MAD2), com formação de outro complexo, o
C-MAD2-CDC20 e amplificação do sinal inibitório sobre CDC20, pois essa ligação sabidamente inibe
tal molécula (Figura 3) (LAD et al., 2009; MUSACCHIO; SALMON, 2007).
FIGURA 3. ESQUEMA DE MUNDANÇA CONFORMACIONAL DE MAD2. a) Moléculas de MAD1,
dispostas em cinetócoros não conectados, formam um complexo estável com MAD2 (C-MAD2-MAD1).
Este complexo recruta e modifica a estrutura conformacional de moléculas O-MAD2, que se encontram
livres no citoplasma, em moléculas C-MAD2. Por sua vez, moléculas C-MAD2 interagem e inibem
CDC20 (C-MAD2- CDC20). b) O complexo C-MAD2-CDC20 também possui atividade catalítica que o
permite modificar moléculas O-MAD2, em uma reação de auto-amplificação. Fonte: Adaptado de
MUSACCHIO e SALMON (2007).
MAD2 age como um sensor do ponto de checagem mitótico pelo monitoramento da conexão
entre cinetócoros e microtúbulos. O CPA não é ativado enquanto houver ligação entre MAD2 e CDC20.
MAD2 atua também impedindo a atividade ubiquitina ligase prematura de APC (CHEN, R. H. et al.,
1996; LI, J. J.; LI, 2006; LI, Y. et al., 1997). A dissociação entre tais moléculas ocorre após alinhamento
cromossômico correto e, então, ativação do CPA (BRAUNSTEIN et al., 2007; FANG; YU;
KIRSCHNER, 1998; LI, Y. et al., 1997).
Separase é proteína responsável pela degradação das moléculas de coesinas, que mantêm as
cromátides irmãs unidas. Quando elas são degradadas, há migração das cromátides para os pólos
celulares e progressão da metáfase para anáfase. Separase é ativada e liberada após degradação de
securina, proteína marcada pelo complexo CPA/CDC20. Em vertebrados, a anáfase se inicia apenas
quando securina e ciclina B estão quase totalmente degradadas (BRITO; RIEDER, 2006; CLUTE;
15
PINES, 1999; HAGTING et al., 2002). O equilíbrio entre CDC20 e seus inibidores é imprescindível
para assegurar uma adequada ativação de CCM.
Como demonstrado em vários tipos de tumores, distúrbios nos pontos de checagem mitótico
permitem que as células prossigam com a mitose antes da formação da maquinaria apropriada,
ocasionando erros na segregação cromossômica (WARNER et al., 2003).
SUDAKIN et al. (2001) demonstraram que a população de MAD2 livre em células HeLa está
presente em níveis de 20 a 50 vezes maiores que a população de MAD2 encontrada em CCM, porém não
é capaz de inativar o CPA.
Falhas na segregação cromossômica, aneuploidia e poliploidia podem ocorrer em situações de
baixas concentrações de MAD2. Isso pela diminuição da capacidade de sinalização do ponto de
checagem mitótico, degradação de securina e separação prematura das cromátides irmãs (MICHEL, L. S.
et al., 2001). Foi demonstrado que a completa perda de MAD2 mostrou-se letal durante o
desenvolvimento embrionário de camundongos (DOBLES et al., 2000; MICHEL, L. S. et al., 2001).
Estudo realizado em linhagens celulares de mieloma múltiplo demonstrou redução proteica importante
de MAD2. Tal redução se associou a segregação cromossômica errônea e formação de pontes
cromossômicas (DIAZ-RODRIGUEZ et al., 2011).
Alguns pesquisadores demonstraram que em linhagens celulares de tumores de mama, ovário e
nasofaringe, os níveis de proteína MAD2 são baixos (MICHEL, L. et al., 2004), e que o locus de MAD2
(4q27) está deletado em neoplasias de fígado (LI, Y. et al., 1997; WANG, X. et al., 2002). Níveis
reduzidos de expressão gênica do gene codificador de MAD2 (MAD2L1) também foram encontrados em
diferentes tipos de cânceres humanos, como tumores de esôfago, fígado e ovário (DOAK et al., 2004;
JEONG et al., 2004; SZE et al., 2004; WANG, X. et al., 2002).
Expressão proteica aumentada de MAD2 foi associada a maior grau de malignidade em
adenocarcinoma seroso de ovário (NAKANO et al., 2012) e a menor grau de diferenciação histológica
em carcinoma hepatocelular, câncer coloretal e gástrico (LI, G. Q.; ZHANG, 2004; WANG, X. et al.,
2002; ZHANG, S. H. et al., 2008). Aumento na expressão gênica de MAD2L1 parece facilitar a
progressão de osteosarcoma tanto in vivo quanto in vitro (YU et al., 2012).
Superexpressão de MAD2, em linfoma não Hodgkin difuso de grandes células, foi visto por
SOTILLO et al. (2007), em estudo de microarranjo tecidual com diferentes tipos de linfomas. Este
mesmo autor demonstrou que essa superexpressão pode iniciar o processo de tumorigênese e cooperar
com outros estímulos oncogênicos. Alterações na relação MAD1/MAD2 podem estar associadas ao
surgimento de tumores conforme estudo recente (SCHUYLER; WU; KUAN, 2012).
Com a diminuição da velocidade de progressão da mitose causada pela superexpressão de
MAD2, há menor grau de proteólise de ciclina B pelo CPA. Entretanto, sabe-se que o CCM não bloqueia
16
de modo definitivo as células e que ciclina B é degradada de forma progressiva (por mecanismos de
ubiquitilação e proteassoma-dependentes) durante este bloqueio (BRITO; RIEDER, 2006). Com a
diminuição da quantidade de ciclina B, a mitose pode continuar e ser finalizada, o que pode ser uma
forma de as células contornarem o bloqueio da mitose gerado pela superexpressão de MAD2 (SOTILLO
et al., 2007).
Podemos dizer, então, que a incidência de instabilidade cromossômica associa-se a
anormalidades do ponto de checagem mitótico causado por alterações na expressão de MAD2.
Alterações nos níveis de expressão de CDC20 também podem levar à instabilidade cromossômica.
Foi demonstrado que altas concentrações de CDC20 podem ativar o CPA, independente do seu estado de
fosforilação. Como consequência, a superexpressão de CDC20 pode levar à ativação inadequada do CPA
e progressão da metáfase para anáfase. Este aumento da sua expressão supera os efeitos inibitórios do
complexo de checagem mitótico (CCM) (FANG et al., 1998).
A ativação prematura do CPA, causada pela superexpressão de CDC20 pode levar a anormalidades
na duplicação dos centrossomos (LIU et al., 2010). CDC20 situa-se no centrossomo durante a intérfase e,
durante a mitose, nos pólos do fuso e nos cinetócoros.
Os centrossomos são importantes organelas, fundamentais para a nucleação dos microtúbulos
(principal organizador do fuso mitótico e local de recrutamento de proteínas estruturais, motoras e
catalíticas) (WARNER et al., 2003). São formadas por um par de centríolos, submersos no material
pericentriolar, que é a sua matriz proteica. Os centríolos se duplicam e se separam durante o ciclo
celular, permitindo à célula o início de um novo ciclo (Figura 4). Alterações na expressão da proteína
separase, responsável por essa separação, pode levar a formação de fuso mitótico multipolar pela
possibilidade de que ocorra mais de uma duplicação centriolar num mesmo ciclo (LUKASIEWICZ;
LINGLE, 2009; TSOU et al., 2009).
17
FIGURA 4. CICLO DO CENTROSSOMO. O ciclo do centrossomo é caracterizado pela separação,
duplicação e desenvolvimento dos centríolos, e pela maturação e separação dos centrossomos. As
células iniciam a fase G1 com um centrossomo contendo um par de centríolos. No final da mitose ou
início de G1, as duas unidades de centríolos são separadas. A duplicação dos centríolos inicia-se na fase
S, caracterizada pela formação dos pró-centríolos na base de cada centríolo original. Cada pró-centríolo
permanece ligado ao centríolo original, impedindo a reduplicação dos centríolos. O completo
desenvolvimento do pró-centríolo ocorre durante o restante da fase S e G2 do ciclo celular. Ao final da
fase G2, a célula possui dois centrossomos com quatro centríolos. A separação dos centrossomos
inicia-se em G2, o que permite a migração dos centrossomos e a formação dos pólos do fuso mitótico.
Após a segregação cromossômica e citocinese, são geradas duas células-filhas, cada uma com um
centrossomo contendo um par de centríolos (centríolo original + pró-centríolo). Ao final da mitose,
início de G1, o ciclo do centrossomo inicia-se novamente com a separação das unidades de centríolos.
Fonte: Adaptado de NIGG (2006).
Alterações nos centrossomos ocorrem no estágio pré-maligno, antes do surgimento da instabilidade
cromossômica, podendo estas alterações ser importantes marcadores iniciais de transformação
neoplásica (LUKASIEWICZ; LINGLE, 2009). Pesquisa recente encontrou alterações nos centrossomos
18
de células da medula óssea de portadores de SMD antes da detecção de anormalidades cromossômicas.
Isso nos leva a acreditar que a instabilidade centrossômica é um evento precoce em SMD e pode
contribuir para anomalias citogenéticas e aneuploidia. Tal fato poderia, inclusive, contribuir para a
transformação leucêmica desta doença (NOLTE et al., 2013).
Percebe-se que existe uma interação entre o ciclo celular e a duplicação e separação dos centríolos,
garantindo a estabilidade genômica. Fusos mono ou multipolares, causados por alterações no número de
centrossomos podem levar a erros na segregação cromossômica, aneuploidia e surgimento de neoplasias
(LUKASIEWICZ; LINGLE, 2009). Tal fato foi demonstrado em carcinoma de células escamosas de
cabeça e pescoço (MONDAL et al., 2007).
Segundo metanálise que avaliou dados de microarranjos tissulares, foi identificado que o gene
CDC20, que codifica a proteína CDC20, é um dos mais comumente superexpressos em tecidos
indiferenciados de câncer humano (RHODES et al., 2004). Estudos comprovam sua superexpressão em
câncer pancreático (LI, D. et al., 2003), linhagens de células de câncer gástrico (KIM, J. M. et al., 2005),
de mama (YUAN et al., 2006) e em carcinoma oral de células escamosas (MONDAL et al., 2007).
Superexpressão da proteína CDC20 por análise imunoistoquímica de tumores de pulmão foi
associada a menor sobrevida em pacientes portadores de adenocarcinoma de pulmão quando comparados
à baixa expressão (KATO et al., 2012). O mesmo achado em biópsias de adenocarcinoma ductal
pancreático (expressão aumentada de CDC20) foi associado a baixo grau de diferenciação tumoral e
menor sobrevida livre de recorrência em 5 anos (CHANG, D. Z. et al., 2012). Neoplasias orais com
expressão aumentada de CDC20 possuem anormalidades na formação do fuso mitótico e aneuploidias
(MONDAL et al., 2007). Relação entre aumento na expressão de CDC20 e menor sobrevida (em
carcinomas de ovário) e maior grau de gliomas foi demonstrado por alguns pesquisadores (MARUCCI et
al., 2008; OUELLET et al., 2006).
Danos ao ponto de checagem mitótico, levando a perdas ou ganhos parciais na função de
checagem e/ou formação de fusos mitóticos anômalos, podem, portanto, levar à aneuploidia durante a
tumorigênese, o que confirma sua relevância clínica.
1.4.5. Proteínas relacionadas ao fuso mitótico
Assim como as proteínas associadas ao ponto de checagem mitótico, outras proteínas também
estão associadas à segregação inapropriada dos cromossomos durante a mitose. Recentemente, tem se
dado atenção especial a um grupo de proteínas da família das serina/treonina kinases, Aurora/Ipl1
Kinases Relacionadas (AIRKs), que está associado a regulação da duplicação dos centrossomos e
segregação dos cromossomos (TONG et al., 2004).
19
AURORA A e AURORA B são proteínas dessa família e foram associadas a várias neoplasias em
estudos prévios (CAMACHO et al., 2006; DE PAULA CARETA et al., 2012; HEGYI et al., 2012; KE
et al., 2003; LIN et al., 2010; VAGNARELLI; EARNSHAW, 2004; YE et al., 2009). O gene AURORA
A localiza-se no cromossomo 20q13.2-q13.3, uma região frequentemente amplificada em tumores
malignos humanos e alvo de deleções em SMD. AURORA A interage com múltiplas proteínas celulares
(p53, BRCA1 e TACC1) e aumentos em sua expressão resultam em falhas no processo mitótico,
incompleta citocinese, instabilidade genômica e aumento na frequência de aneuploidias (LI, J. J.; LI,
2006; TONG et al., 2004). A interação entre AURORA A e p53 leva à inibição ou degradação desta
última proteína. Fosforilação de p53 em Ser215 impede a ligação de p53 ao DNA, interferindo na
ativação transcricional de genes alvo, como p21 e PTEN. Ao fosforilar outro resíduo, a Ser315,
AURORA A direciona a ubiquitilação de p53 por Mdm2 e sua subsequente proteólise (LUKASIEWICZ;
LINGLE, 2009).
Embora o exato papel dessa proteína no desenvolvimento dos tumores ainda não esteja
totalmente elucidado, alguns autores (KE et al., 2003; MERALDI; HONDA; NIGG, 2002) mostraram
que sua superexpressão interfere na formação do CCM, mais especificamente, na interação CDC20-
BUBR1.
Outros estudos (LITTLEPAGE; RUDERMAN, 2002) sugeriram que AURORA A, quando
superexpressa, age suprimindo MAD2 e estimulando CDC20, sobrepondo o ponto de checagem
mitótico. Além disso, a superexpressão de AURORA A tem sido correlacionada com amplificação do
centrossomo, o que poderia prejudicar a formação do aparelho mitótico, ocasionando alterações
cromossômicas (HATA et al., 2005; MERALDI et al., 2002; TONG et al., 2004).
Amplificação e superexpressão de AURORA A têm sido demonstrados em vários tipos de
tumores humanos, incluindo SMD, câncer de mama, câncer hepatocelular, câncer de bexiga, tumor de
células germinativas, linfoma não-Hodgkin e câncer pancreático (BRIASSOULI et al., 2007;
HEREDIA; DE SOUSA; JUNIOR; et al., 2014; TONG et al., 2004).
A superexpressão de AURORA A interfere nos mecanismos de reparo do DNA, sobrevivência e
transformação celular, pela ativação de NFkB e inibição de IkB, inibidor do primeiro. Como
consequência desta ativação, ocorre expressão de Bcl-2, proteína antiapoptótica (BOLANOS-GARCIA,
2005; DUTERTRE; PRIGENT, 2003).
Amplificação dos centrossomos pode estar associada à superexpressão de AURORA A, sendo
esta definida pela presença de dois ou mais centrossomos por célula (ou quatro centríolos) ou pela
ocorrência de centrossomos de tamanho aumentado (Figura 5) (HATA et al., 2005; MERALDI et al.,
2002). É um fenômeno que ocorre comumente em tumores sólidos e neoplasias hematológicas
(LUKASIEWICZ; LINGLE, 2009).
20
FIGURA 5. AMPLIFICAÇÃO DOS CENTROSSOMOS DECORRENTE DE SUPEREXPRESSÃO DE
AURORA A. Sob condições biológicas normais, os centrossomos migram para as extremidades opostas
da célula, formando os pólos do fuso mitótico, que permitem a correta segregação dos cromossomos.
Superexpressão de AURORA A causa amplificação dos centrossomos e a formação de fuso multipolar,
que juntamente com a capacidade de sobreposição ao CCM, também proporcionada pela superexpressão
de AURORA A, resulta em instabilidade genética e tumorigênese. Fonte: Adaptado de WARNER et al.
(2003).
AURORA A é proteína que regula o processo de maturação dos centrossomos, que ocorre no
final da fase G2 e na prófase. Uma das consequências da superexpressão de AURORA A consiste na
perda na regulação da duplicação e maturação dos centrossomos, o que leva a geração de células com
número anormal destes elementos, os centrossomos multipolares, associados ou não, a falhas na
dinâmica do aparelho mitótico (LI, D. et al., 2003).
O surgimento de aneuploidias e a gênese de tumores podem decorrer, pois, da superexpressão de
AURORA A, já que o aumento na sua expressão gera amplificação dos centrossomos e sua ação se
destaca ao CCM (DEWAR et al., 2004; WARNER et al., 2003).
O gene AURORA B (17p13) codifica uma proteína que interage com INCENP (proteína interna
do centrômero), borealina e survivina, formando um complexo que, durante a prófase, localiza-se em
torno de todo o cromossomo e concentra-se no interior da região central do centrômero durante a
prometáfase (BOLANOS-GARCIA, 2005).
AURORA B tem sido associada à segregação cromossômica e citocinese, e sua atividade quinase
é necessária para a orientação bipolar e condensação dos cromossomos (DEWAR et al., 2004). Sua
superexpressão foi correlacionada a múltiplos defeitos na maquinaria mitótica, dentre os quais, perda da
conexão entre cinetócoro e microtúbulos, e finalização da mitose sem os eventos característicos da
anáfase ou citocinese (MURATA-HORI; TATSUKA; WANG, 2002; WANG, X. et al., 2002).
21
Função anormal da família de proteínas Aurora-quinases, incluindo AURORA B, pode resultar
em modificações complexas na regulação dos processos mitóticos. Sua expressão pode ser quantificada
por imunoistoquímica ou técnicas de reação em cadeia de polimerase (PCR) e aumentos ou diminuições
de sua expressão, parecem ser dependentes da taxa de proliferação celular (representada por marcadores
de proliferação celular bem estabelecidos) (HEGYI et al., 2012).
AURORA B age na liberação de cinetócoros não conectados corretamente aos microtúbulos. Esta
ação é realizada só após orientação bipolar dos cromossomos, ou seja, até que a tensão existente gerada
por esta orientação consiga afastar os cinetócoros da região interna do centrômero e da zona de
influência da AURORA B. Isso se faz pelo rompimento contínuo dos microtúbulos ligados ao cinetócoro
(CARMENA; RUCHAUD; EARNSHAW, 2009; VAGNARELLI; EARNSHAW, 2004).
A ligação incorreta de microtúbulos do fuso aos cromossomos é um evento relativamente comum
no início da mitose, e as células dispõem de mecanismos redundantes para corrigir esses erros. O ponto
de checagem mitótico (CCM) constitui um destes mecanismos de fiscalização, protelando o início da
anáfase até que todos os cromossomos estejam bi-orientados e sob tensão adequada. Esta, por si só,
regula a estabilidade da ligação dos microtúbulos, e quando ocorre ausência de tensão, AURORA B
começa a agir. Após o estado de bi-orientação dos cromossomos ser atingido, inicia-se a degradação de
ciclinas e outros substratos de CPA, após a cessação da ação do CCM. Com isso, a anáfase começa, pela
separação das cromátides-irmãs (CARMENA et al., 2009). Percebe-se que a inibição da atividade de
AURORA B nos cinetócoros é um dos mecanismos que ajuda na estabilidade da ligação entre
cinetócoros e microtúbulos (Figura 6).
22
FIGURA 6. DINÂMICA DAS PROTEÍNAS ENVOLVIDAS NA BIORIENTAÇÃO DOS
CROMOSSOMOS. AURORA B localiza-se na camada interna dos centrômeros nos cromossomos não
conectados aos microtúbulos (junto à proteína MCAK – Mitotic Centromere-Associated Kinesin),
mantendo fosforilação inibitória sobre MCAK. Após ligação dos microtúbulos e sob diferentes tensões, a
posição de MCAK se modifica e essa se aproxima da camada externa, que contém PP1 (Phosphoprotein
Phosphatase 1). PP1 desfosforila e ativa MCAK, que promove a despolimerização local dos
microtúbulos. A tensão exercida pela orientação bipolar afasta os cinetócoros da camada interna do
centrômero e da zona de influência de AURORA B. Fonte: Adaptado de DUCAT e ZHENG (2004).
AURKB induz modificações na cromatina, pela fosforilação das histonas H3 em Ser10,
necessárias para condensação e segregação cromossômicas (OTA et al., 2002). Esta fosforilação leva a
descondensação local da cromatina, facilitação da ligação de fatores que irão promover a condensação
dos cromossomos no final da fase G2 e início da mitose, além de inferferir na metilação de resíduos de
lisina 9 em H3 (H3K9). A metilação de K9 ocorre em regiões de heterocromatina constitutiva e está
envolvida no silenciamento epigenético de genes localizados na eucromatina. Os grupos H3K9 metilados
são reconhecidos pela proteína HP1 (proteína heterocromatina), a qual recruta histonas metiltransferases
e histonas deacetilases, levando a um aumento dessa metilação, da heterocromatização e do
silenciamento gênico (SABBATTINI et al., 2007; VERDAASDONK; BLOOM, 2011).
Dessa forma, falhas na segregação cromossômica podem ser um efeito causado pelas alterações
na condensação cromossômica (WEI et al., 1999) e a superexpressão de AURORA B pode interferir nos
mecanismos regulatórios da cromatina, levando a alterações epigenéticas (ativação/ silenciamento de
genes) e desenvolvimento do câncer.
Alteração na posição
de MCAK
Cromossomos biorientados
Cromossomo não ligado
ao microtúbulo
Ligação dos microtúbulos
sob tensões distintas
23
Estudos demonstraram que os níveis de AURORA B têm correlação com a agressividade dos
tumores, podendo ser utilizado como um fator prognóstico para carcinoma indiferenciado de tireóide
(SORRENTINO et al., 2005) e carcinoma de pulmão não pequenas células (VISCHIONI et al., 2006).
Aumento nas expressões proteicas de AURORA A E B são fenômenos iniciais na origem da
tumorigênese de neoplasias epiteliais malignas (TWU et al., 2009). Em neoplasias biliares, a
superexpressão simultânea de AURORA A E AURORA B (levando a uma desregulação na mitose) se
associou a pior sobrevida (SHEN et al., 2009). Hiperexpressão de AURORA-A e p53 constituem fatores
importantes para o surgimento de tumores uroteliais de trato urinário superior e podem predizer desfecho
clínico e presença de invasão vascular (SCARPINI et al., 2012). Alta expressão de AURORA B se
associou a baixa sobrevida global em neoplasia de células escamosas de cabeça e pescoço (ERPOLAT et
al., 2012).
Outros tumores associados à superexpressão de AURORA B são: carcinoma hepatocelular e
cervival, câncer gástrico, doenças linfoproliferativas e leucemias agudas (DE PAULA CARETA et al.,
2012; ENJOJI et al., 2009; HUANG et al., 2008; IKEZOE et al., 2009; LIN et al., 2010; LUCENA-
ARAUJO et al., 2011). Linfomas agressivos, como linfoma difuso de grandes células e linfoma de
Burkitt, mostraram expressão de AURORA B aumentada quando comparados com linfomas de baixo
grau em estudo prévio (IKEZOE et al., 2009). Outros autores (HUANG et al., 2008) também
demostraram elevada expressão de AURKA (66,3% dos casos) e AURKB (40,8% dos casos) em células
CD34+ de pacientes portadores de LMA de novo quando comparadas a doadores sadios. Aumentos na
expressão gênica ou expressão aberrante de AURKA e AURKB foram vistos em estudos realizados em
linhagens celulares de leucemia e células mononucleares de leucemia e portadores de SMD e LMA
(IKEZOE et al., 2009; LUCENA-ARAUJO et al., 2011; YE et al., 2009).
1.5. Análise histológica e imunoistoquímica em SMD
A análise histológica da medula óssea em portadores de SMD é de grande auxílio para seu
diagnóstico e classificação, principalmente nos casos de incerteza quanto ao grau de dispoese e/ou em
amostras contendo pequeno número de megacariócitos (que dificultam muito a detecção da presença de
dismegacariocitopoese) e amostras hipocelulares, à análise do mielograma. O diagnóstico de SMD
hipocelular só pode ser feito pela avaliação histológica da medula óssea. Ademais, não raramente, tais
pacientes apresentam citogenética normal, outro fator que dificulta o diagnóstico dessa patologia e
fortalece mais uma vez a importância da histologia medular, preferencialmente associada à análise
imunoistoquímica. O diagnóstico de SMD com fibrose medular, de síndromes de sobreposição e de
SMD associada à mastocitose são outras vantagens que a histologia nos permite (VALENT et al., 2012;
VALENT et al., 2010; VASSALO J., 2009).
24
Em relação à imunoistoquímica, a marcação do anticorpo CD34 nos permite identificar a presença
de precursores mieloides em localização anormal, os chamados ALIPs (abnormal localization of
immature precursors cells). A marcação CD61 é de grande auxílio para a identificação de megacarióticos
de tamanho pequeno, como os micromegacariócitos e megacarioblastos. Aliado à sua importância
diagnóstica, essa técnica consegue nos trazer informações acerca do prognóstico, sendo o principal
exemplo a análise da expressão de proteína p53. Estudos demonstraram que aumentos na expressão
proteica dessa proteína possuem correlação com a presença de mutação no gene TP53, alteração genética
sabidamente associada a piores desfechos, como resposta pobre à terapêutica. Pacientes portadores de
SMD com deleção 5q e de baixo risco ou intermediário-1 (classificação IPSS) possuem frequência de
mutação TP53 em 18% e a presença de marcação nuclear forte da proteína p53 (em ≥ 2% das células
medulares), pela análise por imunoistoquímica, foi encontrada na grande maioria dos pacientes com
mutação no gene TP53. Sendo assim, o grau de expressão de p53 pode fornecer informações acerca do
prognóstico desta doença pela associação entre sua superexpressão e a presença de mutações em seu
gene (JADERSTEN et al., 2011). A sensibilidade aceitável na predição da presença da mutação no gene
TP53 pela análise imunoistoquímica da proteína p53 nos encoraja para que a avaliação de sua expressão,
assim como de outras proteínas envolvidas no ciclo celular possa ser realizada rotineiramente nos
laboratórios de patologia.
Os mecanismos associados a anormalidades cromossômicas, o principal fator prognóstico em
SMD, necessitam de maiores estudos. Tal entendimento é relevante para se obter maior eficácia no
diagnóstico, tratamento e determinação do prognóstico desta neoplasia, a qual é considerada como o
câncer de maior prevalência na área da onco-hematologia.
Alterações na expressão de proteínas relacionadas ao ponto de checagem mitótico (MAD2 e
CDC20) e ao fuso mitótico (AURORA B) estão fortemente relacionadas à instabilidade cromossômica,
aneuploidia e progressão tumoral em diferentes tumores sólidos e neoplasias hematológicas. Dessa
forma, estudos avaliando suas imunoexpressões podem contribuir para a compreensão da fisiopatologia
da SMD, a qual é a doença clonal primária da medula óssea mais comum do mundo ocidental em
indivíduos com idade superior a 60 anos.
25
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Avaliar a imunoexpressão das proteínas envolvidas no mecanismo de ação do ponto de checagem
mitótico (MAD2 e CDC20) e do fuso mitótico (AURORA A e AURORA B) em pacientes portadores de
SMD.
2.2. Objetivos Específicos
1) Detectar a imunoexpressão de proteínas CDC20, MAD2, AURORA A e AURORA B na medula
óssea de pacientes com SMD e nas amostras controle (biópsias de medula óssea de pacientes com
diagnóstico de linfoma, coletadas para estadiamento, sem evidências de infiltração);
2) Verificar a frequência de expressão positiva das proteínas acima entre os grupos SMD e controle;
3) Comparar a expressão das proteínas estudadas em termos quantitativo (valores em %) e qualitativo
(expressão positiva versus negativa) entre os grupos SMD e controle;
4) Verificar a existência de possível associação entre o grau de expressão proteica (em termos
quantitativo e qualitativo) e variáveis clínicas e laboratoriais, em pacientes com diagnóstico de SMD.
26
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Seleção da amostra
O estudo foi retrospectivo, no qual foram incluídos 40 blocos de biópsia de medula óssea (BMO)
de pacientes de ambos os sexos, no período de Janeiro de 2008 a Janeiro de 2014, provenientes do
Ambulatório de SMD do HUWC/UFC com diagnóstico confirmado de SMD.
Todos os pacientes foram previamente submetidos ao protocolo de exclusão (MAGALHÃES;
LORAND-METZE, 2004), no qual foram excluídas as seguintes condições (potenciais causas de
displasia medular): deficiências nutricionais (vitamina B12 e ácido fólico); exposição recente a agentes
tóxicos (metais pesados, benzeno e derivados do petróleo); exposição recente a drogas citotóxicas e
fatores de crescimento; disfunções endócrinas; etilismo; disfunções metabólicas (doença hepática
crônica, insuficiência renal; doenças inflamatórias crônicas; infecções virais, como HIV, hepatites,
CMV, toxoplasmose, parvovírus B19); e doenças autoimunes.
O levantamento dos prontuários foi feito de acordo com o formulário de coleta de dados (Anexo 1)
e, após esse procedimento, foram selecionados os participantes que preencheram os critérios de inclusão.
Após seleção dos prontuários, foram obtidos os blocos de BMO dos pacientes (estas coletadas no
momento do diagnóstico) e dos controles para realização de imunoistoquímica. Os chefes do
departamento de Patologia e do SAME foram informados sobre os objetivos e metodologia da pesquisa,
tendo os mesmos concordado com o estudo (vide Anexos 2 e 3, respectivamente). Os critérios de
inclusão e exclusão utilizados no presente estudo estão descritos na Tabela 2.
Como grupo controle, foram incluídas dez amostras de BMO, obtidas para estadiamento de
linfomas não Hodgkin, de pacientes de ambos os sexos, com idade variando de 24 a 81 anos,
provenientes de dois laboratórios privados, cujos resultados mostraram ausência de infiltração pela
doença.
27
TABELA 2. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO
Critérios de inclusão Critérios de exclusão
Ter realizado os exames investigativos na
medula óssea (mielograma, biópsia de medula
óssea e citogenética);
Ter diagnóstico confirmado de SMD.
Amostras de pacientes com idade menor do que
18 anos de idade;
Amostras de pacientes que apresentem alguma
condição clínica presente no protocolo de
exclusão.
3.2. Imunoistoquímica
As reações de imunoistoquímica foram realizadas no Laboratório de Patologia Labtech (Fortaleza,
CE), de acordo com as instruções dos fabricantes dos respectivos reagentes para pesquisa de expressão
das proteínas CDC20, MAD2 e AURORA A e AURORA B.
Os cortes dos blocos de parafina foram submetidos inicialmente à análise histopatológica pela
coloração de HE (hematoxilina-eosina). As lâminas foram desparafinizadas em xilol e desidratadas em
álcool. A recuperação antigênica foi realizada em sistema de alta pressão em solução de citrato de sódio
10 mM em pH específico e a peroxidase endógena foi bloqueada em solução de peróxido de hidrogênio
3%. As amostras foram incubadas com os anticorpos específicos (anticorpos primários) e submetidas
ao sistema de detecção DAKO (ADVANCE TM
HP) e ao substrato cromogênico
DAB (3,3’ Diaminobenzidine Tetrahydrochloride). Em seguida, as amostras foram contracoradas em
hematoxilina e lavadas. Por fim, as mesmas foram desidratadas em etanol e xilol, sendo, posteriormente,
realizada a montagem das lâminas (Anexo 4).
A Tabela 3 mostra as características dos reagentes utilizados com as respectivas diluições.
TABELA 3. CARACTERIZAÇÃO DOS ANTICORPOS UTILIZADOS
ANTICORPO FABRICANTE TÍTULO CATÁLOGO
MAD2 Atlas 1:50 HPA003348
CDC20 Abcam 1:200 ab86104
AURORA A Abcam 1:100 ab52973
AURORA B Epytomics 1:1000 EP1009Y
28
3.3. Interpretação da imunoistoquímica
A leitura de todas as reações (pacientes e controles) foi realizada por dois patologistas de forma
independente e cega. As amostras foram avaliadas de forma qualitativa e desse modo, divididas em
amostras com resultado positivo, quando houve alguma marcação celular ou resultado negativo, na
ausência de marcação. Além disso, as amostras foram submetidas a análise quantitativa, (pela avaliação
de 10 campos no aumento de 400 vezes) (ZHANG, X.; WANG; WANG, 2013), sendo as expressões
proteicas expressas quantitativamente pela porcentagem do número de células marcadas, em relação ao
número total de células. As amostras da leitura quantitativa, com resultados positivos, foram, então,
divididas em grupos, definidos de acordo com o valor percentual das células marcadas, abaixo descritos
(KATO et al., 2012):
Expressão leve: marcação em menos de 10% das células;
Expressão moderada: marcação em 10 a 49% das células;
Expressão alta: marcação em ≥ 50% das células.
A coloração considerada positiva foi citoplasmática para as proteínas MAD2 e AURORA A e
nuclear para CDC20 e AURORA B (CHANG, D. Z. et al., 2012; ERPOLAT et al., 2012; LIANG et al.,
2012; WANG, L. et al., 2009).
Os controles internos negativos das reações foram realizados com reações sem os anticorpos
primários e os positivos com secções de tecidos indicados de acordo com as instruções do fabricante de
cada anticorpo.
Após leitura das reações, foram realizadas análises comparativas das expressões proteicas entre as
amostras do estudo e os controles. Entre os portadores de SMD, as seguintes características clínicas e
laboratoriais foram analisadas para pesquisa de associação entre estas e as expressões proteicas: sexo,
idade ao diagnóstico, origem, número de citopenias ao hemograma, número de displasias e % de blastos
ao mielograma, celularidade da medula óssea à histologia, dependência transfusional, citogenética,
evolução clínica, classificação OMS e IPSS. Foi realizada, também, análise do tempo de sobrevida dos
pacientes portadores de SMD de acordo com a expressão qualitativa (positiva versus negativa) e
quantitativa das proteínas do estudo.
As citopenias foram definidas de acordo com a classificação IPSS, considerando-se quando:
Hb < 10,0 g/dL, neutrófilos < 1.800/mm3 ou plaquetas < 100.000/mm
3 (GREENBERG, P. et al., 1997).
29
A celularidade da medula óssea foi analisada de acordo com a idade e classificada como descrito na
Tabela 4 (ALVES, 2009).
TABELA 4. CELULARIDADE DA MEDULA ÓSSEA DE ACORDO COM A IDADE
Idade (anos) Celularidade da medula óssea
Normocelular Hipercelular Hipocelular
18 - 35 > 50% > 70% < 50%
36 - 60 em torno de 50% > 60% < 40%
> 60 em torno de 40% > 40% < 30%
Fonte: Adaptado de ALVES (2009).
Cariótipo normal é definido na presença de 46 cromossomos (22 pares autossômicos e 1
par alossômico sexual), sendo 46,XX para o sexo feminino e 46,XY para o masculino. Cariótipo
complexo foi definido conforme a classificação IPSS (1997). Frente a um número diferente de 46
cromossomos à análise citogenética, temos uma situação de aneuploidia, que pode ser poliploidia (mais
do que 46 cromossosmos) ou hipoploidia (abaixo de 46 cromossomos).
A dependência transfusional foi considerada quando Hb < 9,0 g/dL em homens e < 8,0 g/dL em
mulheres (MALCOVATI et al., 2011).
3.4. Análise estatística
A amostra foi limitada ao número de pacientes incluídos durante o levantamento, obedecendo aos
critérios de inclusão e exclusão. Os dados foram expressos em média e desvio padrão ou mediana e
variação no caso de variáveis contínuas, conforme apropriado. Os dados categóricos estão descritos
como número absoluto e porcentual do total.
Para determinação da normalidade das variáveis estudadas, foi aplicado o teste de
Kolmogorov-Smirnov. Identificou-se que o grau de expressão (em %) das três proteínas avaliadas
(MAD2, CDC20 e AURORA A e AURORA B) assumiu distribuição não normal. O grau de expressão
proteica foi analisado tanto do ponto de vista quantitativo como qualitativo.
Para a comparação da intensidade de expressão das proteínas conforme as seguintes variáveis
categóricas (grau de celularidade da MO, número de displasias, dependência transfusional, IPSS – risco,
30
grau e número de citopenias, normalidade ou não do cariótipo, complexidade da citogenética, % de
blastos < ou ≥ 5 e óbito), utilizou-se o teste de Mann-Whitney ou de Kruskal-Wallis, quando apropriado.
O grau de expressão proteica (em %) também foi categorizado em três diferentes grupos
(< 10%, 10-49% e ≥ 50%), com as proporções entre os mesmos comparadas conforme as variáveis
categóricas descritas acima. Para essa análise comparativa, foi aplicado o teste do Qui-quadrado,
calculando-se os resíduos ajustados, quando apropriado. Nas situações em que se detectaram variáveis
com frequência esperada inferior a 5, aplicou-se o Teste Exato de Fischer.
A comparação entre a expressão proteica, do ponto de vista qualitativo (expressão positiva versus
negativa) com as diferentes variáveis categóricas analisadas foi conduzida de modo semelhante ao
descrito no parágrafo anterior.
A sobrevida global, de acordo com os diferentes graus de expressão proteica (análise qualitativa e
quantitativa), foi avaliada pelo teste de Kaplan-Meier. Para a comparação das curvas de sobrevida,
aplicou-se o teste de Log-Rank.
O pacote estatístico utilizado foi o SPSS 22.0®
(Chicago, IL, USA). O nível de significância
estatística foi definido em 5% para todos os testes (p<0,05).
3.5 Aspectos Éticos
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Walter
Cantídio. CEP Nº 10794913.2.0000.5045.
31
4. RESULTADOS
4.1. Características epidemiológicas, clínicas e laboratoriais dos pacientes
Dos 40 pacientes incluídos no estudo, a vasta maioria (92,5%) foi classificada como SMD
primária. A idade média dos pacientes foi 57,8 ± 20,2 anos. Observou-se distribuição homogênea (50%
dos casos) entre os sexos e a faixa etária (> 60 anos e ≤ 60 anos). A maioria era proveniente de zona
urbana e não apresentava histórico de exposição a agentes mielotóxicos à anamnese. À análise da biópsia
de medula óssea, dezoito pacientes (47,4%) mostraram medula hipercelular e à análise do sangue
periférico, 23 pacientes (57,5%) apresentavam duas ou três citopenias. Houve dependência transfusional
em 17 pacientes (43,6%) e dez (25,0%) evoluíram para óbito durante o período do estudo (Quadro 3).
O subtipo predominante, de acordo com a classificação da OMS para SMD, foi o grupo CRDM
(41%, n = 16), seguido pelos subtipos ARSA, CRDU e SMD-U (12,8%, n = 5) (Quadro 3 e Figura 7).
Segundo estratificação pelo IPSS (1997), a maioria dos pacientes foi incluída nos grupos de menor risco,
sendo 30% (n = 9) de baixo risco e 53,3% (n = 16) de risco intermediário I (Quadro 3 e Figura 8).
Apenas três pacientes foram classificados como SMD secundária. Neste grupo, a maioria
apresentou apenas uma ou nenhuma citopenia, todos eram do sexo feminino, provenientes de zona rural
e apresentaram medula óssea hipocelular. Destes, dois pacientes haviam se submetido à quimioterapia e
um fez uso de imunossupressor (azatioprina).
A maior parte dos pacientes apresentou citopenias menos graves, resultados citogenéticos não
aneuploide e não complexo, com 51,5% dos casos (n= 17) classificados como de prognóstico favorável
pelo IPSS (dentre 33 casos com metáfases). Apenas nove pacientes (25%) apresentaram uma única
displasia isolada (Quadro 4). As figuras 9 e 10 mostram a frequência de cariótipos normais e alterados e
classificação prognóstica pelo IPSS, respectivamente.
32
QUADRO 3. CARACTERÍSTICAS CLÍNICO-EPIDEMIOLÓGICAS DOS PACIENTES PORTADORES
DE SMD (N = 40)
* De acordo com MALCOVATI et al. (2011).
Idade
Média (anos)
Mediana
≤ 60 anos
> 60 anos
57,8 ± 20,2
59,5 (18-91)
20 (50,0%)
20 (50,0%)
Sexo
Masculino
Feminino
20 (50,0%)
20 (50,0%)
Origem
Zona Rural
Zona Urbana
15 (38,5%)
24 (61,5%)
Exposição a mielotóxicos
Sim
Não
12 (31,6%)
26 (68,4%)
Celularidade da MO
Normocelular 9 (23,7%)
Hipocelular 11 (28,9%)
Hipercelular 18 (47,4%)
Número de citopenias
0/1
2/3
17 (42,5%)
23 (57,5%)
Distribuição OMS (2008)
CRDU
ARSA
CRDM
AREB I
AREB II
SMD inclassificável
SMD 2ária
5 (12,8%)
5 (12,8%)
16 (41,0%)
2 (5,1%)
3 (7,7%)
5 (12,8%)
3 (7,7%)
Dependência transfusional*
Sim
Não
17 (43,6%)
22 (56,4%)
IPSS
Baixo Risco
Intermediário 1 (Int-1)
Intermediário 2 (Int-2)
Alto Risco
9 (30,0%)
16 (53,3%)
4 (13,3%)
1 (3,3%)
Evolução
Óbito
Em tratamento
10 (25,0%)
30 (75,0%)
33
QUADRO 4. CARACTERIZAÇÃO DAS CITOPENIAS E DA CITOGENÉTICA DOS PACIENTES
PORTADORES DE SMD (N = 40)
Caracterização das citopenias
Hemoglobina < 8,0 g/dL
Hemoglobina ≥ 8,0 g/dL
14 (35,9%)
25 (64,1%)
24 (63,2%) Neutrófilos < 800/mm3
Neutrófilos ≥ 800/mm3
8 (20,5%)
31 (77,5%)
Plaquetas < 50.000/mm3
Plaquetas ≥ 50.000/mm3
12 (30,8%)
27 (69,2%)
Número de displasias
Uma displasia 9 (25,0%)
Duas displasias 12 (33,3%)
Três displasias 15 (41,7%)
Caracterização citogenética
Complexidade
Complexo
Não complexo
5 (15,2%)
28 (84,8%)
Normalidade
Normal
Anormal
16 (48,5%)
17 (51,5%)
Ploidia
Euploide
Aneuploide
22 (66,7%)
11 (33,3%)
Prognóstico - IPSS
Favorável
Intermediário
Desfavorável
17 (51,5%)
9 (27,3%)
7 (21,2%)
34
FIGURA 7. DISTRIBUIÇÃO DOS PACIENTES DO GRUPO SMD DE ACORDO COM A
CLASSIFICAÇÃO DA OMS.
FIGURA 8. DISTRIBUIÇÃO DOS PACIENTES DO GRUPO SMD DE ACORDO COM O IPSS (1997).
35
FIGURA 9. DISTRIBUIÇÃO DOS PACIENTES DO GRUPO SMD DE ACORDO COM O RESULTADO
DA CITOGENÉTICA.
FIGURA 10. DISTRIBUIÇÃO DO RESULTADO DA CITOGENÉTICA DOS PACIENTES DO GRUPO
SMD DE ACORDO COM A CLASSIFICAÇÃO PROGNÓSTICA DO CARIÓTIPO PELO IPSS (1997).
36
4.2. Expressão proteica
4.2.1. Expressão qualitativa no grupo SMD
Nessa análise, as amostra foram divididas em dois grupos de acordo com a presença ou ausência
de expressão proteica (marcação positiva versus negativa). Observou-se predomínio de expressão
positiva entre as proteínas MAD2 (87,5%, n = 35) e CDC20 (82,5%, n = 33), enquanto que a maioria dos
pacientes apresentou expressão negativa para AURORA A (64,7%, n = 22) e AURORA B (67,5%,
n = 27), como mostrado no Quadro 5.
Avaliou-se a média com respectivo desvio-padrão de variáveis clínicas conforme a expressão
proteica qualitativa de cada uma das quatro proteínas analisadas. As associações entre os dois grupos
também foram comparadas em relação a parâmetros demográficos (idade, sexo e origem), clínicos
(presença ou ausência de dependência transfusional, evolução para óbito), laboratoriais (número e grau
de citopenias, número de displasias, porcentagem de blastos na medula óssea, celularidade da medula
óssea, citogenética) e classificação IPSS (risco alto e baixo risco). A análise citogenética incluiu
avaliação de normalidade, complexidade, ploidia e classificação prognóstica pelo IPSS (favorável,
intermediário, desfavorável).
QUADRO 5. FREQUÊNCIA EM % DE EXPRESSÃO POSITIVA E NEGATIVA DE MAD2, CDC20,
AURORA B E AURORA A EM PACIENTES PORTADORES DE SMD
* Em se tratando da análise da AURORA A, foram avaliadas trinta e quatro pacientes no grupo SMD,
pois não foi possível a obtenção de seis blocos por problemas estruturais dos laboratórios envolvidos.
4.2.1.1. MAD2
Os resultados da análise comparativa entre pacientes com expressão positiva e negativa para a
proteína MAD2 encontram-se nos Quadros 6 e 7, assim como seus respectivos níveis de significância.
PROTEÍNAS EXPRESSÃO QUALITATIVA
EXPRESSÃO NEGATIVA EXPRESSÃO POSITIVA
MAD2 (n = 40) 5 (12,5%) 35 (87,5%)
CDC20 (n = 40) 7 (17,5%) 33 (82,5%)
AURORA B (n = 40) 27 (67,5%) 13 (32,5%)
AURORA A (n = 34*) 22 (64,7%) 12 (35,3%)
37
QUADRO 6. IDADE, GRAU DE CITOPENIAS E PORCENTAGEM DE BLASTOS, CONFORME
EXPRESSÃO POSITIVA VERSUS NEGATIVA DA PROTEÍNA MAD2
Característica
(média ± DP)
Expressão Proteica (MAD2)
n = 40 p
Expressão Negativa (n = 5) Expressão positiva (n = 35)
Idade (anos) 65,0 ± 11,1 56,8 ± 21,0 0,326
Grau de citopenias
Hemoglobina (g/dL)
Neutrófilos (nº/mm3)
Plaquetas (nº/mm3)
8,9 ± 3,1
919 ± 380
63.400 ± 36.211
9,1 ± 3,0
2.108 ± 1.744
168.591 ± 163.707
0,984
0,223
0,257
% de blastos 2,4 ± 2,5 2,1 ± 3,8 0,529
38
QUADRO 7. VARIÁVEIS CLÍNICAS, LABORATORIAIS E CLASSIFICAÇÃO IPSS CONFORME
EXPRESSÃO POSITIVA VERSUS NEGATIVA DA PROTEÍNA MAD2
VARIÁVEL
MAD2
p Expressão
Negativa
(n = 5)
Expressão
Positiva
(n = 35)
Sexo Masculino 3 (60,0%) 17 (48,6%)
0,633 Feminino 2 (40,0%) 18 (51,4%)
Origem - zona Rural 2 (40,0%) 13 (38,2%)
0,940 Urbana 3 (60,0%) 21 (61,8%)
Biópsia-celularidade
Normocelular 1 (20,0%) 8 (24,2%)
0,239 Hipocelular 3 (60,0%) 8 (24,2%)
Hipercelular 1 (20,0%) 17 (51,5%)
Cariótipo-complexidade Não complexo 3 (100,0%) 25 (83,3%)
0,443 Complexo 0 5 (16,7%)
Cariótipo-normalidade Normal 3 (100,0%) 13 (43,3%)
0,061 Alterado 0 17 (56,7%)
Citogenética-prognóstico
Favorável 2 (66,7%) 15 (50,0%)
0,640 Intermediário 1 (33,3%) 8 (26,7%)
Desfavorável 0 7 (23,3%)
Citogenética-ploidia Euploidia 3 (100,0%) 19 (63,3%)
0,534 Aneuploidia 0 11 (36,7%)
Número de displasias
Uma 1 (20,0%) 8 (25,8%)
0,933 Duas 2 (40,0%) 10 (32,3%)
Três 2 (40,0%) 13 (41,9%)
Número de citopenias Zero ou uma 0 17 (48,6%) 0,040
Duas ou três 5 (100,0%) 18 (51,4%)
Hemoglobina < 8,0 g/dL Sim 1 (20,0%) 13 (38,2%)
0,636 Não 4 (80,0%) 21 (61,8%)
Neutrófilos < 800/mm3
Sim 2 (40,0%) 6 (17,6%) 0,268
Não 3 (60,0%) 28 (82,4%)
Plaquetas < 50.000/mm3
Sim 2 (40,0%) 10 (29,4%) 0,634
Não 3 (60,0%) 24 (70,6%)
Blastos < 5% Sim 4 (80,0%) 29 (87,9%)
0,527 Não 1 (20,0%) 4 (12,1%)
IPSS Baixo risco + INT1 3 (100,0%) 22 (81,5%)
0,414 INT2 + Alto risco 0 5 (18,5%)
Dependência transfusional Não 4 (80,0%) 18 (52,9%)
0,363 Sim 1 (20,0%) 16 (47,1%)
Óbito Não 5 (100,0%) 25 (71,4%)
0,306 Sim 0 10 (28,6%)
39
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Expressão Positiva Expressão Negativa
Citopenias 0/1
Citopenias 2/3
Cem por cento dos pacientes do grupo com expressão negativa apresentaram cariótipo normal
(não complexo e não aneuploide) (n = 3), a maioria (66,7%, n = 2) pertencendo ao grupo de citogenética
favorável pelo IPSS. Nenhum paciente desse grupo evoluiu para óbito no período do estudo (n = 5).
Além disso, mais de 50% desses pacientes apresentaram citopenias menos graves, < 5% de blastos,
foram classificados como baixo risco pelo IPSS e não tinham dependência transfusional. Todos (n = 5)
apresentaram duas ou três citopenias ao hemograma. Em 60% desses pacientes (n = 3), observou-se
medula óssea hipocelular.
O grupo de pacientes com expressão positiva apresentou maior frequência de cariótipo alterado
(56,7%, n = 17), maior frequência de citogenética não aneuploide (63,3%, n = 19), sendo 50% (15
pacientes) pertencentes ao grupo de cariótipo favorável pelo IPSS. Dezessete pacientes (51,5%)
apresentaram medula óssea hipercelular. As citopenias foram de menor intensidade, sendo que 48,6%
(17 pacientes) apresentaram uma ou nenhuma citopenia. Treze pacientes (41,9%) apresentaram três
displasias, e 87,9% (29 pacientes) tinham menos de 5% de blastos na medula óssea.
A frequência de pacientes com duas ou três citopenias foi significativamente maior no grupo com
expressão negativa (p=0,040, Qui-quadrado - Figura 11). Foi observada uma tendência a um maior
número de casos com citogenética alterada no grupo de pacientes com expressão positiva em
comparação ao grupo com expressão negativa (p=0,061, Qui-quadrado - Figura 12).
FIGURA 11. GRÁFICO EM BARRAS MOSTRANDO A PORCENTAGEM DE CASOS DE
CITOPENIAS (0/1 VERSUS 2/3) NO GRUPO SMD COM EXPRESSÃO POSITIVA OU NEGATIVA DA
PROTEÍNA MAD2 (p = 0,040).
40
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Expressão Positiva Expressão Negativa
Citogenética Normal
Citogenética Alterada
FIGURA 12. GRÁFICO EM BARRAS MOSTRANDO A PORCENTAGEM DE CASOS DE
CITOGENÉTICA NORMAL E ALTERADA NO GRUPO SMD COM EXPRESSÃO POSITIVA OU
NEGATIVA DA PROTEÍNA MAD2 (p = 0,061).
41
4.2.1.2. CDC20
Os resultados da análise comparativa entre pacientes com expressão positiva e negativa para a
proteína CDC20 encontram-se nos Quadros 8 e 9, assim como seus níveis de significância.
QUADRO 8. IDADE, GRAU DE CITOPENIAS E PORCENTAGEM DE BLASTOS, CONFORME
EXPRESSÃO POSITIVA VERSUS NEGATIVA DA PROTEÍNA CDC20
Característica
(média ± DP)
Expressão Proteica (CDC20)
n = 40 p
Expressão Negativa (n = 7) Expressão Positiva (n = 33)
Idade (anos) 61,7 ± 12,1 57,0 ± 21,5 0,728
Grau de citopenias
Hemoglobina (g/dL)
Neutrófilos (nº/mm3)
Plaquetas (nº/mm3)
9,2 ± 2,8
1.352 ± 1.091
60.700 ± 65.948
9,1 ± 3,0
2.065 ± 1.755
172.269 ± 163.261
0,955
0,635
0,039
% de blastos 1,9 ± 3,4 2,2 ± 3,7 0,544
42
QUADRO 9. VARIÁVEIS CLÍNICAS, LABORATORIAIS E CLASSIFICAÇÃO IPSS CONFORME
EXPRESSÃO POSITIVA VERSUS NEGATIVA DA PROTEÍNA CDC20
VARIÁVEL
CDC20
p Expressão
Negativa
(n = 7)
Expressão
Positiva
(n = 33)
Sexo Masculino 5 (71,4%) 15 (45,5%)
0,407 Feminino 2 (28,6%) 18 (54,5%)
Origem – Zona Rural 2 (33,3%) 13 (39,4%)
0,779 Urbana 4 (66,7%) 20 (60,6%)
Biópsia-celularidade
Normocelular 2 (33,3%) 7 (21,9%)
0,732 Hipocelular 2 (33,3%) 9 (28,1%)
Hipercelular 2 (33,3%) 16 (50,0%)
Cariótipo-complexidade Não complexo 4 (80,0%) 24 (85,7%)
0,743 Complexo 1 (20,0%) 4 (14,3%)
Cariótipo-normalidade Normal 2 (40,0%) 14 (50,0%)
0,680 Alterado 3 (60,0%) 14 (50,0%)
Citogenética-prognóstico
Favorável 2 (40,0%) 15 (53,6%)
0,777 Intermediário 2 (40,0%) 7 (25,0%)
Desfavorável 1 (20,0%) 6 (21,4%)
Citogenética-ploidia Euploidia 2 (40,0%) 20 (71,4%)
0,304 Aneuploidia 3 (60,0%) 8 (28,6%)
Número de displasias
Uma 1 (16,7%) 8 (26,7%)
0,852 Duas 2 (33,3%) 10 (33,3%)
Três 3 (50,0%) 12 (40,0%)
Número de citopenias Zero ou uma 1 (14,3%) 16 (48,5%)
0,205 Duas ou três 6 (85,7%) 17 (51,5%)
Hemoglobina < 8,0 g/dL Sim 2 (33,3%) 12 (36,4%)
0,887 Não 4 (66,7%) 21 (63,6%)
Neutrófilos < 800/mm3
Sim 2 (33,3%) 6 (18,2%) 0,583
Não 4 (66,7%) 27 (81,8%)
Plaquetas < 50.000/mm3
Sim 4 (66,7%) 8 (24,2%) 0,038
Não 2 (33,3%) 25 (75,8%)
Blastos < 5% Sim 5 (83,3%) 28 (87,5%)
0,782 Não 1 (16,7%) 4 (12,5%)
IPSS Baixo risco + INT1 4 (100,0%) 21 (80,8%)
0,337 INT2 + Alto risco 0 5 (19,2%)
Dependência transfusional Não 3 (50,0%) 19 (57,6%)
0,731 Sim 3 (50,0%) 14 (42,4%)
Óbito Não 4 (57,1%) 26 (78,8%)
0,338 Sim 3 (42,9%) 7 (21,2%)
43
O Quadro 8 mostra os resultados nos grupos com expressão positiva e negativa em relação à
variáveis numéricas (média ± DP), que incluem idade, níveis de hemoglobina, contagem de neutrófilos e
plaquetas e porcentagem de blastos. O grupo com expressão negativa apresentou contagem plaquetária
significativamente menor, em comparação ao grupo com expressão positiva (p = 0,039, Mann-Whitney -
Figura 13). Não houve diferenças entre os grupos em relação às outras variáveis analisadas.
FIGURA 13. CONTAGEM PLAQUETÁRIA ENTRE OS PACIENTES DO GRUPO SMD NO
MOMENTO DO DIAGNÓSTICO CONFORME EXPRESSÃO POSITIVA OU NEGATIVA DA
PROTEÍNA CDC20 (p = 0,039).
No Quadro 9, no grupo com expressão negativa, temos resultado anormal e aneuploide de
citogenética em três pacientes (60%), sendo que apenas um deles (20%) foi classificado como cariótipo
desfavorável pelo IPSS. Cinquenta por cento (3 pacientes) apresentaram três displasias à análise medular
e 85,7% (6 pacientes) duas ou três citopenias, sendo de menor intensidade em relação aos níveis de
hemoglobina e neutrófilos. A maioria dos casos (66,7%, n = 4) apresentou contagem plaquetária abaixo
de 50.000/mm3, mostrando esse parâmetro, diferença estatística em comparação ao grupo com expressão
positiva (p = 0,038, Qui-quadrado - Figura 14). Todos os pacientes desse grupo (n = 4) foram
classificados como baixo risco pelo IPSS. Três pacientes (50%) tinham dependência transfusional e três
(42,9%) faleceram no período do estudo.
44
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Expressão Positiva Expressão Negativa
Plaquetas < 50.000/mm3
Plaquetas ≥ 50.000/mm3
No grupo constituído por pacientes com expressão positiva, temos que dezesseis pacientes (50%)
tiveram medula óssea hipercelular, três displasias em 40% (12 pacientes) e < 5% de blastos em 87,5%
dos casos (28 pacientes). A análise citogenética mostrou que metade dos casos (14 pacientes) apresentou
resultado normal, 85,7% sendo não complexo (n = 24), 71,4% não aneuploide (n = 20) e 53,6% (n = 15)
classificados como bom prognóstico pelo IPSS. Dezesseis pacientes (48,5%) tiveram zero ou uma
citopenia e 51,5% (n = 17), duas ou três. A minoria dos pacientes apresentou Hb < 8g/dL e
neutrófilos < 800/mm3, sendo 36,4% (n = 12) e 18,2% (n = 6), respectivamente. Em relação às plaquetas,
75,8% dos pacientes desse grupo (n = 25) apresentaram plaquetas ≥ 50.000/mm3. O IPSS foi de baixo
risco em 80,8% dos casos (n = 21). Houve dependência transfusional em 42,4% dos casos (n = 14). Seis
pacientes (18,2%) dos pacientes evoluíram para óbito durante o período referente ao estudo.
FIGURA 14. GRÁFICO EM BARRAS MOSTRANDO A PORCENTAGEM DE PACIENTES COM
CONTAGEM PLAQUETÁRIA < 50.000/mm3 E ≥ 50.000/mm
3 NO GRUPO SMD CONFORME
EXPRESSÃO POSITIVA OU NEGATIVA DA PROTEÍNA CDC20 (p = 0,038).
45
4.2.1.3. AURORA B
Os resultados da análise comparativa entre pacientes com expressão positiva e negativa para a
proteína AURORA B encontram-se nos Quadros 10 e 11, assim como seus respectivos níveis de
significância.
QUADRO 10. IDADE, GRAU DE CITOPENIAS E PORCENTAGEM DE BLASTOS, CONFORME
EXPRESSÃO POSITIVA VERSUS NEGATIVA DA PROTEÍNA AURORA B.
Característica
(média ± DP)
Expressão Proteica (AURORA B)
n = 40 p
Expressão Negativa (n = 27) Expressão Positiva (n = 13)
Idade (anos) 57,8 ± 18,1 58,0 ± 24,8 0,887
Grau de citopenias
Hb (g/dL)
Neutrófilos (nº/mm3)
Plaquetas (nº/mm3)
9,5 ± 3,1
1.846 ± 1.635
152.707 ± 148.486
8,4 ± 2,7
2.175 ± 1.810
159.900 ± 179.405
0,268
0,803
0,691
% de blastos 1,6 ± 2,7 3,1 ± 5,0 0,359
p= 0,011
46
QUADRO 11. VARIÁVEIS CLÍNICAS, LABORATORIAIS E CLASSIFICAÇÃO IPSS CONFORME
EXPRESSÃO POSITIVA VERSUS NEGATIVA DA PROTEÍNA AURORA B
Variável
AURORA B
p Expressão
Negativa
(n = 27)
Expressão
Positiva
(n = 13)
Sexo Masculino 14 (51,9%) 6 (46,2%)
0,736 Feminino 13 (48,1%) 7 (53,8%)
Origem - Zona Rural 8 (30,8%) 7 (53,8%)
0,185 Urbana 18 (69,2%) 6 (46,2%)
Biópsia-celularidade
Normocelular 7 (26,9%) 2 (16,7%)
0,776 Hipocelular 7 (26,9%) 4 (33,3%)
Hipercelular 12 (46,2%) 6 (50,0%)
Cariótipo-complexidade Não complexo 16 (80,0%) 12 (92,3%)
0,625 Complexo 4 (20,0%) 1 (7,7%)
Cariótipo-normalidade Normal 10 (50,0%) 6 (46,2%)
0,829 Alterado 10 (50,0%) 7 (53,8%)
Citogenética - prognóstico
Favorável 9 (45,0%) 8 (61,5%)
0,638 Intermediário 6 (30,0%) 3 (23,1%)
Desfavorável 5 (25,0%) 2 (15,4%)
Citogenética - ploidia Euploidia 13(65,0%) 9 (69,2%)
0,801 Aneuploidia 7 (35,0%) 4 (30,8%)
Número de displasias
Uma 7 (28,0%) 2 (18,2%)
0,577 Duas 9 (36,0%) 3 (27,3%)
Três 9 (36,0%) 6 (54,5%)
Número de citopenias Zero ou uma 11 (40,7%) 6 (46,2%)
0,746 Duas ou três 16 (59,3%) 7 (53,8%)
7 (53,8%) Hemoglobina < 8,0 g/dL
Sim 8 (30,8%) 6 (46,2%) 0,482
Não 18 (69,2%) 7 (53,8%)
Neutrófilos < 800/mm3
Sim 5 (19,2%) 3 (23,1%) 0,779
Não 21 (80,8%) 10 (76,9%)
Plaquetas < 50.000/mm3
Sim 7 (26,9%) 5 (38,5%) 0,486
Não 19 (73,1%) 8 (61,5%)
Blastos < 5% Sim 23 (88,5%) 10 (83,3%)
0,643 Não 3 (11,5%) 2 (16,7%)
IPSS Baixo risco + INT1 15 (83,3%) 10 (83,3%)
1,000 INT2 + Alto risco 3 (16,7%) 2 (16,7%)
Dependência transfusional Não 17 (65,4%) 5 (38,5%)
0,172 Sim 9 (34,6%) 8 (61,5%)
Óbito Não 24 (88,9%) 6 (46,2%)
0,006 Sim 3 (11,1%) 7 (53,8%)
47
0,0%
20,0%
40,0%
60,0%
80,0%
100,0%
Expressão Positiva Expressão Negativa
Óbito
Em tratamento
Os dois grupos (expressão positiva e negativa) apresentaram-se bastante semelhantes em todas
variáveis avaliadas, com exceção do parâmetro clínico de relacionado à evolução para óbito. De modo
geral, houve predomínio de pacientes (> 50%) com cariótipo não complexo e não aneuploide, citopenias
menos pronunciadas, < 5% de blastos e classificados como IPSS de baixo risco. No grupo de expressão
negativa, 28% (n = 7) apresentaram uma displasia isolada e 59,3% (n = 16), duas ou três citopenias.
Metade deles (10 pacientes) apresentou cariótipo alterado e 46,2%, medula óssea hipercelular (n = 12).
Dentre os pacientes com expressão positiva, 53,8% (7 pacientes) apresentaram duas ou três citopenias e
54,5% (6 pacientes), três displasias. A maioria (53,8%, n = 7) teve cariótipo alterado, 50% (n = 6)
apresentaram medula hipercelular e 61,5% (n = 8), tiveram dependência transfusional. Sete pacientes
(53,8%) pertencentes ao grupo com expressão positiva evoluíram para óbito no período do estudo,
enquanto que apenas três pacientes (11,1%) apresentaram essa evolução clínica no grupo com expressão
negativa, sendo essa diferença estatisticamente significante (p = 0,006, Qui-quadrado - Figura 15).
FIGURA 15. GRÁFICO EM BARRAS MOSTRANDO A EVOLUÇÃO DOS PACIENTES (ÓBITO OU
EM TRATAMENTO) NO GRUPO SMD CONFORME EXPRESSÃO POSITIVA OU NEGATIVA DA
PROTEÍNA AURORA B (p = 0,006).
4.2.1.4. AURORA A
Os resultados da análise comparativa entre pacientes com expressão positiva e negativa para a
proteína AURORA A encontram-se nos Quadros 12 e 13, assim como seus respectivos níveis de
significância. Entretanto, algumas considerações devem ser salientadas em relação à avaliação de sua
expressão. Houve dificuldades técnicas na sua padronização devido à presença de marcação fraca em
48
todas as amostras, a despeito de otimizações no processamento. Com isso, optamos por considerar as
amostras que apresentaram apenas esse tipo de marcação, como amostras negativas. Além disso, a
marcação citoplasmática em megacariócitos esteve presente em mais de 95% das amostras, fato que nos
fez considerar tal marcação inespecífica, sendo, portanto, não contabilizada como expressão positiva.
Desse modo, para AURORA A, as amostras consideradas positivas foram aquelas nas quais houve
marcação moderada a forte das células, à exceção dos megacariócitos.
QUADRO 12. IDADE, GRAU DE CITOPENIAS E PORCENTAGEM DE BLASTOS, CONFORME
EXPRESSÃO POSITIVA VERSUS NEGATIVA DA PROTEÍNA AURORA A.
Característica
(média ± DP)
Expressão Proteica (AURORA A)
n = 34 p
Expressão Negativa (n = 22) Expressão Positiva (n = 12)
Idade (anos) 57,9 ± 21,4 61,4 ± 18,0 0,709
Grau de citopenias
Hb (g/dL)
Neutrófilos (nº/mm3)
Plaquetas (nº/mm3)
9,3 ± 3,4
2.242 ± 1.837
184.919 ± 188.432
8,3 ± 2,3
1.622 ± 1.644
108.866 ± 114.180
0,308
0,200
0,152
% de blastos 1,6 ± 2,2 3,1 ± 5,1 0,611
49
QUADRO 13. VARIÁVEIS CLÍNICAS, LABORATORIAIS E CLASSIFICAÇÃO IPSS CONFORME
EXPRESSÃO POSITIVA VERSUS NEGATIVA DA PROTEÍNA AURORA A
Variável
AURORA A
p Expressão
Negativa
(n = 22)
Expressão
Positiva
(n = 12)
Sexo Masculino 10 (45,5%) 7 (58,3%)
0,721 Feminino 12 (54,5%) 5 (41,7%)
Origem - Zona Rural 9 (42,9%) 4 (33,3%)
0,719 Urbana 12 (57,1%) 8 (66,7%)
Biópsia-celularidade
Normocelular 4 (19,0%) 4 (36,4%)
0,467 Hipocelular 5 (23,8%) 3 (27,3%)
Hipercelular 12 (57,1%) 4 (36,4%)
Cariótipo-complexidade Não complexo 16 (100,0%) 7 (63,6%)
0,019 Complexo 0 4 (36,4%)
Cariótipo-normalidade Normal 11 (68,8%) 3 (27,3%)
0,034 Alterado 5 (31,3%) 8 (72,7%)
Citogenética - prognóstico
Favorável 9 (56,3%) 5 (45,5%)
0,125 Intermediário 6 (37,5%) 2 (18,2%)
Desfavorável 1 (6,3%) 4 (36,4%)
Citogenética - ploidia Euploidia 15 (93,8%) 3 (27,3%)
0,001 Aneuploidia 1 (6,3%) 8 (72,7%)
Número de displasias
Uma 5 (26,3%) 2 (18,2%)
0,804 Duas 5 (26,3%) 4 (36,4%)
Três 9 (47,4%) 5 (45,5%)
Número de citopenias Zero ou uma 9 (40,9%) 4 (33,3%)
0,727 Duas ou três 13 (53,1%) 8 (66,7%)
7 (53,8%) Hemoglobina < 8,0 g/dL
Sim 6 (28,7%) 7 (58,3%) 0,142
Não 15 (71,4%) 5 (47,7%)
Neutrófilos < 800/mm3
Sim 3 (14,3%) 4 (33,3%) 0,377
Não 18 (85,7%) 8 (66,7%)
Plaquetas < 50.000/mm3
Sim 5 (23,8%) 6 (50,0%) 0,149
Não 16 (76,2%) 6 (50,0%)
Blastos < 5% Sim 19 (90,5%) 8 (81,8%)
0,593 Não 2 (9,5%) 2 (18,2%)
IPSS Baixo risco + INT1 13 (92,9%) 8 (72,7%)
0,288 INT2 + Alto risco 1 (7,1%) 3 (27,3%)
Dependência transfusional Não 15 (71,4%) 4 (33,3%)
0,033 Sim 6 (28,6%) 8 (66,7%)
Óbito Não 18 (81,8%) 8 (66,7%)
0,410 Sim 4 (18,2%) 4 (33,3%)
50
Não houve diferenças entre os grupos com expressão positiva e negativa em relação às variáveis
numéricas (idade, hemoglobina, neutrófilos, plaquetas e blastos). O grupo com expressão positiva
apresentou níveis hematimétricos discretamente mais baixos do que o grupo negativo, assim como maior
porcentagem de blastos.
O grupo com expressão negativa apresentou predomínio de medula óssea hipercelular, três
displasias, duas ou três citopenias, sendo essas menos graves na maioria dos pacientes desse grupo. Mais
de 90% dos casos apresentou menos de 5% de blastos e baixo risco pela classificação IPSS. Quatro
pacientes desse grupo evoluíram para óbito no período do estudo (18,2%) e 6 (28,6%) tinham
dependência transfusional. Em relação à citogenética, temos que 100% (n = 16) apresentaram cariótipo
não complexo, sendo 93,8% (n = 15) não aneuploide. Onze pacientes (68,8%) apresentaram cariótipo
normal e 9 (56,3%), citogenética favorável pelo IPSS.
O grupo com expressão positiva apresentou predomínio de três displasias e duas a três citopenias,
sendo que 7 pacientes (58,3%) apresentaram hemoglobina < 8g/dL, 4 (33,3%), neutrófilos < 800/mm3 e
6 pacientes (50%), plaquetas < 50.000/mm3. A maioria permaneceu viva, tinha risco baixo pelo IPSS,
< 5% de blastos e dependência transfusional. Apenas três pacientes (27,3%) apresentaram medula óssea
hipocelular. Houve predomínio de cariótipo alterado (8 pacientes, 72,7%), sendo a maioria desses não
complexo (63,6%, n = 7), porém aneuploide (8 pacientes, 72,7%). Quatro pacientes (36,4%) foram
classificados como citogenética desfavorável pelo IPSS.
Os grupos com expressão positiva e negativa apresentaram diferenças estatisticamente
significantes com relação à análise de citogenética. O grupo com expressão positiva apresentou maior
frequência de cariótipos complexos (p = 0,019, Qui-Quadrado - Figura 16) e de cariótipos alterados
(p = 0,034, Qui-Quadrado - Figura 17), assim como de aneuploidia (p = 0,001, Qui-Quadrado -
Figura 18), quando comparados com o grupo com expressão negativa. Além disso, a proporção de
pacientes com dependência transfusional foi significativamente maior no grupo com expressão positiva,
constituindo 66,7% dos casos (n = 8), enquanto que no grupo com expressão negativa foi de apenas
28,6% (n = 6), com p = 0,033 (Qui-quadrado - Figura 19).
A expressão positiva e negativa da proteína AURORA A por imunoistoquímica (nos pacientes
portadores de SMD) encontram-se demonstradas na figura 20.
51
0,0%
20,0%
40,0%
60,0%
80,0%
100,0%
Expressão Positiva Expressão Negativa
Cariótipo Normal
Cariótipo Alterado
0,0%
20,0%
40,0%
60,0%
80,0%
100,0%
Expressão Positiva Expressão Negativa
Cariótipo Não Compexo
Cariótipo Alterado
FIGURA 16. GRÁFICO EM BARRAS MOSTRANDO A PORCENTAGEM DE PACIENTES COM
CARIÓTIPO COMPLEXO E NÃO COMPLEXO NO GRUPO SMD CONFORME EXPRESSÃO
POSITIVA OU NEGATIVA DA PROTEÍNA AURORA A (p = 0,019).
FIGURA 17. GRÁFICO EM BARRAS MOSTRANDO A PORCENTAGEM DE PACIENTES COM
CARIÓTIPO NORMAL OU ALTERADO NO GRUPO SMD CONFORME EXPRESSÃO POSITIVA OU
NEGATIVA DA PROTEÍNA AURORA A (p = 0,034).
52
0,0%
20,0%
40,0%
60,0%
80,0%
100,0%
Expressão Positiva Expressão Negativa
Euploidia
Aneuploidia
0,0%
20,0%
40,0%
60,0%
80,0%
100,0%
Expressão Positiva Expressão Negativa
Sim Não
Dependência
FIGURA 18. GRÁFICO EM BARRAS MOSTRANDO A PORCENTAGEM DE PACIENTES COM
EUPLOIDIA E ANEUPLOIDIA NO GRUPO SMD CONFORME EXPRESSÃO POSITIVA OU
NEGATIVA DA PROTEÍNA AURORA A (p = 0,001).
FIGURA 19. GRÁFICO EM BARRAS MOSTRANDO A PORCENTAGEM DE PACIENTES COM E
SEM DEPENDÊNCIA TRANSFUSIONAL NO GRUPO SMD CONFORME EXPRESSÃO POSITIVA OU
NEGATIVA DA PROTEÍNA AURORA A (p = 0,033).
53
FIGURA 20 – IMUNOISTOQUÍMICA MOSTRANDO DIFERENTES GRAUS DE EXPRESSÃO
QUALITATIVA DA PROTEÍNA AURORA A EM BMO DE PACIENTES PORTADORES DE SMD
(400x). A) EXPRESSÃO NEGATIVA: setas mostram expressão citoplasmática inespecífica em
megacariócitos; B) EXPRESSÃO POSITIVA: setas indicam expressão citoplasmática mais evidente em
grupos de células mononucleares, compatível com expressão positiva.
A B
A B
54
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Controle Grupo SMD
Expressão Positiva
Expressão Negativa
4.2.2. Expressão qualitativa no grupo SMD e no grupo Controle
Para cada uma das proteínas analisadas, observou-se frequência significativamente maior de
expressão positiva no grupo SMD em relação ao grupo controle (com exceção da proteína AURORA A,
a qual não mostrou resultados com significância estatística).
4.2.2.1. MAD2
Dos 40 pacientes analisados, trinta e cinco pacientes da amostra apresentaram marcação positiva
para a proteína MAD2 (87,5%), ao passo que cinco pacientes (50%) do grupo controle apresentaram
positividade para essa proteína (p = 0,018, Qui-quadrado - Figura 21).
FIGURA 21. GRÁFICO EM BARRAS MOSTRANDO A PORCENTAGEM DE CASOS DE EXPRESSÃO
POSITIVA E NEGATIVA DA PROTEÍNA MAD2 NOS GRUPOS SMD E CONTROLE (p = 0,018).
4.2.2.2. CDC20
Trinta e três pacientes da amostra (n = 40) apresentaram marcação positiva para a proteína
CDC20 (82,5%), ao passo que nenhum dos pacientes do grupo controle apresentou tal positividade
(p < 0,001, Qui-quadrado - Figura 22).
55
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Controle Grupo SMD
Expressão Positiva
Expressão Negativa
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Controle Grupo SMD
Expressão Positiva
Expressão Negativa
FIGURA 22. GRÁFICO EM BARRAS MOSTRANDO A PORCENTAGEM DE CASOS DE EXPRESSÃO
POSITIVA E NEGATIVA DA PROTEÍNA CDC20 NOS GRUPOS SMD E CONTROLE (p < 0,001).
4.2.2.3. AURORA B
Apenas treze pacientes da amostra (n = 40) apresentaram marcação positiva para a proteína
Aurora B (32,5%), ao passo que nenhum dos pacientes do grupo controle apresentou positividade para
essa proteína (p = 0,046, Qui-quadrado - Figura 23).
FIGURA 23. GRÁFICO EM BARRAS MOSTRANDO A PORCENTAGEM DE CASOS DE EXPRESSÃO
POSITIVA E NEGATIVA DA PROTEÍNA AURORA B NOS GRUPOS SMD E CONTROLE (p = 0,046).
56
0,0%
20,0%
40,0%
60,0%
80,0%
100,0%
Controle Grupo SMD
Expressão Positiva
Expressão Negativa
4.2.2.4. AURORA A
Apenas doze pacientes da amostra (n = 34) apresentaram marcação positiva para a proteína
Aurora A (35,3%), ao passo que apenas um paciente (14,3%) do grupo controle (n = 7) apresentou
positividade para essa proteína (p = 0,399, Qui-quadrado - Figura 24).
FIGURA 24. GRÁFICO EM BARRAS MOSTRANDO A PORCENTAGEM DE CASOS DE EXPRESSÃO
POSITIVA E NEGATIVA DA PROTEÍNA AURORA A NOS GRUPOS SMD E CONTROLE (p = 0,399).
4.2.3. Quantitativa - expressão em porcentagem de marcação
4.2.3.1 MAD2
Foi realizada análise comparativa entre a expressão da proteína MAD2 (nos casos positivos) e as
seguintes características clínico-laboratoriais: celularidade da medula óssea, número de displasias,
presença ou ausência de dependência transfusional, classificação pelo sistema IPSS baixo risco (baixo
risco + intermediário-1) e alto risco (intermediário-2 + alto risco), grau de citopenias, presença ou
ausência de cariótipo complexo, cariótipo normal ou alterado, cariótipo aneuploide ou não aneuploide,
número de citopenias, porcentagem de blastos acima e abaixo de 5% (na medula óssea) e evolução
clínica para óbito ou não.
57
O Quadro 14 mostra os valores encontrados (expressos em porcentagem) da expressão da
proteína MAD2 (média ± DP) de acordo com os parâmetros avaliados e seus respectivos níveis de
significância.
A média de expressão proteica foi significativamente maior nos pacientes que apresentaram
plaquetopenia abaixo de 50.000/mm3 (p = 0,008, Mann-Whitney - Figura 25) e que evoluíram para óbito
(p = 0,002, Mann-Whitney - Figura 26) durante o período do estudo. Além disso, pacientes com duas a
três citopenias e três displasias apresentaram médias de expressão proteica aumentadas (33,3 ± 22,5% e
37,2 ± 26,7%, respectivamente) em comparação aos outros pacientes com menos citopenias
(22,9 ± 20,0%) e displasias (uma displasia - 17,6 ± 13,9%; duas displasias (19,9 ± 7,1%), com valores de
p marginalmente significantes (p = 0,095 e 0,094). Não houve diferenças significativas quanto aos níveis
de expressão proteica de MAD2 com relação aos outros parâmetros avaliados.
58
QUADRO 14. EXPRESSÃO QUANTITATIVA EM % DA PROTEÍNA MAD2 CONFORME
CARACTERÍSTICAS CLÍNICO-LABORATORIAIS
Característica Expressão Proteica (média ± DP)
n=35
p
Celularidade da MO Normocelular Hipocelular Hipercelular
0,596
25,6 ± 26,3 30,4 ± 19,8 26,6 ± 20,0
Número de displasias Uma Duas Três
0,094
17,6 ± 13,9 19,9 ± 7,1 37,2 ± 26,7
Dep. Transfusional Sim Não
0,138 33,4 ± 22,8 24,2 ± 20,8
IPSS Baixo Risco Alto Risco
0,803 28,9 ± 21,9 33,7 ± 30,5
Grau de citopenia
Hb < 8,0 g/dL Hb ≥ 8,0 g/dL 0,280
32,1 ± 20,7 26,4 ± 22,9
Neutrófilos < 800/mm3 Neutrófilos ≥800/mm
3
0,161 40,6 ± 26,7 26,0 ± 20,4
Plaquetas < 50.000/mm3 Plaquetas ≥ 50.000/mm
3
0,008 42,6 ± 22,8 22,7 ± 19,1
Cariótipo complexo Não Sim
0,388
28,6 ± 22,1 37,1 ± 27,7
Cariótipo normal Sim Não
0,402 26,5 ± 19,2 32,7 ± 25,4
Ploidia Euploidia Aneuploidia
0,282 28,5 ± 23,0 32,7 ± 23,2
Número de citopenias 0/1 2/3
0,095 22,9 ± 20,0 33,3 ± 22,5
% de blastos < 5 ≥ 5
0,869 27,3 ± 21,8 27,1 ± 16,8
Óbito Sim Não
0,002 46,9 ± 27,0 20,8 ± 13,8
59
FIGURA 25. EXPRESSÃO QUANTITATIVA DA PROTEÍNA MAD2 (EM %) ENTRE OS PACIENTES
DO GRUPO SMD COM PLAQUETAS < OU ≥ 50.000/mm3 (p = 0,008).
FIGURA 26. EXPRESSÃO QUANTITATIVA DA PROTEÍNA MAD2 (EM %) ENTRE OS PACIENTES
DO GRUPO SMD QUE SE ENCONTRAM EM TRATAMENTO OU QUE EVOLUÍRAM PARA ÓBITO
(p = 0,002).
p = 0,008
p = 0,002
60
4.2.3.2. CDC20
Foi realizada análise comparativa entre a expressão da proteína CDC20 (nos casos positivos) e as
seguintes características clínico-laboratoriais: celularidade da medula óssea, número de displasias,
presença ou ausência de dependência transfusional, classificação pelo sistema IPSS baixo risco (baixo
risco + intermediário-1) e alto risco (intermediário-2 + alto risco), grau de citopenias, presença ou
ausência de cariótipo complexo, cariótipo normal ou alterado, cariótipo aneuploide e não aneuploide,
número de citopenias, porcentagem de blastos acima e abaixo de 5% (na medula óssea) e evolução
clínica para óbito ou não.
O Quadro 15 mostra os valores encontrados (expressos em porcentagem) da expressão da
proteína CDC20 (média ± DP) de acordo com os parâmetros avaliados e seus respectivos níveis de
significância.
A média de expressão proteica (CDC20) foi significativamente maior nos pacientes que
apresentaram plaquetopenia abaixo de 50.000/mm3
(p = 0,017, Mann-Whitney - Figura 27), três
displasias em comparação a um ou duas displasias (p = 0,017, Kruskal-Wallis - Figura 28) e cariótipo
complexo (p = 0,030, Mann-Whitney - Figura 29). Os pacientes com número de neutrófilos abaixo de
800/mm3 apresentaram média de expressão proteica maior, em relação aos pacientes com contagens
acima de 800 células/mm3, o que foi compatível com tendência estatística (p = 0,050, Mann-Whitney -
Figura 30). Situação semelhante foi observada entre os pacientes com cariótipo euploide e aneuploidia
(p = 0,053, Mann-Whitney - Figura 31) e entre aqueles que permaneceram vivos ou evoluíram para óbito
(p= 0,078, Mann-Whitney).
Não houve diferenças significativas com relação à análise dos outros parâmetros estudados.
61
QUADRO 15. EXPRESSÃO QUANTITATIVA EM % DA PROTEÍNA CDC20 CONFORME
CARACTERÍSTICAS CLÍNICO-LABORATORIAIS
Característica Expressão Proteica em % (média ± DP)
n = 33
n=31
p
Celularidade da MO Normocelular Hipocelular Hipercelular
0,837 18,5 ± 15,6 16,1 ± 10,0 24,0 ± 23,0
Número de displasias Uma Duas Três
0,017 10,5 ± 5,7 12,8 ± 7,8 33,9 ± 24,1
Dep. transfusional Sim Não
0,433 26,6 ± 24,5 17,7 ± 12,9
IPSS Baixo Risco Alto Risco
0,625
19,8 ± 14,1 37,6 ± 36,6
Grau de citopenia
Hb < 8,0 g/dL Hb ≥ 8,0 g/dL 0,421
23,3 ± 16,9 20,4 ± 20,3
Neutrófilos < 800/mm3 Neutrófilos ≥ 800/mm
3
0,050 39,4 ± 29,6 17,5 ± 13,5
Plaquetas < 50.000/mm3 Plaquetas ≥ 50.000/mm
3
0,017 38,2 ± 26,2 16,1 ± 12,4
Cariótipo complexo Não Sim
0,030 18,4 ± 14,0 50,0 ± 30,2
Cariótipo normal Sim Não
0,301 17,2 ± 11,7 28,7 ± 24,7
Ploidia Euploidia Aneuploidia
0,053
17,5 ± 13,1 36,7 ± 27,4
Número de citopenias 0/1 2/3
0,564
17,4 ± 13,1 25,3 ± 22,9
% de blastos < 5 ≥ 5
0,279 19,1 ± 18,0 31,0 ± 21,2
Óbito Sim Não
0,078 39,4 ± 28,9 16,7 ± 12,1
62
p = 0,017
p = 0,563
p = 0,011
p = 0,015
FIGURA 27. EXPRESSÃO QUANTITATIVA DA PROTEÍNA CDC20 (EM %) ENTRE OS PACIENTES
DO GRUPO SMD COM PLAQUETAS < OU ≥ 50.000/mm3 (p = 0,017).
FIGURA 28. EXPRESSÃO QUANTITATIVA DA PROTEÍNA CDC20 (EM %) NOS PACIENTES DO
GRUPO SMD CONFORME O NÚMERO DE DISPLASIAS (p = 0,017).
63
p = 0,030
FIGURA 29. EXPRESSÃO QUANTITATIVA DA PROTEÍNA CDC20 (EM %) NOS PACIENTES DO
GRUPO SMD CONFORME PRESENÇA OU NÃO DE CARIÓTIPO COMPLEXO (p = 0,030).
FIGURA 30. EXPRESSÃO QUANTITATIVA DA PROTEÍNA CDC20 (EM %) NOS PACIENTES DO
GRUPO SMD COM CONTAGEM DE NEUTRÓFILOS < OU ≥ 800/mm3 (p = 0,050).
p = 0,050
64
FIGURA 31. EXPRESSÃO QUANTITATIVA DA PROTEÍNA CDC20 (EM %) NOS PACIENTES DO
GRUPO SMD CONFORME PRESENÇA DE EUPLOIDIA OU ANEUPLOIDIA (p = 0,053).
p = 0,053
65
4.2.3.3. AURORA B
Foi realizada análise comparativa entre a expressão da proteína AURORA B (nos casos
positivos) e as seguintes características clínico-laboratoriais: celularidade da medula óssea, número de
displasias, presença ou ausência de dependência transfusional, classificação pelo sistema IPSS baixo
risco (baixo risco + intermediário-1) e alto risco (intermediário-2 + alto risco), grau de citopenias,
presença ou ausência de cariótipo complexo, cariótipo normal ou alterado, cariótipo aneuploide e não
aneuploide, número de citopenias, porcentagem de blastos acima e abaixo de 5% (na medula óssea) e
evolução clínica para óbito ou não.
O Quadro 16 mostra os valores encontrados (expressos em porcentagem) da expressão da
proteína AURORA B (média ± DP) de acordo com os parâmetros avaliados e seus respectivos níveis de
significância.
Pacientes com cariótipo alterado apresentaram valores de expressão proteica significativamente
maiores, em relação aos pacientes com cariótipo normal (p=0,037, Mann-Whitney - Figura 32). Não
houve diferenças significativas à análise dos outros parâmetros estudados.
66
QUADRO 16. EXPRESSÃO QUANTITATIVA EM % DA PROTEÍNA AURORA B CONFORME
CARACTERÍSTICAS CLÍNICO-LABORATORIAIS
*apenas um paciente com cariótipo complexo
Característica Expressão Proteica (média ± DP)
n = 13
p
Celularidade da MO Normocelular Hipocelular Hipercelular
0,555 25,0 ± 21,2 13,1 ± 13,0 9,6 ± 4,9
Número de displasias Uma Duas Três
0,128 12,2 ± 13,0 5,6 ± 4,0 19,5 ± 11,8
Dep. transfusional Sim Não
0,417 13,0 ± 11,4 17,8 ± 14,0
IPSS Baixo Risco Alto Risco
0,417 14,9 ± 12,8 21,0 ± 8,4
Grau de citopenia
Hb < 8,0 g/dL Hb ≥ 8,0 g/dL 0,829
14,5 ± 12,5 15,2 ± 12,9
Neutrófilos < 800/mm3 Neutrófilos ≥800/mm
3
0,233 10,3 ± 14,4 16,2 ± 11,9
Plaquetas < 50.000/mm3 Plaquetas ≥ 50.000/mm
3
0,460 13,8 ± 14,9 15,5 ± 11,2
Cariótipo complexo Não Sim
0,281 13,8 ± 12,1 27,0*
Cariótipo normal Sim Não
0,037 7,5 ± 5,0 21,2 ± 13,2
Ploidia Euploidia Aneuploidia
0,697 13,4 ± 11,7 18,0 ± 14,4
Número de citopenias 0/1 2/3
0,517 16,5 ± 13,0 13,4 ± 12,3
% de blastos < 5 ≥ 5
0,158 11,8 ± 11,6 21,0 ± 8,4
Óbito Sim Não
0,313 18,8 ± 14,6 10,2 ± 7,3
67
FIGURA 32. EXPRESSÃO QUANTITATIVA DA PROTEÍNA AURORA B (EM %) NOS PACIENTES
DO GRUPO SMD CONFORME PRESENÇA DE CITOGENÉTICA NORMAL OU ALTERADA
(p = 0,037).
p = 0,037
68
4.2.4. Expressão Quantitativa – categorização em grupos conforme porcentagem de expressão
(< 10%, 10-49%, ≥ 50%)
A Tabela 5 mostra a distribuição, entre os pacientes com expressão positiva, em três diferentes
graus de expressão: < 10% (baixa), 10-49% (moderada) e ≥ 50% (alta). A maioria dos pacientes com
marcação positiva apresentou positividade moderada em relação às proteínas MAD2, CDC20 e
AURORA B (Figuras 33, 34 e 35, respectivamente). Não houve pacientes com marcação forte para a
proteína AURORA B. Não foi realizada a expressão por grupos nos casos dos pacientes com expressão
positiva para a proteína AURORA A, devido às dificuldades técnicas já citadas previamente.
Foi realizada análise comparativa entre a expressão das proteínas, classificada por grupos (baixa,
moderada ou alta), dentre os casos com marcação positivas, e os parâmetros demográficos (idade, sexo e
origem), clínicos (presença ou ausência de dependência transfusional, evolução para óbito ou não),
laboratoriais (número e grau de citopenias, número de displasias, porcentagem de blastos na medula
óssea, celularidade da medula óssea, citogenética) e classificação IPSS (risco alto e baixo risco). A
análise citogenética incluiu avaliação de normalidade, complexidade e ploidia, além da classificação
prognóstica pelo IPSS (bom, intermediário, ruim).
TABELA 5. EXPRESSÃO PROTEICA POR GRUPOS CONFORME GRAU DE EXPRESSÃO (BAIXA -
< 10%, MODERADA – 10-49% E ALTA - ≥ 50%)
Proteínas GRAU DE EXPRESSÃO
< 10% 10-49% ≥ 50%
MAD2 (n = 35) 4 (11,4%) 23 (65,7%) 8 (22,9%)
CDC20 (n = 33) 9 (27,3%) 20 (60,6%) 4 (12,1%)
Aurora B (n = 13) 4 (30,8%) 9 (69,2%) 0
69
FIGURA 33. DISTRIBUIÇÃO DOS PACIENTES COM EXPRESSÃO POSITIVA DE ACORDO COM O
GRAU DE EXPRESSÃO PARA A PROTEÍNA MAD2 (BAIXA, MODERADA OU ALTA).
FIGURA 34. DISTRIBUIÇÃO DOS PACIENTES COM EXPRESSÃO POSITIVA DE ACORDO COM O
GRAU DE EXPRESSÃO PARA A PROTEÍNA CDC20 (BAIXA, MODERADA OU ALTA).
70
FIGURA 35. DISTRIBUIÇÃO DOS PACIENTES COM EXPRESSÃO POSITIVA DE ACORDO COM O
GRAU DE EXPRESSÃO PARA A PROTEÍNA AURORA B (BAIXA OU MODERADA).
4.2.4.1. MAD2 (expressão por grupos < 10%, 10-49%, ≥ 50%)
O Quadro 17 mostra a expressão por grupos do grau de marcação proteína MAD2 de acordo com
idade, grau de citopenias e porcentagem de blastos na medula óssea, com seus respectivos níveis de
significância. Apesar de não apresentar significância estatística, a média de porcentagem de blastos foi
maior no grupo com expressão proteica ≥ 50%, quando comparada com os grupos com expressão baixa
(<10%) e moderada (10-49%). Não houve diferenças entre os diferentes graus de expressão de MAD2
em relação à idade e grau de citopenias.
71
QUADRO 17. EXPRESSÃO QUANTITATIVA DA PROTEÍNA MAD2 POR GRUPOS (< 10%, 10-49% E
≥ 50%) CONFORME IDADE, GRAU DE CITOPENIAS E PORCENTAGEM DE BLASTOS.
O Quadro 18 mostra a expressão por grupos do grau de marcação da proteína MAD2 conforme
outras variáveis demográficas, clínicas, laboratoriais e classificação IPSS, com seus respectivos níveis de
significância. Houve uma proporção significativamente maior de pacientes do grupo com alta expressão
proteica (62,5%, n = 5) com plaquetopenias mais graves (< 50.000/mm3), em comparação aos grupos
com expressão leve e moderada (p = 0,042, Qui-Quadrado, Figura 36). Observou-se que todos os
pacientes com baixa expressão proteica (100%, n = 4) tinham citopenias menos pronunciadas, cariótipo
não complexo, não aneuploide (n = 3), ausência de dependência transfusional e não faleceram no
período de avaliação do estudo (n = 4). Em relação ao grupo com expressão proteica moderada, a
maioria dos pacientes apresentou citopenias menos graves (59,1% com Hb ≥ 8g/dL, n = 13; 86,4% com
neutrófilos ≥ 800/mm3, n = 19 e 77,3% com plaquetas ≥ 50.000/mm
3, n = 17), cariótipo não complexo
(84,2%, n = 16) e baixo risco pela classificação IPSS (88,2%, n = 15). Dentre o grupo com alta
expressão proteica, a maioria tinha idade abaixo de 60 anos (75%, n = 6), duas ou mais citopenias no
sangue periférico (75%, n = 6), três displasias na medula óssea (83,3%, n = 5) e cariótipo alterado
(62,5%, n = 5). Mais da metade dos pacientes com alta expressão proteica (62,5%, n = 5) evoluiu para
óbito durante o período do estudo, diferentemente dos grupos de baixa expressão (nenhum paciente) e de
moderada expressão (n = 5, 21,7%), com valor de p = 0,036, Qui-quadrado - Figura 37).
Característica
(média ± DP)
Grau de Expressão Proteica (MAD2)
n = 35 p
< 10% 10-49% ≥ 50%
Idade (anos) 68,5 ± 17,7 59,6 ± 20,9 43,1 ± 18,3 0,121
Grau de citopenias
Hb (g/dL)
Neutrófilos (nº/mm3)
Plaquetas (nº/mm3)
11,1 ± 2,7
2.404 ± 1.446
143.050 ± 97.741
9,1 ± 2,9
2.407 ± 1.904
206.690 ± 183.610
8,3 ± 3,5
1.137 ± 1.076
76.587 ± 80.635
0,313
0,175
0,130
% de blastos 0,12 ± 0,25 1,8 ± 3,3 3,8 ± 5,5 0,098
72
QUADRO 18. CARACTERÍSTICAS DEMOGRÁFICAS, CLÍNICAS, LABORATORIAIS E
CLASSIFICAÇÃO IPSS CONFORME GRAU DE EXPRESSÃO DA PROTEÍNA MAD2
(<10%, 10-49% OU ≥ 50%)
Variável
Grau de Expressão Proteica (MAD2)
p
< 10% 10-49% ≥ 50%
Sexo
Feminino 2 (50,0%) 11 (47,8%) 5 (62,5%) 0,773
Masculino 2 (50,0%) 12 (52,2%) 3 (37,5%)
Idade
≤ 60 anos 1 (25%) 11 (47,8%) 6 (75,0%) 0,221
> 60 anos 3 (75%) 12 (52,2%) 2 (25,0%)
Origem
Rural 1 (25,0%) 8 (36,4%) 4 (50,0%) 0,671
Urbana 3 (75,0%) 14 (63,6%) 4 (50,0%)
Celularidade MO
Normocelular 1 (25,0%) 6 (27,3%) 1 (14,3%) 0,764 Hipocelular 1 (25,0%) 4 (18,2%) 3 (42,9%)
Hipercelular 2 (66,7%) 12 (54,5%) 3 (42,9%)
Citopenias
0/1 2 (50,0%) 13 (56,5%) 2 (25,0%) 0,307
2/3 2 (50,0%)
10 (43,5%)
6 (75,0%)
Hb
< 8,0 g/dL 0 9 (40,9%) 4 (50,0%) 0,222
≥ 8,0 g/dL 4 (100,0%) 13 (59,1%) 4 (50,0%)
Neutrófilos < 800/mm
3 0
3 (13,6%)
3 (37,5%)
0,195
≥ 800/mm3 4 (100,0%) 19 (86,4%) 5 (62,5%)
Plaquetas
< 50.000/mm3 0 5 (22,7%) 5 (62,5%) 0,042
≥ 50.000/mm3 4 (100,0%) 17 (77,3%) 3 (37,5%)
Displasias
0/1 2 (50,0%) 5 (23,8%) 1 (16,7%) 0,138
2 1 (25,0%) 9 (42,9%) 0
3 1 (25,0%) 7 (33,3%) 5 (83,3%)
Cariótipo - IPSS
Favorável 2 (66,7%) 9 (47,4%) 4 (50,0%) 0,461
Intermediário
0 7 (36,8%) 1 (12,5%)
Desfavorável 1 (33,3%) 3 (15,8%) 3 (37,5%)
Cariótipo Normal 2 (66,7%) 8 (42,1%) 3 (37,5%) 0,674
Alterado 1 (33,3%) 11 (57,9%) 5 (62,5%)
Ploidia Euploidia 3 (100%) 11 (57,9%) 5 (62,5%) 0,371
Aneuploidia 0 8 (42,1%) 3 (37,5%)
Cariótipo -
complexidade
Complexo 0 3 (15,8%) 2 (25,0%) 0,603
Não complexo 3 (100,0%) 16 (84,2%) 6 (75,0%)
IPSS Risco
Baixo + Int-1 2 (66,7%) 15 (88,2%) 5 (71,4%) 0,492
Int-2 + Alto 1 (33,3%) 2 (11,8%) 2 (28,6%)
Dependência
transfusional
Sim 0 11 (50,0%) 5 (62,5%) 0,111
Não 4 (100,0%) 11 (50,0%) 3 (37,5%)
Óbito Não 4 (100,0%) 18 (78,3%) 5 (37,5%) 0,036
Sim 0 5 (21,7%) 5 (62,5%)
73
0%
20%
40%
60%
80%
100%
< 10% 10-49% ≥ 50%
Plaquetas < 50.000/mm3
Plaquetas ≥ 50.000/mm3
0,0%
20,0%
40,0%
60,0%
80,0%
100,0%
< 10% 10-49% ≥ 50%
Óbito
Em tratamento
FIGURA 36. PORCENTAGEM DE CASOS COM PLAQUETAS < 50.000/mm3 OU ≥ 50.000/mm
3 NO
GRUPO SMD CONFORME O GRAU DE EXPRESSÃO DA PROTEÍNA MAD2 (<10%, 10-49%
E ≥ 50%) (p = 0,042). Observou-se proporção significativamente maior de pacientes com plaquetas
< 50.000/mm3 no grupo de expressão alta (>50%) em comparação ao grupo de expressão baixa (<10%) e
moderada (10-49%) de MAD2 (p < 0,05).
FIGURA 37. PORCENTAGEM DE CASOS QUE EVOLUÍRAM PARA ÓBITO OU QUE SE
ENCONTRAM EM TRATAMENTO NO GRUPO SMD CONFORME O GRAU DE EXPRESSÃO DA
PROTEÍNA MAD2 (<10%, 10-49% E ≥ 50%) (p = 0,036).
74
A Figura 38 mostra os diferentes graus de expressão da proteína MAD2 à microscopia óptica
(aumento de 400x).
FIGURA 38. IMUNOISTOQUÍMICA MOSTRANDO DIFERENTES GRAUS DE EXPRESSÃO DA
PROTEÍNA MAD2 EM BMO DE PACIENTES PORTADORES DE SMD (400x). A) EXPRESSÃO
NEGATIVA: setas mostram grupo de células mononucleares sem marcação citoplasmática;
B) EXPRESSÃO FRACA (< 10%): as setas vermelhas representam um megacariócito sem expressão e
outro com expressão positiva, enquanto a seta preta aponta para um neutrófilo com expressão proteica
positiva; C) EXPRESSÃO MODERADA (10-49%): setas indicam células com expressão citoplasmática;
D) EXPRESSÃO FORTE (≥ 50%): maioria das células apresenta expressão proteica, com seta destacando
megacariócito com expressão positiva.
A B
C D
75
4.2.4.2. CDC20 (expressão por grupos < 10%, 10-49%, ≥ 50%)
O Quadro 19 mostra a média com respectivo desvio-padrão (idade, grau de citopenias e
porcentagem de blastos na medula óssea), com seus respectivos níveis de significância. Pacientes com
baixa expressão proteica apresentaram média de idade significativamente maior em comparação aos
pacientes dos grupos com expressão proteica moderada e alta (p = 0,042, Kruskal-Wallis - Figura 39).
Pacientes com alta expressão proteica apresentaram médias de contagem de blastos (em %)
consideravelmente mais elevadas quando comparados com os pacientes dos grupos de baixa e moderada
expressão proteica, porém sem significância estatística (p = 0,067).
QUADRO 19. EXPRESSÃO QUANTITATIVA DA PROTEÍNA CDC20 POR GRUPOS (< 10%, 10-49% E
≥ 50%) CONFORME IDADE, GRAU DE CITOPENIAS E PORCENTAGEM DE BLASTOS.
Característica
(média ± DP)
Grau de Expressão Proteica (CDC20)
n = 33 p
< 10% 10-49% ≥50%
Idade (anos) 72,8 ± 14,7 51,2 ± 21,6 50,5 ± 19,8 0,042
Grau de citopenias
Hb (g/dL)
Neutrófilos (nº/mm3)
Plaquetas (nº/mm3)
9,2 ± 3,2
1.781 ± 1.324
171.400 ± 110.022
9,0 ± 3,1
2.380 ± 1.957
190.465 ± 189.493
9,2 ± 2,7
1.129 ± 1.360
83.250 ± 108.834
0,996
0,210
0,311
% de blastos 1,8 ± 3,5 1,8 ± 3,6 5,6 ± 3,7 0,067
76
FIGURA 39. IDADE NO MOMENTO DO DIAGNÓSTICO NOS PACIENTES DO GRUPO SMD
CONFORME O GRAU DE EXPRESSÃO DA PROTEÍNA CDC20 (p = 0,042).
O Quadro 20 mostra a associação entre os diferentes graus de expressão de CDC20 (< 10%,
10-49% e ≥ 50%) conforme outras variáveis categóricas. Pacientes com expressão baixa ou moderada
apresentaram mais frequentemente citopenias menos pronunciadas, maior frequência de cariótipos não
aneuploides e foram classificados como baixo risco pelo IPSS.
No grupo de alta expressão, cem por cento dos pacientes apresentaram três displasias (n = 3) e
cariótipo alterado (n = 4). A maioria dos pacientes (75%) deste grupo possuía duas a três citopenias,
cariótipo aneuploide e dependência transfusional (n = 3). Esse mesmo grupo de pacientes apresentou, de
forma estatisticamente significante, maior frequência de plaquetopenias mais graves (< 50.000/mm3),
assim como maior frequência de evolução para óbito, em relação aos grupos de baixa e moderada
expressão (p= 0,036 e p= 0,015, respectivamente - Qui-Quadrado), conforme demonstrado nas figuras 40
e 41.
p = 0,045
p = 0,02 p = 0,97
77
A maioria dos pacientes do grupo de baixa expressão (77,8%) foi constituída por
pacientes > 60 anos (n = 7), enquanto que, no grupo de expressão moderada, 70% desses (n = 14) tinham
idade ≤ 60 anos (p = 0,056, Qui-Quadrado – Figura 42).
Metade dos pacientes com alta expressão (n = 2) apresentou cariótipo complexo, diferentemente
do observado nos grupos de leve e moderada expressão, em que se observou predomínio de cariótipo não
complexo (100%, n = 7 e 88,2%, n = 15, respectivamente), obtendo-se p = 0,066 (Qui-Quadrado - Figura
43). Pacientes com alta expressão proteica apresentaram mais frequentemente cariótipo alterado (100%,
n = 4) e aneuploide (75%, n = 3), não se observando, no entanto, diferenças estatisticamente significantes
com relação aos grupos de leve e moderada expressão (p = 0,097 e 0,077, respectivamente).
78
QUADRO 20. CARACTERÍSTICAS DEMOGRÁFICAS, CLÍNICAS, LABORATORIAIS E
CLASSIFICAÇÃO IPSS CONFORME GRAU DE EXPRESSÃO DA PROTEÍNA CDC20 (<10%, 10-49%
e ≥ 50%)
Variável
Grau de Expressão Proteica (CDC20)
p
< 10% 10-49% ≥50%
Sexo
Feminino 5 (55,6%) 12 (60,0%) 1 (25,0%) 0,438
Masculino 4 (44,4%) 8 (40,0%) 3 (75,0%)
Idade
≤ 60 anos 2 (22,2%) 14 (70,0%) 2 (50,0%) 0,056
> 60 anos 7 (77,8%) 6 (30,0%) 2 (50,0%)
Origem
Rural 4 (44,4%) 8 (40,0%) 1 (25,0%) 0,800
Urbana 5 (55,6%) 12 (60,0%) 3 (75,0%)
Celularidade MO
Normocelular 2 (22,2%) 4 (20,0%) 1 (33,3%) 0,768
Hipocelular 2 (22,2%) 7 (35,0%) 0
Hipercelular 5 (55,6%) 9 (45,0%) 2 (66,7%)
Citopenias
0/1 4 (44,4%) 11 (55,0%) 1 (25,0%) 0,527
2/3 5 (55,6%)
9 (45,0%)
3 (75,0%)
Hb
< 8,0 g/dL 3 (33,3%) 7 (35,0%) 2 (50,0%) 0,830
≥ 8,0 g/dL 6 (66,7%) 13 (65,0%) 2 (50,0%)
Neutrófilos < 800/mm
3 1 (11,1%)
3 (15,0%)
2 (50,0%)
0,206
≥ 800/mm3 8 (88,9%) 17 (85,0%) 2 (50,0%)
Plaquetas
< 50.000/mm3 1 (11,1%) 4 (20,0%) 3 (75,0%) 0,036
≥ 50.000/mm3 8 (88,9%) 16 (80,0%) 1 (25,0%)
Displasias
0/1 3 (33,3%) 5 (27,8%) 0 0,222 2 4 (44,4%) 6 (33,3%) 0
3 2 (22,2%) 7 (38,9%) 3 (100,0%)
Cariótipo - IPSS
Favorável 6 (85,7%) 8 (47,1%) 1 (25,0%) 0,173 Intermediário 0 6 (35,3%) 1 (25,0%)
Desfavorável 1 (14,3%) 3 (17,6%) 2 (50,0%)
Cariótipo Normal 4 (57,1%) 10 (58,8%) 0 0,097
Alterado 3 (42,9%) 7 (41,2%) 4 (100,0%)
Ploidia Euploidia 6 (85,7%) 13 (76,5%) 1 (25,0%) 0,077
Aneuploidia 1 (14,3%) 4 (23,5%) 3 (75,0%)
Cariótipo -
complexidade
Complexo 0 2 (11,8%) 2 (50,0%) 0,066
Não complexo 7 (100,0%) 15 (88,2%) 2 (50,0%)
IPSS Risco
Baixo + Int-1 5 (71,4%) 14 (93,3%) 2 (50,0%) 0,113
Int-2 + Alto 2 (28,6%) 1 (6,7%) 2 (50,0%)
Dependência
transfusional
Sim 4 (44,4%) 7 (35,0%) 3 (75,0%) 0,332
Não 5 (55,6%) 13 (65,0%) 1 (25,0%)
Óbito Não 7 (77,8%) 18 (90,0%) 1 (25,0%) 0,015
Sim 2 (22,2%) 2 (10,0%) 3 (75,0%)
79
0,0%
20,0%
40,0%
60,0%
80,0%
100,0%
< 10% 10-49% ≥ 50%
Plaquetas < 50.000/mm3
Plaquetas ≥ 50.000/mm3
0,0%
20,0%
40,0%
60,0%
80,0%
100,0%
< 10% 10-49% ≥ 50%
Óbito
Em tratamento
FIGURA 40. PORCENTAGEM DE CASOS COM PLAQUETAS < 50.000/mm3 OU ≥ 50.000/mm
3 NO
GRUPO SMD CONFORME O GRAU DE EXPRESSÃO DA PROTEÍNA CDC20 (<10%, 10-49%
E ≥ 50%) (p = 0,036). Observou-se proporção significativamente maior de pacientes com plaquetas
< 50.000/mm3 no grupo de expressão alta (> 50%) em comparação ao grupo de expressão baixa (< 10%) e
moderada (10-49%) de CDC20 (p < 0,05).
FIGURA 41. PORCENTAGEM DE CASOS QUE EVOLUÍRAM PARA ÓBITO OU QUE SE
ENCONTRAM EM TRATAMENTO NO GRUPO SMD CONFORME O GRAU DE EXPRESSÃO DA
PROTEÍNA CDC20 (<10%, 10-49% E ≥ 50%) (p = 0,015).
80
0,0%
20,0%
40,0%
60,0%
80,0%
100,0%
< 10% 10-49% ≥ 50%
Cariótipo Não Complexo
Cariótipo Complexo
0,0%
20,0%
40,0%
60,0%
80,0%
100,0%
< 10% 10-49% ≥ 50%
Idade ≤ 60 anos
Idade > 60 anos
FIGURA 42. PORCENTAGEM DE CASOS COM IDADE ≤ 60 ANOS OU > 60 ANOS NO GRUPO SMD
CONFORME O GRAU DE EXPRESSÃO DA PROTEÍNA CDC20 (<10%, 10-49% E ≥ 50%) (p = 0,056).
FIGURA 43. PORCENTAGEM DE CASOS COM CARIÓTIPO COMPLEXO OU NÃO COMPLEXO NO
GRUPO SMD CONFORME O GRAU DE EXPRESSÃO DA PROTEÍNA CDC20 (<10%, 10-49%
E ≥ 50%) (p = 0,066).
81
A Figura 44 mostra os diferentes graus de expressão da proteína CDC20 à microscopia óptica
(aumento de 400x).
FIGURA 44. IMUNOISTOQUÍMICA MOSTRANDO DIFERENTES GRAUS DE EXPRESSÃO DA
PROTEÍNA CDC20 EM BMO DE PACIENTES PORTADORES DE SMD (400x). A) EXPRESSÃO
NEGATIVA; B) EXPRESSÃO FRACA (< 10%): seta indicando duas células com expressão nuclear;
C) EXPRESSÃO MODERADA (10-49%): seta destacando megacariócito com expressão nuclear;
D) EXPRESSÃO FORTE (≥ 50%): setas mostram dois megacariócitos sem expressão em meio a células
com expressão proteica positiva.
B
D
C
82
4.2.4.3. AURORA B (expressão por grupos < 10%, 10-49%)
O Quadro 21 sumariza as médias com respectivos desvios-padrão de variáveis clínicas de acordo
com diferentes graus de marcação da proteína AURORA B, não sendo observadas diferenças
estatisticamente significantes.
QUADRO 21. EXPRESSÃO QUANTITATIVA DA PROTEÍNA AURORA B POR GRUPOS
(< 10% E 10-49%) CONFORME IDADE, GRAU DE CITOPENIAS E PORCENTAGEM DE BLASTOS.
Característica
(média ± DP)
Grau de Expressão Proteica (AURORA B)
n = 13 p
< 10% 10-49%
Idade (anos) 54,0 ± 28,4 59,7 ± 24,6 0,604
Grau de citopenias
Hb (g/dL)
Neutrófilos (nº/mm3)
Plaquetas (nº/mm3)
7,4 ± 3,4
1866 ± 1949
72.350 ± 106.723
8,8 ± 2,5
2312 ± 1849
198.811 ± 196.143
0,710
0,503
0,260
% de blastos 0,7 ± 0,9 4,3 ± 5,9 0,283
83
O Quadro 22 mostra a associação entre os diferentes graus de marcação da AURORA B
(< 10% e 10-49%) e diversas variáveis categóricas clinicamente relevantes. Setenta e cinco por cento dos
pacientes com baixa expressão (n = 3) apresentaram cariótipo normal e não aneuploide, observando-se,
em todos esses pacientes, cariótipo não complexo (n = 4), sendo 75% (n = 3) classificados como
citogenética favorável pelo IPSS. Ainda neste grupo, 66,7% (n= 2) apresentaram duas displasias e 75%
(n = 3) apresentaram duas a três citopenias e a mesma proporção (75%) apresentou dependência
transfusional (n = 3) e plaquetopenias mais pronunciadas (< 50.000/mm3) (n = 3). Além disso, todos os
pacientes desse grupo (n = 3) foram de baixo risco pelo IPSS. No grupo com expressão moderada, a
maioria dos pacientes teve cariótipo não complexo (88,9%, n = 8), citopenias menos graves (em relação
à contagem de neutrófilos e plaquetas, 88,9%, n = 8 e 77,8%, n =7), sendo classificados como de baixo
risco pelo IPSS (77,8%, n = 7). Seis pacientes (75%) apresentaram três displasias, sendo que no grupo de
expressão baixa, nenhum paciente apresentou tal característica. Esta última característica associou-se a
um valor de p= 0,077.
84
QUADRO 22. CARACTERÍSTICAS DEMOGRÁFICAS, CLÍNICAS, LABORATORIAIS E
CLASSIFICAÇÃO IPSS CONFORME GRAU DE EXPRESSÃO DA PROTEÍNA AURORA B
(<10% E 10-49%)
Variável
Grau de Expressão Proteica (AURORA B)
(AURORA B)
p
< 10% 10-49%
Sexo
Feminino 3 (75,0%) 4 (44,4%) 0,559
Masculino 1 (25,0%) 5 (55,6%)
Idade
≤ 60 anos 2 (50,0%) 4 (44,4%) 0,853
> 60 anos 2 (50,0%) 5 (55,6%)
Origem
Rural 2 (50,0%) 5 (55,6%) 0,853
Urbana 2 (50,0%) 4 (44,4%)
Celularidade MO
Normocelular 0 2 (25,0%) 0,472
Hipocelular 2 (50,0%) 2 (25,0%)
Hipercelular 2 (50,0%) 4 (50,0%)
Citopenias
0/1 1 (25,0%) 5 (55,6%) 0,343
2/3 3 (75,0%)
4 (44,4%)
Hb
< 8,0 g/dL 2 (40,0%) 4 (44,4%) 0,657
≥ 8,0 g/dL 2 (50,0%) 5 (55,6%)
Neutrófilos < 800/mm
3 2 (50,0%)
1 (11,1%)
0,203
≥ 800/mm3 2 (50,0%) 8 (88,9%)
Plaquetas
< 50.000/mm3 3 (75,0%) 2 (22,2%) 0,119
≥ 50.000/mm3 1 (25,0%) 7 (77,8%)
Displasias
0/1 1 (33,3%) 1 (12,5%) 0,077
2 2 (66,7%) 1 (12,5%)
3 0 6 (75,0%)
Cariótipo – IPSS
Favorável 3 (75,0%) 5 (55,6%) 0,586
Intermediário 1 (25,0%) 2 (22,2%)
Desfavorável ZERO 2 (22,2%)
Cariótipo Normal 3 (75,0%) 3 (33,3%) 0,217
Alterado 1 (25,0%) 6 (66,7%)
Ploidia Euploidia 3 (75,0%) 6 (66,7%) 0,646
Aneuploidia 1 (25,0%) 3 (33,3%)
Cariótipo -
complexidade
Complexo 0 1 (11,1%) 0,692
Não complexo 4 (100,0%) 8 (88,9%)
IPSS Risco
Baixo + Int-1 3 (100%) 7 (77,8%) 0,545
Int-2 + Alto 0 2 (22,2%)
Dependência
transfusional
Sim 3 (75,0%) 5 (55,6%) 0,506
Não 1 (25,0%) 4 (44,4%)
Óbito Não 2 (50,0%) 4 (44,4%) 0,853
Sim 2 (50,0%) 5 (55,6%)
85
A Figura 45 mostra diferentes graus de expressão da proteína AURORA B à microscopia óptica
(aumento de 400x).
FIGURA 45. IMUNOISTOQUÍMICA MOSTRANDO DIFERENTES GRAUS DE EXPRESSÃO DA
PROTEÍNA AURORA B EM BMO DE PACIENTES PORTADORES DE SMD (400x). A) EXPRESSÃO
NEGATIVA; B) EXPRESSÃO FRACA (< 10%): a seta menor mostra uma célula com expressão nuclear em
meio a várias células com expressão negativa, enquanto a seta maior representa um megacariócito com
expressão negativa; C) EXPRESSÃO MODERADA (10-49%).
A
B
C
86
4.3. Análise de sobrevida
A sobrevida média dos pacientes foi de 38,9 ± 20,4 (2 – 69) meses. Dez pacientes faleceram
durante o tempo do estudo.
4.3.1. MAD2
Em relação à análise qualitativa, nenhum paciente com expressão negativa de MAD2, evoluiu para
óbito durante o estudo, o que nos impossibilitou uma avaliação comparativa entre os grupos com
expressão positiva versus negativa versus óbito.
Dentre os pacientes com expressão positiva, aqueles com alta expressão de MAD2 - ≥ 50% (n = 8; 5
óbitos) apresentaram sobrevida significativamente menor do que os pacientes com expressão < 50% (n =
27; 5 óbitos), p= 0,002 - Figura 46A). Ao analisarmos a sobrevida média dos pacientes com expressão
negativa ou < 50% (n = 32; 5 óbitos) versus os pacientes com expressão ≥ 50% (n = 8; 5 óbitos),
observamos diferenças estatisticamente significantes, p < 0,001 (Figura 47A).
O Quadro 23 mostra os resultados da análise da sobrevida dos pacientes portadores de SMD, em
relação à expressão de MAD2.
QUADRO 23. ANÁLISE DO TEMPO DE SOBREVIDA DOS PACIENTES PORTADORES DE
SMD DE ACORDO COM A EXPRESSÃO DE MAD2
Expressão Óbito (n) Sobrevida (meses) – IC 95% p
Análise qualitativa
Negativa (n= 5) ZERO * N/D
Positiva (n= 35) 10 *
Análise por grupos
< 50% (n= 27) 5 59,4 ± 4,0* 0,002
≥ 50% (n= 8) 5 28,3 ± 7,8*
Análise por grupos (com inclusão do grupo com expressão negativa)
Expressão negativa e/ou
< 50% (n = 32) 5
60,8 ± 3,5**
< 0,001
≥ 50% (n = 8) 5 28,3 ± 7,8**
* Análise não realizada pelo fato de todos os óbitos terem ocorrido no grupo de expressão positiva; **
Resultados expressos em média ± erro padrão da média; N/D: não disponível;
87
4.3.2. CDC20
Em relação à análise qualitativa de CDC20, dentre os dez pacientes que evoluíram para óbito
durante o período do estudo, sete apresentaram expressão positiva desta proteína (n= 33) e três, expressão
negativa (n= 7). Não houve diferenças significativas em relação à sobrevida na análise comparativa entre
esses dois grupos (Quadro 24, p= 0,313).
Dentre os pacientes com expressão positiva desta proteína (n= 33), quatro falecerem no grupo com
expressão < 50% (n = 29) e três pacientes faleceram no grupo com expressão ≥ 50% (n= 4), observando-se
significância estatística). (Quadro 24 - p= 0,005 – Figura 46B). Ao analisarmos a sobrevida média dos
pacientes com expressão negativa ou < 50% (n = 36; 7 óbitos) versus os pacientes com expressão ≥ 50%
(n = 4; 3 óbitos), também observamos diferenças novamente estatisticamente significantes, p = 0,013
(Figura 47B).
O Quadro 24 mostra os resultados da análise da sobrevida dos pacientes portadores de SMD, em
relação à expressão de CDC20.
QUADRO 24. ANÁLISE DO TEMPO DE SOBREVIDA DOS PACIENTES PORTADORES DE
SMD DE ACORDO COM A EXPRESSÃO DE CDC20
Expressão Óbito (n) Sobrevida (meses) – IC 95% p
Análise qualitativa
Negativa (n= 7) 3 47,9 ± 9,4* 0,313
Positiva (n= 33) 7 56,7 ± 4,1*
Análise por grupos
< 50% (n= 29) 4 60,8 ± 3,8* 0,005
≥ 50% (n= 4) 3 31,2 ± 11,5*
Análise por grupos (com inclusão do grupo com expressão negativa)
Expressão negativa e/ou
< 50% (n = 36) 7 58,1 ± 3,7*
0,013
≥ 50% (n = 4) 3 31,2 ± 11,5*
* Resultados expressos em média ± erro padrão da média
4.2.4. AURORA B
A avaliação da sobrevida dos pacientes em relação à análise qualitativa de AURORA B mostrou que
três pacientes com expressão negativa (n= 27) evoluíram para óbito; no grupo com expressão positiva (n=
13), sete faleceram no período do estudo, obtendo-se p = 0,001 (Quadro 25).
88
Na análise por grupos (<10% versus ≥ 10%), temos que dois pacientes (n= 4) do grupo com
expressão < 10% falecerem durante o estudo, enquanto no grupo com expressão ≥ 10% (n = 9), cinco
evoluíram para óbito, o que não alcançou significância estatística, p= 0,666 (Quadro 25, Figura 46C). Ao
analisarmos a sobrevida média dos pacientes com expressão negativa ou < 10% (n = 31; 5 óbitos) versus
os pacientes com expressão ≥ 10% (n = 9; 5 óbitos), observamos diferenças estatisticamente significantes,
p = 0,002 (Quadro 25, Figura 47C).
O Quadro 25 mostra os resultados da análise da sobrevida dos pacientes portadores de SMD, em
relação à expressão de AURORA B.
QUADRO 25. ANÁLISE DO TEMPO DE SOBREVIDA DOS PACIENTES PORTADORES DE
SMD DE ACORDO COM A EXPRESSÃO DE AURORA B
Expressão Óbito (n) Sobrevida (meses) – IC 95% p
Análise qualitativa
Negativa (n = 27) 3 62,9 ± 3,4* 0,001
Positiva (n = 13) 7 34,3 ± 6,4*
Análise por grupos
< 10% (n = 4) 2 41,7 ± 6,4* 0,666
≥ 10% (n = 9) 5 31,0 ± 8,0*
Análise por grupos (com inclusão do grupo com expressão negativa)
Expressão negativa e/ou <
10% (n = 31) 5 60,7 ± 3,5*
0,002
≥ 10% (n = 9) 5 31,0 ± 8,0*
* Resultados expressos em média ± erro padrão da média
4.2.5. AURORA A
A análise da sobrevida em relação à proteína AURORA A (apenas análise qualitativa) encontra-se
descrita no Quadro 26. Não encontramos diferenças significantes em relação ao tempo de sobrevida
comparando-se os pacientes com expressão positiva (n = 12) versus expressão negativa (n = 22). Quatro
pacientes faleceram em ambos os grupos, p = 0,254.
89
QUADRO 26. ANÁLISE DO TEMPO DE SOBREVIDA DOS PACIENTES PORTADORES DE
SMD DE ACORDO COM A EXPRESSÃO DE AURORA A
Expressão Óbito (n) Sobrevida (meses) – IC 95% p
Análise qualitativa
Negativa (n= 22) 4 59,0 ± 4,4* 0,254
Positiva (n= 12) 4 49,1 ± 8,1*
* Resultados expressos em média ± erro padrão da média
90
FIGURA 46. SOBREVIDA GLOBAL DE ACORDO COM A ANÁLISE QUALITATIVA:
A) MAD2; B) CDC20; C) AURORA A; D) AURORA B. LEGENDA: LINHA AZUL –
EXPRESSÃO NEGATIVA; LINHA VERDE – EXPRESSÃO POSITIVA.
A
B
C
D
p = 0,313
p = 0,209
p = 0,254
p = 0,001
91
FIGURA 47. SOBREVIDA GLOBAL DE ACORDO COM A ANÁLISE QUANTITATIVA
(ENTRE OS PACIENTES COM EXPRESSÃO POSITIVA): A) MAD2 – EXPRESSÃO < 50%
VERSUS ≥ 50%; B) CDC20 - EXPRESSÃO < 50% VERSUS ≥ 50%; C) AURORA B -
EXPRESSÃO < 10% VERSUS ≥ 10%. LEGENDA: LINHA AZUL – EXPRESSÃO < 50%
OU < 10%; LINHA VERDE – EXPRESSÃO ≥ 50% OU ≥ 10%.
FIGURA 48. SOBREVIDA GLOBAL DE ACORDO COM DIFERENTES GRAUS DE
EXPRESSÃO PROTEICA: A) MAD2 - EXPRESSÃO NEGATIVA E/OU < 50% VERSUS ≥ 50%;
B) CDC20 - EXPRESSÃO NEGATIVA E/OU < 50% VERSUS ≥ 50%; C) AURORA B -
EXPRESSÃO NEGATIVA E/OU < 10% VERSUS ≥ 10%. LEGENDA: LINHA AZUL –
EXPRESSÃO NEGATIVA E/OU < 50% OU < 10%; LINHA VERDE – EXPRESSÃO ≥ 50%
OU ≥ 10%.
nbnvbnbvn
A
B
C
A
B
C
p = 0,002
p = 0,005
p = 0,666
p < 0,001
p = 0,013
p = 0,002
92
5. DISCUSSÃO
Este estudo retrospectivo foi desenvolvido para avaliar a imunoexpressão de proteínas
relacionadas ao ponto de checagem mitótico (CDC20 e MAD2) e ao fuso mitótico (AURORA A e
AURORA B) em biópsias de medula óssea de pacientes portadores de SMD, assim como detectar
associação entre expressão dessas proteínas e características epidemiológicas, clínicas e laboratoriais
nesse grupo de pacientes. A avaliação da expressão proteica foi realizada de forma qualitativa (positiva
versus negativa) e quantitativa (essa última realizada pela análise da porcentagem de expressão de células
positivas assim como pela expressão por grupos, < 10%, 10-49%, ≥ 50%). Além disso, foi realizada
análise qualitativa da expressão proteica de controles (amostras de biópsias de medula óssea de
portadores de linfomas não Hodgkin, na ausência de infiltração medular pela doença).
A heterogeneidade da SMD é algo intrigante, razão pela qual as pesquisas, que têm como objetivo
caracterizar as diferenças existentes entre portadores dessa doença, como o presente estudo, possuem
grande potencial na expansão de nossos conhecimentos sobre sua fisiopatogenia, evolução clínica e
prognóstico, auxiliando na escolha da melhor opção terapêutica. Até o momento desconhece-se qualquer
estudo prévio na literatura que tenha avaliado a expressão dessas proteínas em biópsias de medula óssea
de pacientes com SMD.
5.1. Dados epidemiológicos
Dados epidemiológicos sobre SMD no Brasil são escassos, levando-se em conta a população
brasileira e as dimensões continentais do nosso país. Estudo prévio realizado por MAGALHÃES et al.
(2010), que incluiu 476 pacientes das regiões Nordeste, Sudeste e Sul, a idade mediana dos pacientes foi
de 68,3 anos (Registro Nacional de SMD). Estudo realizado em um único centro com 102 pacientes, no
estado do Ceará, mostrou idade mediana de 64 anos (COSTA et al., 2013). Outro estudo realizado no
estado do Rio Grande do Norte, no qual foram incluídos 29 pacientes, a idade média do grupo foi de 57,3
anos (FERREIRA JUNIOR; IVO; PONTES, 2013). Nosso estudo mostrou mediana de idade de 59,5
anos, sendo que 50% dos pacientes apresentaram idade > 60 anos, concordando com dados nacionais.
Países ocidentais, como Austrália, Holanda, Alemanha e outros, possuem resultados distintos em
seus estudos epidemiológicos, com medianas de idade variando entre 71 e 77 anos (AVGERINOU et al.,
2013; DINMOHAMED et al., 2014; MA, 2012; MA et al., 2007; MAYNADIE et al., 1996;
MCQUILTEN et al., 2013; NOLTE et al., 2012; PHEKOO et al., 2006). Por outro lado, países orientais
(Japão, China, Índia e outros) apresentam medianas de idade inferiores, entre 50 a 60 anos, dados mais
próximos aos encontrados no nosso grupo (DAKSHINAMURTHY et al., 2005; LEE et al., 1999;
OGUMA et al., 1995; ZHAO et al., 2002).
93
O fato de o Brasil possuir medianas de idades inferiores aos encontrados nos países ocidentais
pode ser explicado pela grande heterogeneidade genética da população e/ou pela exposição a fatores
ambientais que contribuem para o desenvolvimento de SMD. Alguns estudos epidemiológicos
(BOWEN, 2013; NISSE et al., 2001; RIGOLIN et al., 1998; SCHNATTER et al., 2012) sugerem que
exposição ocupacional a solventes orgânicos, pesticidas, derivados de petróleo, entre outros, contribuem
para o desenvolvimento de SMD primária. Atualmente, o Brasil ocupa a terceira posição no ranking dos
maiores produtores agrícolas do mundo, sendo líder no consumo de agrotóxicos (CARNEIRO;
ALMEIDA, 2010). Dados do Censo agropecuário de 2006 demonstram o uso exacerbado de agrotóxicos
em todo o país. O Ceará é o quarto maior usuário de agrotóxicos do Brasil, e o primeiro do Nordeste
(IBGE, 2007). Em nosso estudo, doze pacientes (31,6%) relataram histórico de exposição a agentes
mielotóxicos (solventes e agrotóxicos), acima do encontrado em estudo americano com 365 pacientes,
no qual apenas 8% dos casos havia sido exposta à agrotóxicos e 19,4%, à solventes (ELHOR GBITO;
GARCIA-MANERO; STROM, 2014).
É importante ressaltar que o envelhecimento da população brasileira está se acentuando e que a
incidência dessa doença é maior à medida que aumenta a faixa etária. Segundo dados do IBGE (2011),
em 2050, a expectativa de vida será de 81,3 anos. Portanto, devemos esperar um aumento na incidência
dessa doença no Brasil nos próximos anos (IBGE, 2008).
A distribuição entre os sexos obteve uma relação H/M de 1, mostrando homogeneidade em
relação a essa característica. Esse resultado está de acordo com registros internacionais que mostram
relação H/M variando de 1,1 a 2 (CHEN, B. et al., 2005; GREENBERG, P. et al., 1997; HAASE et al.,
2007; OGUMA et al., 1995; SOLE et al., 2005).
Em relação à procedência dos pacientes, a maioria (61,5%) residia em área urbana, dado distinto
de estudo recente realizado na Grécia, no qual houve predomínio de portadores de SMD oriundos de
região rural, sendo 53,5% do total de 721 pacientes. (AVGERINOU et al., 2013).
5.2. Dados clínicos
De acordo com a literatura (DAKSHINAMURTHY et al., 2005; HAASE, 2008; HAASE et al.,
2007; SOLE et al., 2005), a maioria dos pacientes do estudo era portadora de SMD de novo, sendo
apenas 7,5% dos casos (três pacientes) classificados como SMD secundária, dois submetidos à
quimioterapia e um à imunossupressão com azatioprina.
O grupo predominante, pela classificação OMS foi o CRDM (41% dos casos), seguido por
CRDU, ARSA e SMD inclassificável (12,8% dos casos). A minoria dos pacientes foi classificada com
AREB I ou AREB II, em concordância com outros estudos (FERREIRA JUNIOR et al., 2013; PARK et
al., 2008). Entretanto, dados da literatura em relação a essa característica são variáveis além de muitos
94
estudos mostrarem resultados de acordo com a classificação OMS de 2001(GERMING et al., 2012;
HAASE et al., 2007; MALCOVATI et al., 2011).
Em relação à classificação IPSS, a maioria dos pacientes foram classificados como de baixo risco
(baixo risco + intermediário 1), também em concordância com registros nacionais e internacionais
(AVGERINOU et al., 2013; ELHOR GBITO et al., 2014; HAASE et al., 2007; MAGALHAES et al.,
2010; MALCOVATI et al., 2011; MAYNADIE et al., 1996; PARK et al., 2008; PHEKOO et al.,
2006; YAGISAWA et al., 2012).
Houve dependência transfusional em 43,6% dos casos de acordo com o critério de MALCOVATI
et al. (2011), resultado inferior ao estudo de MAGALHÃES et al. (2010) e HEREDIA et al. (2012), no
qual a maioria dos pacientes portadores de SMD (66,3 e 62,3%, respectivamente) apresentou
dependência transfusional. Essa discrepância pode ser explicada provavelmente pela presença de níveis
de hemoglobina menos graves nos pacientes do presente estudo, com 64,1% dos mesmos apresentando
Hb ≥ 8,0 g/dL ao diagnóstico, assim como pelo menor número de pacientes estudados, em comparação
aos outros dois estudos nacionais supracitados.
As citopenias foram menos graves na maioria dos pacientes, utilizando-se a caracterização das
mesmas pelo IPSS revisado (2012) e categorizando os pacientes em apenas dois grupos em relação ao
valor de hemoglobina e ao número de plaquetas. O IPSS revisado categoriza os pacientes em três grupos,
em se tratando dos valores de hemoglobina (< 8,0 g/dL, > 8,0 g/dL e < 10,0 g/dL e > 10,0 g/dL) e das
contagens plaquetárias (< 50.000/mm3, > 50.000/mm
3 e < 100.000/mm
3 e > 100.000/mm
3) e em dois
grupos, em se tratando do número de neutrófilos (< 800/mm3 e > 800/mm
3). Nosso estudo tomou como
referência o menor valor das variáveis, ou seja, hemoglobina < 8,0 g/dL, neutrófilos < 800/mm3 e
plaquetas < 50.000/mm3. A opção por comparar grupos com citopenias mais graves e a não utilização da
divisão original do IPSS revisado, deve-se ao nosso interesse em conhecer a expressão das proteínas do
nosso estudo, no grupo de pacientes com doença mais grave (sendo o grau das citopenias um dos
critérios de gravidade). Houve concordância com dados da literatura, nos quais a maioria dos pacientes
apresenta citopenias menos graves, porém com a ressalva de que, em muitos estudos, os critérios usados
foram o do IPSS original, que as classifica de maneira distinta (MISHRA et al., 2013; NEUKIRCHEN
et al., 2014; VOSO et al., 2013).
Apesar de grande parte dos casos de SMD apresentarem medula hipercelular (47,4%), a
frequência de medula hipocelular (28,9%) observada em nosso estudo foi maior do que o descrito na
literatura internacional (entre 10%-20% dos casos) (CATENACCI; SCHILLER, 2005; DELLA PORTA
et al., 2009; GERMING et al., 2008) e de acordo com estudos nacionais, os quais relatam frequência de
medula hipocelular em aproximadamente um quarto dos casos (LORAND-METZE et al., 2004;
VASSALO J., 2009). A hipercelularidade de medula óssea se relaciona à própria patogênese da doença,
95
na qual a apoptose excessiva, presente nos estágios iniciais da doença é contrabalanceada pelo aumento
na proliferação das células progenitoras hematopoéticas. Essas alterações proliferativas podem ser uma
característica intrínseca do clone neoplásico ou podem estar relacionadas a interações autócrinas e/ou
parácrinas de citocinas (BERNASCONI, 2008; ISHIBASHI; TAMURA; OGATA, 2011; MUFTI,
2004).
De acordo com a literatura, nosso estudo mostrou alteração citogenética em 51,5% dos pacientes
(n = 17) do grupo SMD, dentre 33 casos nos quais houve células em metáfase. Destes, apenas 15,2
(n = 5) apresentaram cariótipo complexo e 21,2% (n = 7) apresentaram citogenética desfavorável (pelo
IPSS), também em concordância com estudos prévios internacionais (BERNASCONI, 2008;
DAKSHINAMURTHY et al., 2005; HAASE, 2008; HAASE et al., 2007; ISHIBASHI et al., 2011;
MUFTI, 2004; SOLE et al., 2005). No entanto, ao compararmos esses resultados com estudos nacionais
identificamos resultados distintos, visto que ROMEO et al. (2002) encontraram frequência de 35,2%
(12/34) de citogenética anormal, enquanto PINHEIRO e CHAUFFAILLE (2009), observaram 20,5%
(9/44) de pacientes com alterações citogenéticas.
5.3. Expressão proteica qualitativa
Nosso estudo mostrou que a maioria dos pacientes apresentou expressão proteica positiva de
MAD2 e CDC20 (87,5 e 82,5%, respectivamente), sendo menor a frequência de positividade para as
proteínas AURORA A e B (35,3 e 32,5%, respectivamente).
A presença de grande número de pacientes com expressão positiva pode ser explicada pela
associação entre expressão aumentada dessas proteínas e instabilidade cromossômica, sabidamente
presente em SMD, já que todas elas são importantes para o correto alinhamento cromossômico e
separação das cromátides-irmãs no ciclo celular (DUCAT; ZHENG, 2004; MERALDI et al., 2002;
MONDAL et al., 2007; MUSACCHIO; SALMON, 2007; SUDAKIN et al., 2001).
Não encontramos positividade para as proteínas CDC20 e AURORA B nos controles, sendo que
50% desses apresentaram positividade para MAD2 e 14,3% para AURORA A.
5.3.1. MAD2
Nosso estudo encontrou associação entre expressão negativa de MAD2 e maior número de
citopenias (p= 0,04). Todos os pacientes do grupo com expressão negativa (100%, n = 5) apresentaram
duas a três citopenias, enquanto que 48,6% (n = 17) dos casos do grupo com expressão positiva
apresentaram nenhuma ou apenas uma citopenia. Algumas hipóteses poderiam explicar o achado de
ausência de expressão (visto MAD2 ser proteína normalmente expressa nas células): i) a quantidade
proteica nesses casos é muito baixa, indetectável in vitro; ii) pode se tratar de casos com mutação,
96
deleção, perda alélica ou perda de heterozigosidade do gene MAD2 (cromossomo 4q27), não detectada
pela citogenética clássica; iii) ou tais casos podem ter sofrido silenciamento gênico por alterações
epigenéticas. Expressão de MAD2 baixa ou ausente leva a falhas na segregação cromossômica,
aneuploidias e poliploidias, já que a sinalização do ponto de checagem mitótico encontra-se diminuída,
com potencial separação prematura de cromátides-irmãs (SCHUYLER et al., 2012). Ademais, a
apoptose aumentada de células progenitoras alteradas (aneuploides) na medula óssea poderia levar ao
surgimento de maior número de citopenias presentes no sangue periférico. Baixa expressão proteica foi
encontrada em carcinoma de nasofaringe, neoplasias de ovário e testículo, além de linhagens celulares de
mieloma múltiplo (BURUM-AUENSEN et al., 2010; DIAZ-RODRIGUEZ et al., 2011; WANG, X. et
al., 2002; WANG, X. et al., 2000). O gene MAD2 encontra-se no cromossomo 4q27, e existem dados da
literatura de casos com deleção (4q) e dissomia uniparental em SMD de baixo risco, não se encontrando
associação com prognóstico (DALLA TORRE et al., 2002; MOHAMEDALI et al., 2007).
5.3.2. CDC20
Pacientes com marcação negativa para CDC20 apresentaram plaquetopenias mais graves, visto
que 66,7% dos pacientes desse grupo (n = 7) apresentaram plaquetas < 50.000/mm3
(p = 0,038). Esse
mesmo grupo (expressão negativa) apresentou médias menores (média ± DP) da contagem plaquetária
em comparação ao grupo com expressão negativa (p = 0,039). Tal associação poderia ser explicada pelo
fato de células com baixos níveis (ou mesmo na ausência) da proteína CDC20 permanecerem mais
tempo em metáfase, levando a um atraso para o início da anáfase. Com isso, haveria mais instabilidade
cromossômica, com surgimento de casos mais "agressivos" de SMD, caracterizados pela presença de
citopenias mais graves.
De forma similar à MAD2, as hipóteses que poderiam ser levantadas para esses casos com
expressão negativa de CDC20 (visto CDC20 ser proteína normalmente expressa nas células), são: i) a
quantidade proteica nesses casos é muito baixa, indetectável in vitro; ii) tais casos podem apresentar
mutação, deleção, perda alélica ou perda de heterozigosidade do gene CDC20 (cromossomo 1p34), não
detectada pela citogenética clássica; iii) ou tais casos podem ter sofrido silenciamento gênico por
alterações epigenéticas. Um estudo demonstrou 36% de casos de SMD com perda de heterozigosidade
do cromossomo 1p (DE SOUZA FERNANDEZ et al., 2000) e outro, perda alélica em 30% de casos de
SMD que evoluíram para LMA (MORI et al., 2003). Há um relato de caso na literatura de SMD com
resultado de citogenética de quase-tiploidia, o qual apresentava del (5q) associada à del (1p) e del (13q).
Trata-se de resultado citogenético raro em neoplasias mielóides, mais frequente em casos de LLA. Este
caso apresentava pancitopenia ao hemograma, medula óssea hipercelular, com dismegacariocitopoese e
diseritropoese (KIM, B. R. et al., 2012). Entretanto, é de suma importância salientar que, dos 7 pacientes
97
com expressão negativa do grupo SMD, 5 (62,5%) apresentaram plaquetas < 50.000/mm3, o que justifica
os achados estatísticos encontrados, sem, no entanto, poder representar uma alteração clinicamente
significante.
5.3.3. AURORA B
No grupo de pacientes com expressão positiva de AURORA B (n = 13), 38,5% (n = 5) evoluíram
para óbito no período do estudo, achado significativamente maior quando comparado ao grupo com
expressão negativa (n = 27), no qual apenas 7,7% (n = 2) tiveram tal desfecho (p = 0,03). AURORA B
tem papel importante na biorientação dos cromossomos durante a metáfase e só permite a progressão da
metáfase para anáfase após todos os cinetócoros estarem corretamente conectados ao microtúbulo do
fuso mitótico, possuindo, portanto, ação na citocinese (CARMENA et al., 2009; DEWAR et al., 2004).
Além disso, atua na condensação cromossômica (pela fosforilação de histonas), no final da fase G2 e
início da mitose, agindo também na metilação H3K9 (OTA et al., 2002). Dessa forma, o aumento de sua
expressão pode levar a divisões celulares errôneas (por finalização da mitose sem que a célula tenha
passado pelas modificações inerentes da metáfase e anáfase) e silenciamento gênico por metilação do
DNA, ambos fatores que podem ser associados à quadros clínicos mais graves de SMD, contribuindo
para piores desfechos clínicos, como óbito. Isso foi visto por alguns pesquisadores em carcinoma
indiferenciado de tireoide, com achado da associação entre expressão de AURORA B em tumores mais
agressivos, como o subtipo anaplásico (SORRENTINO et al., 2005). Outros autores encontraram menor
sobrevida geral em pacientes com superexpressão de AURORA B em carcinomas de cabeça e pescoço
(ERPOLAT et al., 2012).
5.3.4. AURORA A
Apesar de nossas limitações na análise da proteína AURORA A, alguns achados interessantes
foram encontrados e em concordância com outros estudos. Expressão positiva de AURORA A foi
significativamente mais frequente em pacientes com citogenética anormal (p = 0,034) e aneuploide
(p = 0,001). Além disso, enquanto nenhum paciente com expressão negativa dessa proteína apresentou
cariótipo complexo, 36,4% do grupo com expressão positiva (n=4), tiveram resultado complexo à análise
citogenética (p = 0,019). Estudos mostraram que expressão aumentada de AURORA A leva à
tumorigênese e instabilidade genética, pela sua associação com amplificação dos centrossomos e geração
de fusos multipolares, os quais resultam em células aneuploides (LI, J. J.; LI, 2006; WARNER et al.,
2003). A figura 49 ilustra a possível relação entre hiperexpressão de AURORA A e surgimento de
aneuploidia em SMD. Esses fatos poderiam explicar nossos achados, entretanto, não conseguimos
98
distinguir, pela análise quantitativa, se havia presença de superexpressão da proteína AURORA A (entre
os casos positivos).
FIGURA 49. POSSÍVEL ASSOCIAÇÃO ENTRE HIPEREXPRESSÃO DE AURORA A E
SURGIMENTO DE ANEUPLOIDIA EM SMD.
Estudo recente (HEREDIA; DE SOUSA; JUNIOR; et al., 2014) analisando amplificação e
expressão do gene da proteína AURORA A (AURKA) em pacientes portadores de SMD, mostrou que
9,8% dos casos (4 dentre 41 casos) apresentaram amplificação desse gene, sendo que um desses casos
apresentava cariótipo alterado e aneuploide (sendo o caso que apresentou maior amplificação gênica).
Ainda, nesse mesmo grupo de pacientes, não foram observadas alterações na expressão gênica em
relação ao número de citopenias, à presença ou ausência de dependência transfusional, à presença de
cariótipo normal ou alterado, aneuploide ou não aneuploide e à classificação IPSS (HEREDIA, 2012).
Outros estudos (LASSMANN et al., 2009; LUCENA-ARAUJO et al., 2011; PARK et al., 2008; SEN
et al., 2002) demonstraram associação entre superexpressão gênica de AURKA e alterações
cromossômicas, de forma semelhante aos achados do nosso estudo (analisando expressão proteica) e
distinto do estudo de HEREDIA et al. (2012), que não encontrou tal associação. Pesquisas envolvendo
tumores de mama, bexiga, fígado e linfomas encontraram amplificação e superexpressão de AURKA
(BRIASSOULI et al., 2007; HEREDIA; DE SOUSA; RIBEIRO JUNIOR; et al., 2014; TONG et al.,
2004). Recentemente, estudo com 70 casos de LMA de novo, LUCENA-ARAUJO et al. (2011) mostrou
associação entre presença de alterações citogenéticas desfavoráveis e aumento de expressão gênica de
AURKA.
Não encontramos diferenças entre os grupos SMD e controles em relação à expressão proteica
qualitativa de AURORA A. Isso pode ter ocorrido pelo menor número de controles, pelas dificuldades
na leitura dessas amostras ou pelo fato de essa proteína ser expressa de forma fisiológica nas nossas
células. Além disso, não podemos descartar que haja influências da doença de base (no caso, linfomas
99
não Hodgkin) na expressão de AURORA A em células hematopoéticas dos controles (por mecanismos
desconhecidos), mesmo na ausência de infiltração.
5.4. Expressão proteica quantitativa
5.4.1. MAD2
De forma geral, houve maior expressão proteica de MAD2 (em %, média ± DP) nos pacientes mais
graves (presença de mais citopenias e/ou displasias, presença de dependência transfusional, IPSS alto
risco, citopenias mais graves, citogenética anormal, aneuploidia e desfecho fatal) (Quadro 14).
Entretanto, conseguimos encontrar diferenças estatisticamente significantes (p < 0,05) em apenas dois
parâmetros clínicos: 1) gravidade da plaquetopenia (42,6 ± 22,8% em portadores de plaquetas
< 50.000/mm3 vs. 22,7 ± 19,1% naqueles com contagem ≥ 50.000/mm
3), com p = 0,008; 2) evolução
para óbito (46,9 ± 27,0% nos que faleceram vs. 20,8 ± 13,8% nos que permaneceram vivos), com
p = 0,002. Ademais, pacientes com duas a três citopenias e três displasias apresentaram expressão
proteica muito superior (33,3 ± 22,5% e 37,2 ± 26,7%, respectivamente) àqueles com menor número de
citopenias (nenhuma ou uma, sendo 22,9 ± 20,0%) e apenas uma (17,6 ± 13,9%) ou duas displasias
(19,9 ± 7,1%), apesar de esse resultado não ter atingir significância estatística (p = 0,095 em relação ao
número de citopenias e 0,094 em relação ao número de displasias).
Em se tratando da expressão de MAD2 por grupos (expressão leve, moderada e alta), os pacientes
com alta expressão (≥ 50%) apresentaram (de forma significativa do ponto de vista estatístico) mais
frequentemente plaquetopenias mais graves (< 50.000/mm3) e taxa de óbito, quando comparados aos
pacientes com menores graus de expressão proteica (p = 0,042 e p = 0,036, respectivamente). Além
disso, a média do percentual de blastos (média ± DP) foi muito maior nesse mesmo grupo (alta
expressão) em comparação aos outros (0,12 ± 0,25% de blastos no grupo com expressão leve; 1,8 ± 3,3%
no grupo com expressão moderada e 3,8 ± 5,5%, no grupo com alta expressão). Esse achado atingiu um
valor de p marginalmente significante (p= 0,098).
Os resultados de expressão proteica quantitativa de MAD2 ressaltam a importância dessa proteína
na regulação do ciclo celular. Expressão aumentada da MAD2 aumenta as chances de que células
poliploides sejam formadas, já que leva a uma conexão muito estável entre microtúbulos do fuso
mitótico e cinetócoros. Esse fato, consequentemente, aumenta a probabilidade de que células com
ligações inadequadas entre tais estruturas - microtúbulo e fuso mitótico - terminem o ciclo celular.
Hiperexpressão de MAD2 leva à instabilidade cromossômica e estudos em animais sugerem que esse
aumento em sua expressão seja um evento precoce na tumorigênese (MORISHITA et al., 2012). Os
nossos achados da associação entre maiores expressões (em média ± DP e em grupos de expressão leve,
100
moderada e alta) e plaquetopenias mais graves, maior evolução para óbito, assim como maior número de
citopenias, displasias e porcentual de blastos, sugere que a hiperexpressão de MAD2 ocorre em SMD
mais agressiva, o que está de acordo com estudos prévios em tumores sólidos, como em neoplasias de
fígado, estômago e ossos (TANAKA et al., 2001; WANG, L. et al., 2009; WU; CHI; HUANG, 2004;
YU et al., 2010; ZHANG, S. H. et al., 2008). Nosso estudo também está de acordo com o estudo
multicêntrico de GREENBERG et al. (2012), realizado com o objetivo de revisar a classificação IPSS
original de 1997 (GREENBERG, P. et al., 1997). Nesse grande estudo, o grupo de pacientes com
plaquetas < 50.000/mm3 apresentou sobrevida global de 1,6 anos e evolução para LMA (em 25% dos
pacientes) em 3,1 anos, enquanto que pacientes com contagens plaquetária entre 50.000/mm3 e <
100.000/mm3 e ≥ 100.000/mm
3 tiveram sobrevida global e evolução para LMA (em 25% dos casos) de
2,8 e 3,1 anos e 5,1 e 8,7 anos, respectivamente.
Estudo realizado com expressão gênica do gene MAD2L1 em SMD não encontrou diferenças em
sua expressão comparando-se diferentes características clínicas dos pacientes, como classificação IPSS,
dependência transfusional, citogenética alterada e/ou aneuploide, número de citopenias e celularidade da
medula óssea. Esse fato nos sugere que a expressão proteica de MAD2 nem sempre se associa a
aumentos na sua expressão gênica, podendo dever-se a alterações pós-translacionais. Nesse mesmo
estudo, houve diferenças significativas entre a maioria desses parâmetros no grupo SMD quando
comparado aos controles (HEREDIA, 2012).
O achado concomitante da associação do maior número de citopenias com expressões aumentadas
de MAD2 (em média ± DP) e com expressão negativa dessa mesma proteína (análise qualitativa)
fortalece o fato de que expressões alteradas de MAD2 (superexpressão ou hipoexpressão) associam-se a
diferentes comportamentos da SMD, o que foi visto por outros (DIAZ-RODRIGUEZ et al., 2011;
DOBLES et al., 2000; HERNANDO et al., 2004; MICHEL, L. S. et al., 2001).
Não encontramos estudos analisando a expressão proteica de MAD2 em medula óssea de
portadores de SMD na literatura, o que torna nossos resultados estimulantes para que novas pesquisas
envolvendo outros processos fisiopatológicos associados a essa doença sejam realizadas.
5.4.2. CDC20
A análise qualitativa (em média ± DP) da proteína CDC20, de forma semelhante à MAD2, mostrou
que pacientes portadores de SMD mais graves, de forma geral, apresentaram maiores expressões
proteicas, como visto em: maior número de displasias, presença de dependência transfusional, IPSS alto
risco, citopenias mais graves, cariótipo complexo, citogenética alterada, cariótipo aneuploide, maior
número de citopenias, presença de > 5% de blastos e evolução para óbito (Quadro 15). Essa diferença de
expressão atingiu significância estatística (p < 0,05) em se tratando de presença de três displasias
101
(p = 0,017), plaquetas < 50.000/mm3 (p = 0,017) e presença de cariótipo complexo (p = 0,03).
Encontramos uma tendência estatística nos pacientes com maior expressão de CDC20 e neutrófilos
< 800/mm3
(p = 0,05) e citogenética aneuploide (p = 0,053).
Na interpretação da expressão proteica por diferentes grupos de expressão (baixa, moderada e alta)
foi demonstrado que pacientes com alta expressão (≥ 50%) apresentaram maior proporção de pacientes
com plaquetopenias mais graves, ou seja, < 50.000/mm3 (p = 0,036), assim como de pacientes com idade
mais jovem ao diagnóstico da doença (p = 0,042) e maior frequência de evolução para óbito (p = 0,015).
Outros resultados clinicamente relevantes, porém marginalmente significantes, consistiram na maior
proporção de pacientes com idade > 60 anos (p = 0,056) e com cariótipo não complexo (p = 0,066) entre
os pacientes com baixa expressão proteica. Somando-se a isso, uma proporção considerável de pacientes
com alta expressão proteica apresentou cariótipo aneuploide (p = 0,077) e esse mesmo grupo (alta
expressão proteica) apresentou maior porcentual de blastos (p = 0,098).
Esses achados corroboram o fato de que a superexpressão de CDC20 leva à ativação inadequada e
prematura do CPA, à instabilidade cromossômica e a anormalidades na duplicação dos centrossomos
(FANG et al., 1998; LIU et al., 2010). Foi sugerido que a instabilidade centrossômica é um fenômeno
precoce em SMD e pode contribuir para anormalidade citogenéticas, visto que alterações nos
centrossomos foram encontradas em medula óssea de pacientes com diagnóstico de SMD, antes que
fossem detectadas alterações cromossômicas (NOLTE et al., 2013). Além disso, número alterado de
centrossomos leva a formação de aneuploidias, como demonstrado em tumores de cabeça e pescoço
(MONDAL et al., 2007). Portanto, a presença da superexpressão de CDC20 pode estar associada à maior
grau de instabilidade cromossômica, levando a doenças mais graves, já que se sabe que anormalidades
cromossômicas constituem um dos principais fatores prognóstico de SMD (BEJAR et al., 2011;
GRAUBERT; WALTER, 2011). Isso foi demonstrado pelos achados de expressão aumentada e
plaquetopenias e neutropenias mais graves, maior número de displasias, cariótipo complexo, citogenética
aneuploide e aumento na porcentagem de blastos. Alguns autores demonstraram associação entre grau de
plaquetopenia e pior prognóstico (sobrevida e progressão para LMA), incluindo o estudo para revisão do
IPSS (AL AMERI et al., 2011; CORDOBA et al., 2012; GREENBERG, P. L. et al., 2012;
KANTARJIAN et al., 2007). Análises similares foram feitas em relação ao grau de neutropenia
(CORDOBA et al., 2012; GONZALEZ-PORRAS et al., 2011), que mostraram piores desfechos (menor
sobrevida global e tempo para transformação leucêmica) em pacientes com SMD e menor número de
neutrófilos. O grupo de pacientes com neutrófilos < 800/mm3, do estudo para revisão do IPSS
(GREENBERG, P. L. et al., 2012), apresentou menor sobrevida quando comparado ao grupo de
pacientes com ≥ 800 neutrófilos/mm3 (1,9 versus 4,4 anos, respectivamente). Transformação leucêmica
102
(em 25% dos casos) ocorreu em 1,9 e 9,2 anos, respectivamente. A provável associação entre
hiperexpressão de CDC20 e surgimento de cariótipo complexo encontra-se ilustrada na figura 50.
A superexpressão de CDC20 associada à idade mais jovem poderia representar doença mais grave,
com pior prognóstico, como demonstrado em alguns estudos que analisaram SMD em indivíduos mais
jovens (CHANG, K. L. et al., 2002; FENAUX et al., 1990). Entretanto, outras pesquisas encontraram
resultados distintos (BRECCIA et al., 2005; OGUMA et al., 1995). GREENBERG et al. (2012),
mostrando que pacientes com idade > 60 anos tiveram piores evoluções (menor sobrevida e menor
tempo para transformação leucêmica). Não podemos excluir o fato de que pacientes mais idosos
poderiam apresentar expressões proteicas menores como reflexo de um fenômeno associado à
senescência e não como representação de uma expressão anormal, visto que a expressão de CDC20 deve
ocorrer de forma fisiológica nas células, pela sua importância para a ocorrência do ciclo celular
(PETERS, 2006).
Achados associados ao prognóstico de tumores sólidos e superexpressão de CDC20 foram vistos
em neoplasias de pulmão, pâncreas, ovário e sistema nervoso central (CHANG, D. Z. et al., 2012;
KATO et al., 2012; MARUCCI et al., 2008; OUELLET et al., 2006), o que se assemelha aos nossos
achados.
O estudo de HEREDIA et al. (2012) avaliou a expressão gênica de CDC20 em SMD e, de modo
similar aos resultados de MAD2, não conseguiu demonstrar associação entre aumento da expressão
gênica e variáveis clínicas como celularidade da medula óssea, número de citopenias, dependência
transfusional, citogenética alterada, cariótipo aneuploide e classificação IPSS. Expressão aumentada de
CDC20 pode, portanto, estar relacionada a alterações pós-translacionais, como hipotetizado para MAD2,
e não ao aumento da expressão gênica.
Nossa análise qualitativa de CDC20 mostrou que pacientes com expressão negativa apresentaram
maior grau de plaquetopenia. Assim, podemos inferir, que tanto a hiperexpressão quanto a
hipoexpressão, poderia estar associada à doença mais grave. O achado de baixa expressão proteica de
CDC20 foi encontrado em um estudo que avaliou linhagens celulares de mieloma múltiplo
(DIAZ-RODRIGUEZ et al., 2011).
Assim como para MAD2, não foi encontrado na literatura estudos com imunoistoquímica para
CDC20 em medula óssea, em SMD, o que torna o presente estudo inovador para contribuição acerca da
patogenia dessa neoplasia hematológica. A figura 51 ilustra a provável associação entre expressão
anômala de CDC20 e MAD2 e desenvolvimento de plaquetopenias mais graves.
103
FIGURA 50. PROVÁVEL ASSOCIAÇÃO ENTRE HIPEREXPRESSÃO DE CDC20 E
SURGIMENTO DE CARIÓTIPO COMPLEXO EM SMD. Legenda: CPA: Complexo Promotor da
Anáfase.
FIGURA 51. PROVÁVEL ASSOCIAÇÃO ENTRE EXPRESSÃO ALTERADA DE MAD2 E
CDC20 E DESENVOLVIMENTO DE PLAQUETOPENIAS MAIS GRAVE EM SMD
(< 50.000/mm3). Legenda: CTH: células-tronco hematopoéticas. Fonte: Adaptado de TEFFERI e
VARDIMAN (2009).
104
5.4.3. AURORA B
A expressão de AURORA B (média ± DP) foi significativamente maior nos pacientes com
citogenética anormal, conforme descrito no quadro 16 (p = 0,037). Outro achado importante à análise
proteica por grupos de expressão baixa, moderada ou alta (apesar de não ter atingido significância
estatística), foi a proporção maior de pacientes com três displasias no grupo com expressão moderada
(10-49%) dessa proteína (p = 0,077).
AURORA B, quando hiperexpressa, pode fazer com que haja desconexão de cinetócoros e
microtúbulos do fuso mitótico de forma prematura, ou seja, antes da anáfase e da citocinese ocorrerem
adequadamente, levando a falhas na segregação cromossômica. Esse fato muito provavelmente está
envolvido na maior frequência de citogenética anormal no grupo de pacientes estudados. A figura 52
ilustra a provável associação entre hiperexpressão de AURORA B e surgimento de cariótipo alterado em
SMD.
FIGURA 52. PROVÁVEL ASSOCIAÇÃO ENTRE HIPEREXPRESSÃO DE AURORA B E
SURGIMENTO DE ALTERAÇÕES CITOGENÉTICAS EM SMD.
A interferência da proteína AURORA B na fosforilação de histona H3 em Ser10 e na metilação
H3K9 nos leva a acreditar que sua superexpressão possa estar associada, também, a alterações
epigenéticas e ao silenciamento gênico mais intensos, sugerindo que exista associação entre maior
expressão de AURORA B e doença mais agressiva. O encontro de maior número de displasias em
pacientes com expressões proteicas moderadas (10-49%) corrobora tais fatos.
Muitas pesquisas em neoplasias sólidas demonstraram que aumentos na expressão de AURORA B
se associa a agressividade tumoral, como estudos em tumores de tireoide (SORRENTINO et al., 2005),
endometriais (KURAI et al., 2005), neoplasias de células escamosas orais e de cabeça e pescoço
(ERPOLAT et al., 2012), tumores de pulmão (TAKESHITA et al., 2013) e de trato biliar (SHEN et al.,
105
2009). Tal agressividade tumoral poderia estar representada pelo encontro de maior número de pacientes
que evoluíram para óbito dentre aqueles com expressão positiva de AURORA B.
Da mesma forma que para as outras proteínas, não encontramos estudos abordando expressão
proteica de AURORA B em SMD, com apenas alguns investigando a expressão gênica dessa proteína.
Em neoplasias hematológicas, poucos estudos investigaram a expressão do gene AURKB. Um
estudo encontrou aumento na expressão gênica em leucemias de crianças (mieloide e linfoide)
(HARTSINK-SEGERS et al., 2013) e dois outros estudos nacionais demonstraram achados distintos.
Um foi realizado com portadores de SMD e demonstrou não haver diferenças entre expressão gênica de
AURKB em células hematopoéticas com citogenética normal ou alterada (OLIVEIRA et al., 2013).
O outro, também em SMD e expressão gênica, encontrou menores expressões do gene AURKB em
SMD hipocelular, quando comparada com SMD hiper e normocelular. Esse mesmo estudo não
encontrou diferenças na expressão gênica de AURORA B quando analisadas as seguintes variáveis
clínicas: número de citopenias, dependência, anormalidade citogenética, cariótipo aneuploide e
classificação IPSS (HEREDIA, 2012).
5.5. Sobrevida e expressão proteica
Nosso estudo mostrou que alta expressão de MAD2 (≥ 50%) e CDC20 (≥ 50%) foi associada à
menor tempo de sobrevida nos pacientes portadores de SMD. Em estudo prévio que avaliou a
imunoexpressão destas duas proteínas em carcinoma de bexiga, foram encontradas expressões elevadas
de MAD2 em 51% (173/339) dos casos e de CDC20 em 59% (200/339). Este mesmo estudo mostrou
que altas expressões de CDC20 correlacionaram-se com menor sobrevida livre de recorrência (p=
0,032). Além disso, expressões elevadas de CDC20 e MAD2 se associaram a pior sobrevida global (p=
0,007 e 0,008, respectivamente)(CHOI et al., 2013). Estes resultados reforçam a importância destas
proteínas, tanto na tumorigênese quanto no prognóstico das neoplasias.
Apesar do pequeno número de amostras avaliadas no presente estudo, nós identificamos
associação entre valores elevados de expressão de AURORA B e menor sobrevida global. Esta proteína
foi associada a maior mortalidade em mulheres afro-americanas portadoras de neoplasia de mama
(STEWART et al., 2013). Este pesquisador analisou 674 genes (incluindo genes específicos para
diferentes subtipos e estádios), com base na avaliação do registro de câncer de mama do Cancer
Genome Atlas (TCGA) e detectou expressão elevada de AURORA B dentre mulheres afrodescendentes,
o que explica parcialmente a alta mortalidade descrita neste grupo de pacientes.
106
Esse é o primeiro estudo avaliando a expressão das proteínas MAD2, CDC20, AURORA A e
AURORA B em biópsias de medula óssea de pacientes portadores de SMD. Nossos resultados levantam
hipóteses em relação ao real papel dessas proteínas tanto na patogênese, quanto no prognóstico e
tratamento dessa patologia, sendo, no entanto, necessária a realização de novas pesquisas a fim de
corroborar e completar os nossos achados. Atualmente, existem pesquisas utilizando inibidores de
AURORA A e B em linfomas agressivos e mieloma múltiplo, com resultados promissores
(FRIEDBERG et al., 2014; KELLY et al., 2013), o que estimula ainda mais o desenvolvimento de mais
estudos direcionados a avaliar a expressão dessas proteínas em pacientes com SMD.
A figura 53 ilustra as consequências do aumento da expressão das proteínas associadas ao ponto
de checagem mitótico (MAD2 e CDC20) e ao fuso mitótico (AURORA A e AURORA B) e suas
associações a piores sobrevidas em algumas neoplasias sólidas, assim como as prováveis implicações
dessas expressões alteradas em portadores de SMD.
107
FIGURA 53. EFEITOS DA EXPRESSÃO AUMENTADA DE PROTEÍNAS ASSOCIADAS AO
PONTO DE CHECAGEM MITÓTICO (MAD2 E CDC20) E AO FUSO MITÓTICO
(AURORA A E AURORA B), SUAS ASSOCIAÇÕES JÁ DEMONSTRADAS EM NEOPLASIAS
SÓLIDAS E AS PROVÁVEIS IMPLICAÇÕES DESSAS EXPRESSÕES AUMENTADAS EM
PORTADORES DE SMD: 1(ZHANG, S. H. et al., 2008);
2(KATO et al., 2012);
3(ERPOLAT et al.,
2012); 4(SHEN et al., 2009).
108
5.6 Limitações
Apesar da originalidade do presente estudo, algumas limitações devem ser discutidas. Estudos
avaliando expressão proteica em medula óssea normal apresentam grande dificuldade na aquisição de
seus controles, já que o modo ideal para isso seria a coleta de biópsia de medula óssea (BMO) de
indivíduos sadios e/ou doadores de medula óssea. Entretanto, atualmente a maioria dos doadores têm sua
medula coletada por aférese através de procedimento ambulatorial e por acesso venoso, sendo não tão
usuais as coletas em centro cirúrgico, sob anestesia geral. Somando-se a isso, sabemos que a BMO não é
procedimento simples e nem isento de riscos, para que seja realizado em indivíduos sadios. Esse fato nos
levou a tomar como amostras referenciais, ou seja, o grupo controle, biópsias provenientes de pacientes
portadores de linfoma não Hodgkin, cuja medula óssea não apresentava sinais de infiltração da doença.
Apesar de esses pacientes apresentarem medula óssea normal à análise histológica, não podemos afirmar
com certeza que a presença da doença de base, por si só (mesmo na ausência de invasão medular), não
poderia alterar a expressão das proteínas estudadas nas células hematopoéticas.
O ciclo celular necessita da ação dessas proteínas para que ocorra adequadamente, entretanto, não
sabemos qual o grau de expressão "normal" das mesmas nas células, assim como se existem diferenças
nas expressões entre os diversos tipos celulares de acordo com a sua taxa de proliferação. Ainda, a
imunoistoquímica possui limitações inerentes à técnica, podendo citar: presença de marcação celular
inespecífica, alterações nas imagens microscópicas dos tecidos (por presença de bolhas, dobras do
tecido, fendas, pigmentos, entre outros), dificuldade nas leituras de medulas hipocelulares, diferenças nas
sensibilidades dos anticorpos comerciais, não uniformidade dos sistemas de detecção, variabilidade na
leitura por diferentes patologistas, dentre outras (BARRA, 2006). Além do mais, houve grande
dificuldade na interpretação da expressão da proteína AURORA A, devido à presença de marcação
heterogênea na maioria das amostras e dos megacariócitos, levando-nos à não realização da interpretação
quantitativa da expressão dessa expressão. Ainda em relação à leitura das reações, optamos por não
realizar interpretação da intensidade de expressão como é feito muitas vezes em estudos envolvendo
imunoistoquímica, principalmente em neoplasias sólidas (KATO et al., 2012; TONG et al., 2004; WU
et al., 2004). Nós classificamos as amostras de acordo com a quantidade de células com expressão
proteica positiva, independente da intensidade encontrada. Isso pelo fato de a medula óssea ser um tecido
heterogêneo, com diferentes linhagens celulares, não sendo infrequentes diferenças na intensidade de
expressão entre as células em uma mesma amostra.
Por último, é importante salientar que poucos pacientes portadores de SMD do nosso estudo foram
classificados como de alto risco pelo IPSS, sendo quatro pertencentes ao grupo intermediário 2 e apenas
um classificado como alto risco. Além do mais, não foi possível o uso do IPSS-R pelo pequeno número
de pacientes em cada grupo de risco relacionado às alterações citogenéticas. Esses fatores dificultaram
109
nossa análise referente à expressão proteica no grupo de pacientes com doença mais agressiva (pelo
IPSS) assim como uma avaliação mais detalhada em relação aos grupos de risco pelo IPSS-R.
110
6. CONCLUSÃO
Este estudo encontrou associações interessantes entre a expressão de proteínas relacionadas ao
ponto de checagem mitótico (CDC20 e MAD2) e ao fuso mitótico (AURORA A e AURORA B) em
pacientes portadores de SMD.
Nos pacientes portadores de SMD, a grande maioria apresentou expressão positiva para MAD2 e
CDC20 (87,5% e 82,5%, respectivamente), sendo a frequência de casos positivos para a expressão das
proteínas AURORA A e AURORA B, 35,3% e 32,5%, respectivamente.
Nenhuma amostra controle apresentou expressão positiva para CDC20 e AURORA B; a
frequência de casos positivos para a expressão da proteína MAD2 nos controles foi de 50% e para a
proteína AURORA A foi de 14,3%; a expressão de MAD2, CDC20 e AURORA B foi
significativamente maior nos pacientes com SMD em comparação aos controles.
A frequência de pacientes com duas a três citopenias foi maior no grupo com expressão negativa
de MAD2; esse mesmo grupo de pacientes apresentou menor número de plaquetas ao hemograma; a
média de expressão em % de MAD2 foi significativamente mais alta entre os pacientes com
plaquetopenias mais graves e entre aqueles que evoluíram para óbito.
A frequência de pacientes com plaquetas < 50.000/mm3 foi maior no grupo com expressão
negativa de CDC20; a média de expressão em % de CDC20 foi significativamente mais alta entre os
pacientes com plaquetopenias mais graves, maior número de displasias e cariótipo complexo (pelo
IPSS); entre os pacientes com expressão de CDC20 < 10%, observaram-se médias de idade
significativamente maiores (ao diagnóstico de SMD).
Entre os pacientes com expressão de MAD2 e CDC20 ≥ 50%, observou-se maior proporção de
pacientes com plaquetopenias mais graves (< 50.000/mm3) e que evoluíram para óbito.
A frequência de pacientes que evoluíram para óbito foi maior no grupo com expressão positiva de
AURORA B; a média de expressão em % de AURORA B foi significativamente mais alta entre os
pacientes com cariótipo alterado.
Pacientes com expressões de MAD2 e CDC20 ≥ 50% apresentaram menor sobrevida global
quando comparados àqueles com expressões proteicas < 50%.
Pacientes com expressão de Aurora-B ≥ 10% apresentaram menor sobrevida global quando
comparados aos pacientes com expressão negativa e/ou < 10%.
111
A frequência de pacientes com cariótipo complexo ou alterado ou aneuploide foi maior no grupo
com expressão positiva de AURORA A, assim como a frequência de pacientes com dependência
transfusional.
112
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ACQUAVIVA, C.; PINES, J. The anaphase-promoting complex/cyclosome: APC/C. J Cell Sci, v.
119, n. Pt 12, p. 2401-4, Jun 15 2006.
AGGARWAL, S. et al. Role of immune responses in the pathogenesis of low-risk MDS and high-
risk MDS: implications for immunotherapy. Br J Haematol, v. 153, n. 5, p. 568-81, Jun 2011.
AL AMERI, A. et al. Significance of thrombocytopenia in myelodysplastic syndromes:
associations and prognostic implications. Clin Lymphoma Myeloma Leuk, v. 11, n. 2, p. 237-41,
Apr 2011.
ALVES, A. C. Histologia da medula óssea. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia,
v. 31, 2009.
AVGERINOU, C. et al. The incidence of myelodysplastic syndromes in Western Greece is
increasing. Ann Hematol, v. 92, n. 7, p. 877-87, Jul 2013.
BARRA, M. B. O uso da imunoistoquímica no diagnóstico: indicações e limitações. Revista da
AMRIGS, v. 50, n. 2, p. 173-184, 2006.
BEJAR, R. Prognostic models in myelodysplastic syndromes. Hematology Am Soc Hematol
Educ Program, v. 2013, p. 504-10, 2013.
BEJAR, R.; LEVINE, R.; EBERT, B. L. Unraveling the molecular pathophysiology of
myelodysplastic syndromes. J Clin Oncol, v. 29, n. 5, p. 504-15, Feb 10 2011.
BENNETT, J. M. et al. Proposals for the classification of the myelodysplastic syndromes. Br J
Haematol, v. 51, n. 2, p. 189-99, Jun 1982.
BERNASCONI, P. Molecular pathways in myelodysplastic syndromes and acute myeloid
leukemia: relationships and distinctions-a review. Br J Haematol, v. 142, n. 5, p. 695-708, Sep
2008.
BOLANOS-GARCIA, V. M. Aurora kinases. Int J Biochem Cell Biol, v. 37, n. 8, p. 1572-7, Aug
2005.
BOWEN, D. T. Occupational and environmental etiology of MDS. Best Pract Res Clin
Haematol, v. 26, n. 4, p. 319-326, Dec 2013.
BRAUNSTEIN, I. et al. Inhibitory factors associated with anaphase-promoting complex/cylosome
in mitotic checkpoint. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 104, n. 12, p. 4870-5, Mar 20 2007.
BRECCIA, M. et al. Myelodysplastic syndromes in patients under 50 years old: a single
institution experience. Leuk Res, v. 29, n. 7, p. 749-54, Jul 2005.
BRIASSOULI, P. et al. Aurora-A regulation of nuclear factor-kappaB signaling by
phosphorylation of IkappaBalpha. Cancer Res, v. 67, n. 4, p. 1689-95, Feb 15 2007.
113
BRITO, D. A.; RIEDER, C. L. Mitotic checkpoint slippage in humans occurs via cyclin B
destruction in the presence of an active checkpoint. Curr Biol, v. 16, n. 12, p. 1194-200, Jun 20
2006.
BURUM-AUENSEN, E. et al. Spindle proteins are differentially expressed in the various
histological subtypes of testicular germ cell tumors. J Carcinog, v. 9, p. 1, 2010.
CAMACHO, E. et al. Analysis of Aurora-A and hMPS1 mitotic kinases in mantle cell lymphoma.
Int J Cancer, v. 118, n. 2, p. 357-63, Jan 15 2006.
CARMENA, M.; RUCHAUD, S.; EARNSHAW, W. C. Making the Auroras glow: regulation of
Aurora A and B kinase function by interacting proteins. Curr Opin Cell Biol, v. 21, n. 6, p. 796-
805, Dec 2009.
CARNEIRO, F. F.; ALMEIDA, V. E. S. Brasil é o país que mais usa agrotóxico no mundo. J
Agrosoft, 2010. Disponível em: < www.agrosoft.org.br/agropag/214789.htm >. Acesso em:
05/01/2014.
CATENACCI, D. V.; SCHILLER, G. J. Myelodysplasic syndromes: a comprehensive review.
Blood Rev, v. 19, n. 6, p. 301-19, Nov 2005.
CHANG, D. Z. et al. Increased CDC20 expression is associated with pancreatic ductal
adenocarcinoma differentiation and progression. J Hematol Oncol, v. 5, p. 15, 2012.
CHANG, K. L. et al. Primary myelodysplasia occurring in adults under 50 years old: a
clinicopathologic study of 52 patients. Leukemia, v. 16, n. 4, p. 623-31, Apr 2002.
CHEN, B. et al. Clinical and cytogenetic features of 508 Chinese patients with myelodysplastic
syndrome and comparison with those in Western countries. Leukemia, v. 19, n. 5, p. 767-75, May
2005.
CHEN, R. H. et al. Association of spindle assembly checkpoint component XMAD2 with
unattached kinetochores. Science, v. 274, n. 5285, p. 242-6, Oct 11 1996.
CHOI, J. W. et al. High expression of spindle assembly checkpoint proteins CDC20 and MAD2 is
associated with poor prognosis in urothelial bladder cancer. Virchows Arch, v. 463, n. 5, p. 681-7,
Nov 2013.
CLUTE, P.; PINES, J. Temporal and spatial control of cyclin B1 destruction in metaphase. Nat
Cell Biol, v. 1, n. 2, p. 82-7, Jun 1999.
CORDOBA, I. et al. The degree of neutropenia has a prognostic impact in low risk
myelodysplastic syndrome. Leuk Res, v. 36, n. 3, p. 287-92, Mar 2012.
COSTA, M. B. et al. Revised IPSS cytogenetics in Brazilian patients correlates with prognosis in
myelodysplastics syndrome. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, v. 35, n.
Suplemento 1, 7/11/2013 2013.
114
DAKSHINAMURTHY, A. G. et al. Cytogenetic analysis of 52 Indian patients with de novo
myelodysplastic syndromes-a comparative analysis of results with reports from Asia. Ann
Hematol, v. 84, n. 5, p. 298-303, May 2005.
DALLA TORRE, C. A. et al. Myelodysplastic syndrome in childhood: report of two cases with
deletion of chromosome 4 and the Philadelphia chromosome. Leuk Res, v. 26, n. 6, p. 533-8, Jun
2002.
DAYYANI, F. et al. Cause of death in patients with lower-risk myelodysplastic syndrome.
Cancer, v. 116, n. 9, p. 2174-9, May 1 2010.
DE PAULA CARETA, F. et al. The Aurora A and B kinases are up-regulated in bone marrow-
derived chronic lymphocytic leukemia cells and represent potential therapeutic targets.
Haematologica, v. 97, n. 8, p. 1246-54, Aug 2012.
DE SOUZA FERNANDEZ, T. et al. Chromosomal alterations associated with evolution from
myelodysplastic syndrome to acute myeloid leukemia. Leuk Res, v. 24, n. 10, p. 839-48, Oct
2000.
DELLA PORTA, M. G. et al. Clinical relevance of bone marrow fibrosis and CD34-positive cell
clusters in primary myelodysplastic syndromes. J Clin Oncol, v. 27, n. 5, p. 754-62, Feb 10 2009.
DEWAR, H. et al. Tension between two kinetochores suffices for their bi-orientation on the
mitotic spindle. Nature, v. 428, n. 6978, p. 93-7, Mar 4 2004.
DIAZ-RODRIGUEZ, E. et al. Deficient spindle assembly checkpoint in multiple myeloma. PLoS
One, v. 6, n. 11, p. e27583, 2011.
DINMOHAMED, A. G. et al. Trends in incidence, initial treatment and survival of
myelodysplastic syndromes: A population-based study of 5144 patients diagnosed in the
Netherlands from 2001 to 2010. Eur J Cancer, v. 50, n. 5, p. 1004-12, Mar 2014.
DOAK, S. H. et al. Differential expression of the MAD2, BUB1 and HSP27 genes in Barrett's
oesophagus-their association with aneuploidy and neoplastic progression. Mutat Res, v. 547, n. 1-
2, p. 133-44, Mar 22 2004.
DOBLES, M. et al. Chromosome missegregation and apoptosis in mice lacking the mitotic
checkpoint protein Mad2. Cell, v. 101, n. 6, p. 635-45, Jun 9 2000.
DUCAT, D.; ZHENG, Y. Aurora kinases in spindle assembly and chromosome segregation. Exp
Cell Res, v. 301, n. 1, p. 60-7, Nov 15 2004.
DUTERTRE, S.; PRIGENT, C. Aurora-A overexpression leads to override of the microtubule-
kinetochore attachment checkpoint. Mol Interv, v. 3, n. 3, p. 127-30, May 2003.
ELHOR GBITO, K. Y.; GARCIA-MANERO, G.; STROM, S. S. Evaluation of epidemiological
factors in survival of patients with de novo myelodysplastic syndromes. Cancer Causes Control,
v. 25, n. 4, p. 425-35, Apr 2014.
ENJOJI, M. et al. BubR1 and AURKB overexpression are associated with a favorable prognosis
in gastric cancer. Mol Med Rep, v. 2, n. 4, p. 589-96, Jul-Aug 2009.
115
ERPOLAT, O. P. et al. High expression of nuclear survivin and Aurora B predicts poor overall
survival in patients with head and neck squamous cell cancer. Strahlenther Onkol, v. 188, n. 3, p.
248-54, Mar 2012.
FANG, G.; YU, H.; KIRSCHNER, M. W. The checkpoint protein MAD2 and the mitotic regulator
CDC20 form a ternary complex with the anaphase-promoting complex to control anaphase
initiation. Genes Dev, v. 12, n. 12, p. 1871-83, Jun 15 1998.
FARRUGGIO, D. C.; TOWNSLEY, F. M.; RUDERMAN, J. V. Cdc20 associates with the kinase
aurora2/Aik. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 96, n. 13, p. 7306-11, Jun 22 1999.
FENAUX, P. et al. de novo myelodysplastic syndromes in adults aged 50 or less. A report on 37
cases. Leuk Res, v. 14, n. 11-12, p. 1053-9, 1990.
FERREIRA JUNIOR, M. A.; IVO, M. A.; PONTES, E. R. C. J. Sobrevida e evolução leucêmica
de portadores de síndromes mielodisplásicas. Cad. Saúde Colet., v. 21, n. 2, p. 154-9, 2013.
FRIEDBERG, J. W. et al. Phase II study of alisertib, a selective Aurora A kinase inhibitor, in
relapsed and refractory aggressive B- and T-cell non-Hodgkin lymphomas. J Clin Oncol, v. 32, n.
1, p. 44-50, Jan 1 2014.
GARCIA-MANERO, G. Myelodysplastic syndromes: 2011 update on diagnosis, risk-stratification,
and management. Am J Hematol, v. 86, n. 6, p. 490-8, Jun 2011.
GARCIA-MANERO, G. et al. A prognostic score for patients with lower risk myelodysplastic
syndrome. Leukemia, v. 22, n. 3, p. 538-43, Mar 2008.
GERMING, U. et al. Epidemiology, classification and prognosis of adults and children with
myelodysplastic syndromes. Ann Hematol, v. 87, n. 9, p. 691-9, Sep 2008.
GERMING, U. et al. Evaluation of dysplasia through detailed cytomorphology in 3156 patients
from the Dusseldorf Registry on myelodysplastic syndromes. Leuk Res, v. 36, n. 6, p. 727-34, Jun
2012.
GONZALEZ-PORRAS, J. R. et al. Prognostic impact of severe thrombocytopenia in low-risk
myelodysplastic syndrome. Cancer, v. 117, n. 24, p. 5529-37, Dec 15 2011.
GRAUBERT, T.; WALTER, M. J. Genetics of myelodysplastic syndromes: new insights.
Hematology Am Soc Hematol Educ Program, v. 2011, p. 543-9, 2011.
GREENBERG, P. et al. International scoring system for evaluating prognosis in myelodysplastic
syndromes. Blood, v. 89, n. 6, p. 2079-88, Mar 15 1997.
GREENBERG, P. L. et al. Revised international prognostic scoring system for myelodysplastic
syndromes. Blood, v. 120, n. 12, p. 2454-65, Sep 20 2012.
HAASE, D. Cytogenetic features in myelodysplastic syndromes. Ann Hematol, v. 87, n. 7, p. 515-
26, Jul 2008.
116
HAASE, D. et al. New insights into the prognostic impact of the karyotype in MDS and
correlation with subtypes: evidence from a core dataset of 2124 patients. Blood, v. 110, n. 13, p.
4385-95, Dec 15 2007.
HAGTING, A. et al. Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and
reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1. J Cell Biol, v. 157, n. 7, p.
1125-37, Jun 24 2002.
HARTSINK-SEGERS, S. A. et al. Aurora kinases in childhood acute leukemia: the promise of
aurora B as therapeutic target. Leukemia, v. 27, n. 3, p. 560-8, Mar 2013.
HATA, T. et al. RNA interference targeting aurora kinase a suppresses tumor growth and
enhances the taxane chemosensitivity in human pancreatic cancer cells. Cancer Res, v. 65, n. 7, p.
2899-905, Apr 1 2005.
HEGYI, K. et al. Aurora kinase B expression in breast carcinoma: cell kinetic and genetic aspects.
Pathobiology, v. 79, n. 6, p. 314-22, 2012.
HEREDIA, F. F. Estudo de Proteínas Relacionadas ao Fuso Mitótico (AURORA A e
AURORA B) e Ponto de Checagem Mitótico (CDC20 E MAD2L1) em Pacientes Portadores
de Síndrome Mielodisplásica. 2012. 144 (DOUTORADO). Universidade Federal do Ceará
HEREDIA, F. F. et al. Proteins related to the spindle and checkpoint mitotic emphasize the
different pathogenesis of hypoplastic MDS. Leuk Res, v. 38, n. 2, p. 218-24, Feb 2014.
HERNANDO, E. et al. Rb inactivation promotes genomic instability by uncoupling cell cycle
progression from mitotic control. Nature, v. 430, n. 7001, p. 797-802, Aug 12 2004.
HIRAI, H. Molecular mechanisms of myelodysplastic syndrome. Jpn J Clin Oncol, v. 33, n. 4, p.
153-60, Apr 2003.
HUANG, X. F. et al. Aurora kinase inhibitory VX-680 increases Bax/Bcl-2 ratio and induces
apoptosis in Aurora-A-high acute myeloid leukemia. Blood, v. 111, n. 5, p. 2854-65, Mar 1 2008.
IBGE. Censo agropecuário 2006: resultados preliminares. 2007. Disponível em: <
http://www.ibge.gov.br/home/estatistica/economia/agropecuaria/censoagro/2006/tabela1_3_10.pdf
>. Acesso em: 15/01/2014.
______. Projeção da população. 2008. Disponível em: <
http://www.ibge.gov.br/home/estatistica/populacao/projecao_da_populacao/2008/piramide/piramid
e.shtm >. Acesso em: 15/01/2014.
IKEZOE, T. et al. Analysis of Aurora B kinase in non-Hodgkin lymphoma. Lab Invest, v. 89, n.
12, p. 1364-73, Dec 2009.
ISHIBASHI, M.; TAMURA, H.; OGATA, K. Disease progression mechanism in myelodysplastic
syndromes: insight into the role of the microenvironment. Leuk Res, v. 35, n. 11, p. 1449-52, Nov
2011.
117
JADERSTEN, M. et al. TP53 mutations in low-risk myelodysplastic syndromes with del(5q)
predict disease progression. J Clin Oncol, v. 29, n. 15, p. 1971-9, May 20 2011.
JAFFE, E. S. et al. Pathology and Genetics Of Tumours of the Haematopoietic and Lymphoid
Tissues 3.Lyon: International Agency for Reaseach on Cancer, 2001.
JEONG, S. J. et al. Transcriptional abnormality of the hsMAD2 mitotic checkpoint gene is a
potential link to hepatocellular carcinogenesis. Cancer Res, v. 64, n. 23, p. 8666-73, Dec 1 2004.
KANTARJIAN, H. et al. The incidence and impact of thrombocytopenia in myelodysplastic
syndromes. Cancer, v. 109, n. 9, p. 1705-14, May 1 2007.
KANTARJIAN, H. et al. Proposal for a new risk model in myelodysplastic syndrome that
accounts for events not considered in the original International Prognostic Scoring System.
Cancer, v. 113, n. 6, p. 1351-61, Sep 15 2008.
KATO, T. et al. Overexpression of CDC20 predicts poor prognosis in primary non-small cell lung
cancer patients. J Surg Oncol, v. 106, n. 4, p. 423-30, Sep 15 2012.
KE, Y. W. et al. Function and regulation of Aurora/Ipl1p kinase family in cell division. Cell Res,
v. 13, n. 2, p. 69-81, Apr 2003.
KELLY, K. R. et al. Phase I study of MLN8237-investigational Aurora A kinase inhibitor-in
relapsed/refractory multiple myeloma, Non-Hodgkin lymphoma and chronic lymphocytic
leukemia. Invest New Drugs, Dec 20 2013.
KIM, B. R. et al. A case of near-triploidy in myelodysplastic syndrome with del(5q) combined
with del(1p) and del(13q). Ann Lab Med, v. 32, n. 4, p. 294-7, Jul 2012.
KIM, J. M. et al. Identification of gastric cancer-related genes using a cDNA microarray
containing novel expressed sequence tags expressed in gastric cancer cells. Clin Cancer Res, v.
11, n. 2 Pt 1, p. 473-82, Jan 15 2005.
KITAGAWA, M. et al. Molecular pathology of myelodysplastic syndromes: biology of medullary
stromal and hematopoietic cells (review). Mol Med Report, v. 4, n. 4, p. 591-6, Jul-Aug 2011.
KOMROKJI, R. S.; ZHANG, L.; BENNETT, J. M. Myelodysplastic syndromes classification and
risk stratification. Hematol Oncol Clin North Am, v. 24, n. 2, p. 443-57, Apr 2010.
KURAI, M. et al. Expression of Aurora kinases A and B in normal, hyperplastic, and malignant
human endometrium: Aurora B as a predictor for poor prognosis in endometrial carcinoma. Hum
Pathol, v. 36, n. 12, p. 1281-8, Dec 2005.
LAD, L. et al. Kinetic analysis of Mad2-Cdc20 formation: conformational changes in Mad2 are
catalyzed by a C-Mad2-ligand complex. Biochemistry, v. 48, n. 40, p. 9503-15, Oct 13 2009.
LASSMANN, S. et al. Aurora A is differentially expressed and regulated in chromosomal and
microsatellite instable sporadic colorectal cancers. Mod Pathol, v. 22, n. 10, p. 1385-97, Oct 2009.
LEE, J. J. et al. Comparisons of prognostic scoring systems for myelodysplastic syndromes: a
Korean multicenter study. Leuk Res, v. 23, n. 5, p. 425-32, May 1999.
118
LI, D. et al. Overexpression of oncogenic STK15/BTAK/Aurora A kinase in human pancreatic
cancer. Clin Cancer Res, v. 9, n. 3, p. 991-7, Mar 2003.
LI, G. Q.; ZHANG, H. F. Mad2 and p27 expression profiles in colorectal cancer and its clinical
significance. World J Gastroenterol, v. 10, n. 21, p. 3218-20, Nov 1 2004.
LI, J. J.; LI, S. A. Mitotic kinases: the key to duplication, segregation, and cytokinesis errors,
chromosomal instability, and oncogenesis. Pharmacol Ther, v. 111, n. 3, p. 974-84, Sep 2006.
LI, Y. et al. MAD2 associates with the cyclosome/anaphase-promoting complex and inhibits its
activity. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 94, n. 23, p. 12431-6, Nov 11 1997.
LIANG, X. et al. Expression of aurora kinase A and B in chondrosarcoma and its relationship with
the prognosis. Diagn Pathol, v. 7, p. 84, 2012.
LIN, Z. Z. et al. Significance of Aurora B overexpression in hepatocellular carcinoma. Aurora B
Overexpression in HCC. BMC Cancer, v. 10, p. 461, 2010.
LITTLEPAGE, L. E.; RUDERMAN, J. V. Identification of a new APC/C recognition domain, the
A box, which is required for the Cdh1-dependent destruction of the kinase Aurora-A during mitotic
exit. Genes Dev, v. 16, n. 17, p. 2274-85, Sep 1 2002.
LIU, Q. et al. Nek2 targets the mitotic checkpoint proteins Mad2 and Cdc20: a mechanism for
aneuploidy in cancer. Exp Mol Pathol, v. 88, n. 2, p. 225-33, Apr 2010.
LOOK, A. T. Molecular Pathogenesis of MDS. Hematology Am Soc Hematol Educ Program, p.
156-60, 2005.
LORAND-METZE, I. et al. Factors influencing survival in myelodysplastic syndromes in a
Brazilian population: comparison of FAB and WHO classifications. Leuk Res, v. 28, n. 6, p. 587-
94, Jun 2004.
LUCENA-ARAUJO, A. R. et al. High expression of AURKA and AURKB is associated with
unfavorable cytogenetic abnormalities and high white blood cell count in patients with acute
myeloid leukemia. Leuk Res, v. 35, n. 2, p. 260-4, Feb 2011.
LUKACKOVA, R. et al. Molecular genetic methods in the diagnosis of myelodysplastic
syndromes. A review. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub, Nov 20
2013.
LUKASIEWICZ, K. B.; LINGLE, W. L. Aurora A, centrosome structure, and the centrosome
cycle. Environ Mol Mutagen, v. 50, n. 8, p. 602-19, Oct 2009.
MA, X. Epidemiology of myelodysplastic syndromes. Am J Med, v. 125, n. 7 Suppl, p. S2-5, Jul
2012.
MA, X. et al. Myelodysplastic syndromes: incidence and survival in the United States. Cancer, v.
109, n. 8, p. 1536-42, Apr 15 2007.
119
MAGALHAES, S. M. et al. Epidemiological and Clinicopathological Data From the Brazilian
Registry of Patients with Myelodysplastic Syndromes and Comparative Analysis Between
Different Geographic Areas. Blood, v. 116, n. 21, p. 785-786, 2010.
MAGALHÃES, S. M. M.; LORAND-METZE, I. Síndromes mielodisplásicas: protocolo de
exclusão. Rev Bras Hematol Hemoter, 2004.
MALCOVATI, L. et al. Impact of the degree of anemia on the outcome of patients with
myelodysplastic syndrome and its integration into the WHO classification-based Prognostic
Scoring System (WPSS). Haematologica, v. 96, n. 10, p. 1433-40, Oct 2011.
MALCOVATI, L. et al. Prognostic factors and life expectancy in myelodysplastic syndromes
classified according to WHO criteria: a basis for clinical decision making. J Clin Oncol, v. 23, n.
30, p. 7594-603, Oct 20 2005.
MARUCCI, G. et al. Gene expression profiling in glioblastoma and immunohistochemical
evaluation of IGFBP-2 and CDC20. Virchows Arch, v. 453, n. 6, p. 599-609, Dec 2008.
MAYNADIE, M. et al. Epidemiological characteristics of myelodysplastic syndrome in a well-
defined French population. Br J Cancer, v. 74, n. 2, p. 288-90, Jul 1996.
MCQUILTEN, Z. K. et al. Myelodysplastic syndrome incidence, transfusion dependence, health
care use, and complications: an Australian population-based study 1998 to 2008. Transfusion, v.
53, n. 8, p. 1714-21, Aug 2013.
MERALDI, P.; HONDA, R.; NIGG, E. A. Aurora-A overexpression reveals tetraploidization as a
major route to centrosome amplification in p53-/- cells. EMBO J, v. 21, n. 4, p. 483-92, Feb 15
2002.
MICHEL, L. et al. Complete loss of the tumor suppressor MAD2 causes premature cyclin B
degradation and mitotic failure in human somatic cells. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 101, n. 13,
p. 4459-64, Mar 30 2004.
MICHEL, L. S. et al. MAD2 haplo-insufficiency causes premature anaphase and chromosome
instability in mammalian cells. Nature, v. 409, n. 6818, p. 355-9, Jan 18 2001.
MISHRA, A. et al. Validation of the revised International Prognostic Scoring System in treated
patients with myelodysplastic syndromes. Am J Hematol, v. 88, n. 7, p. 566-70, Jul 2013.
MOHAMEDALI, A. et al. Prevalence and prognostic significance of allelic imbalance by single-
nucleotide polymorphism analysis in low-risk myelodysplastic syndromes. Blood, v. 110, n. 9, p.
3365-73, Nov 1 2007.
MONDAL, G. et al. Overexpression of Cdc20 leads to impairment of the spindle assembly
checkpoint and aneuploidization in oral cancer. Carcinogenesis, v. 28, n. 1, p. 81-92, Jan 2007.
MORI, N. et al. Progression of myelodysplastic syndrome: allelic loss on chromosomal arm 1p.
Br J Haematol, v. 122, n. 2, p. 226-30, Jul 2003.
120
MORISHITA, M. et al. Expression of mitotic-arrest deficiency 2 predicts the efficacy of
neoadjuvant chemotherapy for locally advanced uterine cervical cancer. Exp Ther Med, v. 3, n. 2,
p. 341-346, Feb 2012.
MUFTI, G. J. Pathobiology, classification, and diagnosis of myelodysplastic syndrome. Best Pract
Res Clin Haematol, v. 17, n. 4, p. 543-57, Dec 2004.
MURATA-HORI, M.; TATSUKA, M.; WANG, Y. L. Probing the dynamics and functions of
aurora B kinase in living cells during mitosis and cytokinesis. Mol Biol Cell, v. 13, n. 4, p. 1099-
108, Apr 2002.
MUSACCHIO, A.; SALMON, E. D. The spindle-assembly checkpoint in space and time. Nat Rev
Mol Cell Biol, v. 8, n. 5, p. 379-93, May 2007.
NAKANO, Y. et al. Mitotic arrest deficiency 2 induces carcinogenesis in mucinous ovarian
tumors. Oncol Lett, v. 3, n. 2, p. 281-286, Feb 2012.
NEUKIRCHEN, J. et al. Validation of the revised international prognostic scoring system (IPSS-
R) in patients with myelodysplastic syndrome: a multicenter study. Leuk Res, v. 38, n. 1, p. 57-64,
Jan 2014.
NGUYEN, P. L. The myelodysplastic syndromes. Hematol Oncol Clin North Am, v. 23, n. 4, p.
675-91, Aug 2009.
NIMER, S. D. An update on the molecular pathogenesis of myelodysplastic syndromes. Biol
Blood Marrow Transplant, v. 17, n. 1 Suppl, p. S11-4, Jan 2011.
NISSE, C. et al. Occupational and environmental risk factors of the myelodysplastic syndromes in
the North of France. Br J Haematol, v. 112, n. 4, p. 927-35, Mar 2001.
NOLTE, F. et al. Centrosome aberrations in bone marrow cells from patients with myelodysplastic
syndromes correlate with chromosomal instability. Ann Hematol, v. 92, n. 10, p. 1325-33, Oct
2013.
NOLTE, F. et al. Characteristics of MDS patients seen at private practices differ significantly
from those treated at university hospitals in Germany. J Cancer Res Clin Oncol, v. 138, n. 6, p.
953-7, Jun 2012.
OGUMA, S. et al. Clinical characteristics of Japanese patients with primary myelodysplastic
syndromes: a co-operative study based on 838 cases. Anemia Study Group of the Ministry of
Health and Welfare. Leuk Res, v. 19, n. 3, p. 219-25, Mar 1995.
OLIVEIRA, F. M. et al. Differential expression of AURKA and AURKB genes in bone marrow
stromal mesenchymal cells of myelodysplastic syndrome: correlation with G-banding analysis and
FISH. Exp Hematol, v. 41, n. 2, p. 198-208, Feb 2013.
OTA, T. et al. Increased mitotic phosphorylation of histone H3 attributable to AIM-1/Aurora-B
overexpression contributes to chromosome number instability. Cancer Res, v. 62, n. 18, p. 5168-
77, Sep 15 2002.
121
OUELLET, V. et al. Tissue array analysis of expression microarray candidates identifies markers
associated with tumor grade and outcome in serous epithelial ovarian cancer. Int J Cancer, v. 119,
n. 3, p. 599-607, Aug 1 2006.
PARK, M. J. et al. Is International Prognostic Scoring System (IPSS) still standard in predicting
prognosis in patients with myelodysplastic syndrome? External validation of the WHO
Classification-Based Prognostic Scoring System (WPSS) and comparison with IPSS. Eur J
Haematol, v. 81, n. 5, p. 364-73, Nov 2008.
PATRA, D.; DUNPHY, W. G. Xe-p9, a Xenopus Suc1/Cks protein, is essential for the Cdc2-
dependent phosphorylation of the anaphase- promoting complex at mitosis. Genes Dev, v. 12, n.
16, p. 2549-59, Aug 15 1998.
PEDERSEN-BJERGAARD, J.; ANDERSEN, M. T.; ANDERSEN, M. K. Genetic pathways in the
pathogenesis of therapy-related myelodysplasia and acute myeloid leukemia. Hematology Am Soc
Hematol Educ Program, p. 392-7, 2007.
PETERS, J. M. The anaphase promoting complex/cyclosome: a machine designed to destroy. Nat
Rev Mol Cell Biol, v. 7, n. 9, p. 644-56, Sep 2006.
PHEKOO, K. J. et al. The incidence and outcome of myeloid malignancies in 2,112 adult patients
in southeast England. Haematologica, v. 91, n. 10, p. 1400-4, Oct 2006.
PINES, J. Mitosis: a matter of getting rid of the right protein at the right time. Trends Cell Biol, v.
16, n. 1, p. 55-63, Jan 2006.
PINHEIRO, R. F.; CHAUFFAILLE, M. L. Comparison of I-FISH and G-banding for the detection
of chromosomal abnormalities during the evolution of myelodysplastic syndrome. Braz J Med
Biol Res, v. 42, n. 11, p. 1110-2, Nov 2009.
PINHEIRO, R. F.; CHAUFFAILLE, M. L. L. F. Síndrome mielodisplásica secundária à quimio ou
radioterapia: SMD relacionada ao tratamento. Rev. Bras. Hematol. Hemoter., 2006.
RHODES, D. R. et al. Large-scale meta-analysis of cancer microarray data identifies common
transcriptional profiles of neoplastic transformation and progression. Proc Natl Acad Sci U S A, v.
101, n. 25, p. 9309-14, Jun 22 2004.
RHYASEN, G. W.; STARCZYNOWSKI, D. T. Deregulation of microRNAs in myelodysplastic
syndrome. Leukemia, v. 26, n. 1, p. 13-22, Jan 2012.
RIGOLIN, G. M. et al. Exposure to myelotoxic agents and myelodysplasia: case-control study and
correlation with clinicobiological findings. Br J Haematol, v. 103, n. 1, p. 189-97, Oct 1998.
ROMEO, M. et al. Comparison of cytogenetics with FISH in 40 myelodysplastic syndrome
patients. Leuk Res, v. 26, n. 11, p. 993-6, Nov 2002.
SABBATTINI, P. et al. A novel role for the Aurora B kinase in epigenetic marking of silent
chromatin in differentiated postmitotic cells. EMBO J, v. 26, n. 22, p. 4657-69, Nov 14 2007.
SANTINI, V. et al. Epigenetics in focus: pathogenesis of myelodysplastic syndromes and the role
of hypomethylating agents. Crit Rev Oncol Hematol, v. 88, n. 2, p. 231-45, Nov 2013.
122
SCARPINI, S. et al. Impact of the expression of Aurora-A, p53, and MIB-1 on the prognosis of
urothelial carcinomas of the upper urinary tract. Urol Oncol, v. 30, n. 2, p. 182-7, Mar-Apr 2012.
SCHNATTER, A. R. et al. Myelodysplastic syndrome and benzene exposure among petroleum
workers: an international pooled analysis. J Natl Cancer Inst, v. 104, n. 22, p. 1724-37, Nov 21
2012.
SCHUYLER, S. C.; WU, Y. F.; KUAN, V. J. The Mad1-Mad2 balancing act - a damaged spindle
checkpoint in chromosome instability and cancer. J Cell Sci, v. 125, n. Pt 18, p. 4197-206, Sep 15
2012.
SEN, S. et al. Amplification/overexpression of a mitotic kinase gene in human bladder cancer. J
Natl Cancer Inst, v. 94, n. 17, p. 1320-9, Sep 4 2002.
SHEN, Y. C. et al. Nuclear overexpression of mitotic regulatory proteins in biliary tract cancer:
correlation with clinicopathologic features and patient survival. Cancer Epidemiol Biomarkers
Prev, v. 18, n. 2, p. 417-23, Feb 2009.
SHIH, A. H.; LEVINE, R. L. Molecular biology of myelodysplastic syndromes. Semin Oncol, v.
38, n. 5, p. 613-20, Oct 2011.
SOLE, F. et al. Identification of novel cytogenetic markers with prognostic significance in a series
of 968 patients with primary myelodysplastic syndromes. Haematologica, v. 90, n. 9, p. 1168-78,
Sep 2005.
SORRENTINO, R. et al. Aurora B overexpression associates with the thyroid carcinoma
undifferentiated phenotype and is required for thyroid carcinoma cell proliferation. J Clin
Endocrinol Metab, v. 90, n. 2, p. 928-35, Feb 2005.
SOTILLO, R. et al. Mad2 overexpression promotes aneuploidy and tumorigenesis in mice.
Cancer Cell, v. 11, n. 1, p. 9-23, Jan 2007.
STEENSMA, D. P. The changing classification of myelodysplastic syndromes: what's in a name?
Hematology Am Soc Hematol Educ Program, p. 645-55, 2009.
STEWART, P. A. et al. Differentially expressed transcripts and dysregulated signaling pathways
and networks in African American breast cancer. PLoS One, v. 8, n. 12, p. e82460, 2013.
SUDAKIN, V.; CHAN, G. K.; YEN, T. J. Checkpoint inhibition of the APC/C in HeLa cells is
mediated by a complex of BUBR1, BUB3, CDC20, and MAD2. J Cell Biol, v. 154, n. 5, p. 925-
36, Sep 3 2001.
SWERDLOW, S. H. et al. WHO Classification of Tumors of Haematopoietic and Lymphoid
Tissues. 4. Lyon: International Agency for Research on Cancer, 2008.
SZE, K. M. et al. Association of MAD2 expression with mitotic checkpoint competence in
hepatoma cells. J Biomed Sci, v. 11, n. 6, p. 920-7, Nov-Dec 2004.
TAKESHITA, M. et al. Aurora-B overexpression is correlated with aneuploidy and poor
prognosis in non-small cell lung cancer. Lung Cancer, v. 80, n. 1, p. 85-90, Apr 2013.
123
TANAKA, K. et al. Mitotic checkpoint protein hsMAD2 as a marker predicting liver metastasis of
human gastric cancers. Jpn J Cancer Res, v. 92, n. 9, p. 952-8, Sep 2001.
TEFFERI, A.; VARDIMAN, J. W. Myelodysplastic syndromes. N Engl J Med, v. 361, n. 19, p.
1872-85, Nov 5 2009.
TONG, T. et al. Overexpression of Aurora-A contributes to malignant development of human
esophageal squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res, v. 10, n. 21, p. 7304-10, Nov 1 2004.
TSOU, M. F. et al. Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication
in human cells. Dev Cell, v. 17, n. 3, p. 344-54, Sep 2009.
TWU, N. F. et al. Expression of Aurora kinase A and B in normal and malignant cervical tissue:
high Aurora A kinase expression in squamous cervical cancer. Eur J Obstet Gynecol Reprod
Biol, v. 142, n. 1, p. 57-63, Jan 2009.
VAGNARELLI, P.; EARNSHAW, W. C. Chromosomal passengers: the four-dimensional
regulation of mitotic events. Chromosoma, v. 113, n. 5, p. 211-22, Nov 2004.
VALENT, P. et al. Idiopathic cytopenia of undetermined significance (ICUS) and idiopathic
dysplasia of uncertain significance (IDUS), and their distinction from low risk MDS. Leuk Res, v.
36, n. 1, p. 1-5, Jan 2012.
VALENT, P. et al. Standards and impact of hematopathology in myelodysplastic syndromes
(MDS). Oncotarget, v. 1, n. 7, p. 483-96, Nov 2010.
VASSALO J., M. S. M. M. Síndromes mielodisplásicas e mielodisplásica/mieloproliferativas. Rev
Bras Hematol Hemoter, v. 31, p. 267-72, 2009.
VERDAASDONK, J. S.; BLOOM, K. Centromeres: unique chromatin structures that drive
chromosome segregation. Nat Rev Mol Cell Biol, v. 12, n. 5, p. 320-32, May 2011.
VISCHIONI, B. et al. Frequent overexpression of aurora B kinase, a novel drug target, in non-
small cell lung carcinoma patients. Mol Cancer Ther, v. 5, n. 11, p. 2905-13, Nov 2006.
VOSO, M. T. et al. Revised International Prognostic Scoring System (IPSS) predicts survival and
leukemic evolution of myelodysplastic syndromes significantly better than IPSS and WHO
Prognostic Scoring System: validation by the Gruppo Romano Mielodisplasie Italian Regional
Database. J Clin Oncol, v. 31, n. 21, p. 2671-7, Jul 20 2013.
WANG, L. et al. MAD2 as a key component of mitotic checkpoint: A probable prognostic factor
for gastric cancer. Am J Clin Pathol, v. 131, n. 6, p. 793-801, Jun 2009.
WANG, X. et al. Significance of MAD2 expression to mitotic checkpoint control in ovarian
cancer cells. Cancer Res, v. 62, n. 6, p. 1662-8, Mar 15 2002.
WANG, X. et al. Correlation of defective mitotic checkpoint with aberrantly reduced expression
of MAD2 protein in nasopharyngeal carcinoma cells. Carcinogenesis, v. 21, n. 12, p. 2293-7, Dec
2000.
124
WARNER, S. L. et al. Targeting Aurora-2 kinase in cancer. Mol Cancer Ther, v. 2, n. 6, p. 589-
95, Jun 2003.
WEI, Y. et al. Phosphorylation of histone H3 is required for proper chromosome condensation and
segregation. Cell, v. 97, n. 1, p. 99-109, Apr 2 1999.
WU, C. W.; CHI, C. W.; HUANG, T. S. Elevated level of spindle checkprotein MAD2 correlates
with cellular mitotic arrest, but not with aneuploidy and clinicopathological characteristics in
gastric cancer. World J Gastroenterol, v. 10, n. 22, p. 3240-4, Nov 15 2004.
YAGISAWA, K. et al. Features of Japanese patients with myelodysplastic syndrome in an aging
population of Sado Island. Int J Hematol, v. 95, n. 4, p. 420-7, Apr 2012.
YE, D. et al. Analysis of Aurora kinase A expression in CD34(+) blast cells isolated from patients
with myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia. J Hematop, v. 2, n. 1, p. 2-8, Mar
2009.
YU, L. et al. Mitotic arrest defective protein 2 expression abnormality and its clinicopathologic
significance in human osteosarcoma. APMIS, v. 118, n. 3, p. 222-9, Mar 2010.
YU, L. et al. Upregulation of Mad2 facilitates in vivo and in vitro osteosarcoma progression.
Oncol Rep, v. 28, n. 6, p. 2170-6, Dec 2012.
YUAN, B. et al. Increased expression of mitotic checkpoint genes in breast cancer cells with
chromosomal instability. Clin Cancer Res, v. 12, n. 2, p. 405-10, Jan 15 2006.
ZHANG, S. H. et al. Clinicopathologic significance of mitotic arrest defective protein 2
overexpression in hepatocellular carcinoma. Hum Pathol, v. 39, n. 12, p. 1827-34, Dec 2008.
ZHANG, X.; WANG, H.; WANG, J. Expression of HMGB1 and NF-kappaB p65 and its
significance in non-small cell lung cancer. Contemp Oncol (Pozn), v. 17, n. 4, p. 350-5, 2013.
ZHAO, W. L. et al. The myelodysplastic syndromes: analysis of prognostic factors and
comparison of prognostic systems in 128 Chinese patients from a single institution. Hematol J, v.
3, n. 3, p. 137-44, 2002.