Download pptx - Olika katalyseringsstrategier hos enzymer - summarisk översikt

Olika katalyseringsstrategier hos enzymer - summarisk översikt

• Allmän syra/bas katalys: i) Allmän bas katalys - en bas stabiliserar en positiv laddad grupp i TS, ii) Allmän syra katalys - en syra stabiliserar en negativ laddad grupp i TS

• Approximation (Proximitet av reaktanter): Närhet av reaktanter leder till lägre entropiförlust vid en enzymkatalyserad reaktion under de kemiska stegen jämfört med icke enzymkatalyserad reaktion.

• Elektrostatisk katalys: Enzymer kan stabilisera joner och andra laddningar (t o m mer effektivt än vatten) pga orienterade dipoler i aktiva ytan

• Metalljonkatalys: i) Elektrofil katalys – koordinerad metalljon som stabiliserar en bildande negativ laddning, ii) Hydroxyljonskatalys vid neutralt pH – Koordinerande metalljon som inbinder vatten och underlättar deprotonisering till hydroxyljon vid neutralt pH. Hydroxyljonen kan sedan reagera med substratet via en nukleofil attack

• Kovalent katalys: i) Elektrofil katalys – ny katalysväg med bildandet av en bättre elektrofil än ursprungselektrofilen (ex bildandet av Schiff bas, e- stabiliseras genom delokalisering), Nukleofil katalys – ny katalysväg med en bättre nukleofil än ursprungsnukleofilen och där intermediären är mer reaktivt än vad substratet är

• Konformationsförändring (Conformational distortion) – strukturförändring av enzymet, substratet eller båda för att föra systemet mot TS (inducet fit and induced strain)

Kovalent katalys

11. Ge ett exempel och förklara reaktionsmekanismen för:

Nukleofil katalys – ny katalysväg med en bättre nukleofil än ursprungsnukleofilen och där intermediären är mer reaktivt än vad substratet är

Nukleofil attack med pyridin som är en bättre nukleofil än H2O

Exempelvis hydrolys av ättiksyraanhydrid underlättas av pyridin

Det bildas ett intermediat som är mer reaktivt än ursprungssubstratet

Kovalent katalys

Nukleofil katalys -

Kovalent katalys

Mät förändringar i reaktivitet med förändringar i strukturen hos reagensen

12. Diskutera vilka faktorer som är av betydelse för reaktionshastighet hos en nukleofil katalys vid hydrolys av en ester?

Hastigheten för en hydrolys av en ester ökar då:

i) Karbonylkolet är kopplat till elektrondragande grupper i acylpositionen (CHCl2CO2Et > CH3CO2Et)

ii) elektrondragande grupp i lämnande gruppen

iii) ökad basisk styrka hos nukleofilen

Elektrondragande grupp i acylpositionen

Ökad basisk styrka hos nukleofilen Elektrondragande grupp i lämnande gruppen

Kovalent katalys nukleofil katalys vid hydrolys av en ester

Tillämpa transitions state teorin - reaktionshastigheten beror på energiskillnaden mellan TS och grundtillståndet → så kan vi dra slutsatsen att:

1. Reaktionen involverar en ökning av negativ laddning på substratet (eftersom reaktionshastigheten ökar med elektrondragande grupp)

2. Reaktionen måste involvera en minskning i laddning hos nukleofilen (eftersom hastigheten ökar vid elektrondonation)

Detta är förenligt med båda reaktionsmekanismerna nedan

Det hastighetsbegränsande steget är formation av ett tetraedriskt intermediat

Det hastighetsbegränsande steget är nedbrytning av ett tetraedriskt intermediat


A Bronsted plot för nukleofil attack av primära och sekundära aminer på p-nitrofenylacetat

Brønsted β värde för en nukleofil katalys fås genom att plotta logk2 mot pKa för olika nukleofiler

Linjärt samband mellan logk och pKa

ΔG# för formation av bindning mellan den nukleofila gruppen och karbonylkolet är proportionellt mot ΔG för överföring av en proton till nukleofilen

NH2R

RNH2 + H+ RNH3

+

Brønsted β är inte strikt mellan 0 och 1 - kan vara större än 1 om den reaktiva gruppen är mer elektrondragande än en proton .


I detta fall liknar TS strukturen den bildade produkten

Det hastighetsbegränsande steget är nedbrytning av ett tetraedriskt intermediat

• β för nukleofil attack av tertiära aminer på estrar med starka basiska alkoholer är:

+ 1.5 för variation av nukleofilens pKa (hastigheten ökar med stigande basstyrka)- 1.5 för variationen av alkoholens pKa (hastigheten minskar med stigande basstyrka)

β-värdet indikerar laddningsfördelningen i TS


•β för reaktion med basiska nukleofiler och estrar som innehållen en aktiverad lämnande grupp är:

+ 0.1 till 0.2 för variation av nukleofilens pKa (marginell ökning av hastigheten med stigande basstyrka)- 0.1 till 0.2 för variationen av den lämnande gruppens pKa (marginell minskar av hastigheten med stigande basstyrka)

I ett annat extremt fall

I detta fall liknar TS strukturen startmaterialet

Det hastighetsbegränsande steget är formation av ett tetraedriskt intermediat

1. Diskutera vilken information om en enzymatisk reaktion kan man få genom ”steady state” kinetik versus ”pre-steady state” kinetik.

Steady state kinetik – visar med vilken hastighet produkt bildas och/eller substrat förbrukas under steady state förhållanden.

Ger ingen information om antal intermediärer. Här kan vi beräkna KM, kcat och kcat/KM

Pre-steady state kinetik – direkt observation av intermediärer i reaktionsvägen och deras hastighet av bildning och nedbrytning kan beräknas.

Pre-steady state kinetik ger information om reaktionsmekanismen genom att påvisa uppkomst av intermediat och dess försvinnande.

2. Om inget intermediat kan detekteras i ”pre-steady state” vad kan det då bero på?

Odetekterade intermediat i pre-steady state kan bero på:

a) Ingen accumulering av intermedietb) Intermediatet ger ingen spektral signalc) Intermediatet bildas så snabbt att det ej kan detekteras.

3. Vilka kriterier måste vara uppfyllda för bevis att ett intermediat bildas i reaktionskedjan?

Ett intermediat är bevisat att vara ”on pathway” om:

a) intermediatet är isolerat och karaktäriserad + b) intermediatet bildas tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway” + c) intermediatet kan reagera tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway”

Detektion av intermediär genom dess ackumulering i ”burst-fas”,

Hydrolys av en amid/ester katalyserad av chymotrypsin kan beskrivas med följande schema:

E = Enzym, S = Substrat, EI = Acylenzym, P1 = Amin och P2 = KarboxylsyraE+S EI

k’1 k3

E+P2+P1

E+S EIk’

1 k3E+P2

+P1

k’1 = apparent första ordningens hastighetskonstant för formationen av P1

k3 = Hastighetskonstanten för formation av P2

i) Burstfasen är den initiala fasen som bildas innan jämvikten ställt in sig

ii) Om [S] > [E] samt om förhållandet mellan k’

1 och k3 är stort (i.e. k’1 >> k3)

kommer ”burst-fasen” ha samma koncentration som [E]0 som då befinner sig i formen [EI]

Tid[P

1]

Burstfas

Formation av P1 över tid

Tid[P

1]

Burstfas

Tid[P

1]

Burstfas


Uppkomsten av en burst-fas visar på snabb formation av intermediatet EI

4. Vilka andra händelser (utöver ackumulering av ett intermediat) kan resultera i en ”burst-fas”? visa med exempel på reaktions scheman

E+S ESKs

E+Pk2

Vi tänker oss följande reaktion som inte innehåller någon intermediär

a) Enzymet kan omvandlas till ett mindre reaktiv tillstånd i kombination med att det reagerar med de första substratmolekylerna k2 >> k’2

E+S ESKs

E’+P Burst fask2

E’+S E’SK’s

E’+P linjär fask’2

Tid

[P1]

Burst fas


i) Burstfas - Snabb produktion av P då en viss mängd S binder in till allt E

ii) Linjär fas – Långsam produktion av P vid reaktion med E’

b) Dissociering av produkten är hastighetsbegränsande k2 >> k’2

Burstfas bildas från den första mängden S som försvinner eller EP som bildas.

Långsam minskning av S eller ökning av EP fås genom en fördröjning i återanvändningen av E pga långsam dissociering av EP

E+S ESKs

EPk2

E+Pk’2

Tid[E

P]

Burst fas

Linjär fas

Tid

[S]

Burst fas

Linjär fas

i) Burstfas - Snabb åtgång av S då en viss mängd av S reagerar med allt E till EPii) Linjär fas - Långsam åtgång av S som speglar den långsamma återanvändningen av E från EP

iii) Burstfas – Snabb produktion av EP då en viss mängd S reagerar med allt E → EPiiii) Linjär fas – Långsam produktion av EP som speglar den långsamma återanvändningen av E från EP

c) Enzymet inhiberas av produkten k2 >> k’2.

E+S ESKs

EPk2

E+Pk’2

E+S ESKs

EPk2

E+Pk’2

EP

-P

Burstfas bildas från den första mängden S som försvinner eller EP som bildas.

På samma sätt som i fallet b fås en långsam minskning av S eller ökning av EP genom en fördröjning i återanvändningen av E pga inhibering av P.

Tid[E

P]

Burst fas

Linjär fas

Tid

[S]

Burst fas

Linjär fas

i) Burstfas - Snabb åtgång av S då en viss mängd av S reagerar med allt E till EPii) Linjär fas - Långsam åtgång av S som speglar den långsamma återanvändningen av E pga inhibering av P

iii) Burstfas – Snabb produktion av EP då en viss mängd S reagerar med alle E → EPiiii) Linjär fas – Långsam produktion av EP som speglar den långsamma återanvändningen av E pga inhibering av P

5. Visa hur man kan studera k2 genom att a) använda en kromofor som lämnande grupp, b) använda en kromofor acylgrupp samt c) använda en kromofor inhibitor till E. Rita grafer!!

Villkor mätbetingelser:i) Enzymet mättas med S ([E] < [S]) vilket ger en ackumulering av ett stabilt intermediat

(EI) över en viss begränsad tid, då det finns tillräckligt med S för att hålla enzymet mättat ES.

ii) Beräkning av k2 mäts under ”single-turnover” betingelser, ingen återanvändning av enzymet.

E+S EIk2 k3

E+P2+P1

ESKs

Hydrolys av amider och estrar katalyserat av ett serinproteas (kymotrypsin)

a) kromofor som lämnande grupp:

Hastigheten för produktion av acylenzym (EI) bestäms från hastigheten av produktion av P1 (nitrofenol alt joniserad form av nitrofenol) som absorberar ljus vid en annan våglängd än esterföreningen.

E+S EIk2 k3

E+P2+P1

ESKs

Tid[P

1]

Exponentiell fas

Linjär fas

i) Hastighetskonstanten för acylering (k2) samt dissocieringskonstanten (Ks) kan beräknas från den exponentiella fasens hastighetskonstants beroende av [S].

ii) Olyckligtvis är nitrofenylestrar oftast så reaktiva att acyleringshastigheten är för hög för att mätas med ”stop flow”

b) Använda en kromofor acylgrupp: Exempelvis furylacryloyl-L-tyrosine etyl ester, vars spektrum förändas vid inbindning till enzym.

E+S EIk2 k3

E+P2+P1

ESKs

i) Spektrum av furylacryloyl-L-tyrosine etyl ester ändras när det binder till E (i.e. ES)

ii) Spektrum ändras ytterligare vid ackumulering av EI.

iii) Under den exponentiella fasen ackumuleras EI, ger k2.

Tid

Abso

rban

s

Ackumulering av EI

Produktion av ES inom dödtid

Om absorbansen ökar vid inbindning!

c) Använda en kromofor inhibitor till E som snabbt kan dissociera från E : Exempelvis proflavin (pro) - ger en ökning i Abs vi inbindning till E.

E EIk2 k3

E+P2+P1

ESS,Ks

Epro

pro

Brist på substrat → minskning av EI (hydrolysen detekteras)→ ökning av Epro

Tid

A46

5

Produktion av EI,

beräkning av k2

Dissociering av Epro Produktion av ES Beräkning av Ks

Abs konstant tills S är förbrukad

i) Snabb minskning i Abs får genom snabb dissociering av Epro och snabb formation av ES. S konkurrerar ut pro.

ii) Exponentiell minskning av Abs fås då EI bildas vilket leder till att mängden fri E som kan binda till pro minskar. Från dessa fas kan k2 beräknas

iii) Abs är konstant så länge det finns nog med S som försäkrar att E är acylerat (i.e.EI)

iv) Efter en tid stiger abs då S börjar ta slut [EI] minskar och [E] ökar som kan binda till pro.

6. Förklara kortfattat hur man kan studera k3

E+S EIk2 k3

E+P2+P1

ESKs

I. Man måste först hitta ett substrat som kan bilda EI mkt fort och som kan ackumuleras som EI dvs all substrat som tillsätts ska först binda till enzymet och bilda EI (k2 >> k3). Därefter sker en långsam hydrolys under ”singel-turnover” betingelser som detekteras genom att tillsätta en kromafor-inhibitor som binder in till enzymet då EI övergått till E + P. Det sker alltså en absorbans-förändring då kromofor-inhibitorn (ex proflavin) binder till enzymet - denna kurva kan i sin tur relateras till k3.

II. EI kan isoleras genom att förvara den vid ett pH där den är oreaktiv. På så sätt isolerar man steget man vill studera. k3 kan sedan beräknas genom att vid ett stop-flow-försök höja pH till reaktiva nivåer och spektroskopiskt mäta hur inbindningen av en kromafor-inhibitor till E varierar med tiden.

EIk3

E+P2

Epropro

Tid

A46

5

7. Diskutera värdena på kcat och KM i tabell 7.1 – vilken information kan fås om det hastighetsbegränsade steget samt förekomsten av ett gemensamt intermediat för olika substrat inom samma klass.

kcat = k2k3/(k2 + k3)

KM = Ksk3/(k2 + k3)

Acylation Deacylation

Om flera substrat genererar samma intermediat och om nedbrytning av intermediatet är hastighetsbegränsande så hydrolyseras dessa med samma kcat !!

• För estrar får samma värde på kcat → Deacylering är hastighetsbegränsande• k2 >> k3 (kcat = k3) och KM = Ksk3/k2 (Lågt värde på KM - synligt i tabellen)

•För amider är fås ett lågt värde på kcat→ Acyleringssteget är hastighetsbegränsande kcat = k2

• För amider är k2<< k3 och KM = Ks (Högt värde KM- synligt i tabellen)Den högre reaktiviteten för p-nitrofenylester speglas i ett lägre KM pga k2 ökar vid bättre lämnande grupp

RCOX

RCO-Ekcat

RCO2H+ERCOY

RCOZ

Vid hydrolys av en ester och amider med kymotrypsin bildas ett intermediat (RCO-E)

8. Förklara principen för hur fördelning av intermediärer mellan tävlande acceptorer kan visa på förekomsten av ett gemensamt intermediat.

E+RCOOR’ RCO-E

R’-OH

A

B

RCOA+E

RCOB+E

Bestäm fördelningen mellan olika produkter vid hydrolys av olika substrat-derivat (i.e. R’ varierar):

Om produktfördelningen A/B är lika för den enzymkatalyserade reaktionen oavsett egenskap hos R’ så är detta ett bra bevis för formation av det gemensamma intermediatet RCO-E

E+RCOOR’

RCO-E

R’-OH

NH2OH

H2O

RCONHOH+E

RCO2H+E

Ex kymotrypsin katalyserad hydrolys av olika estrar i närvaro av hydroxylamin och vatten

R’

Produktfördelningen är konstant för den enzymkatalyserade reaktionen!

9. Diskutera utifrån figurerna 7.2 och 7.3 hur man kan avgöra om det hastighetsbegränsande steget är formation eller hydrolys av acylenzyme.

Mät hastigheten för formation av produkt från ett visst substrat vid olika koncentrationer av acceptor [A]

E+RCOOR’ RCO-E

R’-OH

RCOA+EA

i) Om det hastighetsbegränsande steget är formation av RCO-E (acylenzym) så kan en högre koncentration av A inte öka hastigheten för reaktionen då A reagerar med RCO-E efter det hastighetsbegränsande steget – k2 är hastighetsbegränsande

ii) Om det hastighetsbegränsande steget är hydrolys av RCO-E så leder en högre koncentration av A till en ökad hastighet för reaktionen – k3 är hastighetsbegränsande

k2 k3

[Ala-NH2] (M)

kca

t (s-1

)

-Ac-Phe-TMA

Ac-Phe-Ala-NH2

Ac-Phe (hydrolys med H2O)

Figure 7.2. Hydrolys av Ac-Phe-TMA = Acetylphenylalanin p-trimetylammoniumanilide

E+Ac-Phe-TMA Ac-Phe-E

TMA-OH

Ala-NH2

H2O

Ac-Phe-Ala-NH2

Ac-Phe

KsE•Ac-Phe-TMA

k2

i) kcat för produktion av Ac-Phe-Ala-NH2 ökar med ökad [Ala-NH2]

ii) kcat för produktion av Ac-Phe minskar med ökad [Ala-NH2].

iii) kcat för minskning av [Ac-Phe-TMA] är konstant med ökad [Ala-NH2].

k2 är hastighetsbegränsande:

Formation av acylenzym är hastighetsbegränsande då ökning av [Ala-NH2] inte ökar hastigheten för nedbrytning av Ac-Phe-TMA

Figure 7.3. Hydrolys av Ac-Phe-OCH3 = Acetylphenylalanin – metyl ester

E+Ac-Phe-OCH3 Ac-Phe-E

CH3OH

Ala-NH2

H2O

Ac-Phe-Ala-NH2

Ac-Phe

KsE•Ac-Phe-OCH3

k2

[Ala-NH2] (M)

kca

t (s-1

)

-Ac-Phe-O-CH3

Ac-Phe-Ala-NH2

Ac-Phe (hydrolys med H2O)

i) kcat för produktion av Ac-Phe-Ala-NH2

ökar med ökad [Ala-NH2]

ii) kcat för produktion av Ac-Phe minskar med ökad [Ala-NH2].

iii) kcat för minskning av [Ac-Phe-OCH3] ökar med ökad [Ala-NH2]

k3 är hastighetsbegränsande:

Hydrolys av acylenzym är hastighetsbegränsande då ökning av [Ala-NH2] ökar hastigheten för nedbrytning av Ac-Phe-OCH3

10. Förklara hur man kunnat bevisa reaktionsvägen för reaktionen:

E + ATP + AA + tRNA E•AA-AMP + tRNA AA-tRNA + AMP + E

PPi E = aminoacyl-tRNA synthetase

Hur har man bevisat att reaktionen går via ackumulering av intermediatet E•AA-AMP (enzymbundet aminoacyl adenylat) och inte via intermediatet E•AA-tRNA

Nettoreaktion: E kan hydrolysera ATP och bilda komplexet Aminoacyl-tRNA (AA-tRNA)

Test för formation av E•AA-AMP:

• Med pyrofosfasutbytes-tekniken:

Till syntes av proteiner

E+ATP+AA+32PPi E•AA-AMP+PPi+32PPi

E+32ATP+AA+PPi E•AA-AMP+PPi+32PPi

i) I frånvaro av tRNA erhålls en jämn fördelning av isotopinmärkt P i ATP och PPi

ii) Detta kan förklaras av en ständig återanvändning av E•AA-AMP (som attackeras av 32PPi)

iii) Alltså: reaktionen går via formation av komplexet aminoacyl adenylat (E•AA-AMP)

Efter formation av E•AA-AMP sker acyleringen av tRNA

E•AA-AMP enzymbundet aminoacyl adenylat

i) Intermediatet (E•AA-AMP) kan isoleras med kromatografi

ii) Fritt aminoacyl adenylat (AA-AMP) har isolerats genom fällning av enzymet med en syra

iii) Det isolerade komplexet kan överföra sin aminosyra till tRNA

iv) Kristallstrukturen av E•AA-AMP har bestämts med tyrosyl-tRNA syntase (E) bundet till tyrosyladenylat (AA-AMP)

Bevis för formation av E•AA-AMP:

tRNA laddat med AA

Från ovanstående resonemang är det logiskt att med följande reaktionsmekanism

E+ATP+AA E•AA-AMPtRNA

AA-tRNA+AMP+E

PPi


AA-tRNA+AMP+E

PPi

Men trots detta fanns det tveksamheter huruvida E•AA-AMP verkligen ackumulerades under reaktionen och om det istället inte var så att tRNA reagerade samtidigt som ATP hydrolyserades enl:

E+ATP+AA+tRNA E•AA-tRNA E+AA-tRNA

AMP+PPi

E+ATP+AA+tRNA E•AA-tRNA E+AA-tRNA

AMP+PPi

Aminoacyl adenylat mekanismen har bevisats genom ytterligare 2 villkor – studier av IRS (isoleucyl-tRNA synthetase )

i) E•AA-AMP reagerar tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway”

ii) E•AA-AMP bildas tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway”


AA-tRNA+AMP+E

PPi

IRS Ile


AA-tRNA+AMP+E

PPi


AA-tRNA+AMP+E

PPi

IRS Ile

Fig 7.4 Studera reaktionen: E•(14C)Ile-AMP + tRNA → (14C)Ile-tRNA + AMP + E

i) ● (mix av E•(14C)Ile-AMP + tRNA) och ο (mix av E + (14C)Ile + ATP + tRNA) ger samma hastighet → Detta innebär att E•(14C)Ilr-AMP reagerar tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway”

ii) k för överföring av (14C)Ile till tRNA är lika med kcat för ”steady state” aminoacylering av tRNA under samma betingelser

iii) Detta innebär att nedbrytning av E•(14C)Ile-AMP är hastighetsbegränsande (k = kcat)

En logisk reaktionsmekanism är då:

k

i) E•Ile-AMP reagerar tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway”

om k > kcat → ett tidigare steg är det hastighetsbegränsande steget!

om k < kcat → E•AA-AMP kan inte existera som intermediat då det reagerar för långsamt!

ii) E•Ile-AMP bildas tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway”

Figur 7.5 - Då man mixar IRS + (γ-32P)ATP + Ile + tRNA fås en burstfas från produktion av 32PPi

Detta är förenligt med reaktionsmekanismen:

i) E•Ile-AMP bildas tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway”

E+ATP+AA+tRNA E•AA-AMP+tRNAslow

AA-tRNA+AMP+E

PPi

fastE+ATP+AA+tRNA E•AA-AMP+tRNA

slowAA-tRNA+AMP+E

PPi

fast

Eller med reaktionsmekanismen:

E+ATP+AA+tRNA E•AA-tRNAslow

E+AA-tRNA

AMP+PPi

fastE+ATP+AA+tRNA E•AA-tRNA

slowE+AA-tRNA

AMP+PPi

fast

Två olika intermediat

Den senare reaktionsmekanismen kan motbevisas:

Figur 7.6: Då man mixar IRS + ATP + (14C)AA + tRNA fås inte någon burstfas som skulle kunna visa på snabb produktion av E•(14C)AA-tRNA

i) E•Ile-AMP bildas tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway”

E+ATP+AA+tRNA E•AA-AMP+tRNAslow

AA-tRNA+AMP+E

PPi

fastE+ATP+AA+tRNA E•AA-AMP+tRNA

slowAA-tRNA+AMP+E

PPi

fastAlltså gäller:

10. Förklara och diskutera hur man mha ”rapid quenching experiments” kommit fram till att editeringsmekanismen för bortstötning av felplacerad threonin involverar en felkoppling av Thr till tRNAVal följt av en snabb hydrolys.

Proofreading vid proteinbiosyntes kan bero på:

i) Hydrolys av felaktigt komplex E•AA-AMP (amino acyl komplex) av E (aminoacyl-tRNA synthetase)

E+ATP+AA+tRNA E•AA-AMP+tRNA

PPi

Hydrolys

E+AA+AMP+tRNAE+ATP+AA+tRNA E•AA-AMP+tRNA

PPi

Hydrolys

E+AA+AMP+tRNA

ii) Hydrolys av ”mischarged” AA-tRNA

E+ATP+AA+tRNA E•AA-AMP+tRNA AA-tRNA+AMP+E

PPiHydrolys

AA+tRNA+AMP+E

E+ATP+AA+tRNA E•AA-AMP+tRNA AA-tRNA+AMP+E

PPiHydrolys

AA+tRNA+AMP+E

i) Argument för formation av det felaktiga komplexet VRS•Thr-AMP:

VRS = Valyl-tRNA synthetase

Pyrofosfatutbytestekniken:

VRS katalyserar 32PPi utbyte i närvaro av threonin och bildar komplexet VRS•Thr-AMP i frånvaro av tRNA

Detta kan förklaras av en ständig återanvändning av VRS•Thr-AMP som kan attackeras av PPi

VRS + ATP + Thr + 32PPi VRS•Thr-AMP + PPi + 32PPi

VRS + 32ATP + Thr + PPi osvVRS•Thr-AMP + PPi + 32PPi

32P blir jämt fördelad mellan ATP och PPi

ii) Argument för formation av VRS•Thr-AMP samt hydrolysering av ”mischarged” Thr-tRNAVal:

I närvaro av tRNA och Thr verkar VRS som ett ATP fosfatase och hydrolyserar ATP → AMP + PPi och katalyserar inte en nettoformation av Thr-tRNAVal.

VRS+ATP+Thr+tRNAVal VRS+Thr-tRNAVal

PPi

VRS+Thr+tRNAValVRS•Thr-AMP+tRNAVal

AMP


PPi

VRS+Thr+tRNAValVRS•Thr-AMP+tRNAVal

AMP

Nettoreaktionen blir hydrolys av ATP → PPi + AMP

Under den här reaktionen formas intermediatet VRS•Thr-AMP (som visas genom 32PPi utbytesreaktionen) men även intermediatet Thr-tRNAVal måste bildas och hydrolyseras

iii) Argument för formation av ”mischarge” Thr-tRNAVal

Transient ”mischarged” tRNAVal kan detekteras och isolerats

Figur 7.7: Blanda VRS•(14C)Thr-AMP + tRNAVal → (14C)Thr- tRNAVal (transiently formed)

(14C)Thr- tRNAVal kan isoleras genom fällning med fenol

iiii) Hydrolys av ”mischarge” Thr-tRNAVal mha VRS sker tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway”

Figur 7.8: (14C)Thr-tRNAVal + VRS → (14C)Thr + tRNAVal, k = 40 s-1

iiiii) Produktion av Thr-tRNAval är tillräckligt snabbt för att vara ”on pathway”

Figur 7.9: VRS•Thr-32AMP + tRNAVal → VRS + Thr-tRNAVal + 32AMP, k = 36 s-1

Alltså är det följande reaktionsmekanism som gäller:


PPi

VRS+Thr+tRNAVal

VRS•Thr-AMP+tRNAVal

AMP k=40s-1

k=36s-1


PPi

VRS+Thr+tRNAVal

VRS•Thr-AMP+tRNAVal

AMP k=40s-1

k=36s-1