PRAKTIKUM iz FIZIOLOGIJE MIKROORGANIZMOV

(1. del)

Polonca Čadež in Ivan Mahne

Ljubljana, 2005

KAZALO

VARNOST V LABORATORIJU - SPLOŠNA PRAVILA 3

PREGLED VAJ 4

PREHRANSKE POTREBE MIKROORGANIZMOV IN GOJIŠČA 5

KONTROLA MIKROORGANIZMOV S FIZIKALNIMI IN KEMIJSKIMI SREDSTVI 8

KVANTIFIKACIJA MIKROORGANIZMOV 13

VREDNOTENJE PROTIMIKROBNE AKTIVNOSTI 17

RASTNA KRIVULJA BAKTERIJ 20

ODPRT RASTNI SISTEM - KEMOSTAT 23

VPLIV DEJAVNIKOV OKOLJA NA RAST MIKROBOV 25

KISIK-REGULATOR CELIČNE AKTIVNOSTI 31

2

VARNOST V LABORATORIJU - SPLOŠNA PRAVILA Delo v večini mikrobioloških laboratorijev zahteva uporabo živih organizmov, zato je aseptična tehnika bistvenega pomena tako za osebno varnost kot za varovanje okolja. Paziti moramo na to, da preprečimo kontaminacijo z mikroorganizmi eksogenega izvora. Osnovna pravila za zmanševanje prisotne mikroflore v laboratoriju: 1. Plaščev in torb ne odlagajmo na laboratorijske mize. 2. Okna in vrata naj bodo med vajami zaprta, da preprečimo kontaminacijo razadi kroženja zraka. 3. Na začetku in koncu vaj obriši mizo z dezinfekcijskim sredstvom. 4. Ne odlagaj kontaminiranega pribora na mizo, zanke prej prežari, steklene pipete in nastavke za

avtomatske pipete odlagaj v posode z razkužilom. 5. Ob koncu vaje odloži vse kulture in material na določeno mesto. Skrb za osebno varnost: 1. Operi si roke s tekočim milom pred in po vajah. 2. Dolge lase si spni zadaj, da jih ne ožgeš s plamenom gorilnika. 3. Pri delu v laboratoriju obleci haljo. 4. V laboratoriju ni dovoljeno jesti in piti. 5. Polito kulturo pokrij s papirnato brisačo in namoči z dezinfekcijskim sredstvom. 6. Nikoli ne pipetiraj z usti, ampak samo s pripomočkom za pipetiranje.

3

PREGLED VAJ Gojišča Izvedba: priprava gojišč za izvedbo naslednjih vaj Kontrola mikroorganizmov Izvedba: aseptična tehnika, sterilizacija - filtracija Kvantifikacija mikroorganizmov Izvedba: indirektne (gojitvene) metode biomasa: motnost - protein Rast mikroorganizmov Izvedba: zaprt sistem (batch culture), podvojevalni čas, donos odprt sistem (kemostat), rastna konstanta, gostota populacije, donos Protimikrobna aktivnost Izvedba: narava in hitrost delovanja inhibitorja aktivnost bakteriocina Vpliv dejavnikov okolja na rast Izvedba: določanje temperaturnega optimuma določanje optimuma pH ugotavljanje raznolikosti pri potrebi po kisiku Kisik-regulator celične aktivnosti Izvredba: model mirujočih celic, vpliv kisika na sintezo in aktivnost nitratne reduktaze

4

PREHRANSKE POTREBE MIKROORGANIZMOV Pri delu z mikroorganizmi je pomembno, da za uspešno rast mikrobne kulture zagotovimo prisotnost potrebnih hranil v dostopni obliki. Glede na veliko različnost mikroorganizmov v naravi, ki imajo tudi zelo različne potrebe po hranilih, moramo zagotoviti ali zelo enostavne snovi kot npr. CO2 in nekaj anorganskih soli ali pa kompleksne snovi kot so lipidi, vitamini in nukleotidi. Suha snov mikrobne celice je večinsko (95%) sestavljena iz elementov C, O, H, N, S, P, K, Ca, Mg in Fe. Imenujemo jih makroelementi. Prvih šest predstavlja komponente ogljikovodikov, lipidov, proteinov in nukleinskih kislin, ostali so v celici v obliki kationov in so pomembni za delovanje različnih encimov. Poleg tega celica potrebuje tudi mikroelemente: Mn, Zn, Co, Mo, Ni, Cu, ki so običajno del encimov in kofaktorjev. Glede na prehranske potrebe mikroorganizmov razlikujemo štiri glavne tipe, ki se razlikujejo po virih energije, elektronov oz. vodikovih ionov in ogljika. Vir ogljika je lahko CO2 (avtotrofi) ali reducirane organske molekule (heterotrofi). Vir energije je lahko svetloba (fototrofi) ali oksidacija organskih ali anorganskih spojin (kemotrofi). Vir elektronov oz. vodikovih ionov so lahko reducirane anorganske molekule (litotrofi) ali organske molekule (organotrofi). Velika večina mikroorganizmov spada v skupino fotolitotrofnih avtotrofov (fotoavtotrofi) ali kemoorganotrofnih heterotrofov (kemoheterotrofi). V ostalih dveh skupinah je zastopanost mikroorganizmov manj številčna, so pa ekološko pomembni. Fotoheterotrofi se nahajajo v onesnaženih jezerih in rekah, kemoavtotrofi oksidirajo reducirane anorganske spojine (Fe, N, S) za pridobivanje energije in elektronov in tako prispevajo h kemijski transformaciji elementov. Dušik, fosfor in žveplo lahko dobijo celice iz istih organskih molekul, ki so tudi vir ogljika, z direktnim vgrajevanjem amonija in fosfata ali pa z redukcijo in asimilacijo oksidiranih anorganskih molekul. Nekateri mikroorganizmi imajo še določene zahteve, ki odražajo njihovo specifično naravo rasti ali okolja, kjer se nahajajo, npr. diatomeje rabijo silicijevo kislino, bakterije iz slanih jezer in oceanov pa večje koncentracije natrijevega iona. Večina organizmov potrebuje za rast določene organske spojine, ki so esencialne celične sestavine ali prekurzorji zanje in jih sami ne morejo proizvajati, to so rastni faktorji. Tri glavne skupine rastnih faktorjev so: (1) aminokisline, (2) purini in pirimidini in (3) vitamini. Vitamini so majhne organske molekule pomembne sestavine encimskih kofaktorjev (biotin, folna, pantotenska in nikotinska kislina, vitamini B1, B2, B6, B12). Za proučevanje biokemijskih in fizioloških lastnosti mikroorganizmov je potrebno gojenje mikrobov v laboratoriju. Za to uporabljamo različna gojišča, pri čemer moramo poznati prehranske zahteve posameznega mikroorganizma in okoljske pogoje kot so temperatura, pH in prisotnost oz. odsotnost kisika. Prvi pristop k temu, katero gojišče bomo uporabili, je odvisen od poznavanja posameznega mikroba. Če poznamo njegovo identiteto, lahko kar v literaturi (Handbook of Microbiological Media, Atlas RM in Parks LC, eds., 1993) poiščemo sestavo ustreznih gojišč za namnoževanje, sicer pa, še posebej za kemoheterotrofe, izberemo kompleksno gojišče.

5

Gojišča razdelimo v določene skupine glede na sestavo (a), agregatno stanje (b) in namembnost (c). a) Po sestavi delimo gojišča na definirana ali sintetična in kompleksna. Nekateri mikrobi (cianobakterije, evkariontske alge) rastejo na enostavnih gojiščih, ki vsebujejo CO2 kot vir ogljika, nitrat ali amonij kot vir dušika, sulfat, fosfat in minerale. Tako gojišče, kjer so vse sestavine kvantitativno znane kemične spojine, imenujemo definirano ali sintetično gojišče. Kemoheterotrofi pogosto rastejo na definiranem gojišču z glukozo in amonijem. Pri sestavi definiranega gojišča je potrebno upoštevati povprečno elementno sestavo celice: Količino ogljika (glukoze) in dušika (amonsulfat), ki ga mora gojišče vsebovati, če hočemo namnožiti določeno količino kvasnih celic, lahko izračunamo: Vir ogljika: glukoza, približna ocena - 51 % se vgradi v biomaso Vir dušika: 1g suhe celične snovi vsebuje 0.0075g dušika Gojišča, ki vsebujejo nekatere spojine neznane kemične sestave, so kompleksna gojišča. Veliko jih uporabljamo kadar prehranske zahteve določenega organizma niso točno poznane in ga na definiranem gojišču ne bi mogli gojiti, kompleksno gojišče pa je zadosti bogato in kompletno za zadostitev vseh potreb različnih mikrobov. Kompleksno gojišče vsebuje pepton in mesni ekstrakt ali kvasni ekstrakt. Pepton je delno hidroliziran protein iz mesa, kazeina ali soje in je vir ogljika, dušika in energije. Mesni ekstrakt vsebuje aminokisline, peptide, nukleotide, organske kisline, vitamine in minerale. Kvasni ekstrakt je vir B vitamina, dušika in ogljika. Veliko uporabljana kompleksna gojišča so hranljiva juha (PKE), TSB (tryptic soy broth), LB (Luria Bertani) in Mac Conkey agar. b) Po fizikalnem stanju delimo gojišča v tekoča, poltrdna in trdna. Pri trdnih gojiščih za namnoževanje na površini dodajamo v tekoče gojišče 1,5 % agarja. To je polisaharid, ki ga pridobivajo iz morskih alg in ga večina mikrobov ne more razgraditi. Zanimivo pri agarju je to, da se tali pri 95°C, strjuje pa pri 40-42°C. Od drugih strjevalcev se uporablja silikagel, ki ne vsebuje nobenih organskih snovi in je še posebej primeren za gojenje avtotrofov. Poltrdna gojišča vsebujejo samo 0,5% agarja ali želatino. c) Po uporabnosti delimo gojišča na splošna ali univerzalna, selektivna in diferencialna. PKE ali TSB sta splošni gojišči, ker omogočata rast zelo širokemu spektru heterotrofnih mikrobov. Vzdrževalna gojišča vsebujejo nižjo koncentracijo snovi. Za nekatere bolj zahtevne mikrobe dodajamo kri, ekstrakte živalskih ali rastlinskih tkiv in taka gojišča imenujemo obogatena. Selektivna gojišča omogočajo rast le določenim mikroorganizmom. Žolčna kislina, bazični fuksin in kristal violično favorizirajo rast gram- bakterij in inhibirajo gram+ bakterije. Določene bakterije lahko iz mešane populacije selektivno namnožimo, če dodamo v gojišče hranilo, ki ga samo te bakterije lahko izkoriščajo (škrob - amilolitični mikrobi, mineralno gojišče z virom energije brez N - fiksatorji dušika, mineralno gojišče z amonijem - nitrifikatorji). Diferencialna gojišča omogočajo razlikovanje med različnimi vrstami bakterij. Dodatek določene snovi povzroči spremembo načina rasti ali kako drugače omogoči razlikovanje (krvni agar - hemolitični, nehemolitični mikrobi; MacConkey agar z laktozo in barvilom nevtral rdeče - fermentativne koliformne enterobakterije se obarvajo rdeče; eozin in metilensko modro (EMB) - kovinsko obarvane kolonije E.coli, ker inkorporirajo barvilo).

6

Specialna gojišča (selektivna in diferencialna) uporabljamo za: 1. izolacijo različnih tipov bakterij iz mešane populacije mikroorganizmov 2. diferenciacijo med podobnimi bakterijami na osnovi izgleda kolonij in biokemijske reakcije z

gojiščem 3. štetje bakterij v sanitarni mikrobiologiji (vode, hrana) 4. preskušanje naravnih substanc (antibiotiki, vitamini, industrijska fermentacija) 5. karakterizacija in identifikacija bakterij glede na njihovo zmožnost povzročanja kemijskih

sprememb v različnih gojiščih. Pri pripravi gojišč sestavine raztapljamo v vodi eno za drugo, ne vse naenkrat. Predhodna snov se mora popolnoma raztopiti. Dodajamo tudi razne snovi, ki puferizirajo gojišče (fosfati). Če je potrebno, uravnamo pH s 6N HCl oz. 6N NaOH. Gojišče nalijemo v primerne posode in takoj steriliziramo. IZVEDBA VAJE Priprava gojišč Vsaka podskupina pripravi naslednja gojišča oz. raztopine: a), b), c), d) Fiziološka raztopina (0,9% NaCl):

Pri vaji, kjer boš določal generacijski čas bakterije E. coli boš za pripravo razredčitvene vrste potreboval fiziološko raztopino v epruvetah po 9 ml.

Pripravi 600 ml fiziološke raztopine tako, da ustrezno količino soli (izračunaj!) raztopiš v destilirani vodi (1000 ml erlenmajerica). Raztopino razdeli po 9 ml v epruvete, pokrij s pokrovčki, ki se naj dobro prilegajo, zloži v košarico in steriliziraj 15 minut pri 121°C. a), b), c), d) Agarizirano LB gojišče za plošče:

Za ugotavljanje števila celic med rastjo bakterije E. coli v zaprtem rastnem sistemu boš potreboval plošče s trdnim gojiščem LB.

Pripravi 600 ml gojišča tako, da ustrezno količino dehidriranega gojišča, ki je navedena na embalaži (preračunaj!) raztopiš v destilirani vodi. Dodaj agar v 1,5% koncentraciji (izračunaj potrebno količino!). Agar se bo raztopil šele po avtoklaviranju. Gojišče steriliziraj 25 minut pri 121°C in nato nalij v sterilne petrijeve posodice. PAZI NA ASEPTIČNO TEHNIKO! e) Fiziološka raztopina (0,9% NaCl):

Pri vaji, kjer boš določal naravo in hitrost delovanja protimikrobnega sredstva boš za pripravo razredčitvene vrste potreboval fiziološko raztopino v epruvetah po 9 ml.

7

Pripravi 1000 ml fiziološke raztopine tako, da ustrezno količino soli (izračunaj!) raztopiš v destilirani vodi. Raztopino razdeli po 9 ml v epruvete, pokrij s pokrovčki, ki se naj dobro prilegajo, zloži v košarico in steriliziraj 15 minut pri 121°C.

e) Agarizirano LB gojišče za plošče:

Za ugotavljanje števila celic, kjer boš določal naravo in hitrost delovanja protimikrobnega sredstva boš potreboval plošče s trdnim gojiščem LB.

Pripravi 900 ml gojišča tako, da ustrezno količino dehidriranega gojišča, ki je navedena na embalaži (preračunaj!) raztopiš v destilirani vodi. Dodaj agar v 1,5% koncentraciji (izračunaj potrebno količino!). Agar se bo raztopil šele po avtoklaviranju. Gojišče steriliziraj 25 minut pri 121°C in nato nalij v sterilne petrijeve posodice. KONTROLA MIKROORGANIZMOV Pregled pogosto uporabljanih pojmov v zvezi s kontrolo mikroorganizmov: Sterilizacija je proces, s katerim uničimo živost mikroorganizmov ali odstranimo vse žive celice in spore. Dezinfekcija je uničenje živosti, inhibicija ali odstranitev mikrobov, ki povzročajo bolezni (termin se uporablja za neživ material). Antiseptiki so kemijska sredstva, ki preprečujejo infekcije tkiva z inhibicijo ali uničenjem živosti patogenih mikrobov. Ker se uporabljajo za tkiva, so navadno blažja od dezinfekcijskih sredstev. Aseptična tehnika je preprečevanje vstopa mikroorganizmov iz okolja. Antimikrobne agense, s katerim uničujemo živost mikroorganizmov, označujemo s končnico -cid, pri čemer označimo še specifično skupino, na ketero delujejo (baktericid, fungicid). Agense za preprečevanje rasti označujemo s končnico -statik (bakteriostatik, fungistatik). Odmiranje mikrobne populacije je, enako kot rast, logaritemska funkcija. Na učinek antimikrobne aktivnosti vplivajo velikost populacije in njena sestava ( npr. prisotnost bakterijskih endospor), koncentracija ter trajanje učinkovanja agensa, temperatura in neposredno okolje mikroba (pH, organske snovi). Sterilizacija in kontrola z uporabo fizikalnih sredstev Za kontrolo mikroorganizmov se največ uporabljata toplota in filtracija, na industrijskem nivoju pa tudi ionizirajoča sevanja. Vlažna toplota Vlažna toplota uničuje mikrobe z razkrojem nukleinskih kislin, denaturacijo encimov in drugih proteinov ter poškodbo celičnih membran.

8

Občutljivost različnih mikrobov do vlažne toplote je različna. Spodnja tabela prikazuje kako dolgo je potrebno uporabiti vlažno toploto za uničenje živosti. Organizem Vegetativne celice Spore kvasovke 5 min pri 50-60°C 5 min pri 70-80°C plesni 30 min pri 62°C 30 min pri 80°C bakterije 10 min pri 60-70°C 2-800 min pri 100°C 0.5-12 min pri 121°C virusi 30 min pri 60°C Z D-vrednostjo (decimalni redukcijski čas) izražamo čas, ki je potreben, da pri določeni temperaturi zmanjšamo mikrobno populacijo za 10 krat.

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

0 1 2 3 4 5 6 7 8

čas učinkovanja (min)

log.

št. p

reži

velih

cel

ic

D

Grafikon 1: Odmiranje mikrobov pri učinkovanju toplote (121°C) Avtoklaviranje Za sterilizacijo z vodno paro uporabljamo avtoklav, kjer lahko s povečanim pritiskom dosežemo temperature nad 100°C. Običajno steriliziramo pri 121°C in pri tej temperaturi odmrejo vse vegetativne celice in endospore v 15 min. Važno je, da vodna para izpodrine ves zrak iz avtoklava in da je posoda naložena tako, da para lahko prosto kroži. Če steriliziramo večje volumne, moramo uporabiti daljše čase, da tudi tekočina v središču doseže 121°C. (5 l tekočine zahteva 70 min avtoklaviranja). Za kontrolo učinkovitosti sterilizacije uporabljamo različne indikatorje. Biološki indikator vsebuje epruveto s sterilno ampulo gojišča in papirni trak s sporami Bacillus stearothermophilus. Po avtoklaviranju ampulo razbijemo in epruveto inkubiramo nekaj dni. Komercialno dosegljiv kemični indikator je papirni trak, ki spremeni barvo pri določeni temperaturi.

9

Pri avtoklaviranju raztopin v steklenih posodah ne smejo biti le-te neprodušno zaprte, razen če se uporablja posoda iz posebnega stekla ter zamaški utrjeni s kovinskimi varovali. Posode naj bodo napolnjene le do 2/3 volumna. Previdni moramo biti pri ohlajevanju in izenačevanju pritiska, da nam steklo ne popoka. Pred odpiranjem avtoklava ga moramo ohladiti na temperaturo pod 100°C (60-80°) in izenačiti pritisk z zunanjim. Pri ohlajanju tekočine nastane v posodi podtlak, ki povzroči, da zrak vdira v posodo, zato je treba zamaške učvrstiti oz. zagotoviti da ne pride do kontaminacije. Pasterizacija Uporablja se za mleko, pivo ter razne napitke. To je segrevanje na 70-80°C za nekaj minut. Odmrejo bolj občutljivi mikrobi npr. patogeni, ostalim pa se zmanjša število do take stopnje, da se kvarjenje močno upočasni ali tudi prepreči. Suha toplota Sterilizacijo z vročim zrakom izvajamo v pečeh pri 140-170°C 2-3 uri. Mikrobe uničimo z oksidacijo celičnih sestavin in denaturacijo proteinov. Suha toplota je manj učinkovita kot vlažna, zato uporabljamo višje temperature in daljše čase. Uporabljamo jo za take materiale, ki ne prenesejo vlažne sterilizacije (maščobe, olja, voski, prašnat material) ter za steklovino (petrijevke, pipete) in kovinski pribor (pincete, škarje). Plastika in guma ne preneseta suhe sterilizacije. Filtracija Filtracija se uporablja za zmanjševanje oz. odstranjevanje mikrobne populacije iz raztopin toplotno občutljivih snovi in plinov. Tekočino porivamo skozi filter z uporabo pritiska ali vakuuma. Obstajata dve vrsti filtrov. Globinski filtri so iz vlaknatega ali granuliranega materiala stisnjenega oz. zvitega tako, da tvori labirint kanalov. Narejeni so iz porcelana, diatomejske zemlje, steklenih vlaken. Zadrževanje delcev je kombinacija adsorbcije oz. zagozditve v kanalih. Danes se večinoma uporabljajo membranski filtri. To so porozne membrane s kontinuirano strukturo in zadrževanje delcev je na osnovi velikosti por. Narejeni so iz acetatne ali nitratne celuloze, polikarbonata ali politetrafluoretilena (PTFE). Za sterilizacijo se uporabljajo membranski filtri z velikostjo por 0,2µm. Filter vložimo v posebno držalo. Ker je slaba lastnost teh filtrov, da se hitro mašijo, je koristno pri gostejših raztopinah uporabiti globinski predfilter iz steklenih vlaken. Tekočino potiskamo skozi filter z brizgo, peristaltično črpalko ali z dušikom iz jeklenke in jo prestrezamo v sterilno posodo. Membranski filtri se veliko uporabljajo v farmacevtski industriji, pri pripravi antibiotikov, vitaminov, gojišč in olj. S filtracijo kontroliramo tudi zrak (kirurške maske, vatni zamaški na gojitvenih posodah). Pri aerobnem namnoževanju mikrobov moramo zrak za prepihovanje gojišča voditi skozi membranski filter (0.2µm). Aseptična komora je zgrajena tako, da ventilator piha zrak skozi filter, ki zadrži delce večje od 0.3µm in zaradi oblike komore naredi zračno zaveso iz sterilnega zraka, ki prepreči vstop zunanjemu zraku. Sevanje

10

Sevanje je lahko ionizirajoče ali neionizirajoče. Neionizirajoče je infrardeče, ultraviolično in ultrazvočno sevanje. Ionizirajoče sevanje pa so delci ( β ali elektroni) ali elektromagnetno sevanje (X ali γ žarki). Učinkovitost sevanja je odvisna od absorbirane doze. UV sevanje učinkuje na DNA, povzroči dimerizacijo timina in tako prepreči replikacijo in transkripcijo. Ionizirajoča sevanja pa povzročajo nastanek prostih radikalov, ki učinkujejo na makromolekule v celici. Za sterilizacijo oz. dezinfekcijo se v glavnem uporablja tri vrste sevanja. Pospešeni elektroni imajo relativno nizko prodorno moč v primerjavi z γ žarki in se uporablajo za sterilizacijo kirurških inštrumentov. γ žarki (Co60, Cs137) imajo veliko prodorno moč. Občutljivost mikrobov pada od vegetativnih bakterij, plesni, kvasovk, bakterijskih spor do virusov. γ žarčenje se uporablja za sterilizacijo v bolnicah, za antibiotike, vitamine, hormone, steroide, plastične petrijevke, brizge. UV sevanje ima omejeno uporabo zaradi slabe prodornosti; bolj se uporablja za dezinfekcijo (UV svetilke v prostoru za precepljanje mikroorganizmov, v ambulantnih čakalnicah). Vegetativne celice so bolj občutljive (3-10krat) kot bakterijske spore. Aseptična tehnika To je način dela, s katerim preprečujemo v mikrobiološkem laboratoriju kontaminacijo kultur in ostalih pripomočkov z mikrobi iz okolja ali vzdržujemo sterilnost gojišč. Aseptično tehniko izvajamo ob plamenu (ožiganje vratu epruvet in erlenmajeric, cepilnih zank, pincet) ali v aseptični komori, kjer pretok filtriranega zraka preprečuje vstop mikrobom v komoro. IZVEDBA VAJE Uporaba membranskih filtrov Material: čaša z vodovodno vodo 5 ml brizga sterilne prazne epruvete držalo za filtre membranski filtri (0.2µm, 0.45µm, 12µm) predfilter iz steklenih vlaken filtrirna posoda vodna črpalka pinceta plošče s trdnim gojiščem PKE PRI IZVEDBI VAJE PAZI NA ASEPTIČNO TEHNIKO! a) sterilizacija tekočin

11

5 ml vodovodne vode prefiltriraj skozi membranski filter z različno velikostjo por (0.2µm, 0.45µm) v prazno sterilno epruveto. 0.1 ml filtrata nacepi na ploščo s trdnim gojiščem, na drugo ploščo pa položi filtre ter plošče inkubiraj 1 teden pri 28°C. b) vakuumska filtracija Uporabljamo jo za določanje števila živih mikrobnih celic v vzorcih, ki imajo majhno število celic/ml. Tako določamo bakterije v zraku in vodi. Po filtraciji določenega volumna vzorca, damo filter na primerno gojišče in inkubiramo. 50 ml vodovodne vode nalij v sterilno filtrirno posodo z 0.2µm membranskim filtrom. Z vodno črpalko presesaj tekočino skozi filter. POZOR! Ko je tekočina presesana, najprej snemi cevko črpalke s presesalne buče, šele nato zapri vodo. 0.1 ml filtrata nacepi na ploščo s trdnim gojiščem, na drugo ploščo pa položi filter ter inkubiraj 1 teden pri 28°C. c) uporaba predfiltra Pri vzorcih, ki vsebujejo poleg mikrobnih celic še druge večje delce, ki bi nam hitro zamašili pore membranskega filtra, moramo uporabiti predfilter, ki je navadno iz steklenih vlaken. 5 ml suspenzije tal prefiltriraj skozi membranski filter 0.2µm ter skozi membranski filter 0.2µm, ki ima še predfilter iz steklenih vlaken, v sterilno prazno epruveto. 0.1 ml filtrata nacepi na ploščo s trdnim gojiščem, na drugo ploščo pa položi filtre ter plošče inkubiraj 1 teden pri 28°C. d), e) sterilizacija tekočin 5 ml vodovodne vode prefiltriraj skozi membranski filter (12µm) oz. filter iz steklenih vlaken v prazno sterilno epruveto. 0.1 ml filtrata nacepi na ploščo s trdnim gojiščem, na drugo ploščo pa položi filtre ter plošče inkubiraj 1 teden pri 28°C. Rezultat: Zabeleži opazovanja po inkubaciji nacepljenih filtratov a) 0.2µm filter 0.45µm filter b) c) d), e) 12µm filter steklena vlakna KVANTIFIKACIJA MIKROORGANIZMOV

12

Za ugotavljanje števila mikrobnih celic imamo na voljo več metod. Ene so direktne, števne metode, druge pa indirektne ali gojitvene. Količino mikrobnih celic izražamo lahko tudi v biomasi. Za določanje biomase uporabljamo fizikalne in kemijske metode. Direktne - števne metode Z uporabo mikroskopa preštejemo celice v majhnem alikvotu vzorca. a) Štetje celic v razmazu Celice štejemo pod mikroskopom. 10µl primerno razredčenega vzorca nanesemo na znano površino na objektnem stekelcu (1cm2), posušimo, fiksiramo in obarvamo. Celice preštejemo na več naključno izbranih vidnih poljih in iz povprečnega števila celic na eno polje izračunamo število celic v 1 ml vzorca. N = X.FM.100 FM= 100/πr2

Za objektiv s povečavo 100x in okular 10x je FM 2000-2500. b) Števne komore Za večje celice (kvasovke, krvne celice) uporabljamo števne komore (Thoma, Neubauer, hemocitometer). Posebno oblikovano predmetno stekelce ima vgravirano mrežo kvadratov na poglobljenem delu. Celice preštejemo v majhnem volumnu tekočega vzorca. Velikosti kvadratov so: 1/25 mm2 1/400 mm2

Globina špranje je 0.1 mm. Za bakterije uporabljamo posebne komore (Petroff-Hausser), ki imajo razdaljo med mrežo in krovnim stekelcem 0.02 mm in v tem primeru lahko uporabljamo imerzijsko olje pri mikroskopiranju. Pomanjkljivosti direktnih metod: ne ločimo živih in mrtvih celic, nekatere celice so težko opazne (kontrastiranje, fluorescenčna mikroskopija), natančnost je majhna, niso primerne za vzorce z majhnim številom celic (< 106/ml) Prednost teh metod pa je dodatna informacija o velikosti in morfologiji celic.

13

Uporaba membranskega filtra in fluorescenčne mikroskopije Znani volumen vzorca prefiltriramo skozi membranski filter, ki ne kaže avtofluorescence in ima velikost por 0.2 ali 0.45 µm. Celice na filtru obdelamo z raztopino fluorokroma, višek barvila odstranimo s spiranjem filtra s fiziološko raztopino. S pomočjo fluorescenčnega mikroskopa preštejemo celice, ki se ob uporabi kratkovalovne vzbujevalne svetlobe (UV, modra) pokažejo v fluorescenčni svetlobi daljših valovnih dolžin (zeleno). Z upoštevanjem površine filtra, površine vidnega polja, povprečnega števila celic na vidno polje in morebitne razredčitve vzorca izračunamo število celic v vzorcu: N = X . FM . R FM = Pf / πr2 , kjer je N število celic, X povprečno število celic na vidno polje, FM faktor mikroskopa, Pf površina filtra, πr2 površina vidnega polja in R razredčitev vzorca. Indirektne - gojitvene metode Štetje na ploščah Znano količino primerno razredčenega vzorca nacepimo na ploščo trdnega gojišča, inkubiramo v ustreznih razmerah in nato preštejemo zrasle kolonije. Za statistično točnost je potrebno, da je na plošči zraslo 30-300 kolonij. Za pripravo ustreznih razredčitev uporabljamo fiziloško raztopino (0.9% NaCl) in ne vode (osmotsko hipotonična). Vendar tudi slana voda ni popolnoma ustrezna, ker ni puferna raztopina, zato dodajamo še fosfatni pufer. Pripravimo 10 kratne (1+9ml) ali 100 kratne (0.1+9.9 ml) razredčitve. Rezultat izrazimo v številu enot, ki tvorijo kolonije (CFU-Colony Forming Units) v volumski ali utežni enoti vzorca. Ker nimamo dokaza, da je ena kolonija res zrasla iz ene celice, je izražanje v CFU enotah ustreznejše, kot pa v številu celic. Metoda je primerna za tekoče vzorce (voda, mleko) in pa za take vzorce, ki dajo v vodnih raztopinah suspenzije (tla). Trajanje inkubacije je načeloma tako dolgo, da se število kolonij ne povečuje več. Razmere inkubacije ter sestava gojišča pa so odvisni od vrste vzorca in od tega, katero mikrobno skupino želimo kvantificirati (aerobi, anaerobi, termofili, mezofili, psihrofili, avtotrofi, heterotrofi). Pri običajni inkubaciji pri 28°C in uporabi gojišča z organskim virom ogljika zrastejo kolonije aerobnih heterotrofnih mikroorganizmov in je odkrivljivost za tla le nekaj %, za morje 20% za mleko 80%. Za gojitvene števne metode lahko izvedemo naceplanje na tri načine in sicer z vmešavanjem, razmazovanjem ali z uporabo membranskega filtra. Slednje uporabljamo za vzorce, ki imajo majhno število živih celic/ml. Tako določamo bakterije v zraku in vodi. Po filtraciji določenega volumna vzorca, damo filter na primerno gojišče in inkubiramo.

14

Določanje biomase Biomaso lahko določamo direktno s tehtanjem mikroorganizmov ali indirektno z določanjem parametrov, ki so v proporcionalni zvezi z biomaso npr. motnost kulture ali vsebnost celičnih sestavin (proteina, C, N). Pri tehtanju lahko določamo mokro ali, kar je bolj natančno, suho maso. Celice filtriramo ali odcentrifugiramo, speremo ostanke gojišča in pri temperaturi 105°C sušimo do konstantne mase. Ker je postopek določanja suhe mase precej zamuden, se pogosto poslužujemo hitrega določanja biomase z merjenjem motnosti (turbidimetrija). Nefelometer meri svetlobo, ki jo celice razpršijo pod določenim kotom, v spektrofotometru in kolorimetru pa merimo padec intenzitete vpadne svetlobe, zaradi razpršene svetlobe na celicah. Večja je gostota celic, manj svetlobe pride skozi kiveto (slika 1). Ker večje celice bolj razpršijo svetlobo kot manjše in ker je lom svetlobe odvisen od valovne dolžine, je potrebno narediti umeritveno krivuljo pri določeni valovni dolžini svetlobe in za vsak organizem posebej. Postopek je primeren za določanje biomase v vzorcih, kjer motnost izvira zgolj iz prisotnih mikrobnih celic.

svetilo kiveta s fotocelica suspenzijo celic

Slika 1: Določanje biomase z merjenjem absorbence I0, I......intenziteta vpadne in izhodne svetlobe log I0 / I = A = O.D. = K.W A.........absorbenca, O.D.....optična gostota W........suha snov, št. mikroorganizmov K.........konstanta Na skali novejših inštrumentov direktno odčitavamo log I0 / I oz. A. Enačba velja za razredčene suspenzije večine bakterij, ki imajo velikost od 0.4 do 2 µm. Ne velja pa za viruse ali nitaste bakterije.

15

Linearna zveza velja za določeno območje biomase. Število celic mora biti večje od 106, da lahko merimo motnost. Pri zelo velikih koncentracijah celic se razprši manj svetlobe na enoto biomase, zato je včasih potrebno redčiti kulturo, da pridemo v linearno območje umeritvene krivulje.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 50 100 150količina bakterijskih celic (ug/ml)

abso

rben

ca

teoretičnodejansko

Grafikon 2: Absorbenca v odvisnosti od količine celic Absorbenco pri določeni valovni dolžini navadno na osnovi umeritve ali kalibracije prevedemo v količino, ki izraža biomaso v absolutnih enotah. Če merimo absorbenco v območju pod 1 velja približna zveza W = 1/K.A650 W.....suha snov (µg/ml). Faktor je potrebno določiti za vsak spektrofotometer posebej. Občutljivost meritev je večja pri nižjih valovnih dolžinah, vendar pa so gojišča dostikrat rumenkaste barve in absorbirajo pri nižjih λ. 650 nm je ustrezna λ za merjenje motnosti, ker se v mnogih primerih absorbenca samega gojišča ne razlikuje od absorbence vode in lahko ničlimo z vodo. Pri večjih valovnih dolžinah pa je večje območje linearne zveze med količino biomase in absorbenco. Biomaso enostavno določamo tudi z merjenjem proteina. Če gre za manjše količine (<200 µg/ml), določamo z Lowry-jevo metodo, večje (1-10 mg/ml) pa z biuretno reakcijo. V obeh primerih moramo celice toplotno obdelati v alkalnem, da hidroliziramo proteine.

16

VREDNOTENJE PROTIMIKROBNE AKTIVNOSTI Minimalna inhibitorna koncentracija (MIK): Ugotavljamo najmanjšo količino snovi, ki je potrebna za inhibicijo rasti testnega organizma. Ena od metod temelji na razredčevalni tehniki. Serijo epruvet z gojiščem, ki vsebuje v vsaki epruveti drugačno koncentracijo testirane snovi nacepimo s kulturo testnega organizma. Po inkubaciji ugotavljamo na osnovi motnosti v katerih epruvetah je rast izostala in iz tega določimo minimalno inhibitorno koncentracijo testirane snovi. MIK ni absolutna vrednost za neko snov. Odvisna je od testnega organizma kot tudi od faktorjev okolja kot so sestava gojišča, pH, prezračevanje in temperatura. Ugotavljanje narave in hitrosti protimikrobnega delovanja: V testu ugotavljanja MIK ni mogoče ugotoviti ali je testirana snov baktericidna ali bakteriostatična in kakšna je hitrost njenega učinkovanja. To lahko ugotovimo, če v časovnih intervalih med inkubacijo testnega organizma s testirano snovjo na podvzorcih merimo motnost in z uporabo štetja na ploščah določimo število živih celic. IZVEDBA VAJE Material: testirana snov: Spitaderm (učinkovini sta 0.5% klorheksidinglukonat in 0.45% H2O2 v 2-propanolu) testni organizem: E. coli gojišče: LB (250 ml erlenmajerica s 100 ml gojišča) V 100 ml kulture bakterije E. coli, ki je v logaritemski fazi rasti, dodaj 0.5 ml Spitaderma. V kontrolno kulturo ne dodajaj ničesar. Čas pred dodajanjem snovi opredelimo kot čas 0. Kulturo inkubiraj pri 37°C. V času 0, 30, 60 min itd. v obeh kulturah izmeri motnost (A650). V istih časovnih intervalih odvzemi po 1 ml podvzorca iz obeh kultur, razredči ga v fiziološki raztopini v seriji redčitev (glej tabelo). 0.1 ml največje in še dveh nižjih redčitev nacepi na trdne plošče z gojiščem LB. Plošče inkubiraj pri 37 oC. Na naslednjih vajah preštej kolonije na števnih ploščah in v grafikonu prikaži spremembe števila preživelih celic in spremembe motnosti med eksperimentom. Tabela: Redčitve kultur v posameznih časih inkubacije Čas (min) 0 30 60 120 180 240 kontrola 10-7 10-7 10-8 10-8 10-8 10-8

Spitaderm 10-7 10-5 10-5 10-2 10-2 10-2

17

Rezultat: Kontrola čas (min) 0 30 60 120 180 240 motnost št. celic Spitaderm čas (min) 0 30 60 120 180 240 motnost št. celic Grafikon: Bakteriocini Mnoge bakterije izdelujejo snovi, ki zavirajo ali preprečujejo rast drugim vrstam mikroorganizmov. Bakteriocini so proteinski produkti s protimikrobnim delovanjem. Razlikujejo se v velikosti, mehanizmih delovanja, spektru protimikrobne aktivnosti in mehanizmih imunosti. Njihovo protimikrobno delovanje je omejeno na ozko sorodne bakterijske vrste in je največkrat posledica nastanka por v celični membrani občutljivih celic. Dve glavni razliki, ki bakteriocine razlikujejo od antibiotikov, pa sta specifičnost protimikrobne aktivnosti in ribosomska sinteza v času aktivne rasti. Antibiotiki so sekundarni metaboliti, ki nastajajo v stacionarni fazi rasti.

18

Protimikrobne učinkovine predstavljajo prednost za bakterijo pri tekmovanju za hranila v okolju, kjer se bakterija nahaja. Poimenujemo jih po vrsti organizma, ki jih proizvaja (E. coli - kolicin, Bacillus subtilis – subtilizin, Vibrio – vibricin). Pri testih, s katerimi sledimo protimikrobno aktivnost, je pomemben izbor indikatorskega organizma, gostota kulture in difuzijska sposobnost bakteriocina. Indikatorsko kulturo lahko vzdržujemo v tekočem gojišču ali na trdnih gojiščih, kamor položimo diske z bakteriocinom. Aktivnost je določena s conami zbistritve indikatorske kulture v mm. Pri bakteriji Vibrio sp., ki je bil izoliran iz morske vode v Piranskem zalivu, je bila opažena protimikrobna aktivnost na nekatere bakterijske vrste, pravtako izolirane iz tega okolja. Učinkovino bakterija izloča v gojišče. IZVEDBA VAJE Material: kultura Vibrio sp. DSM 14379 kultura B13 centrifugirke sterilni membranski filtri 0,2 µm sterilne plastične posodice sterilni papirnati diski plošče PKS epruvete za razmazovanje etanol Celice Vibrio sp. DSM 14379, namnožene do začetka prehoda v stacionarno fazo rasti (8ur), odstranimo s centrifugiranjem in supernatant prefiltriramo skozi 0,2 µm membranski filter v sterilno posodo. Filtrat označimo z IG (izrabljeno gojišče). Ugotavljali bomo tudi vpliv slanosti na sintezo protimikrobne učinkovine, zato bo namnoževanje potekalo pri različnih koncentracijah soli v gojišču (0,5; 1,7; 3; 5 in 10%). Protimikrobno aktivnost določimo z difuzijskim testom na trdnem gojišču. Indikatorsko kulturo B13 razmažemo (100 µl) na ploščo PKS. Nato položimo 5 sterilnih papirnatih diskov (7mm) na površino in dodamo na vsak disk 3, 5, 10, 15 oz. 20 µl IG. Inkubiramo pri 28°C in nato izmerimo bistro cono okrog diskov. Rezultat: Izrabljeno gojišče IG (3µl) IG (5µl) IG (10µl) IG (15µl) IG (20µl) Bistra cona (mm)

19

RASTNA KRIVULJA BAKTERIJ Rast bakterijske populacije v zaprtem (batch) sistemu ponazarja rastna krivulja, ki jo lahko razdelimo na štiri faze: lag fazo, logaritemsko ali eksponentno fazo, stacionarno fazo in fazo odmiranja. Po prenosu celic v sveže gojišče, so celice sicer metabolično aktivne, prilagajajo se na nove hranljive vire oz. sintetizirajo razne koencime, vendar se ne delijo. Govorimo o lag fazi. Lag faza izostane samo v primeru, če prenesemo mlado kulturo iz logaritemske faze v sveže gojišče enake sestave. Velikost celic se veča, dokler ne doseže kritično velikost za delitev in od tu naprej govorimo o eksponentni fazi. Celice rastejo in se delijo ustrezno svojemu genetskemu potencialu, sestavi gojišča in razmeram rasti (temperatura, pH, O2). Pogosto proizvajajo tudi rezervne snovi iz obilice hranil v okolici. Ko se hranljivi viri izčrpajo, ko se akumulirajo toksični produkti, ko se gostota celic močno poveča, aerobom lahko začne primanjkovati kisika, ki je slabo topen, celice spremenijo svojo fiziologijo. Lahko dodajo novo plast celične stene, upočasnijo metabolizem in delitev, ali pa začnejo rabiti rezervne snovi. Rastna krivulja preide v stacionarno fazo. Dolžina stacionarne faze je odvisna od posameznega organizma. Talni mikrobi, ki so prilagojeni na hitro spreminjajoče se okolje, imajo zelo učinkovite mehanizme za vzdrževanje med pomanjkanjem hranil. Mnogi tvorijo spore in ciste. Končno preide populacija v fazo odmiranja. Smrt nastopi zaradi izstradanja ali toksičnih snovi. V tej fazi se število celic ne spreminja, če jih določamo z mikroskopom ali turbidimetrično (razen če celice lizirajo), če pa jih določamo z gojitvenimi tehnikami, se število celic zmanjšuje. Generacijski ali podvojevalni čas V eksponentni fazi se celice delijo v konstantnih intervalih. V določenem času se torej populacija podvoji. Povprečni podvojevalni čas lahko določimo iz rastne krivulje, ki jo prikažemo na semilogaritemskem diagramu. Donos in hitrost rasti Celični donos oz. zrasla biomasa je odvisna od sestave gojišča in okoljskih pogojev. Razlikuje se tudi med posameznimi organizmi. Iz istega energetskega vira pridobijo fermentativni oz. aerobni organizmi pri katabolni razgradnji različno količino ATP. Koncentracija hranil vpliva tako na hitrost rasti kot tudi na donos, vendar se hitrost rasti povečuje samo v ozkem pasu pri zelo nizkih koncentracijah hranil. Donos pa se povečuje linearno s povečano koncentracijo hranila. Običajno ga izražamo v gramih suhe celične biomase na mol porabljenega substrata.

20

IZVEDBA VAJE Material: kultura bakterije E. coli minimalno gojišče z glukozo (0,4%) minimalno gojišče z glukozo (0,4%) in nitratom 10mM (1g/l) tekoče gojišče LB epruvete s sterilno fiziološko raztopino (9ml) petrijevke s trdnim gojiščem LB avtomatske pipete (1 ml in 0.1 ml) in sterilni nastavki za pipete epruvete za razmazovanje in alkohol kivete 3,5-dinitrosalicilna kislina epruvete Nacepi 5 ml kulture bakterijskih celic v logaritemski fazi v sveže termostatirano (37°C) a) minimalno gojišče z glukozo (500ml) ter vključi mešalo (200 obr/min) in prepihovanje z

zrakom b) minimalno gojišče z glukozo (500ml) brez mešanja in prepihovanja c) minimalno gojišče z glukozo in nitratom (500ml) brez mešanja in prepihovanja d) gojišče LB(500ml) ter vključi mešalo (200 obr/min) in prepihovanje z zrakom . V 30 min časovnih intervalih odvzemi vzorec in izmeri absorbenco v fotometru pri 650 nm. 1 ml vzorca daj v 9 ml sterilne fiziološke raztopine. Pripravi 10 kratne razredčitve ustrezno spodnji tabeli. 0.1 ml zadnjih treh redčitev nacepi na plošče z gojiščem in jih enakomerno razmaži s sterilno epruveto. Plošče inkubiraj pri 37°C. čas inkubacije (min) nacepljene razredčitve motnost A650 število celic/ml 0 10-4 10-5 10-6 60 10-4 10-5 10-6 120 10-5 10-6 10-7 150 10-6 10-7 10-8 180 10-6 10-7 10-8 210 10-7 10-8 10-9 240 10-7 10-8 10-9 270 10-7 10-8 10-9 300 10-7 10-8 10-9 Na naslednji vajah preštej zrasle kolonije in nariši graf, kjer nanašaš absorbenco in log števila celic v odvisnosti od časa rasti. Za izračun donosa spremljaj porabo glukoze v gojišču med rastjo posameznih variant.

21

Kvantitativno določanje glukoze 1 ml vzorca odpipetiraj v epruveto in dodaj 0.5 ml reagenta 3,5-dinitrosalicilne kisline. Za slepo probo odmeri 1 ml H2O namesto vzorca. Segrevaj 5 min v vodni kopeli pri 100°C. Ohladi in dodaj 10 ml H2O. Premešaj in izmeri koncentracijo glukoze v fotometru ( 540nm). Ničliš s slepo probo. Faktor, ki ga vtipkaš v fotometer za preračunavanje A v koncentracijo glukoze (mg/ml), je 2.316. Rezultat: Izračunaj konstanto hitrosti rasti za zaprt sistem in generacijski čas za E. coli iz spodnjih enačb. Generacijski čas tudi oceni iz grafa. Primerjaj obe vrednosti. Primerjaj vrednosti dobljene pri posameznih rastnih pogojih. k = (logX2 - logX1) tgen = 1 / k 0,301 . t Izračunaj donos izražen v gramih suhe celične snovi na mol porabljene glukoze. Upoštevaj da 1 enota A650 ustreza 0,4 g s.s. Grafikon:

22

ODPRT RASTNI SISTEM - KEMOSTAT V zaprtem rastnem sistemu se okolje med namnoževanjem mikrobov stalno spreminja. Nasprotno pa odprti rastni sistem (kontinuirana kultura) omogoča namnoževanje celic v konstantnih razmerah. V tem rastnem sistemu hranila (sveže gojišče) stalno dovajamo in z enako hitrostjo odvajamo izrabljeno gojišče in celice iz kulture. Ko se v sistemu vzpostavi ravnotežje, ostaja število mikrobnih celic in koncentracija hranil konstantna, pravimo, da je v dinamičnem ravnotežju (steady state). Najpogosteje rabljen način kontinuiranega namnoževanja mikrobov je kemostat, ki omogoča uravnavanje gostote populacije in hitrosti rasti kulture z dvema parametroma: koncentracijo rast omejujočega (limitnega) hranila in hitrostjo razredčevanja. Na splošno velja za rast mikrobov, da je hitrost rasti odvisna od koncentracije hranil: S µ =µmax _______ Ks + S Kjer je µ konstanta hitrosti rasti, µmax konstanta hitrosti rasti pri nasičenosti s substratom, S koncentracija substrata v kulturi in Ks konstanta nasičenosti s substratom, ki je enaka koncentraciji S kjer je µ=1/2µmax. Ključno za delovanje kemostata je, da je med uravnoteženim delovanjem kemostata koncentracija omejujočega hranila zelo blizu 0. Če dotok hranila povečamo, se poveča tudi µ in obratno. V kemostatu je hitrost dotoka svežega gojišča enaka hitrosti iztoka izrabljenega gojišča in celic iz kulture. Razmerje tega pretoka proti volumnu pa imenujemo hitrost razredčevanja, D: D = F / V V ravnotežju velja D = µ. V kemostatu lahko vzdržujemo populacijo pri različnih konstantnih hitrostih rasti, to pa je mogoče le do kritične vrednosti hitrosti razredčevanja, Dc, ki je odvisno od koncentracije substrata v rezervoarju (SR): SR

Dc = µmax _______ Ks + SR Ker je običajno SR >> Ks je Dc zelo blizu vrednosti µmax in lahko dosežemo delovanje kemostata blizu maksimalne rastne hitrosti. Pomemben aspekt v delovanju kemostata je gostota populacije. Donos biomase (Y) je razmerje med prirastjo biomase in porabljenim substratom in je mera za učinkovitost izrabe substrata za sintezo novega celičnega materiala. Y = dX / dS

23

Zveza med koncentracijo celic (X) in omejujočega hranila (S) v kemostatu je pri dinamičnem ravnotežju podana z enačbama: X = Y (SR - S) in D S = Ks _______ µmax - D S je torej odvisen od D in X od S. S poznavanjem konstant SR, Y, Ks in µmax lahko določimo S in X za katerokoli vrednost D. Kemostat nam omogoča, da kontroliramo hitrost rasti (µ) in gostoto populacije (X) neodvisno eno od drugega. Hitrost rasti s spremembo hitrosti razredčevanja (D), kar praktično pomeni s spremembo pretoka, ker volumen ostaja nespremenjen. Gostoto populacije določamo s spreminjanjem koncentracije hranil v rezervoarju. IZVEDBA VAJE Material: 50 ml merilni valj kivete epruvete centrifugirke 3,5-dinitrosalicilna kislina 3N NaOH 2.5 % CuSO4 Določili bomo konstanto hitrosti rasti (µ) in gostoto populacije (X) pri kontinuiranem namnoževanju bakterije Pseudomonas stutzeri v treh aeriranih kemostatatih. Dva imata približno enak D in različno koncentracijo substrata v rezervoarju, tretji ima večji D in nizko koncentracijo glukoze (0,5 g/l). 500 ml mineralnega gojišča za Pseudomonas vsebuje poleg soli (K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2SO4, MgSO4. 7H2O) še mikroelemente (B, Zn, Fe, Co, Mo, Cu in Mn) ter glukozo v enem primeru 0.5 g/l, v drugem pa 5 g/l. Med delovanjem kemostatov v dinamičnem ravnotežju, ki je že predhodno vzpostavljeno, izmeri hitrost pretoka (F). V časovnem intervalu 1,5 ure odvzemi 20 ml vzorca kulture na iztoku iz kemostatov in izmeri koncentracijo glukoze ter količino mikrobne biomase (A650 in protein z biuretno reakcijo). Iz dobljenih rezultatov izračunaj D, µ, Y in X in dobljene vrednosti primerjaj za vse tri kemostate. Kvantitativno določanje glukoze 1 ml vzorca odpipetiraj v epruveto in dodaj 0.5 ml reagenta 3,5-dinitrosalicilne kisline. Za slepo probo odmeri 1 ml H2O namesto vzorca. Segrevaj 5 min v vodni kopeli pri 100°C. Ohladi in dodaj 10 ml H2O. Premešaj in izmeri koncentracijo glukoze v fotometru ( 540nm). Ničliš s slepo probo. Faktor, ki ga vtipkaš v fotometer za preračunavanje A v koncentracijo glukoze (mg/ml), je 2.316.

24

Določanje proteinov z biuretno reakcijo 5 oz. 20 ml (odvisno od izmerjene motnosti kulture) kulture centrifugiraj 5 min pri 10.000 obr/min, gojišče odlij in celice suspendiraj v fiziološki raztopini. Ponovno centrifugiraj in nato odlij supernatant. Usedek suspendiraj v 2 ml destilirane vode in kvantitativno prenesi v stekleno centrifugirko. Dodaj 1 ml 3N NaOH in premešaj. Slepo probo delaj vzporedno z 2 ml H2O in 1 ml NaOH. Segrevaj 5 min v vreli vodi nato ohladi. Dodaj 1 ml 2.5 % CuSO4, premešaj in pusti stati 5 min. Oborino odcentrifugiraj 10 min pri 3000 obr/min. Zmeri absorbenco v fotometru pri 555 nm (ničliš s slepo probo). Koncentracijo proteinov odčitaš v fotometru tako, da vtipkaš faktor za preračunavanje A v koncentracijo proteinov. Rezultat: konc.glukoze v rezervoarju

a) 0.5 g glukoze/l c) 5 g glukoze/l

F D motnost A650 konc.glukoze v kemostatu konc.proteina (mg/ml) suha snov (mg/ml) Y (g/mol) VPLIV DEJAVNIKOV OKOLJA NA RAST MIKROBOV Mikrobna aktivnost je odvisna od fizikalnih in kemijskih razmer v okolju. Na določene dejavnike okolja pa se različni organizmi različno odzivajo. Okolje lahko učinkuje na preživljivost organizma, njegovo rast, diferenciacijo ali razmnoževanje. Najpomembnejši dejavniki okolja so ob dostopnih hranilih še temperatura, pH, vodna aktivnost in kisik. Temperatura Temperatura vpliva na rast in preživetje organizmov. Po eni strani se hitrost biokemijskih reakcij s povečano temperaturo pospeši, kar ima za posledico hitrejšo rast, po drugi strani pa se nad določeno temperaturo proteini, nukleinske kisline in tudi druge celične sestavine ireverzibilno denaturirajo. Za vsak organizem obstaja minimalna temperatura, pod katero ne zasledimo več rasti, optimalna temperatura, kjer je rast najhitrejša in maksimalna temperatura, nad katero rast ni več mogoča. Preprečevanje rasti pod minimalno temperaturo je posledica geliranja celične membrane, tako da ni več mogoč transport hranil in vzpostavitev gradienta protonov.

25

Glede na odnos do temperature lahko razdelimo organizme na psihrofile, mezofile, termofile in ekstremne termofile. Mezofile najdemo v toplokrvnih živalih ter tleh in vodah zmernih in tropskih predelov, psihro- in termofile pa v nenavadno mrzlih oz. vročih okoljih (ledeniki,vrelci, gejzirji). Obligatni psihrofili so tisti organizmi, ki imajo optimalno temperaturo za rast 15°C ali manj in minimalno temperaturo za rast 0°C ali nižje. Fakultativni psihrofili so bolj razširjeni od obligatnih in se nahajajo v tleh in vodah zmernega klimatskega področja. Najbolje rastejo pri temperaturah med 25-30°C. Pri temperaturah okrog 0°C je rast močno upočasnjena, vendar je še vedno možna (kvarjenje hrane v hladilniku). Da lahko aktivni transport nemoteno teče tudi pri nižjih temperaturah, imajo psihrofili v celičnih membranah večjo vsebnost nenasičenih maščobnih kislin, kar ima za posledico, da ostane membrana poltekoča, tudi pri nižjih temperaturah. Zamrzovanje preprečuje rast, ni pa nujno, da uniči mikroorganizme. Najnižja meja za biokemijske reakcije v vodnih raztopinah je -140°C. Zamrzovanje se uporablja celo za shranjevanje mikrobnih kultur. Dodatek glicerola ali dimetilsulfoksida (0.5 M) v suspenzijo zaščiti celice pred dehidracijo, makromolekule (serumski albumin, dekstran) v koncentracijah 10-5 do 10-3 M pa zaščitijo celice z vezavo na celično površino in s tem ščitijo membrane. Mezofili rastejo v območju 20-40°C. Ločimo dve skupini, ena ima optimum 20-30°C, to so rastlinski saprofiti, druga pa 35-40°C in rastejo v toplokrvnih gostiteljih. Termofili imajo optimum pri temperaturah 45-50°C, rastejo pa v območju 20-70°C. V naravi najdemo taka okolja v zgornji (nekaj cm) plasti tal (opoldansko poletno sonce), v kupih komposta, silaži in seveda v zvezi z vulkanskimi pojavi. Organizmi se adaptirajo na visoke temperature tako, da so njihovi encimi in drugi proteini bolj toplotno stabilni, membranski lipidi pa vsebujejo več nasičenih maščobnih kislin. Ekstremni termofili imajo temperaturi optimum pri 80°C ali več (termalni vrelci). Idealna temperatura za neko določeno encimsko aktivnost ne sovpada vedno z optimalno temperaturo za rast. Primer je produkcija rdečega pigmenta pri Serratia marcescens. pH Vsak organizem ima določeno pH območje, v katerem je rast mogoča in tudi pH optimum. Naravna okolja imajo pH vrednosti med 5 (paradižnik, kislo zelje, kisla tla) in 9 (alkalna tla). Organizme, ki živijo v okoljih z nizkim pH imenujemo acidofile. Plesni so bolj tolerantne do kislih medijev kot bakterije. Med obligatne acidofilne bakterije spada rod Thiobacillus, ki oksidira sulfidne minerale in tvori žvepleno kislino. Pri nevtralnem pH celice tega organizma lizirajo, ker je potrebna visoka koncentracija vodikovih ionov za stabilnost njegove plazemske membrane. Nekaj organizmov je alkalofilnih, ti imajo optimum pH 10-11 (tla z visoko vsebnostjo karbonatov). Pri pripravi gojišč za laboratorijsko gojenje mikroorganizmov navadno uravnamo pH na 7. Ker se zaradi metabolne aktivnosti tvorijo kisline pri razgradnji ogljikovih hidratov ali baze iz proteinov, morajo biti gojišča puferizirana. V mineralno gojišče dodajamo K2HPO4 in KH2PO4, kompleksna gojišča pa vsebujejo pepton, ki zaradi amfoterne narave deluje kot naravni pufer. IZVEDBA VAJE

26

Vpliv temperature Material: kulture bakterij: Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas fluorescens, Salmonella typhimurium TL 747 poševno gojišče z bakterijo Serratia marcescens tekoče gojišče PKE v širokih epruvetah (10 ml) poševno gojišče PKE cepilna zanka sterilni nastavki za pipete Nacepi tekoče gojišče z 0.1 ml bakterijske kulture v 5 ponovitvah. Inkubiraj v rastnih komorah (28, 37 in 44°C), oz. v hladni sobi (4°C) in na sobni temperaturi. Po 24 urah izmeri motnost v vseh variantah. Iz grafikona (A650, T) ugotovi vpliv temperature na različne vrste bakterij in jih glede na temperaturni optimum razvrsti med psihrofile oz. mezofile. Serratio marcescens nacepi s cepilno zanko na poševno gojišče in inkubiraj pri različnih temperaturah (4, 20, 28 in 37°C) 1 teden. Po končani inkubaciji ugotavljaj obarvanost kolonij pri različnih temperaturah. Rezultat: Organizem: Pseudomonas stutzeri temperatura inkubacije 4°C 20°C 28°C 37°C 44°C motnost - A660 Organizem: Pseudomonas fluorescens temperatura inkubacije 4°C 20°C 28°C 37°C 44°C motnost - A660 Organizem: Salmonella typhimurium Temperatura inkubacije 4°C 20°C 28°C 37°C 44°C motnost – A660 Organizem: Serratia marcescens temperatura inkubacije 4°C 20°C 28°C 37°C 44°C obarvanost Grafikon:

27

pH Material: kulture bakterij: P. fluorescens, Salmonella typhimurium TL 747, Lactobacillus tekoče gojišče PKE oz. MRS v širokih epruvetah (10ml) z različnim pH (5, 6, 7, 8, 9, 10) sterilni nastavki za pipete Nacepi tekoča gojišča z različnimi pH z 0.1 ml kulture P. fluorescens in S. typhimurium (PKE) ter Lactobacillusa (MRS) in jih inkubiraj pri 28 oz. 37°C. Po 24 urah izmeri motnost v vseh variantah. Ugotovi vpliv pH na rast bakterij in nariši graf iz katerega boš lahko ugotovil pH optimum za posamezne bakterije. Rezultat: Organizem: Lactobacillus pH 5 6 7 8 9 10 motnost - A650 Organizem: P. fluorescens pH 5 6 7 8 9 10 motnost - A650 Organizem: S. typhimurium pH 5 6 7 8 9 10 motnost - A650 Grafikon:

28

Kisik Mikroorganizmi se razlikujejo glede na potrebo oz. tolerantnost do kisika. Učinek kisika je različen za določene skupine mikroorganizmov. skupina učinek aerobi obligatni kisik je nujno potreben mikroaerofilni kisik je potreben, vendar nižje koncentracije kot normalno anaerobi fakultativni kisik ni potreben, vendar je rast na O2 boljša aerotolerantni kisik ni potreben in rast na O2 ni boljša (fermentativni organizmi) obligatni (striktni) kisik uniči živost mikroorganizmov Kisik je škodljiv za striktne anaerobe, ker niso sposobni razgraditi nekaterih toksičnih produktov, ki nastajajo pri metabolizmu s kisikom: peroksid (H2O2), superoksid (O2

-) in hidroksilni radikal (OH.) (nimajo encimov peroksidaze, superoksid dismutase in katalaze). Za namnoževanje aerobnih mikroorganizmov je zaradi slabe topnosti kisika v vodi potrebno kulturo prepihovati s sterilnim zrakom skozi porozno frito z drobnimi luknjicami ali pa močno stresati na stresalniku. Za namnoževanje anaerobnih mikroorganizmov moramo kisik izključiti iz okolja. Postopki so manj zahtevni za manj občutljive mikrobe kot za striktne anaerobe. Eden od enostavnih načinov je, da gojišče napolnimo do vrha posode in tesno zamašimo, drugi pa, da dodamo neko snov, ki reagira s kisikom in ga tako izločimo iz gojišča. Taka snov je tioglikolat, ki ga dodajamo v gojišče, kadar želimo ugotoviti ali je nek organizem aeroben, anaeroben ali fakultativno anaeroben. V gojišče

29

dodamo še redoks indikator (npr. resazurin), ki ob prisotnosti kisika spremeni barvo in tako ugotovimo, kako globoko v gojišče prodre kisik. Različna potreba po kisiku, ki se odraža kot rast bakterij na različnih mestih v gojišču s tioglikolatom, je prikazana v sliki 2: a)-aerob, b)-obligatni anaerob, c)-aerotolerantni anaerob, d)-fakultativni anaerob, e)-mikroaerofil.

Slika 2: Rast različnih bakterij v gojišču s tioglikolatom Za namnoževanje anaerobov se uporabljajo tudi anaerobni lonci, ki omogočajo zamenjavo atmosfere z dušikom ali vodikom, dodatek nekega reducirajočega sredstva odstrani še najmanjše sledove kisika. Metanogeni mikrobi so tako občutljivi na kisik, da je potrebno tudi vse manipulacije izvesti brez kisika, zato delamo v posebnih anaerobnih boksih. IZVEDBA VAJE Material: kulture 3 neimenovanih mikroorganizmov epruvete s tekočim gojiščem, ki vsebuje tioglikolat in resazurin cepilne zanke S cepilno zanko nacepi celice vse tri kulture v epruvete z gojiščem in daj na inkubacijo za 24 ur. Po inkubaciji ugotovi glede na to, kje opaziš rast mikrobov, v katero skupino spada posamezen organizem: aerob, anaerob ali aerotolerantni anaerob.

30

Rezultat:

Organizem: rast v epruveti z gojiščem: skupina: 1 2 3

KISIK - REGULATOR CELIČNE AKTIVNOSTI Kisik je eden najpomembnejših regulacijskih signalov pri fakultativno anaerobnih bakterijah, ki živijo v oksičnih in anoksičnih okoljih ali tam, kjer se hitro menja preskrbljenost s kisikom. Prehod iz aerobne v anaerobno rast vpliva tako na katabolizem kot anabolizem. Aerobno respiracijo zamenja anaerobna respiracija, fototrofna rast ali fermentacija, odvisno od posameznega organizma. Spremenjena ekspresija genov zahteva tudi sintezo različnih koencimov in kofaktorjev (kinoni, hemi, Mo kofaktor). Biosintetske in katabolne reakcije, ki rabijo O2 kot kosubstrat za oksidacijo ali hidroksilacijo, morajo zamenjati alternativne reakcije. Pravi fakultativni anaerobi lahko rastejo popolnoma brez kisika, drugi, npr. kvasovke, pa so sicer sposobne anaerobnega katabolizma, vendar pa rabijo majhne količine kisika za biosintetske reakcije (steroidi, deoksiribonukleotidi). Večinoma aerobni in anaerobni katabolizem ne delujeta simultano in ekspresija alternativnih poti je stvar hierarhične kontrole. Pri enterobakterijah je O2 represor anaerobne respiracije in fermentacije in nitrat represor drugih alternativnih anaerobnih respiracijskih poti. Tako je zagotovljen maksimalen izkoristek substrata in sinteza ATP. Preklop med aerobnim in anaerobnim metabolizmom je reguliran na nivoju transkripcije in to uravnavajo različni regulacijski sistemi, ki se odzivajo na O2. Večina teh proteinov vsebuje hem ali Fe kot kofaktor, ki reagira z O2 bodisi z vezavo ali redoks reakcijo. Pri E. coli so ugotovili , da transkripcijski regulator FNR kontrolira ekspresijo genov, ki so potrebni za anaerobni metabolizem, kot odgovor na O2 in je obenem senzor in regulator. Denitrifikacija je anaeroben proces, pri katerem se nitrat, ki služi kot alternativni prevzemnik elektronov iz dihalne verige, postopno reducira preko nitrita, NO in N2O do N2. Vsako stopnjo posebej katalizira drug encim in sicer NAR, NIR, NOR in N2OR. Pri denitrifikaciji je kisik tako represor sinteze encimov kot tudi inhibitor encimske aktivnosti. Nekateri organizmi pa se lahko tudi izognejo tej kontroli. Respiracijska nitratna reduktaza se nahaja na notranji strani citoplazemske membrane in kisik preprečuje transport nitrata skozi membrano. Nekatere bakterije imajo nitratno reduktazo locirano v periplazemskem prostoru (NAP) in se tako izognejo inhibiciji s kisikom. Tudi sinteza NAP ni odvisna od prisotnosti/odsotnosti kisika ampak je pod kontrolo drugih dejavnikov.

31

V modelu z “mirujočimi celicami” bomo testirali učinek kisika na aktivnost NAR in NAP. Model omogoča merjenje encimskih aktivnosti pri konstantni biomasi (t.j. količini encima), ker dodatek kloramfenikola preprečuje sintezo proteinov. Celice namnožimo na dva načina: Pseudomonas fluorescens v tekočem gojišču PKE, ki vsebuje tudi nitrat (10 mM) pod anaerobnimi razmerami, kar omogoča sintezo membranske nitratne reduktaze; Pseudomonas stutzeri pa v tekočem gojišču LB brez nitrata pod aerobnimi razmerami, kar omogoča sintezo periplazemske nitratne reduktaze. Po namnoževanju celice ločimo od gojišča s centrifugiranjem, jih operemo s fosfatnim pufrom s kloramfenikolom ter suspendiramo v enakem pufru. Količino celic v suspenziji določimo z biuretno reakcijo za merjenje proteinov. Aktivnost encima merimo pri Pseudomonas fluorescens tako, da zasledujemo porabo substrata (NO3

-), pri P. stutzeri pa nastajanje produkta (NO2-), ker med aerobnim namnoževanjem kisik

preprečuje sintezo NIR, ki bi reducirala nitrit. IZVEDBA VAJE Material: celice Pseudomonas fluorescens (____ mg proteina /ml) celice P. strutzeri (___ mg proteina / ml) gojišče PKE oz. LB 50 mM fosfatni pufer pH 7.6 s kloramfenikolom (200 µg/ml) 100 mM KNO3kloroform nitritni reagent SA + NEDA (sulfanilamid + naftiletilendiamin) 35 ml penicilinke gumijasti pokrovčki aluminijasti pokrovčki 10 ml pipete epruvete stojala za epruvete 2 ml in 10 ml brizge vodna kopel (temp. 30o C) Model z “mirujočimi celicami” 10 ml reakcijske mešanice v stekleničkah vsebuje: celice P. fluorescens oz. P. stutzeri (0.5 mg proteina/ml) NO3- (2 mM) fosfatni pufer pH 7.6 s kloramfenikolom gojišče PKE (5 ml) Preračunaj količine, ki jih moraš dodati v reakcijsko mešanico, da bodo končne koncentracije in volumen ustrezal zgornjim zahtevam!

32

V stekleničke odmeri 5 ml gojišča, ustrezno količino celic in fosfatni pufer. NO3- dodaš na koncu,

ko je sistem že anaeroben, kjer je to potrebno in termostatiran. Dodatek nitrata je začetek reakcije (čas 0). a) V variantah z anaerobnimi razmerami zapri stekleničke z gumijastimi zamaški in aluminijevimi pokrovčki in zamenjaj zrak v stekleničkah z N2. Za izenačevanje pritiska med jemanjem vzorcev iz stekleničke namesti 10 ml siringo z N2 skozi gumijasti zamašek. b) Za aerobne razmere pusti stekleničke odprte in večkrat premešaj med poskusom, da zagotoviš boljši dostop kisika. Po 1 min in nato še štirikrat v 5 min časovnih intervalih odvzemi po 2 ml vzorca v epruveto, ki vsebuje 50 µl kloroforma za prekinitev reakcije. Določi koncentracijo nitrata oz. nitrita v vzorcu. Postopek za merjenje nitrata : Nitrat merimo s pretočnim analizatorjem. Princip določanja je redukcija nitrata s hidrazin sulfatom do nitrita, nato pa kolorimetrično določanje nitrita z barvnim reagentom, ki vsebuje sulfanilamid (SA) in naftil etilen diamin (NEDA). Vzorce in standardne raztopine nitrata nalijemo v posodice in vključimo aparat za začetek jemanja vzorcev. Iz zapisa na printerju dobimo koncentracijo nitrata + nitrita. Odštejemo vrednost za nitrit, ki smo jo določili posebej in tako dobimo koncentracijo nitrata. Postopek za merjenje nitrita: V epruveto odmeri: 100 µl vzorca 3.9 ml H2O 1 ml reagenta SA + NEDA Za ničlenje in standardiziranje fotometra potrebuješ 1 epruveto s 4 ml H2O in 1 ml SA + NEDA ter 1 epruveto z 1 ml standardne raztopine nitrita (50 µmol/l), 3 ml H2O in 1 ml SA + NEDA. Po 20 min meri absorbenco raztopin pri 540 nm. S standardom umeriš fotometer tako, da lahko odčitavaš kar koncentracijo nitrita. Pri izračunu končne koncentracije upoštevaj tudi količino vzorca! Rezultat: Rezultate meritev celične aktivnosti v modelu z “mirujočimi celicami” predstavi v grafikonu za anaerobno in aerobno varianto za vsak organizem posebej. Izračunaj tudi specifične aktivnosti nitratne reduktaze v vseh eksperimentalnih variantah. Organizem:

33

a) aerobni pogoji čas (min) 1 5 10 15 20 konc. nitrita (mmol/l) konc. nitrata+nitrita konc. nitrata (mmol/l) Specifična aktivnost nitratne reduktaze: b) anaerobni pogoji čas (min) 1 5 10 15 20 konc. nitrita (mmol/l) konc. nitrata+nitrita konc. nitrata (mmol/l) Specifična aktivnost nitratne reduktaze: Grafikon:

34