Download pdf - PRAKTIKUM IZ FIZIOLOGIJE MIKROORGANIZMOV za · PDF filemikrobiologije pri predmetu Fiziologija mikroorganizmov. Vse pravice pridržane. Reproduciranje in razmnoževanje dela brez vnaprejšnjega

UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

ODDELEK ZA ŽIVILSTVO

PRAKTIKUM IZ FIZIOLOGIJE MIKROORGANIZMOV

za študente mikrobiologije

Tjaša Danevčič, Ines Mandić-Mulec

Ljubljana, 2007

Danevčič T., Mandić-Mulec I. Praktikum iz fiziologije mikroorganizmov za študente mikrobiologije. Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo. Ljubljana, 2007.

Avtorici: dr. Tjaša Danevčič prof. dr. Ines Mandić-Mulec Recenzenta: prof. dr. David Stopar prof. dr. Nina Gunde-Cimerman Izdajatelj: Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Leto: 2007 Tisk: XX Naklada: XX Kolegij študija mikrobiologije je dne 20.4.2007 sprejel Praktikum iz fiziologije za študente mikrobiologije kot učno gradivo za študente univerzitetnega študijskega programa mikrobiologije pri predmetu Fiziologija mikroorganizmov. Vse pravice pridržane. Reproduciranje in razmnoževanje dela brez vnaprejšnjega soglasja izdajatelja je kršenje njegovih pravic. CIP - Kataložni zapis o publikaciji Narodna in univerzitetna knjižnica, Ljubljana 579.22(075.8)(076.5) DANEVČIČ, Tjaša Praktikum iz fiziologije mikroorganizmov : za študente mikrobiologije / Tjaša Danevčič, Ines Mandić-Mulec. - Ljubljana : Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2007 ISBN 978-961-6333-59-7 1. Mandić-Mulec, Ines 234760448


II

KAZALO VSEBINE

str.

KAZALO VSEBINE II

PRAVILA ZA VARNO DELO V MIKROBIOLOŠKEM LABORATORIJU 1

KVANTIFIKACIJA MIKROORGANIZMOV 3

Vaja 1: Ugotavljanje območja uporabe Beer-Lambert-ovega zakona 8

RASTNA KRIVULJA BAKTERIJ 9

VPLIV DEJAVNIKOV OKOLJA NA RAST MIKROBOV 11

Vaja 2: Vpliv temperature in pH na rast E. coli ESH10 K-12 in Salmonella

typhimurium TL 747 15

ODPRT RASTNI SISTEM - KEMOSTAT 20

Vaja 3: Izračun donosa biomase in hitrosti rasti v odprtem rastnem sistemu 21

KISIK - REGULATOR CELIČNE AKTIVNOSTI 24

Vaja 4: Adaptacija Escherichia coli na anaerobiozo: nitratna reduktaza 24

SLANOST 30

SPREMLJANJE AKTIVNOSTI MIKROBNIH CELIC 30

Vaja 5: Vpliv slanosti na metabolno aktivnost in hitrost respiracije pri bakteriji Vibrio sp. 32

PROTIMIKROBNE SNOVI IN VREDNOTENJE NJIHOVE AKTIVNOSTI 36

Vaja 6: Vpliv antibiotikov in razkužila na rast mikroorganizmov 38

Vaja 7: Vpliv bakteriocina na rast testnega organizma 41

ANTIBIOTIKI IN FREKVENCA MUTACIJ 46

Vaja 8: Vpliv koncentracije streptomicina na razvoj rezistentnih bakterij Serratia

marcescens 46

KOMPETENCA PRI Bacillus subtilis 49

Vaja 9: Določanje števila kompetentnih celic, regulacija kompetence in medcelično komuniciranje pri Bacillus subtilis 50

Danevčič T., Mandić-Mulec I. Praktikum iz fiziologije mikroorganizmov za študente mikrobiologije. III Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo. Ljubljana, 2007.

SPORULACIJA PRI Bacillus subtilis 56

Vaja 10: Regulacija sporulacije pri Bacillus subtilis 57

KEMOTAKSA PRI BAKTERIJAH 60

Vaja 11: Opazovanje kemotaktičnega gibanja pri bakterijskih celicah 61

BIOFILMI PRI Bacillus subtilis 63

Vaja 12: Razvoj biofilma pri različnih sevih Bacillus subtilis 64

AMILAZNA AKTIVNOST PRI BAKTERIJAH 67

Vaja 13: Vpliv vira ogljika na amilazno aktivnost pri Bacillus subtilis 67

SESTAVA GOJIŠČ 71


1

PRAVILA ZA VARNO DELO V MIKROBIOLOŠKEM LABORATORIJU

1. Pri delu z mikroorganizmi obravnavajte mikroorganizme kot pogojno patogene in zato

ves čas dela z mikroorganizmi uporabljajte aseptično tehniko.

2. Pred in po vsaki vaji si umijte roke z razkužilom (detergent z biocidnim delovanjem).

3. Delovni pult razkužite pred in po uporabi mikrobne kulture (alkohol, Spitaderm).

4. V primeru manjših nezaščitenih ran na koži ne začnite dela z mikrobnimi kulturami brez

dodatne zaščite (zaščitne rokavice, respiratorna maska) in predhodnega pogovora z

asistentom oziroma predpostavljenim. V primeru večjih odprtih ran na koži je delo z

mikrobnimi kulturami prepovedano.

5. Nikoli ne pipetirajte kulture mikroorganizmov z usti. Vedno uporabljaj pipetne nastavke.

6. V primeru razlitja mikrobne kulture prelijte razlito kulturo z razkužilom (alkohol,

Spitaderm) in nemudoma obvestite asistenta oziroma predpostavljenega. Če je prišlo do

razlitja po telesu, inficirano mesto razkužite in sperite s toplo vodo in milom. Če je

prišlo do poškodbe, kužnino odstranite, iztisnite kri v posodo z razkužilom in mesto

poškodbe razkužite ter rano sterilno obvežite. V kolikor pridejo mikrobi v usta jih

izpljunite v posodo z razkužilom ter usta izpirajte z 0.2 % solno kislino.

7. Mikrobnih kultur nikoli ne odnašajte iz laboratorija.

8. Ves uporabljen material na vajah jasno in nedvoumno označite (vrsta mikroorganizma,

ime študenta, datum, vrsta vzorca, redčitev) in odložite na dogovorjeno mesto.

9. S plinskim gorilnikom delajte zelo previdno. Če imate dolge lase, morajo biti speti.

Plinski gorilnik ugasnite takoj po končanem delu in preverite ali je plinska napeljava

zaprta.

10. Optični material (leče, objektivi) očistite pred in po uporabi. Leče čistite izključno s

staničevino.

11. Po uporabi vse reagente in opremo (epruvete, petrijevke, pipete, mikroskop) vrnite na

dogovorjeno mesto. Material, ki je bil v stiku z mikrobno kulturo je potrebno sterilizirati

in zato ločiti od ostalega materiala.

Danevčič T., Mandić-Mulec I. Praktikum iz fiziologije mikroorganizmov za študente mikrobiologije. 2 Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo. Ljubljana, 2007.

12. Nesreče pri delu (opekline, urezi, razlitje mikrobioloških kultur) takoj javite asistentu

ali nadrejenemu.


KVANTIFIKACIJA MIKROORGANIZMOV

Za ugotavljanje števila mikrobnih celic imamo na voljo več metod. Poznamo direktne ali

števne metode in indirektne ali gojitvene.

Količino mikrobnih celic lahko izražamo tudi z biomaso. Za določanje biomase

uporabljamo fizikalne in kemijske metode.

Direktne - števne metode

Z uporabo mikroskopa preštejemo celice v majhnem volumnu vzorca.

a) Štetje celic v razmazu

Celice štejemo pod mikroskopom. 10 µL primerno redčenega vzorca nanesemo na znano

površino na objektnem stekelcu (1 cm2), posušimo, fiksiramo in obarvamo. Celice

preštejemo na več naključno izbranih vidnih poljih in iz povprečnega števila celic na eno

polje izračunamo število celic v 1 mL vzorca.

100⋅⋅= FMXN , … (1)

2

100

rFM

⋅=

π, … (2)

kjer je N število celic, X povprečno število celic na vidno polje, FM faktor mikroskopa in

πr2 površina vidnega polja. Za objektiv s povečavo 100x in okular 10x je FM 2000-2500.

b) Števne komore

Za večje celice (npr. kvasovke, krvne celice) uporabljamo števne komore (Thoma,

Neubauer, hemocitometer). To so posebno oblikovana predmetna stekelca, ki imajo

vgravirano mrežo kvadratov na poglobljenem delu.

Celice preštejemo v majhnem volumnu tekočega vzorca.

Velikosti kvadratov so: 1/25 mm2

1/400 mm2

Globina špranje je 0.1 mm.


Za bakterije uporabljamo posebne komore (Petroff-Hausser), ki imajo razdaljo med mrežo

in krovnim stekelcem 0.02 mm in v tem primeru lahko uporabljamo imerzijsko olje pri

mikroskopiranju.

Pomanjkljivosti direktnih metod: ne ločimo živih in mrtvih celic, nekatere celice so težko

opazne (zaradi tega je potrebna uporaba kontrastiranja, fluorescenčne mikroskopije),

natančnost je majhna, niso primerne za vzorce z majhnim številom celic (< 106 mL-1).

Njihova prednost je dodatna informacija o velikosti in morfologiji celic.

Uporaba membranskega filtra in fluorescenčne mikroskopije

Znani volumen vzorca prefiltriramo skozi membranski filter, ki ne kaže avtofluorescence

in ima velikost por 0.2 ali 0.45 µm. Celice na filtru obdelamo z raztopino fluorokroma in

višek barvila odstranimo s spiranjem filtra s fiziološko raztopino. S pomočjo

fluorescenčnega mikroskopa preštejemo celice, ki se ob uporabi kratkovalovne vzbujevalne

svetlobe (UV, modra) pokažejo v fluorescenčni svetlobi daljših valovnih dolžin (zeleno). Z

upoštevanjem površine filtra, površine vidnega polja, povprečnega števila celic na vidno

polje in morebitne redčitve vzorca izračunamo število celic v vzorcu:

VRFMXN ⋅⋅⋅= , … (3)

2r

PFM

f

⋅=

π, … (4)

kjer je N število celic, X povprečno število celic na vidno polje, FM faktor mikroskopa,

Pf površina filtra, πr2 površina vidnega polja, V volumen prefiltriraneg vzorca in R redčitev

vzorca.

Indirektne - gojitvene metode

Štetje na ploščah

Znano količino primerno redčenega vzorca nacepimo na ploščo trdnega gojišča,

inkubiramo v ustreznih razmerah in nato preštejemo zrasle kolonije. Za števnost plošče je

potrebno, da je na plošči zraslo 30-300 kolonij.


Za pripravo ustreznih redčitev uporabljamo fiziološko raztopino (0.9 % (w/V) NaCl) in ne

vode (osmotsko hipotonična). Največkrat pripravljamo 10 kratne ali 100 kratne redčitve.

Rezultat izrazimo v številu enot, ki tvorijo kolonije (CFU-Colony Forming Units) v

volumski ali utežni enoti vzorca. Ker nimamo dokaza, da je ena kolonija res zrasla iz ene

celice, je izražanje v CFU enotah ustreznejše, kot pa v številu celic. Metoda je primerna za

tekoče vzorce (voda, mleko) in za take vzorce, ki dajo v vodnih raztopinah suspenzije (tla).

Trajanje inkubacije je načeloma tako dolgo, da se število kolonij ne povečuje več.

Razmere inkubacije ter sestava gojišča so odvisne od vrste vzorca in od tega, katero

mikrobno skupino želimo določiti (npr. aerobi, anaerobi, termofili, mezofili, psihrofili,

avtotrofi, heterotrofi). Pri aerobni inkubaciji pri 28 °C in uporabi gojišča z organskim

virom ogljika zrastejo kolonije aerobnih heterotrofnih mikroorganizmov in je odkrivljivost

za tla le nekaj %, za morje do 20 % za mleko do 80 %.

Za gojitvene števne metode lahko izvedemo nacepljanje na tri načine in sicer z

vmešavanjem, razmazovanjem ali z uporabo membranskega filtra. Slednje uporabljamo za

vzorce, ki imajo majhno število živih celic v enem mL. Tako določamo bakterije v zraku in

vodi. Po filtraciji določenega volumna vzorca, damo filter na primerno gojišče in

inkubiramo.

Določanje biomase

Biomaso lahko določamo direktno s tehtanjem mikroorganizmov ali indirektno z

določanjem parametrov, ki so v proporcionalni zvezi z biomaso npr. motnost kulture ali

vsebnost celičnih sestavin (npr. proteina, C, N).

Pri tehtanju lahko določamo mokro ali, kar je bolj natančno, suho maso. Celice filtriramo

ali odcentrifugiramo, speremo ostanke gojišča in sušimo do konstantne mase pri

temperaturi 105 °C.


Ker je postopek določanja suhe mase precej zamuden, se pogosto poslužujemo hitrega

določanja biomase z merjenjem motnosti (turbidimetrija). Nefelometer meri svetlobo, ki

jo celice razpršijo pod določenim kotom, s spektrofotometrom in kolorimetrom pa merimo

padec intenzitete vpadne svetlobe, zaradi razpršene svetlobe na celicah. Večja kot je

gostota celic, manj svetlobe pride skozi kiveto. Ker večje celice bolj razpršijo svetlobo kot

manjše in ker je lom svetlobe odvisen od valovne dolžine, je potrebno narediti umeritveno

krivuljo pri določeni valovni dolžini svetlobe in za vsak organizem posebej.

Suho snov lahko izračunamo iz motnosti po naslednji enačbi:

WKODAI

I⋅===0log , … (5)

kjer sta I0 in I intenziteta vpadne in izhodne svetlobe, A absorbanca, OD optična gostota,

W suha snov in K konstanta.

Postopek je primeren za določanje biomase v vzorcih, kjer motnost izvira zgolj iz prisotnih

mikrobnih celic.

Na skali novejših inštrumentov direktno odčitavamo log I

I 0 oz. A.

Enačba 5 velja za redčene suspenzije večine bakterij, ki imajo velikost od 0.4 do 2 µm.

Enačba ne velja za viruse ali nitaste bakterije. Poleg tega lahko motnost merimo le, če je

število celic večje od 106 mL-1.

Linearna zveza velja le za določeno območje biomase. Pri zelo visokih koncentracijah celic

se razprši manj svetlobe na enoto biomase, zato je včasih potrebno kulturo redčiti, da

pridemo v linearno območje umeritvene krivulje.

Linearno zvezo med absorbanco in koncentracijo snovi, ki absorbira svetlobo, predstavlja

Beer-Lambert-ov zakon:

clA ⋅⋅= 0ε , … (6)


kjer so A absorbanca, ε0 absorbtivni koeficient odvisen od valovne dolžine svetlobe (mL

mg-1 cm-1), l dolžina poti žarka skozi snov, ki absorbira svetlobo (cm) in c koncentracija

absorbirane snovi v raztopini (mg mL-1).

Absorbanco pri določeni valovni dolžini na osnovi umeritve ali kalibracije prevedemo v

količino, ki izraža biomaso v absolutnih enotah (slika 1).

Slika 1: Absorbanca v odvisnosti od koncentracije suhe snovi bakterijskih celic (Gerhardt in sod., 1994).

Občutljivost meritev je večja pri nižjih valovnih dolžinah (λ), vendar so gojišča velikokrat

rumenkaste barve in absorbirajo svetlobo pri nižjih λ. 650 nm je ustrezna λ za merjenje

motnosti, ker se v mnogih primerih absorbanca samega gojišča ne razlikuje od absorbance

vode in lahko ničlimo z vodo. Pri višjih valovnih dolžinah pa je večje območje linearne

zveze med količino biomase in absorbanco.

Biomaso enostavno določamo tudi z merjenjem proteina. Če gre za manjše količine

(< 200 µg mL-1), določamo biomaso z Lowry-jevo metodo, večje količine (1-10 mg mL-1)

pa z biuretno reakcijo. V obeh primerih moramo celice toplotno obdelati v alkalnem, da

hidroliziramo proteine.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14

količina suhe snovi (mg mL-1

)

absorb

anca

A6

50

teoretično

dejansko


Vaja 1: Merjenje gostote bakterijske populacije z uporabo Beer-Lambert-ovega

zakona

Namen vaje: določiti gostoto bakterijske populacije z uporabo Beer-Lambert-ovega

zakona pri različnih valovnih dolžinah.

Materiali:

- avtomatske pipete (0.1 in 1 mL)

- bakterijska kultura E. coli v stacionarni fazi rasti

- etanol

- mikrotitrske plošče

- plošče LB

- spektrofotometer

- sterilna fiziološka raztopina

- sterilne ependorfke

- sterilni pipetni nastavki

- sterilno tekoče gojišče LB

- vibracijski mešalnik

Izvedba vaje:

Kulturo E. coli gojite do stacionarne faze v tekočem gojišču LB pri 200 obr/min in 37 °C.

Določite število celic v 1 mL kulture, tako da naredite redčitveno vrsto kulture v fiziološki

raztopini (0.9 % (w/V) NaCl) do 10-8. V ependorfke odpipetirajte 0.9 mL fiziološke

raztopine in prenesite 0.1 mL kulture E. coli, premešajte ter dalje prenašajte 0.1 mL

redčitve. Po 0.1 mL zadnjih treh redčitev (10-6, 10-7 in 10-8) prenesite na LB plošče in jih

enakomerno razmažite s sterilno stekleno epruveto. Plošče inkubirajte na 37 °C 24-48 ur.

Vsak študent pripravi redčitve kulture in gojišča LB v fiziološki raztopini (celoten volumen

je 1 mL) za določanje območja v katerem je absorbanca linearna s celično gostoto. Kulturo

in gojišče LB redčite od 0-100 % s korakom 20 % v treh ponovitvah. Redčitve gojišča LB

boste uporabljali za ničlitev spektrofotometra. Vse vzorce premešajte na vibracijskem


mešalniku. Po 0.2 mL vseh redčitev, neredčene kulture in redčenega ter neredčenega

gojišča LB prenesite v mikrotitrske plošče. Zabeležite si kateri vzorec je na katerem mestu

na mikrotitrski plošči. Izmerite absorbanco pri 540 in 650 nm na spektrofotometru.

Rezultati:

Na naslednjih vajah preštejte zrasle kolonije na ploščah LB in določite število celic v 1 mL

prekonočne kulture E. coli.

Izračunajte povprečno vrednost in standardni odklon absorbance za vsako redčitev pri obeh

valovnih dolžinah.

Narišite graf celične gostote v odvisnosti od absorbance pri obeh valovnih dolžinah.

Primerjajte koeficiente za obe valovni dolžini med seboj in jih predstavite v tabeli.

Vprašanja:

Določite kdaj celična gostota ni več linearna z absorbanco pri obeh valovnih dolžinah? Ali

je ta točka odvisna od uporabljene valovne dolžine?

Kolikšen je v linearnem območju absorbtivni koeficient ε0?

Kako je absorbtivni koeficient ε0 odvisen od valovne dolžine?

Literatura:

- Gerhardt P., Murray R.G.E., Wood W.A., Krieg N.R. 1994. Methods for general

and molecular bacteriology. Washington, ASM Press: 248-277.

- White D., Hegeman G.D. 1998. Microbial Physiology and Biochemistry

Laboratory. A quantitative approach. Oxford, Oxford University Press, Inc.:1-3.


RASTNA KRIVULJA BAKTERIJ

Bakterijska rast je rezultat koordiniranih procesov kot so kemična sinteza, polimerizacija,

biosinteza in transport molekul. Posledica vseh teh procesov je nastanek nove celice. Rast

bakterijskih celic v zaprtem (batch) sistemu lahko grafično prikažemo z rastno krivuljo, ki

jo razdelimo v več faz. Te faze so lag faza ali faza prilagajanja, logaritemska ali

eksponentna faza, stacionarna faza in faza odmiranja.

Te faze se med seboj razlikujejo:

- Lag faza ali faza prilagajanja je faza, ki nastopi takrat, ko mikroorganizme

prenesemo v sveže gojišče v katerem so celice sicer metabolično aktivne, se večajo,

vendar se ne delijo, in se prilagajajo na nove okoljske pogoje; dolžina lag faze je

največkrat odvisna od okoljskih pogojev, v katerih so bile celice pred vnosom v

sveže gojišče; lag faza izostane samo v primeru, če prenesemo mlado kulturo iz

logaritemske faze v sveže gojišče enake sestave.

- Eksponentna ali logaritemska faza je faza rasti mikroorganizmov, kjer celice

rastejo in se delijo, število celic se podvoji znotraj določene časovne periode;

stopnja eksponentne rasti je odvisna od dejavnikov okolja kot so temperatura,

hranila, pH, vodna aktivnost in tudi od genetskih lastnosti organizma.

- Stacionarna faza je faza v kateri se število celic ne spreminja in je dosežena takrat,

ko začne v rastnem gojišču primanjkovati hranil ali se začnejo kopičiti toksični

produkti, ki inhibirajo rast; celice spremenijo svojo fiziologijo, upočasnijo

metabolizem in delitev, začnejo izrabljati rezervne snovi; dolžina stacionarne faze

je odvisna od posameznega organizma; talni mikrobi, ki so prilagojeni na hitro

spreminjajoče se okolje, imajo zelo učinkovite mehanizme za vzdrževanje živosti

med pomanjkanjem hranil, mnogi tvorijo spore in ciste.

- Faza odmiranja je faza v kateri se celice izstradajo, niso več sposobne delitve in

vzdrževanja metabolizma, njihovo število se eksponentno zmanjšuje, saj celice

odmirajo.


Generacijski ali podvojevalni čas

V eksponentni fazi se celice delijo v konstantnih intervalih. V določenem času se torej

populacija podvoji. Torej je generacijski čas čas, ki je potreben, da se gostota populacije

podvoji. Povprečni podvojevalni čas lahko določimo iz rastne krivulje, ki jo prikažemo na

semilogaritemskem grafu ali ga izračunamo s pomočjo enačb 7 in 8. Generacijski čas je

odvisen od bakterijske vrste in okolja v katerem se le-ta nahaja. Ta čas se lahko spreminja

od 20 min pri hitrorastočih bakterijah v idealnih pogojih do ur in dni pri neidealnih pogojih

in počasi rastočih bakterijah.

Donos in hitrost rasti

Celični donos oz. zrasla biomasa je odvisna od sestave gojišča, dejavnikov okolja kot tudi

vrste mikroorganizmov. Iz istega energetskega vira namreč pridobijo fermentativni oz.

aerobni organizmi pri katabolni razgradnji različno količino ATP. Koncentracija hranil

vpliva tako na hitrost rasti kot tudi na donos, vendar se hitrost rasti povečuje samo v ozkem

pasu pri zelo nizkih koncentracijah hranil. Donos se povečuje linearno s povečevanjem

koncentracije hranil. Običajno ga izražamo v gramih suhe celične biomase na mol

porabljenega substrata.

VPLIV DEJAVNIKOV OKOLJA NA RAST MIKROBOV

Bakterije se morajo v okolju nenehno prilagajati spremembam fizikalnih in kemijskih

dejavnikov okolja kot so temperatura, hranila, pH in slanost. Pri tem izbirajo zanje

energetsko najugodnejše poti, pri katerih prihaja tako do sprememb v bakterijski

morfologiji, v aktivnosti fizioloških procesov kot tudi v biosintezi določenih intermediatov.

Temperatura

Temperatura vpliva na rast in preživetje organizmov. Po eni strani se hitrost biokemijskih

reakcij s povečano temperaturo poveča, kar ima za posledico hitrejšo rast, po drugi strani


se nad določeno temperaturo proteini, nukleinske kisline in tudi druge celične sestavine

ireverzibilno denaturirajo. Za vsak organizem obstaja minimalna temperatura, pod katero

ne zasledimo več rasti, optimalna temperatura, kjer je rast najhitrejša in maksimalna

temperatura, nad katero rast ni več mogoča. Odsotnost rasti pod minimalno temperaturo je

posledica onemogočenega transporta hranil preko celične membrane.

Glede na odnos do temperature lahko razdelimo organizme na psihrofile, mezofile,

termofile in ekstremne termofile. Mezofile najdemo v toplokrvnih živalih ter tleh in

vodah zmernih in tropskih predelov, psihro- in termofile pa v mrzlih oz. vročih okoljih

(oceani, ledeniki, vrelci, gejzirji).

Obligatni psihrofili so tisti organizmi, ki imajo optimalno temperaturo za rast 15 °C ali

manj in minimalno temperaturo za rast 0 °C ali nižje. Fakultativni psihrofili so bolj

razširjeni od obligatnih in se nahajajo v tleh in vodah zmernega klimatskega področja.

Najbolje rastejo pri temperaturah med 25-30 °C. Pri temperaturah okrog 0 °C je rast močno

upočasnjena, vendar je še vedno možna (kvarjenje hrane v hladilniku). Da lahko aktivni

transport nemoteno teče tudi pri nižjih temperaturah, imajo psihrofili v celičnih

membranah večjo vsebnost nenasičenih maščobnih kislin, kar ima za posledico, da ostane

membrana fluidna, tudi pri nižjih temperaturah. Zamrzovanje preprečuje rast, ni pa nujno,

da uniči mikroorganizme. Najnižja meja za biokemijske reakcije v vodnih raztopinah je

–140 °C. Zamrzovanje se uporablja celo za shranjevanje mikrobnih kultur. Dodatek

glicerola ali dimetilsulfoksida (0.5 M) v suspenzijo zaščiti celice pred dehidracijo,

makromolekule (npr. serumski albumin, dekstran) v koncentracijah 10-5 do 10-3 M pa

zaščitijo celice tako, da z vezavo na celično površino ščitijo membrane.

Mezofili rastejo v območju 20-40 °C. Ločimo dve skupini, prva ima optimum 20-30 °C, to

so rastlinski saprofiti, druga 35-40 °C in rastejo v toplokrvnih gostiteljih.

Termofili imajo optimum pri temperaturah 45-50 °C, rastejo v območju 20-70 °C. V

naravi najdemo taka okolja v zgornji (nekaj cm) plasti tal (opoldansko poletno sonce), v


kupih komposta, silaži in vulkanih. Organizmi se prilagodijo na visoke temperature tako,

da so njihovi encimi in drugi proteini bolj toplotno stabilni, membranski lipidi pa vsebujejo

več nasičenih maščobnih kislin. Ekstremni termofili imajo temperaturni optimum pri

80 °C ali več (termalni vrelci).

pH

Vsak organizem ima določeno pH območje, v katerem je rast mogoča in tudi pH

optimum. Naravna okolja imajo pH vrednosti med 5 (npr. paradižnik, kislo zelje, kisla tla)

in 9 (alkalna tla). Organizme, ki živijo v okoljih z nizkim pH imenujemo acidofile. Med

obligatne acidofilne bakterije spada rod Thiobacillus, ki oksidira sulfidne minerale in tvori

žvepleno kislino. Pri nevtralnem pH celice tega organizma lizirajo, ker je potrebna visoka

koncentracija vodikovih ionov za stabilnost njegove plazemske membrane. Nekaj

organizmov je alkalofilnih, ti imajo pH optimum 10-11 (npr. tla z visoko vsebnostjo

karbonatov).

Pri pripravi gojišč za laboratorijsko gojenje mikroorganizmov navadno uravnamo pH na 7.

Ker se zaradi metabolne aktivnosti tvorijo kisline pri razgradnji ogljikovih hidratov ali

baze iz proteinov, morajo biti gojišča puferizirana. V mineralno gojišče dodajamo K2HPO4

in KH2PO4, kompleksna gojišča pa vsebujejo pepton, ki zaradi amfoterne narave deluje kot

naravni pufer.


Kisik

Mikroorganizmi se razlikujejo glede na potrebo oz. tolerantnost do kisika.

skupina učinek

aerobi

obligatni kisik je nujno potreben (Micrococcus luteus)

mikroaerofilni kisik je potreben, vendar nižje koncentracije kot normalno

(Campylobacter)

anaerobi

fakultativni kisik ni potreben, vendar je rast na O2 boljša (E. coli,

Staphylococcus)

aerotolerantni kisik ni potreben in rast na O2 ni boljša (fermentativni

organizmi – Lactobacillus)

obligatni (striktni) kisik uniči živost mikroorganizmov (Bacteroides)

Kisik je škodljiv za striktne anaerobe, ker niso sposobni razgraditi nekaterih toksičnih

produktov, ki nastajajo pri metabolizmu s kisikom: peroksid (H2O2), superoksid (O2-) in

hidroksilni radikal (OH·) (nimajo encimov peroksidaze, superoksid dismutaze in katalaze).

Za namnoževanje aerobnih mikroorganizmov je zaradi slabe topnosti kisika v vodi

potrebno kulturo prepihovati s sterilnim zrakom skozi porozno frito z drobnimi luknjicami

ali pa močno stresati na stresalniku.

Za namnoževanje anaerobnih mikroorganizmov moramo kisik izključiti iz okolja. Postopki

so manj zahtevni za manj občutljive mikrobe kot za striktne anaerobe. Eden od enostavnih

načinov je, da gojišče napolnimo do vrha posode in tesno zamašimo, drugi pa, da dodamo

snov, ki reagira s kisikom in ga tako izločimo iz gojišča. Taka snov je tioglikolat, ki ga

dodajamo v gojišče, kadar želimo ugotoviti ali je nek organizem aeroben, anaeroben ali

fakultativno anaeroben. V gojišče dodamo še redoks indikator (npr. resazurin), ki ob

prisotnosti kisika spremeni barvo in tako ugotovimo, kako globoko v gojišče prodre kisik.


Za namnoževanje anaerobov se uporabljajo tudi anaerobni lonci, ki omogočajo zamenjavo

atmosfere z dušikom ali vodikom v prisotnosti reducirajočega sredstva tioglikolata, ki

odstrani še sledove kisika. Metanogeni mikrobi so tako občutljivi na kisik, da je potrebno

tudi vse manipulacije izvesti v odsotnosti kisika, zato delamo v posebnih anaerobnih

komorah.

Vaja 2: Vpliv temperature in pH na rast E. coli ESH10 K-12 in Salmonella

typhimurium TL 747

Namen vaje: spremljati rast mikroorganizmov pri različnih pH in temperaturah in pokazati

kako ta dva dejavnika okolja vplivata na hitrost rasti ter generacijski čas izbranih

mikroorganizmov.

Materiali:

- avtomatske pipete (1 mL)

- fotometer

- gojišče PKE z različnimi vrednostmi pH (6, 7, 8, 9 in 10)

- kulturi bakterije E. coli in bakterije Salmonella typhimurium v eksponentni fazi

rasti


- stresalnik

Izvedba vaje:

Nacepite 2 % (V/V) prekonočne kulture bakterije E. coli in bakterije Salmonella

typhimurium v sveže gojišče PKE z različnimi vrednostmi pH (6, 7, 8, 9, 10). Seva

nacepite v dve erlenmajerici z istima vrednostima pH in potem eno izmed erlenmajeric

inkubirajte na stresalniku na 28 °C, eno pa na 37 °C pri 200 obr/min. V 30 min časovnih

intervalih izmerite motnost kulture pri 650 nm.


čas inkubacije (min)

OD650

E. coli

pH 6 28 °C

OD650

E. coli

pH 6 37 °C

OD650

S. typhimurium

pH 6 28 °C

OD650 S. typhimurium

pH 6 37 °C

0 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360


OD650

E. coli

pH 7 28 °C

OD650

E. coli

pH 7 37 °C

OD650

S. typhimurium

pH 7 28 °C


pH 7 37 °C

0 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360



OD650

E. coli

pH 8 28 °C

OD650

E. coli

pH 8 37 °C

OD650

S. typhimurium

pH 8 28 °C


pH 8 37 °C

0 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360


OD650

E. coli

pH 9 28 °C

OD650

E. coli

pH 9 37 °C

OD650

S. typhimurium

pH 9 28 °C


pH 9 37 °C

0 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360



OD650

E. coli

pH 10 28 °C

OD650

E. coli

pH 10 37 °C

OD650

S. typhimurium

pH 10 28 °C


pH 10 37 °C

0 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360

Rezultati:

Narišite graf, kjer nanašate motnost v odvisnosti od časa rasti.

Izračunajte konstanto hitrosti rasti za zaprti sistem in generacijski čas za posamezen sev pri

definiranih dejavnikih okolja iz spodnjih enačb. Generacijski čas tudi ocenite iz grafa.

Primerjajte obe dobljeni vrednosti. Primerjajte vrednosti dobljene pri posameznih rastnih

pogojih (pH in temperaturi) in izračunane parametre tudi grafično predstavite.

Enačbi za izračun konstante hitrosti rasti in generacijskega časa sta:

t

XX

⋅

−=

301,0

)log(log 12µ , … (7)

µ

1=gent , … (8)

kjer so µ konstanta hitrosti rasti, X2 motnost kulture po določenem času inkubacije v

eksponentni fazi rasti, X1 motnost kulture na začetku eksponentne faze rasti, t čas

inkubacije med obema izbranima točkama, tgen generacijski čas seva pri določenih

dejavnikih okolja in 0.301 konstanta oziroma pretvornik iz naravnega v desetiški

logaritem.


Vprašanja:

Ali lahko izračunamo generacijski čas v vsaki fazi rasti?

Zakaj dodajamo pufer k rastnim gojiščem?

Na kakšen način mikroorganizmi spremenijo pH njihovega lastnega okolja?

Literatura:

- Madigan M.T., Martinko J.M., Parker J. 1997. Brock biology of microorganisms.

8th ed. New Jersey, Prentice Hall International, Inc.: 149-177.


ODPRT RASTNI SISTEM - KEMOSTAT

V zaprtem rastnem sistemu se okolje med namnoževanjem mikrobov stalno spreminja.

Nasprotno pa je odprti rastni sistem (kontinuirana kultura) pretočni sistem katerem hranila

(sveže gojišče) stalno dovajamo in z enako hitrostjo odvajamo izrabljeno gojišče in celice

iz kulture. Ko se v sistemu vzpostavi ravnotežje, ostajata število mikrobnih celic in

koncentracija hranil konstantna, pravimo, da je sistem v dinamičnem ravnotežju (steady

state).

Najpogosteje rabljen način kontinuiranega namnoževanja mikrobov je kemostat, ki

omogoča uravnavanje gostote populacije in hitrosti rasti kulture z dvema parametroma:

koncentracijo za rast omejujočega (limitnega) hranila in hitrostjo razredčevanja.

Na splošno velja za rast mikrobov, da je hitrost rasti odvisna od koncentracije hranil:

SK

S

s +⋅= maxµµ , ... (9)

kjer je µ konstanta hitrosti rasti, µmax maksimalna hitrosti rasti pri nasičenosti s substratom,

S koncentracija substrata v kulturi in Ks konstanta nasičenosti s substratom, ki je enaka

koncentraciji S kjer je max2

1µµ ⋅= .

Ključno za delovanje kemostata je, da je med uravnoteženim delovanjem kemostata

koncentracija omejujočega hranila zelo blizu nič. Če dotok hranila oziroma pretočno hitrost

povečamo, se poveča tudi µ in obratno. V kemostatu je hitrost dotoka svežega gojišča

enaka hitrosti iztoka izrabljenega gojišča in celic iz kulture. Razmerje tega pretoka (F) proti

volumnu (V) pa imenujemo hitrost razredčevanja, D:

V

FD = V ravnotežju velja D = µ. ... (10)

V kemostatu lahko vzdržujemo populacijo pri različnih konstantnih hitrostih rasti, to pa je

mogoče le do kritične vrednosti hitrosti razredčevanja, Dc. Ta je odvisna od koncentracije

substrata v rezervoarju (SR):


RS

R

CSK

SD

+⋅= maxµ . … (11)

Če je SR >> Ks je Dc običajno zelo blizu vrednosti µmax in lahko dosežemo delovanje

kemostata blizu maksimalne rastne hitrosti.

Pomemben vidik v delovanju kemostata je gostota populacije. Donos biomase (Y) je

razmerje med prirastjo biomase in porabljenim substratom in je mera za učinkovitost

izrabe substrata za sintezo novega celičnega materiala.

dS

dXY = … (12)

Zveza med koncentracijo celic (X) in koncentracijo omejujočega hranila (S) v kemostatu je

pri dinamičnem ravnotežju podana z enačbama:

)( SSYX R −⋅= in … (13)

D

DKS S

−⋅=

maxµ. … (14)

S je torej odvisen od D in X je odvisen od S. S poznavanjem konstant SR, Y, Ks in µmax

lahko določimo S in X za katerokoli vrednost D.

Kemostat nam omogoča, da uravnavamo hitrost rasti (µ) in gostoto populacije (X)

neodvisno eno od drugega. Hitrost rasti uravnavamo s spremembo hitrosti razredčevanja

(D), kar pomeni s spremembo pretoka, ker volumen ostaja nespremenjen. Gostoto

populacije uravnavamo s spreminjanjem koncentracije hranil v rezervoarju.

Vaja 3: Izračun donosa biomase in hitrosti rasti v odprtem rastnem sistemu

Namen vaje: izračunati konstanto hitrosti rasti (µ) in gostoto populacije (X) v kemostatu iz

predloženih podatkov in se naučiti kvantitativne obravnave rasti.


Materiali:

- kalkulator

Izvedba vaje:

Bakterije Pseudomonas stutzeri smo kontinurano namnoževali v dveh aeriranih

kemostatih. Kemostata imata enak D in različno koncentracijo substrata v rezervoarju. 500

mL mineralnega gojišča za Pseudomonas vsebuje poleg soli (K2HPO4, KH2PO4,

(NH4)2SO4, MgSO4·7H2O) še mikroelemente (B, Zn, Fe, Co, Mo, Cu in Mn) ter glukozo v

enem primeru 0.5 g L-1, v drugem pa 5 g L-1.

Med delovanjem kemostatov v dinamičnem ravnotežju, ki je bilo predhodno

vzpostavljeno, smo izmeri hitrost pretoka (F). V časovnem intervalu 90 min smo odvzeli

30 mL vzorca kulture na iztoku iz kemostatov in izmerili koncentracijo glukoze ter

količino mikrobne biomase (OD650 in protein z biuretno reakcijo). Iz dobljenih rezultatov

izračunajte manjkajoče podatke v spodnji tabeli (D, µ, Y in X) in dobljene vrednosti

primerjajte za oba kemostata.

Rezultati:

konc.glukoze v rezervoarju 0.5 g L-1 5 g L-1 F (mL h-1) 23 23 D (h-1) µ (h-1) motnost OD650 0.41 1.41 konc. glukoze v kemostatu (g L-1) 0.02 0.09 konc. proteina (mg mL-1) 0.14 0.65 suha snov (mg mL-1) Y (g mol-1)

Vprašanja:

Na kaj vse vpliva koncentracija substrata v rezervoarju?

Ali vpliva hitrost razredčevanja na donos biomase?

V kakšni povezavi sta donos biomase in koncentracija substrata v rezervoarju?


Literatura:



- Rhodes P.M., Stanbury P.F. 1997. Applied microbial physiology. A practical

approach. New York, Oxford University Press: 193-212.


KISIK - REGULATOR CELIČNE AKTIVNOSTI

Kisik je eden najpomembnejših regulacijskih signalov pri fakultativno anaerobnih

bakterijah, ki živijo v oksičnih in anoksičnih okoljih ali tam, kjer se hitro menja

preskrbljenost s kisikom. Prehod iz aerobne v anaerobno rast vpliva tako na katabolizem

kot anabolizem. Aerobno respiracijo zamenja anaerobna respiracija, fototrofna rast ali

fermentacija, odvisno od posameznega organizma. S tem prihaja do spremenjenega

izražanja genov, ki zahteva tudi sintezo različnih koencimov in kofaktorjev (kinoni, hemi,

Mo kofaktor). Biosintetske in katabolne reakcije, ki rabijo O2 kot kosubstrat za oksidacijo

ali hidroksilacijo, morajo zamenjati alternativne reakcije. Fakultativni anaerobi (npr.

E.coli) lahko rastejo popolnoma brez kisika, drugi, npr. kvasovke, so sicer sposobni

anaerobnega katabolizma, vendar rabijo majhne količine kisika za biosintetske reakcije

(steroidi, deoksiribonukleotidi).

Večinoma aerobni in anaerobni katabolizem ne delujeta simultano in je izražanje

alternativnih poti stvar hierarhične kontrole. Pri enterobakterijah je O2 represor anaerobne

respiracije in fermentacije in nitrat represor drugih alternativnih anaerobnih poti respiracije.

Tako je zagotovljen maksimalen izkoristek substrata in sinteza ATP.

Preklop med aerobnim in anaerobnim metabolizmom je reguliran na nivoju transkripcije in

to uravnavajo različni regulacijski sistemi, ki se odzivajo na O2. Večina teh proteinov

vsebuje hem ali Fe kot kofaktor, ki reagira z O2 bodisi z vezavo ali redoks reakcijo. Pri

E. coli so ugotovili, da transkripcijski regulator FNR, v odvisnosti od vsebnosti O2,

kontrolira ekspresijo genov, ki so potrebni za anaerobni metabolizem in je obenem senzor

in regulator.

Vaja 4: Adaptacija Escherichia coli na anaerobiozo: nitratna reduktaza

E. coli je fakultativno anaerobna bakterija, ki lahko raste v prisotnosti ali odsotnosti kisika.

Pri aerobni rasti uporablja E. coli aerobno respiracijo, kjer prihaja do transporta elektronov

preko verige citokromov na citokrom oksidazo in kisik. V primeru anaerobne rasti pa lahko


E. coli fermentira ali izvaja anaerobno respiracijo, ki je odvisna od vira ogljika in

prejemnikov elektronov. Takrat prihaja do encimskih sprememb (npr. v aktivnosti ali

sintezi) kot so: zmanjšana sinteza citokrom o oksidaze in povečana sinteza respiratorne

nitratne reduktaze (slika 2). Druge encimske spremembe so prikazane na sliki 3, njihova

regulacija s kisikom pa na sliki 4.

Slika 2: Encimske spremembe med aerobno in anaerobno rastjo E. coli. Ko celice E. coli preklopijo iz

aerobne rasti na anaerobno rast z nitratom kot končnim prejemnikom elektronov, prihaja do encimskih

sprememb. Te spremembe so: a) citokrom o oksidazo (cyt o) zamenja nitratna reduktaza (NR); b) sukcinat

dehidrogenazo (SDH) zamenja fumarat reduktaza (FR); c) piruvat dehidrogenazo (PDH) zamenja piruvat-

format liaza (PFL); d) ne sintetizira se α-ketoglutarat dehidrogenaza (αKGDH); e) sintetizira se format-

vodikova liaza (FHL). Zaradi nizke koncentracije αKGDH in povišane koncentracije FR pride do spremembe

cikla citronske kisline iz oksidativne poti v reduktivno pot pri kateri nastaja in se izloča sukcinat. Druge

metabolne spremembe v primeru anaerobne rasti vključujejo nastanek mlečne in ocetne kisline ter etanola, ki

se sproščajo v gojišče (White in Hegeman, 1998).


Slika 3: Regulacija genske ekspresije s kisikom in nitratom pri E.coli. A) ArcA/ArcB regulatorni sistem.

ArcB je membranski protein, ki je aktiviran v odsotnosti kisika, najverjetneje z redukcijo. Aktivna oblika

ArcB je fosforilirana in prenese fosfat na citoplazmatski regulatorni protein ArcA, le-ta potem prepreči

transkripcijo genov, ki so izraženi med aerobno rastjo. V tem primeru torej anaerobioza prepreči transkripcijo

mnogih genov. B) FNR regulatorni sistem. FNR je transkripcijski regulator, ki je aktiviran med anaerobno

rastjo in je induktor ali represor mnogih genov. Skupaj z ArcA/ArcB sistemom tekmuje za različno izražanje

genov pri E.coli med aerobnimi in anaerobnimi pogoji (White in Hegeman, 1998).


Slika 4: Kontrola izražanja genov z nitratom. Membransko vezan senzorski protein histidin kinaza (HK)

zazna nitrat in se avtofosforilira. Fosfatna skupina se nato prenese na citoplazmatski regulatorni protein NarL,

ta stimulira transkripcijo nitratnih reduktaznih genov in prepreči transkripcijo genov za alternativne

akceptorje elektronov (geni za fumaratno reduktazo in geni za DMSO-TMAO reduktazo) (White in

Hegeman, 1998).

Namen vaje: ugotoviti vpliv kisika in nitrata na izražanje nitratne reduktaze pri E. coli.

Materiali:


- bakterijska kultura E. coli v stacionarni fazi rasti

- destilirana voda

- gojišče M9 z 0.2 % (V/V) glukoze in 0.25 % (V/V) kazeinskega hidrolizata

- N2

- reagent SA + NEDA

- spektrofotometer

- standard NO3- (1 mg mL-1)

- steklene epruvete

- sterilne Hungate-ove epruvete


- sterilni 20 % (w/V) KNO3


- stresalnik


Izvedba vaje:

E. coli bomo gojili bodisi aerobno ali anaerobno na glukozi in nitratu ter anaerobno na

glukozi ter tako ugotavljali pri katerih pogojih celice sintetizirajo nitratno reduktazo.

Nacepite 50 mL gojišča M9, pH 7 z 0.2 % (V/V) glukoze in 0.25 % (V/V) kazeinskega

hidrolizata v 250 mL erlenmajerici z 30 µL prekonočne kulture E. coli ESH 10 K-12.

Inkubirajte s stresanjem pri 200 obr/min na 37 °C. Ko opazite povečano motnost gojišča

(po priblžno 2.5 h inkubacije), prenesite dvakrat 10 mL kulture v dve sterilni Hungate-ovi

epruveti. V eno epruveto dodajte 20 % (w/V) KNO3, da bo končna koncentracija 19.8 mM.

Enaka koncentracija KNO3 naj bo tudi v erlenmajerici. Postavite erlenmajerico na

stresalnik, epruvet ne stresajte. V Hungate-ovih epruvetah zamenjajte aerobno atmosfero z

N2. Vzorce inkubirajte 2 uri dokler kulture ne dosežejo motnost OD650 približno 0.2 do 0.3.

Po končani inkubaciji določite količino nastalega nitrita.

Postopek za merjenje nitrita:

V epruveto odmerite: 100 µL vzorca

3.9 mL H2O

1 mL reagenta SA + NEDA (sulfanilamid in naftiletilendiamin)

Za ničlitev in standardiziranje fotometra potrebujete 1 epruveto s 4 mL H2O in 1 mL

SA + NEDA ter 1 epruveto z 1 mL standardne raztopine nitrita (1 mg mL-1), 3 mL H2O in

1 mL SA + NEDA. Po 20 min izmerite absorbanco raztopin pri 540 nm. S standardom

umerite fotometer tako, da lahko odčitate direktno koncentracijo nitrita. Pri izračunu

končne koncentracije upoštevajte tudi količino vzorca!


Rezultati:

Prisotnost O2 Prisotnost NO3- Koncentracija nastalega

NO2- (mg mL-1)

+ + - + - -

Vprašanja:

Pri katerih pogojih namnoževanja bakterije E. coli se je sintetizirala nitratna reduktaza in

zakaj?

Kakšna je fiziološka vloga nitratne reduktaze pri bakterijskih celicah?

Kako pri regulaciji sinteze nitratne reduktaze sodelujeta regulacijska sistema Arc in Fnr?

Literatura:

- Gunsalus R.P., Park S.J. 1994. Aerobic-anaerobic gene regulation in Escherichia

coli: control by the ArcAB and Fnr regulons. Research in Microbiology, 145, 5-6:

437-450.

- White D., Hegeman G.D. 1998. Microbial Physiology and Biochemistry

Laboratory. A quantitative approach. Oxford, Oxford University Press, Inc.:

110-115.


SLANOST

Slanost je eden ključnih dejavnikov okolja, ki vpliva na delovanje bakterijskih celic. Znano

je, da osmotski stres zmanjša rast bakterijskih celic, celično produktivnost, povzroči

inaktivacijo celic v industrijskih fermentacijah ter zavira biodegradacijske procese čiščenja

odpadnih voda. Večina mikroorganizmov v celici akumulira kompatibilne topljence ali

osmolite (npr. betain, prolin, glutaminska kislina, glutamin in trehaloza) oziroma spremeni

celični volumen, kot odgovor na spremembe slanosti v okolju. Pri povečani osmolarnosti

pride do izgube vode iz celice, medtem ko voda vdira v celico pri zmanjšani osmolarnosti.

Poleg tega slanost vpliva tudi na lipidno sestavo in funkcije bakterijske membrane.

Bakterije, ki rastejo pri višjih slanostih imajo večji delež negativno nabitih fosfolipidov v

membrani. Vsi ti procesi sodelujejo pri adaptaciji bakterij na spremembe v osmolarnosti

okolja.

SPREMLJANJE AKTIVNOSTI MIKROBNIH CELIC

Aktivnost mikrobnih celic se spreminja s spreminjanjem dejavnikov okolja. V ta namen

bomo spremljali aktivnost mikrobnih celic preko aktivnosti dehidrogenaz in mikrobne

respiracije.

Dehidrogenaze so zelo specifični encimi, ki katalizirajo biološko oksidacijo organske

snovi. Proces dehidrogenacije lahko ponazorimo z naslednjo formulo:

XH2 + A X + AH2 , … (15)

kjer je XH2 organska spojina kot vir vodika in A kot prejemnik vodika.

Zaradi raznolikosti substratov in prejemnikov poznamo mnogo različnih specifičnih

dehidrogenaznih sistemov (npr. sukcinat, fumarat, format, laktat, NADH dehidrogenaza,

hidrogenaza), ki so udeleženi v metabolni aktivnosti mikroorganizmov. Merjenje

dehidrogenazne aktivnosti torej kaže na celokupno oksidativno aktivnost celic. V mnogih


fizioloških in ekoloških študijah so za meritve metabolne aktivnosti uporabljene

tetrazolijeve soli (npr. 2-(4-iodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-fenil tetrazolijev klorid (INT);

5-ciano-2,3-ditolil tetrazolijev klorid (CTC); 2,3,5-trifenil tetrazolijev klorid (TTC)), ki so

reducirane z mnogimi dehidrogenaznimi encimi prisotnimi v aerobnih, fakultativnih in

anaerobnih mikroorganizmih. Poleg tega lahko te soli uporabljamo tudi kot indikator

aktivnosti elektronske transportne verige pri bakterijah, algah in kvasovkah. Tetrazolijeve

soli (npr. INT in CTC) se uporabljajo tudi v mikroskopiji za določanje števila živih celic v

okoljskem vzorcu ali za določanje metabolno aktivnih bakterijskih celic v čisti kulturi, saj

kopičijo aktivni mikroorganizmi kristale formazana v celici.

Za spremljanje dehidrogenazne aktivnosti bakterijskih celic se največkrat uporablja redoks

indikator 2,3,5-trifeniltetrazolijev klorid (TTC), ki omogoča poenostavljeno merjenje

dehidrogenazne aktivnosti. TTC je lahko prejemnik elektronov v reakcijah, ki vključujejo

različne dehidrogenaze kot tudi encime, ki vsebujejo flavin. Ti encimi reducirajo TTC v

netopni 1,3,5-trifeniltetrazolijev formazan (TTF). Kristali slednjega se kopičijo v aktivnih

celicah, zato ga je potrebno ekstrahirati iz bakterijskih celic z organskimi topili (npr.

aceton, metanol) in meriti spektrofotometrično. Pri redukciji TTC v TTF pride do

spremembe barve iz rumene v vijolično. Količina nastalega formazana je mera za

celokupno metabolno aktivnost mikroorganizmov.

Dehidrogenazno aktivnost podamo kot količino nastalega TTF na celico:

Dehidrogenazna aktivnost = kulture

olame

kulture

olameTPF

VCFUlk

VA

VCFU

Vc

⋅⋅⋅

⋅=

⋅

⋅ tan485tan ,

celica

gµ ... (17)

kjer so A485 - absorbanca vzorca pri 485 nm, Vmetanola - volumen metanola potreben za

ekstrakcijo (mL); k – ekstrakcijski koeficient izračunan iz umeritvene krivulje (0.0403 mL

µg-1 cm-1); l - dolžina poti žarka v kiveti (1 cm); CFU - število celic v 1 mL kulture; in

Vkulture - volumen kulture uporabljene za izvajanje poskusa (mL).

Aktivnost mikrobnih celic lahko merimo tudi s produkcijo CO2. Pri aerobni razgradnji

organske snovi so večinski produkti mikrobne respiracije CO2, H2O in novonastala


biomasa. Produkcija CO2 je lahko mera za hitrost respiracije, ki jo izračunamo po naslednji

formuli:

Hitrost respiracije = kulture

lg

VtCFU

VVCO

⋅⋅

⋅+⋅∆ )(2 α, (mL celico-1 h-1) … (18)

kjer so: ∆CO2 = [CCO2,1h – CCO2,0h ] – razlika v izmerjenih koncentracijah CO2 v plinski

fazi na začetku in koncu inkubacije (%); Vg – volumen plinske faze (mL); Vl – volumen

tekoče faze (mL); α - Bunsenov koeficient topnosti plinov, za CO2 je pri 25 °C vrednost

0.758; CFU – število celic v 1 mL kulture, t – čas inkubacije in Vkulture - volumen kulture

uporabljene za izvajanje poskusa (mL).

Vaja 5: Vpliv slanosti na metabolno aktivnost in hitrost respiracije pri bakteriji

Vibrio sp.

Namen vaje: ugotoviti, kako slanost vpliva na metabolno aktivnost in hitrost respiracije

bakterije Vibrio sp., ki smo jo izolirali iz Škocjanskega zatoka, kjer je slanost cca. 3 %

(w/V).

Materiali:

- 0.1 M Tris-HCl pH 7.7

- 0.3, 1.7, 3, 5 ali 10 % (w/V) raztopina NaCl

- 0.5 M KH2PO4

- 1 % (w/V) TTC v 0.l M Tris-HCl pH 7.7

- 1 M glukoza

- 15-mL serumske stekleničke

- 20 mM Tris-HCl pH 7.4 z 0.3, 1.7, 3, 5 ali 10 % (w/V) NaCl


- centrifuga

- etanol

- kivete

- metanol

- plinski kromatograf


- plošče PKS s 3 % (w/V) NaCl

- prekonočna kultura bakterije Vibrio sp. v gojišču PKS z različnimi koncentracijami

NaCl (0.3, 1.7, 3, 5 in 10 % (w/V))

- spektrofotometer

- sterilna fiziološka raztopina (0.9 % (w/V) NaCl)

- sterilne centrifugirke


- sterilne steklene 5 in 10-mL pipete


- stresalnik


Izvedba vaje:

Prekonočni kulturi, ki je rasla v gojišču PKS z določeno koncentracijo NaCl (0.3,

1.7, 3, 5 in 10 % (w/V)):

a) Izmerite optično gostoto OD650.

b) V sterilnih ependorfkah pripravite redčitve prekonočne kulture do 10-8. Za redčitve

uporabite sterilno fiziološko raztopino (0.9 % (w/V) NaCl). Na plošče PKS s 3 %

(w/V) NaCl nacepite po 100 µL redčin 10-6, 10-7 in 10-8 za določanje števila celic.

Plošče inkubirajte na 28 °C 24-48 ur.

c) V dve centrifugirki odpipetirajte po 10 mL prekonočne kulture in centrifugirajte

15 min pri 13000 obr/min.

Za določanje dehidrogenazne aktivnosti:

Celice v eni centrifugirki resuspendirajte v 1 mL 20 mM Tris-HCl pufru pH 7.4 z enako

koncentracijo NaCl kot je bila v gojišču ter jih dobro premešajte na vibracijskem

mešalniku. Suspenzijo celic (0.5 mL) prenesite v dve ependorfki. Celicam v eni ependorfki

dodajte 0.5 mL 1 % (w/V) TTC v 0.1 M Tris-HCl pufru pH 7.7, 25 µL 0.5 M KH2PO4 in

25 µL 1 M glukoze ter dobro premešajte. Drugo ependorfko imejte za kontrolo, kjer

suspenziji celic dodate 0.5 mL 0.1 M Tris-HCl pufra pH 7.7 brez TTC ter 25 µL 0.5 M

KH2PO4 in 25 µL 1 M glukoze. Vzorec in kontrolo inkubirajte v temi na stresalniku pri


100 obr/min na 28 °C eno uro. Po končani inkubaciji vzorce centrifugirajte 15 minut pri

8000 obr/min in odstranite supernatant. Iz celic nato ekstrahirajte nastali TTF, tako da jim

dodate 1.5 mL metanola. Suspenzijo celic dobro premešajte na vibracijskem mešalniku in

nato ročno mešajte še 15 minut. Po končanem mešanju ekstrakte centrifugirajte 15 minut

pri 8000 obr/min in metanolnim ekstraktom izmerite absorbanco pri 485 nm (A485).

Za določanje hitrosti bakterijske respiracije:

Celice v drugi centrifugirki resuspendirajte v 10 mL raztopine NaCl z enako koncentracijo

kot je bila v gojišču med rastjo. Po 5 mL celic v raztopini NaCl prenesite v dve 15-mL

serumski steklenički. Steklenički plinotesno zaprite in merite nastali CO2 s plinskim

kromatografom in sicer takoj ter po enourni inkubaciji s stresanjem pri 200 obr/min na

28 °C.

Pogoji pri katerih deluje plinski kromatograf med merjenjem so naslednji: temperatura

injektorja 100 °C, temperatura pečice in kolone 50 °C, temperatura detektorja toplotne

prevodnosti (TCD - thermal conductivity detector) 100 °C, pretok nosilnega plina helija

(He) skozi kolono 180 mL min-1. Uporabljamo 180 cm dolgo kolono s premerom 1/8˝ in

polnilom Porapak R mesh 100/120 (Millipore Corporation, Miliford, ZDA).

Rezultati:

Po inkubaciji preštejte zrasle kolonije na ploščah in izračunajte dehidrogenazno aktivnost

ter hitrost bakterijske respiracije.

Narišite tabelo v kateri boste pokazali kako se OD650, število celic, metabolna aktivnost in

hitrost bakterijske respiracije spreminjajo s slanostjo. Podatke prikažite tudi grafično.

Vprašanja:

Ali sta hitrost rasti in dehidrogenazna aktivnost med seboj povezani in zakaj?

Zakaj je dehidrogenazna aktivnost mera za celokupno metabolno aktivnost bakterijskih

celic?

Zakaj je produkcija CO2 mera za hitrost bakterijske respiracije?


Literatura:

- Danevčič T. 2006. Vpliv slanosti na energetski metabolizem pri bakteriji Vibrio sp.

Doktorska disertacija. Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Podiplomski študij bioloških in

biotehniških znanosti: znanstveno področje biotehnologija: 119 str.

- Hatzinger P.B., Palmer P., Smith R.L., Peñarrieta C.T., Yoshinari T. 2003.

Applicability of tetrazolium salts for the measurement of respiratory activity and

viability of groundwater bacteria. Journal of Microbiological Methods, 52: 47-58.

- Maness P.C., Smolinski S., Blake D.M., Huang Z., Wolfrum E.J., Jacoby W.A. 1999.

Bacterial activity of photocatalytic TiO2 reaction: toward an understanding of its killing

mechanism. Applied and Environmental Microbiology, 65: 4094-4098.

- Weaver R.W. 1994. Methods of soil analysis. Part 2 - Microbiological and biochemical

properties. Wisconsin, Madison, Soil Science Society of America Book Series No.5:

820-823.


PROTIMIKROBNE SNOVI IN VREDNOTENJE NJIHOVE AKTIVNOSTI

Pregled pogosto uporabljanih pojmov v povezavi s kontrolo mikroorganizmov:

Sterilizacija je proces, s katerim uničimo živost mikroorganizmov ali odstranimo vse žive

celice in spore.

Dezinfekcija je uničenje živosti, inhibicija ali odstranitev nesporogenih mikrobov, ki

povzročajo bolezni (uporablja se za neživ material kot so delovne površine, laboratorijski

pribor). Izvaja se s pomočjo sredstev kot so alkoholi, aldehidi, halogeni in oksidirajoči

agensi).

Antiseptiki so kemijska sredstva, ki preprečujejo infekcije tkiva z inhibicijo ali uničenjem

živosti patogenih mikrobov. Ker se uporabljajo za tkiva, so navadno blažja od

dezinfekcijskih sredstev.

Aseptična tehnika je preprečevanje vstopa mikroorganizmov iz okolja.

Protimikrobne snovi, s katerim uničujemo živost mikroorganizmov, označujemo s

končnico -cid, pri čemer označimo še specifično skupino, na katero delujejo (baktericid,

fungicid). Snovi za preprečevanje rasti označujemo s končnico -statik (bakteriostatik,

fungistatik).

Minimalna inhibitorna koncentracija (MIK)

Ugotavljamo najmanjšo količino snovi, ki je potrebna za inhibicijo rasti testnega

organizma. Ena od metod temelji na razredčevalni tehniki. Serijo epruvet z gojiščem, ki

vsebuje v vsaki epruveti drugačno koncentracijo testirane snovi nacepimo s kulturo

testnega organizma. Po inkubaciji ugotavljamo na osnovi motnosti v katerih epruvetah ni

rasti in iz tega določimo minimalno inhibitorno koncentracijo testirane snovi. MIK ni

absolutna vrednost za neko snov in je odvisna od testnega organizma kot tudi od

dejavnikov okolja kot so sestava gojišča, pH, prezračevanje in temperatura.


Ugotavljanje narave in hitrosti protimikrobnega delovanja

V testu ugotavljanja MIK ni mogoče ugotoviti ali je testirana snov baktericidna ali

bakteriostatična in kakšna je hitrost njenega učinkovanja. To lahko ugotovimo, če v

časovnih intervalih med inkubacijo testnega organizma s testirano snovjo na podvzorcih

merimo motnost in z uporabo štetja na ploščah določimo število celic.

Kakšen je učinek dodane protimikrobne snovi na rast testnega organizma v primerjavi s

kontrolo lahko izračunamo s pomočjo enačbe 18. Ta enačba je:

100)(

)()(

0

00

,650,650

,650,650,650,650⋅

−

−−−=

KK

VVKK

ODOD

ODODODODR

x

xx , (%) … (18)

kjer je R upad rasti celic, OD650,Kx motnost kontrole po določenem času inkubacije,

OD650,K0 motnost kontrole ob času 0, OD650,Vx motnost vzorca z dodano protimikrobno

snovjo po določenem času inkubacije in OD650,V0 motnost vzorca z dodano protimikrobno

snovjo ob času 0.

Antibiotiki

Leta 1928 je škotski znanstvenik Alexander Fleming po naključju odkril antibiotik

penicilin. Opazil je plesen, ki je rasla na bakterijski kulturi v njegovem laboratoriju in

zaznal čisto cono okoli plesni, saj bakterijske celice tam niso rasle. Nadaljne študije so

pokazale, da ta plesen tvori nekatere zaščitne spojine, ki inhibirajo ali uničijo bakterije.

Plesen so identificirali kot Penicillium notatum in zaščitno spojino kot penicilin. Temu so

sledila odkritja drugih organizmov, ki tudi tvorijo podobne spojine, ki bodisi uničujejo ali

inhibirajo bakterijsko rast. Te spojine so poimenovali antibiotiki, ker uničujejo

mikroorganizme.

Antibiotiki se uporabljajo za preprečevanje in zdravljenje bakterijsko pogojenih bolezni pri

človeku in živalih. Zaradi njihove prekomerne uporabe za zdravljenje ljudi in živali so se


razvili sevi odporni na širok spekter antibiotikov. Odpornost na antibiotike je zato velik

problem sodobne medicine.

Antibiotike delimo v skupine glede na njihove biosintetske poti in prekurzorje:

- antibiotiki iz aminokislinskih prekurzorjev sintetizirani po neribosomski sintetski

poti (β-laktamski antibiotiki, ciklični peptidi, lipopeptidi) ali po normalni

ribosomski sintezi (nizin)

- antibiotiki iz sladkorjev (aminoglikozidi)

- antibiotiki iz maščobnih kislin (poliketidni anibiotiki kot tetraciklin, makrolidi,

polieni).

Antibiotike delimo tudi glede na način oziroma mehanizem delovanja na bakterijske celice

npr.:

- antibiotiki, ki delujejo na celično steno (bacitracin in vankomicin preprečujeta

sintezo peptidoglikana; penicilin in cefalosporin preprečujeta povezave

peptidoglikanskih molekul in s tem tvorbo celične stene)

- antibiotiki, ki delujejo na ribosomsko sintezo proteinov v celici (kloramfenikol,

eritromicin, streptomicin, tetraciklin, gentamicin, streptomicin – antibiotiki s

širokim spektrom delovanja)

Mehanizmi delovanja antibiotikov, ki jih bomo uporabljali na vajah:

- ampicilin: ovira zadnjo fazo sinteze celične stene

- streptomicin: irreverzibilno se veže na 30S podenoto ribosoma in prepreči začetek

sinteze proteinov ali zmanjša sintezo ter inducira napake pri branju mRNK

- spektinomicin: reverzibilno prepreči vezavo mRNK na 30S podenoto ribosoma,

vendar ne povzroča napak pri branju mRNK.

Vaja 6: Vpliv antibiotikov in razkužila na rast mikroorganizmov

Namen vaje: ugotoviti vpliv ampicilina, spektinomicina in spitaderma na rast

mikroorganizmov.


Materiali:

- antibiotik ampicilin 100 mg mL-1

- antibiotik spektinomicin 50 mg mL-1

- avtomatska pipeta (0.1 mL)

- bakterijska kultura E. coli v eksponentni fazi rasti

- mikrotitrske plošče

- spektrofotometer

- spitaderm

- steklene petrijevke

- sterilna destilirana voda


- tekoče gojišče LB

- večkanalna pipeta

Izvedba vaje:

V sterilno petrijevko nalijte tekoče gojišče LB. Z večkanalno pipeto prenesite v vsako

jamico mikrotitrske plošče 0.1 mL gojišča LB, nato v prvi stolpec vrstic A in B

odpipetirajte 50 µL sterilne vode, v prvi stolpec vrstic C in D odpipetirajte 50 µL

antibiotika ampicilin (100 mg mL-1), v prvi stolpec vrstic E in F 50 µL antibiotika

spektinomicina (50 mg mL-1) in v prvi stolpec vrstic G in H 50 µL razkužila spitaderm

(0.5 % (w/w) klorheksidindiglukonat, 0.45 % (w/w) H2O2 in 70 % (w/w) 2-propanol). Po

končanem dodajanju protimikrobnih snovi prenašajte 50 µL raztopine iz enega stolpca v

drugega, vmes menjujte pipetne nastavke in tekočino premešajte. Na tak način boste redčili

izbrane protimikrobne učinkovine. Po redčenju pokrijte mikrotitrsko ploščo s pokrovom. V

sterilno petrijevko nalijte del testne kulture Escherichia coli ESH10 K-12 v eksponentni

fazi rasti in jo nacepljajte v jamice mikrotitrske plošče po 100 µL od stolpca 12 proti

stolpcu 1 (vmes ni potrebno menjavanje pipetnih nastavkov). Inkubirajte mikrotitrske

plošče na 37 °C.


Rezultati:

Izmerite motnost na spektrofotometru pri 650 nm takoj po dodatku kulture in v enournih

časovnih intervalih inkubacije (5 ur). Primerjajte motnosti kulture z dodano protimikrobno

učinkovino s kontrolno kulturo. Kaj opazite?

Za vsako protimikrobno učinkovino izračunajte upad motnosti kulture testnega organizma

glede na koncentracijo oziroma količino dodane učinkovine v primerjavi s kontrolno

kulturo po 5 urah inkubacije s pomočjo enačbe 18. Izračunane vrednosti predstavite tudi

grafično.

Narišite motnost v odvisnosti od časa za kontrolno kulturo in kulture z dodanimi

protimikrobnimi učinkovinami za pet največjih koncentracij. Kaj opazite? Kakšen je

učinek izbranih protimikrobnih snovi?

Vprašanja:

Kakšen vpliv imajo na testni organizem izbrane protimikrobne učinkovine?

Kako je upad motnosti kulture testnega organizma odvisen od koncentracije oziroma

količine dodane protimikrobne učinkovine?

Kako določite razliko med bakteriocidnim in bakteriostatičnim protimikrobnim sredstvom?

Bakteriocini

Bakterijske toksine imenovane tudi protimikrobni proteini ali bakteriocini sintetizirajo

skoraj vse bakterijske vrste, tako po Gramu pozitivne kot tudi po Gramu negativne. Znano

je, da 99 % bakterij proizvaja najmanj en bakteriocin. Te snovi zavirajo ali preprečujejo

rast sorodnim vrstam mikroorganizmov. Bakteriocini so proteinske molekule

protimikrobne narave, ki inhibirajo rast sorodnih bakterijskih vrst (delujejo

bakteriostatično) ali uničijo sorodne bakterijske vrste (delujejo baktericidno). To so zelo

heterogena skupina molekul, ki se razlikujejo po mehanizmu delovanja, aktivnosti,

velikosti, biokemijskih lastnostih, mehanizmu imunosti in genski zasnovi. Njihova sinteza

je vezana na bakterijsko rast in je odvisna od mnogih dejavnikov okolja kot so hranila (vir

ogljika, vir dušika, soli), pH, temperatura in kisik.


Te molekule so produkt bakterijske ribosomske sinteze. Večinoma so sintetizirane kot

prepeptidi, procesirane v celici in nato prenesene s transportnim mehanizmom izven celice,

kjer so tudi aktivne. Njihov mehanizem delovanja je najpogosteje vezan na tvorbo pore v

membrani občutljivih bakterijskih celic ali pa na nukleazno aktivnost na nivoju DNK,

rRNK ali tRNK.

Dve glavni razliki, ki bakteriocine razlikujeta od antibiotikov, sta torej specifičnost

delovanja protimikrobne učinkovine in ribosomska sinteza v času aktivne rasti. Antibiotiki

so sekundarni metaboliti, ki nastajajo v stacionarni fazi rasti.

Protimikrobne učinkovine predstavljajo prednost za bakterijo pri tekmovanju za hranila v

okolju, kjer se bakterija nahaja. Poimenujemo jih po vrsti organizma, ki jih proizvaja

(E. coli - kolicin, Bacillus subtilis – subtilizin, Vibrio – vibricin).

Pri testih, s katerimi sledimo protimikrobno aktivnost, je pomemben izbor indikatorskega

organizma, gostota kulture in difuzijska sposobnost bakteriocina. Indikatorsko kulturo

lahko vzdržujemo v tekočem gojišču ali na trdnih gojiščih, kamor položimo diske z

bakteriocinom. Aktivnost je določena s conami zbistritve indikatorske kulture v mm.

Pri bakteriji Vibrio sp., ki je bila izolirana iz brakične vode Škocjanskega zatoka, je bila

opažena protimikrobna aktivnost na nekatere bakterijske vrste, prav tako izolirane iz tega

okolja. Učinkovino bakterija izloča v gojišče.

Vaja 7: Vpliv bakteriocina na rast testnega organizma

Namen vaje: ugotoviti vpliv bakteriocina na rast testnega organizma in kako različne

koncentracije soli vplivajo na sintezo bakteriocina


a) Merjenje protimikrobne aktivnosti na mikrotitrski plošči

Materiali:


- etanol

- izrabljeno gojišče kulture Vibrio sp.

- kultura 5A v eksponentni fazi rasti

- mikrotitrska plošča

- spektrofotometer

- sterilne petrijevke


- tekoče gojišče PKS

- večkanalna pipeta

Izvedba vaje:

V sterilno petrijevko nalijte tekoče gojišče PKS. Z večkanalno pipeto prenesite v štiri

vrstice mikrotitrske plošče 0.1 mL gojišča PKS, nato v prvi stolpec vrstic A in B

odpipetirajte 50 µL 3 % (w/V) raztopine NaCl, v prvi stolpec vrstic C in D odpipetirajte

50 µL izrabljenega gojišča (IG) kulture Vibrio sp. DSM14379. Po končanem dodajanju

bakteriocina prenašajte 50 µL tekočine iz enega stolpca v drugega, vmes menjujte pipetne

nastavke in tekočino premešajte. Na tak način boste redčili IG. Po redčenju pokrijte

mikrotitrsko ploščo s pokrovom. V sterilno petrijevko nalijte del testne kulture 5A v

eksponentni fazi rasti in jo nacepljajte v jamice mikrotitrske plošče po 100 µL od stolpca

12 proti stolpcu 1 (vmes ni potrebno menjavanje pipetnih nastavkov). Inkubirajte

mikrotitrske plošče na 28 °C.

Rezultat:

Izmerite motnost na mikročitalcu pri 650 nm takoj po dodatku kulture in v enournih

časovnih intervalih inkubacije (5 ur). Primerjajte motnosti kulture z dodanim IG s

kontrolno kulturo. Kaj opazite?


Za testni organizem izračunajte upad motnosti testne kulture v primerjavi s kontrolo glede

na količino dodanega IG po 5 urah inkubacije s pomočjo enačbe 18. Izračunane vrednosti

predstavite tudi grafično. Narišite tudi motnost v odvisnosti od časa za kontrolno kulturo in

kulturo z dodanim IG za pet največjih koncentracij. Kaj opazite?

Vprašanja:

Kakšen vpliv ima bakteriocin na testni organizem?

Kako je upad motnosti kulture testnega organizma odvisen od koncentracije oziroma

količine dodanega bakteriocina?

b) Merjenje protimikrobne aktivnosti z difuzijskim testom

Materiali:


- bakterijska kultura Vibrio sp. gojena do stacionarne faze rasti pri različnih

koncentracijah NaCl (0.3, 1.7, 3, 5 in 10 % (w/V)) v gojišču PKS pri 200 obr/min

in 28°C

- centrifuga

- kultura 5A v eksponentni fazi rasti gojena v gojišču PKS pri 200 obr/min in 28°C

- pinceta

- plošče PKS

- sterilne 10-mL steklene pipete

- sterilne centrifugirke

- sterilni filtri 0.2 µm

- sterilni papirnati diski (5 mm)


Izvedba vaje:

10 mL kulture Vibrio sp. DSM 14379, namnožene do začetka prehoda v stacionarno fazo

rasti, centrifugirajte 15 min pri 13000 obr/min in supernatant prefiltrirajte skozi 0.2 µm

membranski filter v sterilno centrifugirko. Filtrat označite z IG (izrabljeno gojišče).

Ugotavljali boste vpliv slanosti na sintezo protimikrobne učinkovine, zato bo


namnoževanje potekalo pri različnih koncentracijah soli v gojišču (0.3; 1.7; 3; 5 in 10 %

(w/V) NaCl).

Protimikrobno aktivnost boste določili z difuzijskim testom na trdnem gojišču PKS.

Indikatorsko kulturo 5A razmažite (100 µL) na ploščo PKS. Nato položite 5 sterilnih

papirnatih diskov (5 mm) na površino in odpipetirajte na vsak disk 3, 5, 7, 10 ali 15 µL IG.

Inkubirajte plošče na 28 °C in nato izmerite premer bistre cone okrog diskov.

Rezultati:

Izrabljeno gojišče – premer bistre cone (mm)

IG (3 µµµµL) IG (5 µµµµL) IG (7 µµµµL) IG (10 µµµµL) IG (15µµµµL)

IG 0.3 % (w/V) NaCl IG 1.7 % (w/V) NaCl IG 3 % (w/V) NaCl IG 5 % (w/V) NaCl IG 10 % (w/V) NaCl

Vprašanja:

Ali količina izrabljenega gojišča vpliva na velikost cone inhibicije?

Kako koncentracija NaCl vpliva na sintezo ali aktivnost bakteriocina?

Literatura:

- Casey J.T., O´Cleirigh C., Walsh P.K., O´Shea D.G. 2004. Development of a robust

microtiter plate-based assay method for assessment of bioactivity. Journal of

Microbiological Methods, 58: 327-334.

- Daw M.A., Falkiner F.R. 1996. Bacteriocins: nature, function and structure.

Micron, 27: 467-479.

- Dykes G.A. 1995. Bacteriocins: ecological and evolutionary significance. Trends in

ecology and evolution, 10: 186-189.

- Jack R.W., Tagg J.R., Ray B. 1995. Bacteriocins of Gram-positive bacteria.

Microbiological reviews, 59: 171-200.


- Riley M.A., Wertz J.E. 2002. Bacteriocin diversity: ecological and evolutionary

perspectives. Biochimie, 84: 357-364.


ANTIBIOTIKI IN FREKVENCA MUTACIJ

Mutacije so rezultat stabilne, dedne spremembe nukleotidnega zaporedja DNK katerih

frekvenca se poveča s spreminjanjem kemijskega in fizikalnega okolja bakterijskih celic. V

primeru, da se mutirana bakterija pojavi v okolju v katerem je nastala, potem raste v širšem

koncentracijskem območju nekega dejavnika od rasti normalne bakterijske celice. V takem

primeru postane mutanta zelo hitro dominantna v bakterijski kulturi.

Mehanizem nastanka mutacij:

- spontane mutacije nastanejo v večini bakterijskih celic in se razvijejo v odsotnosti

mutagene snovi

- inducirane mutacije so rezultat izpostavljanja bakterijskih celic mutagenu (fizikalni

ali kemijski snovi)

- mutacije brez kemijskege ali fizikalne snovi ali mutageneza s transponibilnimi

elementi kot so insercijski elementi, transpozoni (npr. Tn5, Tn10) in nekateri virusi

(npr. bakteriofag Mu); ti elementi se vključujejo v gene na kromosomu in s tem

preprečijo funkcionalnost samega gena.

Vaja 8: Vpliv koncentracije streptomicina na razvoj rezistentnih bakterij Serratia

marcescens

Namen vaje: izolirati na streptomicin rezistentne mutante bakterije Serratia marcescens

po metodi z gradientno agarsko ploščo in ugotoviti njihov koncentracijski razpon rasti.

Material:

- agarizirano gojišče TSB

- avtomatske pipete (0.1 mL)

- cepilna zanka

- lesena palčka

- prekonočna bakterijska kultura Serratia marcescens gojena v gojišču TSB pri

200 obr/min in 28 °C


- sterilna petrijevka


- streptomicin 33.4 mg mL-1

- tekoče gojišče TSB

Izvedba vaje:

Vsak študent bo pripravil svojo gradientno agarsko ploščo. Najprej postavite sterilno

petrijevko na nagnjeno površino z uporabo lesene palčke. Na dnu petrijevke označite na

kateri strani je bila le-ta dvignjena. Nato aseptično prelijte 15 mL stopljenega TSB (tryptic

soy broth) agarja iz epruvete v petrijevko, jo pokrijte in počakajte, da se agar strdi ter

ohladi. Ko se agar strdi in ohladi, odstranite stekleno palčko in postavite petrijevko na

ravno površino. Aseptično prelijte 15 mL stopljenega TSB agarja z 0.2 mg mL-1

streptomicina na površini gradientne agarske plošče. Pokrijte ploščo s pokrovom in

počakajte, da se agar strdi in ohladi.

Slika 5: Shematski prikaz priprave gradientne agarske plošče. A) Postavite stekleno palčko pod petrijevko,

dodajte TSB agar in pustite, da se strdi. B) Odstranite palčko in dodajte TSB agar s streptomicinom (Harley

in Prescott, 2002).

Na pripravljene gradientne agarske plošče odpipetirajte 0.3 mL kulture Serratia

marcescens in jo razmažite po površini s stekleno epruveto. Počakajte, da se kultura vpije v

agar in inkubirajte na 28 °C 1 teden.

Po inkubaciji preglejte gradientne agarske plošče na katerih, naj bi se razvile rezistentne

kolonije Serratia marcescens v področju z višjo koncentracijo streptomicina. Vzemite


epruvete s 5 mL gojišča TSB brez antibiotika, z 0.04 mg mL-1 streptomicina ter z

0.2 mg mL-1 streptomicina in vanje nacepite originalno bakterijsko kulturo Serratia

marcescens. V enaka gojišča nacepite tudi eno izmed mutant iz regije z visoko

koncentracijo antibiotika na gradientni agarski plošči. Vse epruvete inkubirajte na 28 °C za

24 - 48 ur. Po inkubaciji opazujte rast mutirane in kontrolne kulture v tekočem gojišču.

Rezultati:

Rast mutirane in kontrolne kulture v odvisnosti od koncentracije streptomicina v gojišču

TSB.

sev gojišče TSB brez streptomicina

gojišče TSB z 0.04 mg mL-1 streptomicina

gojišče TSB z 0.2 mg mL-1 streptomicina

mutanta S. marcescens

kontrola S. marcescens

Vprašanja:

Ali lahko metodo gradientne agarske plošče uporabljamo za katerikoli antibiotik?

Na katerem delu gradientne agarske plošče se je pojavilo največ mutant in zakaj?

Zakaj je gradientna metoda bolj primerna za izolacijo mutant odpornih na antibiotike?

Literatura:

- Harley J.P., Prescott L.M. 2002. Laboratory excercises in microbiology. 5th ed. New

York, McGraw-Hill College: 382-383.




KOMPETENCA PRI Bacillus subtilis

Kompetenca je genetsko programirano fiziološko stanje, ki dovoljuje celicam vezavo in

sprejem proste DNA (plazmidna, fagna (transfekcija) ali kromosomska) iz okolja in vodi h

genetski transformaciji.

Vloga kompetence:

- DNA kot hrana

- vnos DNA v celico kot matrico za popravilo DNA poškodb

- vnos novih genetskih informacij v celico

Razvoj kompetence pri B.subtilis je reguliran preko:

- faze rasti: kompetenca nastopi na prehodu iz eksponentne v stacionarno fazo,

maksimalna je dve uri po prehodu v stacionarno fazo (T2)

- hranil: minimalni medij z glukozo, solmi in aminokislinami = kompetenčno gojišče

(kompetenca je nižja pri uporabi glicerola ali glutamina namesto glukoze)

- tipa celic: le 10 % celic kulture je kompetentnih, saj so kompetentne celice

metabolno in morfološko različne

Glavni transkripcijski faktor za razvoj kompetence je ComK, ki omogoča prepis poznih

kompetenčnih genov odgovornih za vezavo in sprejem DNA. Regulacija njegove aktivnosti

je ključna in je uravnana na transkripcijskem in posttranslacijskem nivoju (slika 6).

Opis poznih kompetenčnih (com) genov:

ComG, C, D, E in F geni so izraženi na prehodu v posteksponentno stanje v

kompetenčnem mediju, njihovi proteini tvorijo poro, ki sodeluje pri transportu DNA v

celico. ComG protein je potreben za vezavo DNA na površino celice.


Slika 6: Shematski prikaz različnih regulatornih poti vključenih v razvoj kompetence pri Bacillus subtilis

(Hamoen in sod., 2003).

Vaja 9: Določanje števila kompetentnih celic, regulacija kompetence in medcelično

komuniciranje pri Bacillus subtilis

Namen vaje: preučiti vpliv mutacije v com genih na razvoj kompetence za transformacijo;

preučiti vpliv hranil na razvoj kompetence; preučiti vpliv com genov na sintezo peptidnih

feromonov ComX; naučiti se uporabe reporterskih genov.

Materiali:

- 1 M Na2CO3

- 1 x SS

- antibiotik kanamicin 10 mg mL-1


- bakterijski sevi IS75, MB1, MB3, BD2129, BD2876, BD2530

- centrifuga


- centrifugirke

- cepilna zanka

- etanol

- kompetenčno gojišče CM

- kromosomska DNA divjega tipa B. subtilis

- led

- ONPG (O-nitrofenil-β-D-galaktopiranozid)

- plošče LB

- plošče MG his, leu, met

- plošče MG his, met

- pufer Z

- spektrofotometer

- sterilna voda


- sterilne erlenmajerice

- sterilne široke epruvete


- stresalnik

- toluen


- vodna kopel

- X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktozid)

- β-merkaptoetanol

Izvedba vaje:

1. dan

Vsaka skupina si pripravi dve oz. tri sterilne široke epruvete z 2 ml kompetenčnega gojišča

(CM), skupini D in E dodata 1 µL kanamicina (končna koncentracija v gojišču naj bo 5 µg

mL-1, založna koncentracija antibiotika je 10 mg mL-1). Epruvete označite in s cepilno

zanko nacepite seve iz plošč:


Skupina Sev Genotip

A IS75

BD2876

his, leu, met

his, leu, met, ∆comQ::Km srfA-lacZ tet

B MB1

BD2129

IS75 comG-lacZ cat

his, leu, met, ∆comK::Km comG-lacZ cat

C MB3

BD2876

BD2129

IS75 ∆mecA::Km comG-lacZ cat



D BD2530

BD2876

BD2129

IS75 mc comS (Kanr) srfA- lacZ ery



E BD2530

BD2876

BD2129

IS75 mc comS (Kanr) srfA- lacZ ery



Kulture inkubirajte čez noč na stresalniku pri 200 obr/min na 37 oC.

2. dan

V dve erlenmajerici (250 mL) odpipetirajte 20 mL gojišča CM ter ju ustrezno označite.

Gojišče nacepite s 500 µL prekonočne kulture (skupine C, D in E eno erlenmajerico

nacepijo z mešano kulturo: dodajo 250 µL prekonočne kulture BD2876 in 250 µL

prekonočne kulture BD2129). Erlenmajerice stresajte v inkubatorju pri 200 obr/min na

37 oC. Po 2 urah inkubacije začnite meriti optično gostoto (OD650) na vsake pol ure (vse

erlenmajerice). Narišite rastne krivulje za vse testirane seve.

Merjenje ββββ-galaktozidaze (vsaka skupina pri enem sevu)

Po 3-4 urah inkubacije odpipetirajte 1 mL kulture v označeno ependorfko (skupina A sev

BD2876, skupina B sev MB1, skupina C sev MB3, skupini D in E pa sev BD2530).

Centrifugirajte, odstranite supernatant in zamrznite pri -20 oC (vzorec T-1). Isto ponovite še

v točki T0 in T2 (t.j. 2 uri po prehodu iz eksponentne v stacionarno rastno stopnjo).


Merjenje kompetence (pri dveh sevih)

Z merjenjem OD650 spremljajte rast bakterijske populacije. Ko bakterije dosežejo točko T2,

so maksimalno kompetentne. V tej točki transformirajte oba seva:

- odpipetirajte 0.5 mL kulture v sterilno široko epruveto ter dodajte 5 µµµµL kromosomske

DNA divjega tipa Bacillus subtilis RO-FF-1 (transformacijska mešanica);

- odpipetirajte 0.5 mL kulture v sterilno široko epruveto ter dodajte 5 µµµµL sterilne vode

(negativna kontrola);

- označite vse epruvete!!!

Epruvete inkubirajte 40 minut s stresanjem pri 200 obr/min na 37 oC.

Med inkubacijo odpipetirajte v označene sterilne ependorfke po 900 µL 1×SS (za redčenje

vsake transformacijske mešanice do 10-6).

Po končani inkubaciji pripravite redčitve transformacijske mešanice do 10-6.

Na plošče MG his, leu, met (minimalno gojišče s histidinom, leucinom in metioninom)

razmažite po 100 µL redčitev 10-5 in 10-6 (za določanje števila vseh celic).

Na plošče MG his, met razmažite po 100 µL neredčene transformacijske mešanice in

redčitve do 10-3 (za določanje števila transformant) ter 100 µL neredčene negativne

kontrole.

Plošče inkubirajte 24 ur na 37 oC.

Na ploščo LB in ploščo MG his, leu, met odpipetirajte 80 µL raztopine X-gal (40 mg mL-1

v dimetilformamidu) ter jo enakomerno razmažite in počakajte, da se površina posuši.

Vsako ploščo razdelite na štiri dele in označite seve BD2876 (oz. BD2129), MB1, MB3 in

BD2530. Ob času T2 nacepite s cepilno zanko ustrezne seve na obe plošči. (vseh pet skupin

skupaj pripravi po dve plošči LB in dve plošči MG his, leu, met.)

Plošče inkubirajte 24 ur na 37 oC.

3. dan

Preštejte kolonije in izračunajte odstotek transformant. Rezultate podajte v tabeli.

Preglejte plošče in opazujte ter opišite fenotipe posameznih sevov.


Merjenje ββββ-galaktozidazne aktivnosti

Postopek za merjenje encimske aktivnosti:

- resuspendirajte celice v 0.5 mL pufra Z (0.1M NaH2PO4 pH 7.0, 1 mM MgSO4, 0.1 M

β-merkaptoetanol - dodajte ga tik pred uporabo: 7µL na 1 mL Z-pufra)

- dodajte 10 µL toluena in premešajte na vibracijskem mešalniku 30 sekund

- inkubirajte na ledu 30 minut

- v ependorfkah zmešajte 0.2 mL tolueniziranih celic z 0.6 mL pufra Z in jih postavite na

30 oC

- pripravite tudi kontrolo za spontano hidrolizo ONPG (namesto celic dodate samo

pufer Z)

- v presledku ~1 minute dodajte 0.2 mL ONPG (4 mg mL-1 v 0.1 M fosfatnem pufru) k

vsakemu vzorcu (zabeležite čas), premešajte na vibracijskem mešalniku

- inkubirajte v vodni kopeli na 30 oC, dokler se ne razvije svetlo rumena barva, nato

ustavite reakcijo z dodatkom 0.5 mL 1M Na2CO3 (zabeležite čas)

- centrifugirajte vzorce 5 min pri 5000 obr/min, da odstranite celice in ni potrebno

upoštevati korekcije (1.75 A550) za absorpcijo celic

- izmerite absorbanco pri 420 nm

- izračunajte aktivnost β-galaktozidaze

Aktivnost β-galaktozidaze = tVOD

AA

⋅⋅

⋅−⋅

650

550420 )75.1(1000 , ... (19)

kjer so A420 – absorbanca pri 420 nm; A550 – absorbanca pri 550 nm; OD650 – optična

gostota bakterijskih celic v točki v kateri ste izvedli β-galaktozidazni test; V – volumen

bakterijske kulture, ki ste ga uporabili za izvedbo β-galaktozidaznega testa (mL) in t – čas

poteka reakcije (s). Encimsko aktivnost podajte v tabeli v kateri bodo vsi podatki potrebni

za njen izračun pri vseh bakterijskih sevih.

Rezultati:

Narišite rastne krivulje vseh testiranih sevov.

Izračunajte odstotek transformant in β-galaktozidazno aktivnost pri vsakem sevu.

β-galaktozidazno aktivnost prikažite tudi grafično.


Vprašanja:

Kateri selekcijski marker smo uporabljali pri transformaciji?

Kako smo dokazali, da hranila vplivajo na kompetenco?

Zakaj smo transformirali mešanico dveh nekompetentnih sevov?

Literatura:

- Dubnau D. 1991. Genetic competence in Bacillus subtilis. Microbiological reviews, 55:

395-424.

- Hamoen L.W., Venema G., Kuipers O.P. 2003. Controlling competence in Bacillus

subtilis: shared use of regulators. Microbiology, 149: 9-17.


SPORULACIJA PRI Bacillus subtilis

V okolju, bogatem s hranili, Bacillus subtilis raste eksponentno, vendar sčasoma

pomanjkanje hranil upočasni rast bakterijske populacije, ki preide v stacionarno rastno

stopnjo. Med prehodom v stacionarno rastno stopnjo celice inducirajo vrsto prilagoditvenih

mehanizmov. Bakterije skušajo izrabiti obstoječe vire energije bolj učinkovito, poiskati in

izrabiti nove vire ter inhibirati rast drugih organizmov.

Mehanizmi prilagoditve bakterijskih celic v stacionarni rastni stopnji so:

- sinteza in izločanje proteaz, amilaz in nukleaz,

- sinteza in izločanje antibiotikov,

- sinteza bičkov (gibljivost),

- razvoj kompetence,

- sporulacija.

Kadar vsi drugi mehanizmi prilagoditve odpovedo, se pri bakteriji Bacillus subtilis

inducira zapleten razvojni program, katerega rezultat je dormantna endospora. Endospora

lahko preživi dolga obdobja brez hranil in je odporna na ekstremne razmere v okolju.

Signale, ki regulirajo vstop v sporulacijo ter večino signalov, ki aktivirajo ostale

adaptacijske mehanizme v stacionarni rastni stopnji, celice interpretirajo s pomočjo

kaskade fosforilacij, poznane kot "Spo0A phosphorelay".

Sporulacija je torej nepovratna točka, je zadnji odgovor, ki ga izbere celica in je pri

bakterijah inducirana s pomanjkanjem hranil, visoko celično gostoto ter poškodbami DNA.

Glavni transkripcijski faktor za iniciacijo sporulacije je Spo0A, ki je reguliran na nivoju

transkrpcije in fosforilacije.


Slika 7: Shematski prikaz regulacijskih poti vključenih v vstop v sporulacijo pri Bacillus subtilis

(Sonenshein, 2000).

Nizka koncentracija Spo0A∼P je dovolj za represijo transkripcije regulatorja AbrB, kar

omogoči transkripcijo mnogih genov, vključenih v adaptacije v stacionarni rastni stopnji,

katerih negativni regulator je AbrB. Višja koncentracija Spo0A∼P stimulira nastanek

aksialnega filamenta, asimetrično delitev ter transkripcijo genov za sporulacijo.

Vaja 10: Regulacija sporulacije pri Bacillus subtilis

Namen vaje: določiti odstotek temperaturno odpornih spor ter opazovati učinek Spo0A na

regulacijo sporulacije in vegetativno rast.

Materiali:

- 1 x SS

- 100 mM IPTG (izopropil-β-D-tiogalaktozid)


- cepilne zanke


- etanol

- plošče LB

- plošče TBAB

- sevi JH642, DZR160, SIK190




- stresalnik

- tekoče gojišče NSM

- vodna kopel

Izvedba vaje:

1. dan

V široko epruveto odpipetirajte 1 mL gojišča NSM (gojišče za sporulacijo) ter epruveto

označite. Skupini C in D dodata še 10 µL 100mM raztopine IPTG (100 mM v vodi). S

cepilno zanko postrgajte kolonijo s plošče ter nacepite tekoče gojišče. Isti sev nacepite še

na ploščo TBAB in ploščo TBAB, na katero predhodno razmažete 60 µL IPTG (vse

skupine). Epruvete in plošče inkubirajte preko noči na 37 oC.

Skupina Sev Genotip

A JH642 wt

B DZR160 ∆spo0A::Em Pspac-spo0A cat

C SIK 190 ∆spo0A::Em Pspac-sad67 cat

D DZR160 ∆spo0A::Em Pspac-spo0A cat

E JH642 wt

2. dan

V sterilnih ependorfkah pripravite redčitve prekonočne kulture v gojišču NSM do 10-7. Za

redčitve uporabite raztopino 1 x SS. Na plošče LB razmažite po 100 µL redčin 10-5, 10-6 in

10-7(za določanje števila vseh celic). Nato redčitve segrevajte 30 minut pri 80 oC. Ta


postopek ubije vegetativne celice, ne pa spore. Po segrevanju na plošče LB razmažite po

100 µL ustreznih redčitev. Redčitve, ki jih segrevate, so podane v spodnji tabeli:

Skupina Redčitve

A 10-5, 10-6, 10-7

B 10-1, 10-2, 10-3

C 10-1, 10-2, 10-3, 10-4

D 10-4, 10-5, 10-6

E 10-5, 10-6, 10-7

Plošče inkubirajte čez noč na 37 oC.

Preglejte plošče TBAB in primerjajte posamezne seve (velikost kolonij, transparentnost).

Opišite svoja opažanja.

3. dan

Preštejte kolonije in izračunajte odstotek sporulacije. Rezultate prikažite v tabeli.

Rezultati:

Izračunajte odstotek sporulacije in rezultate primerjajte med seboj.

Vprašanja:

Ali IPTG vpliva na odstotek sporulacije?

Kako izgledajo kolonije spo+ in spo- bakterij na trdnem gojišču?

Opišite fenotip/genotip mutante SIK190 in razložite njen vpliv na sporulacijo?

Literatura:

- Piggot P.J., Hilbert D.W. 2004. Sporulation in Bacillus subtilis. Current Opinion in

Microbiology, 7: 579-586.

- Sonenshein A.L. 2000. Control of sporulation initiation in Bacillus subtilis. Current

Opinion in Microbiology, 3: 561-566.


KEMOTAKSA PRI BAKTERIJAH

Kemotaksa je sposobnost bakterije, da se premika vzdolž koncentracijskega gradienta

bodisi proti ali proč od neke snovi. Za gibanje rabijo bakterije ATP ali protonsko gonilno

silo.

Oblike gibanja pri bakterijah so:

- plavanje (vrtenje bička)

- rojenje (premikanje z lateralnimi bički)

- polzenje (gibanje brez flagelov, potreben le stik celic s površino)

- trzajoče gibanje (premikanje s pili)

Gibljive bakterije se premikajo s pomočjo bičkov, ki delujejo kot nekakšni propelerji.

Gibanje je sestavljeno iz dveh načinov: premikanje in vrtenje na mestu. Pri vrtenju bička v

eni smeri se bakterija premika, pri vrtenju v nasprotni smeri pa ostaja na mestu, ne da bi se

gibala. Posledica tega je naključno premikanje brez neke določene smeri.

Kemotaksa je torej gibanje organizmov proti ali proč od neke snovi. Pozitivna kemotaksa

je gibanje k neki snovi, ki ima za bakterijo pozitiven vpliv (npr. hranilo), negativna

kemotaksa je gibanje od snovi, ki je bakteriji škodljiva. Tako razlikujemo atraktante in

repelente. Bakterije zaznavajo absolutno koncentracijo atraktanta ali repelenta v času. Če

zaznajo, da je več atraktanta oziroma manj repelenta, plavajo naprej v isti smeri. Če

zaznajo, da je manj atraktanta oziroma več repelenta, naključno spremenijo smer plavanja.

Ob prisotnosti atraktanta bakterije zmanjšajo pojavljanje vrtenja na mestu, plavajo proti

snovi in njihov biček se vrti v obratni smeri urinega kazalca. Ob prisotnosti repelenta

bakterije povečajo pojavljanje vrtenja na mestu, začnejo se zaustavljati in gibati v nasprotni

smeri od snovi, njihov biček se vrti v smeri urinega kazalca.

Gibljive bakterije imajo torej sposobnost zaznavanja spremembe v koncentraciji neke

snovi prevesti v kontrolo vrtenja bička. Posebni senzorski proteini v membrani (npr.

kemoreceptor, metil prenašalni protein - MCP) zaznavajo te spremembe koncentracije in z


vezavo oz. sproščanjem metilne skupine kot odgovor na koncentracijo atraktanta oz.

repelenta posredno vplivajo preko niza citoplazemskih proteinov na smer vrtenja bička in s

tem na premikanje oz. vrtenje na mestu.

V naravnih okoljih imajo gibljive bakterije prednost pred negibljivimi, saj so sposobne

usmerjenega gibanja proti hranilom in okoljem, ki so ugodnejša za njihovo rast. Po drugi

strani pa se lahko izognejo zanje potencialno škodljivim razmeram.

Vaja 11: Opazovanje kemotaktičnega gibanja pri bakterijskih celicah

Namen vaje: opazovati gibanje dveh bakterijskih vrst Serratia marcescens in Micrococcus

luteus na agariziranem gojišču.

Materiali:

- bakterijska seva Serratia marcescens in Micrococcus luteus

- cepilne zanke

- dvoprekatne petrijevke s PKE in H2O

- pincete

- plošče PKE

- skalpel

- sterilna destilirana voda

- sterilni filter trakovi

Izvedba vaje:

V petrijevki z gojiščem PKE izrežite s skalpelom na sredini 1 cm trak iz gojišča in ga

odstranite, da dobite dva ločena sektorja. S sterilno pinceto namestite 2 trakova filter

papirja tako, da bosta povezovala obe polovici. Rahlo pritisnite papir na gojišče. Namestite

3 papirne trakove tudi čez pregrado v petrijevki (PKE-H2O).

Na spodnji strani petrijevke (PKE/PKE) označite na eni polovici, kjer je papirni trak na

gojišču, katero kulturo boste nacepil (S in M). Na spodnji strani petrijevke (PKE/H2O)


označite 2 trakova na nasprotnih straneh z oznako S (Serratia) in 1 trak, kjer se dotika

agarizirane vode z oznako M (Micrococcus). S cepilno zanko nanesite nekaj kulture obeh

bakterij na označena mesta.

Plošče inkubirajte na 37 °C 24 – 48 ur.

Rezultati:

Opazujte gibanje in rast obeh bakterij v petrijevkah in si to označite na skici.

Vprašanja:

Kakšna je prednost gibljivih bakterij pred negibljivimi?

Kaj vpliva na prehod bakterij iz enega dela gojišča na drugega v obeh primerih?

Na kakšen način bi še lahko pokazali gibljivost bakterij?

Literatura:

- Baker M.D., Wolanin P.M., Stock J.B. 2006. Systems biology of bacterial

chemotaxis. Current opinion in microbiology, 9: 187-192.

- Kentner D., Sourijk V. 2006. Spatial organization of the bacterial chemotaxis

system. Current opinion in microbiology, 9: 619-624.

- Madigan M.T., Martinko J.M., Parker J. 1997. Brock Biology of microorganisms.

8th ed. New Jersey, Prentice-Hall International, Inc.: 83-90, 243-244.


BIOFILMI PRI Bacillus subtilis

Biofilmi so strukturirane združbe mikrobnih celic ene ali več vrst ujete v polimerni matriks

in pripete na abiotske ali biotske površine. Biofilm je sestavljen iz mešanice bioloških

komponent kot so voda (< 97 %), mikrobne celice različnih vrst (2-5 %), zunajcelični

polisaharidi (EPS 1-2 %), zunajcelični proteini (< 1-2 %), nukleinske kisline (< 1-2 %) in

vezani ter prosti ioni.

Biofilm so sposobne tvoriti mnoge po Gramu pozitivne kot tudi po Gramu negativne

bakterije in glive. Tvorba biofilmov je njihova preživetvena strategija v neugodnih pogojih.

Bakterije so v biofilmu bolj odporne na protimikrobne snovi kot planktonske celice. Te

celice so na fiziološkem nivoju različne od planktonskih in imajo izražene druge gene.

Razoj biofilma zahteva koordinacijo, interakcije in komunikacijo med mnogimi

bakterijskimi vrstami, ki gradijo biofilme. Proces je visoko reguliran in nanj vplivajo tako

dejavniki okolja (temperatura, osmolarnost, pH, kisik in železo) kot tudi hranila.

Slika 8: Model razvoja biofilma. Posamezne planktonske celice lahko tvorijo interakcije s površino ali

drugimi celicami kar vodi k tvorbi mikrokolonij. Celice, ki so prisotne v biofilmu, lahko preidejo nazaj v

planktonski način življenja, da zaključijo razvojni proces biofilma (O'Toole in sod., 2000).

Bacillus subtilis je sposoben tvorbe večceličnih struktur ali biofilmov z vezavo na abiotske

površine (npr. polivinilklorid - PVC) ali na interfazi zrak – voda. Ta bakterija tvori na


površinah tridimenzinalne strukture debeline nad 30 µm. V naravnih okoljih, kjer je

Bacillus prisoten, je tvorba biofilma prvi korak v kompleksnem razvojnem procesu, ki

vključuje tvorbo plodnih telesc, sporulacijo, kompetenco in druge fiziološke procese.

Pri Bacillus subtilis so geni, ki regulirajo vstop v sporulacijo (spo0A, spo0H), odgovorni za

začetne stopnje v razvoju biofilma. Mutacija v genu spo0A povzroči nepravilnosti v tvorbi

biofilma. Spo0A mutante se vežejo na trdno površino v monosloju in ne tvorijo zrelega

biofilma. Te mutante niso sposobne vzpostavljati interakcij med celicami, ki so potrebne za

tvobo večceličnih biofilmov. Glavna vloga Spo0A pri tvorbi biofilov je negativna

regulacija AbrB. AbrB namreč prepreči izražanje genov katerih produkti so udeleženi pri

medcelični adheziji.

Vaja 12: Razvoj biofilma pri različnih sevih Bacillus subtilis

Namen vaje: ugotoviti kako mutacije v določenih genih vplivajo na razvoj biofilma pri

bakteriji Bacillus subtilis.

Materiali:

- 1 % (V/V) raztopina kristalvijoličnega v pufru za spiranje

- avtomatska pipeta (0.1 in 1 mL)

- bakterijski sevi RO-FF-1, IS75, BD1866, BC3, BC5

- destilirana voda

- mešanica 80 % (V/V) etanola in 20 % (V/V) acetona

- mikrotitrske plošče iz polivinilklorida

- pufer za spiranje (0.15 M amonijev sulfat, 0.1 M kalijev fosfat, 0.034 M natrijev

citrat, 0.001 M magnezijev sulfat, pH 7)

- spektrofotometer


- tekoče gojišče LBb


Izvedba vaje:

Sev Genotip

RO-FF-1 wt

IS75 his leu met

BD1866 IS75 ∆abrB (Kan)

BC3 RO-FF-1 ∆abrB (Kan)

BC5 RO-FF-1 ∆spoOA (Ery)

Vse skupine uporabljajo vse seve.

1.dan:

Prekonočno kulturo redčite 100 krat v svežem gojišču LBb do A650 ≈ 0.01. Po 100 µL

redčenih celic vsakega seva prenesite v 3 luknjice mikrotiterske plošče iz polivinilklorida

(PVC). Za slepi vzorec uporabite 100 µL gojišča LBb. Mikrotiterske plošče inkubirajte na

37 °C.

2. in 3. dan:

Vzorce v mikrotiterskih ploščah premešajte s pipeto 12 ur po inokulaciji in nato vsakih 24

ur zamenjajte porabljeno gojišče LBb s svežim pri tem pazite, da ne odstranite prilepljenih

celic.

4.dan:

Po 72 urah inkubacije luknjice v mikrotiterskih ploščah obarvajte s kristalvijoličnim, ki

omogoči kvantifikacijo pritrjenih bakterijskih celic.

Postopek za barvanje pritrjenih celic:

- najprej iz luknjic odstranite gojišče in nepritrjene celice z avtomatsko pipeto

- luknjice štirikrat sperite z 200 µL pufra za spiranje (0.15 M amonijev sulfat, 0.1 M

kalijev fosfat, 0.034 M natrijev citrat, 0.001 M magnezijev sulfat, pH 7)


- celice pritrjene na steni luknjic barvajte z 200 µL 1 % (V/V) raztopine

kristalvijoličnega v pufru za spranje 20 minut pri sobni temperaturi

- po inkubaciji odstranite odvečno raztopino kristalvijoličnega

- luknjice štirikrat sperite z 200 µL destilirane vode

- kristalvijolično, ki je obarvalo pritrjene celice, raztopite v 200 µL mešanice 80 % (V/V)

etanola in 20 % (V/V) acetona

- količino sproščenega barvila iz biofilma ovrednotite spektrofotometrično pri A600 z

mikročitalcem.

Rezultati:

Prikažite rezultate A600 v odvisnosti od seva v tabeli in grafično. Izračunajte povprečje in

standardni odklon za vsak sev.

Vprašanja:

Ali je izbrana metoda za gojenje in kvantifikacijo biofilmov ustrezna?

Ali bi takšno metodo lahko uporabljali tudi za druge bakterijske vrste, ki so sposobne

tvorbe biofilmov?

Na kakšen način bi spremljali kinetiko razvoja biofilma pri bakterijskih celicah?

Literatura:

- Chagneau C., Saier M.H., Jr. 2004. Biofilm defective mutants of Bacillus subtilis.

Journal of molecular microbiology and biotechnology, 8: 177-188.

- Hamon M.A., Stanley N.R., Britton R.A., Grossman A.D., Lazazzera B.A. 2004.

Identification of AbrB – regulated genes involved in biofilm formation by Bacillus

subtilis. Molecular microbioloy, 52: 847-860.

- Hamon M.A., Lazazzera B.A. 2001. The sporulation transcription factor SpoOA is

required for biofilm development in Bacillus subtilis. Molecular microbiology, 42:

1199-1209.

- O'Toole G., Kaplan H.B., Kolter R. 2000. Biofilm formation as microbial development.

Annual review in microbiology, 54: 49-79.


AMILAZNA AKTIVNOST PRI BAKTERIJAH

Bakterije potrebujejo za rast vir energije, da lahko sintetizirajo različne sestavine celic.

Energija prihaja iz kontrolirane razgradnje organskih substratov v okolju kot so lipidi,

proteini in polisaharidi.

Mnoge bakterije so sposobne razgradnje škroba kot vira energije. Te bakterije sintetizirajo

amilaze, ki jih sproščajo v okolje. Amilaze razgradijo škrob do topnih produktov (npr.

glukoze ali maltoze), ki jih dalje absorbirajo v citoplazmo.

Pri bakterijah poznamo tri različne tipe eksoamilaz, ki jih delimo glede na to kako

razgrajujejo škrobne molekule. Tipi eksoamilaz so:

- α-amilaze, ki cepijo α(1 → 4) glikozidno vez in tvorijo maltozo ali daljše oligosaharide

z α-anomerno konfiguracijo

- glukoamilaze, ki hidrolizirajo α(1 → 4) in α(1 → 6) vezi in omogočijo kompletno

razgradnjo škroba do β-glukoze

- β-amilaze, ki cepijo predzadnje nereducirajoče α(1 → 4) vezi in tvorijo β-anomerne

maltozne enote.

Vaja 13: Vpliv vira ogljika na amilazno aktivnost pri Bacillus subtilis

Namen vaje: ugotoviti vpliv različnih sladkorjev na izražanje oziroma aktivnost amilaze

pri bakteriji Bacillus subtilis.

Materiali:

- 1 % (w/V) škroba v 0.1 M citrat-fosfatnem pufru pH 6.5


- bakterijski sev RO-FF-1

- centrifuga

- cepilne zanke


- destilirana voda

- DNS reagent

- epruvete

- etanol

- 50 % (w/V) fruktoza

- 50 % (w/V) galaktoza

- 50 % (w/V) glukoza

- kivete

- 50 % (w/V) maltoza

- plošče LB

- spektrofotometer

- sterilna fiziološka raztopina


- sterilne steklene 5-mL pipete


- sterilni nastavki

- stresalnik

- tekoče gojišče TSB

- vodna kopel

Izvedba vaje:

1.dan:

Bacillus subtilis RO-FF-1 boste gojili v gojišču TSB z različnimi sladkorji. V sterilne

široke epruvete odpipetirajte 5 mL ustreznega gojišča TSB in mu dodajte ustrezno količino

enega izmed izbranih virov ogljika (tabela) ter nacepite bakterijski sev iz plošče.

Inkubirajte na stresalniku pri 200 obr/min preko noči na 37 °C.


Skupina Gojišče

A TSB

B TSB 2 % (w/V) glukoza

C TSB 2 % (w/V) fruktoza

D TSB 2 % (w/V) maltoza

E TSB 2 % (w/V) galaktoza

2.dan:

a) Izmerite motnost OD650 kulture.

b) V sterilnih ependorfkah pripravite redčitve prekonočne kulture do 10-8. Za redčitve

uporabite sterilno fiziološko raztopino (0.9 % (w/V) NaCl). Na plošče LB nacepite

po 100 µL redčin 10-6, 10-7 in 10-8 za določanje števila celic. Plošče inkubirajte

preko noči na 37 °C.

c) Merjenje amilazne aktivnosti:

1 mL kulture v sterilnih ependorfkah centrifugirajte 15 minut pri 13000 obr/min.

Prenesite dvakrat 100 µL in enkrat 200 µL supernatanta bakterijske kulture v

steklene epruvete. V eno epruveto odpipetirajte 100 µL destilirane vode za slepi

vzorec. Epruveto z 200 µL vzorca segrevajte 20 minut na 100 °C, da inaktivirate

encim. Po segrevanju dodajte v vse epruvete 0.5 mL 1 % (w/V) škroba v 0.1 M

citrat-fosfatnem pufru (pH 6.5). Premešajte in inkubirajte v vodni kopeli pri 40 °C

30 minut. Reakcijo ustavite z dodatkom 1 mL DNS reagenta (1 g

3,5-dinitrosalicilne kisline v 20 mL 2 M NaOH in 30 g NaK-tartrata v 100 mL

destilirane vode). Premešajte in segrevajte 10 minut na 100 °C. Ohladite in dodajte

destilirano vodo do 10 mL. Izmerite absorbanco A540 na spektrofotometru. Ničlite s

slepim vzorcem. Faktor, ki ga vtipkate v spektrofotometer za preračunavanje A540 v

koncentracijo glukoze (mg mL-1), je 2.312.

3.dan:

Preštejte kolonije na ploščah LB in določite število celic, ki so zrasle v gojiščih z

različnimi viri ogljika.


Rezultati:

Izračunajte amilazno aktivnost pri vseh pogojih rasti, ki jo podate kot količino nastale

glukoze na mL vzorca na časovno enoto in celico.

Vprašanja:

Zakaj je amilazna aktivnost odvisna od vira ogljika v gojišču?

Kakšne metode bi še lahko uporabili za spremljanje amilazne aktivnosti pri bakterijah?

Literatura:

- Dharami Aiyer P.V. 2004. Effect of C:N ratio on alpha amylase production by Bacillus

licheniformis SPT 27. African Journal of Biotechnology, 3: 519-522.

- Nickless D.M., Sobieski R.J., Crupper S.S. 2001. Genetic regulation of amylase

expression in Bacillus. Bioscene, 27: 27-30.


SESTAVA GOJIŠČ

Gojišče LB

10 g triptona

5g kvasnega ekstrakta

5 g NaCl

1000 mL destilirane vode

Gojišče TSB

17 g kazeinskega hidrolizata

3 g peptona iz soje

5 g NaCl

2.5 g K2HPO4

2.5 g glukoze


Gojišče M9

10.5 g K2HPO4

4.5 g KH2PO4

1 g (NH4)2SO4

0.5 g Na-citrat·2H2O

10 mL 20 % (w/V) glukoze

10 mL MgSO4·7H2O


Gojišče PKS

5 g peptokompleksa

1 g kvasnega ekstrakta

2 g MgCl2·6H2O


za 0.3 % (w/V) NaCl v gojišče dodate 3 g NaCl


za 1.7 % (w/V) NaCl v gojišče dodate 17 g NaCl

za 3 % (w/V) NaCl v gojišče dodate 30 g NaCl



Gojišče PKE z različnimi pH vrednostmi

6 g peptokompleksa


1000 mL pufra z ustrezno vrednostjo pH

za pH 5: 125 mL 0.2 M kalijevega hidrogen ftalata in 60 mL 0.2 M NaOH

razredčite do 500 mL z destilirano vodo

za pH 6: 125 mL 0.2 M KH2PO4 in 14.25 mL 0.2 M NaOH razredčite do 500 mL z

destilirano vodo

za pH 7: 125 mL 0.2 M KH2PO4 in 74.1 mL 0.2 M NaOH razredčite do 500 mL z

destilirano vodo

za pH 8: 125 mL 0.2 M KH2PO4 in 117 mL 0.2 M NaOH razredčite do 500 mL z

destilirano vodo

za pH 9: 125 mL 0.2 M glicina in 22 mL 0.2 M NaOH razredčite do 500 mL z

destilirano vodo

za pH 10: 125 mL 0.2 M glicina in 80 mL 0.2 M NaOH razredčite do 500 mL z

destilirano vodo

Gojišče NSM (nutrient sporulation media)

8 g Nutrient broth

1 g KCl


Po avtoklaviranju dodate:

0.1 mL 0.28 mg mL-1 Fe(SO4)2·7H2O

0.1 mL 164 mg mL-1 Ca(NO3)2

0.1 mL 1.25 mg mL-1 MnCl2

0.1 mL 25 mg mL-1 MgSO4·7H2O


Gojišče TBAB

30.5 g TBAB (Tryptic blood agar base)


Po avtoklaviranju dodate:

5 mL 1 M MgSO4·7H2O

0.25 mL 0.1 M MnCl2

V primeru, ko gojišče vsebuje antibiotike, dodate še:

0.5 mL 10 mg mL-1 kloramfenikol

5 mL 1 mg mL-1 eritromicin

Gojišče LBb (modificirano gojišče LB za gojenje biofilmov)

10 g triptona

10 g NaCl


0.1 % (w/V) glukoze

0.15 M amonijev sulfat

0.1 M kalijev fosfat

0.034 M Na-citrat

0.001 M MgSO4·7H2O


Gojišče CM (kompetenčno gojišče)

2.5 mM MgCl2

100 mL gojišča SPI

Gojišče SPI

100 mL 1 x SS soli


1 mL 2 % (w/V) kazeinskega hidrolizata

1 mL 10 % (w/V) kvasnega ekstrakta

50 µg mL-1 potrebne aminokisline (histidin, leucin, metionin)


1 x SS (Spizizen soli)

6 g KH2PO4

14 g K2HPO4

2 g (NH4)2SO4

1 g Na-citrat·2H2O

0.2 g MgSO4·7H2O


2 x SS (Spizizen soli)

12 g KH2PO4

28 g K2HPO4

4 g (NH4)2SO4

2 g Na-citrat·2H2O

0.4 g MgSO4·7H2O


Minimalno gojišče

Minimalni agar: 20 g agarja


2 x SS z dodatki: 1.25 mL 40 % (w/V) Na-glutamat


0.25 mL 0.1 M MnCl2

5 mL 10 mg mL-1 aminokisline (histidin, leucin, metionin)

500 mL 2 x SS

Raztopini avtoklavirajte vsako posebej in ju po avtoklaviranju še vroči zlijte skupaj.

Za trdna gojišča dodate 15 g agar-agar-ja na 1000 mL tekočega gojišča.