EKSPRESI MMP-2, MMP-9, DAN iNOS PADA PULPA GIGI MANUSIA YANG
MENJADI SUBJEK TRAKSI ORTODONTIK
(MMP-2, MMP-9, and iNOS Expression in Human Dental Pulp Subjected to Orthodontic
Traction)
Angelo Leone, dkk.
AbstrakTujuan: untuk menguji hipotesis bahwa beberapa metaloproteinase (MMP-2, MMP-9) dan enzim inducible nitric oxide synthetase (iNOS) pada sampel pulpa gigi tidak berubah ketika mendapatkan perawatan ortodontik.Materi dan metode: pulpa gigi manusia diambil dari pasien lelaki dan perempuan (N=10, umur 10-14 tahun). Teknik kawat lurus digunakan dengan menggunakan nikel-titanium atau kawat lengkung baja. Peningkatan tekanan yang diberikan pada gigi berangsur sedikit demi sedikit. Lima pasien dilakukan pencabutan gigi premolar setelah 14 bulan perawatan dan satu pasien setelah 24 bulan. Sampel difiksasi dalam Bouin, ditanam dalam malam, dan setelah itu diproses untuk imunohistokimia dengan menggunakan anti-MMP-2, anti-MMP-9, dan antibodi anti-iNOS.Hasil: reduksi ekspresi MMP-2, MMP-9, dan iNOS terjadi pada sampel yang dilakukan perawatan. Hal ini menjadi lebih terbukti seiring berjalannya waktu perawatan.Simpulan: hipotesis ditolak. Reduksi ekspresi dari protein tersebut memperlihatkan hubungan yang terkait dengan waktu.
Kata kunci : imunohistokimia, pulpa gigi, MMP-2, MMP-9, iNOS.
PENDAHULUAN
Pulpa gigi merupakan tipe jaringan ikat longgar khusus yang ditandai oleh adanya
beberapa sel dan matriks ekstraseluler amorf dengan jumlah yang sangat banyak dalam
proteoglikan dan glikosaminoglikan dan serat kolagen yang sedikit. Jaringan mucous sangat
berlimpah selama perkembangan embrionik, sedangkan pada organisme dewasa hanya
terdapat pada pulpa gigi, tali pusar, dan badan vitreous/hialin.
Tipe-tipe seluler yang ada pada pulpa gigi yakni meliputi odontoblas, fibroblas (yang
menghasilkan komponen-komponen matriks ekstraseluler), sel-sel mesenkim, dan sel-sel
sistem imun (makrofag, limfosit, leukosit). Selain itu juga terdapat pembuluh darah dan
nervus. Fungsi utama dari pulpa gigi adalah struktural (sintesis dentin), trofik (menyediakan
1
suplai darah dan pembuluh limfatik pada gigi), protektif (sintesis dentin reparatif atau dentin
sekunder), dan sensorik (menyediakan inervasi nervus pada gigi).
Beberapa laporan menegaskan bahwa beban yang diberikan pada gigi dapat
menyebabkan hilangnya vitalitas pulpa, akan tetapi laporan lainnya menyatakan bahwa
tekanan yang diberikan tidak memiliki dampak negatif tersebut.1-3 Pulpa yang menjadi subjek
traksi ortodontik menunjukkan perubahan morfologi dan struktural. Terdapat peningkatan
vakuolisasi, matriks ekstraseluler (ECM), dan perubahan sirkulasi peredarah darah dengan
adanya peningkatan vaskularisasi selama periode awal perawatan dan selanjutnya terjadi
reduksi diameter pembuluh darah.1,4-7 Terlebih lagi, Perinetti dkk.2 menemukan suatu ekspresi
alkaline fosfatase yang menurun pada fase awal perawatan dan melaporkan perbedaan yang
signifikan dalam ekspresi aspartate aminotransferase antara pulpa yang dirawat dan pulpa
kontrol.3 Beberapa penulis8,9 meneliti respons respiratori pulpa setelah aplikasi tekanan
ortodontik, dan beberapa orang peneliti lainnya10-12 juga meneliti aktivitas alkaline fosfatase
dan sitokin inflamatori pada jaringan gigi setelah pergerakan gigi ortodontik.
Pada penelitian ini diteliti mengenai ekspresi MMP-2, MMP-9, dan inducible nitric
oxide synthetase (iNOS) sebagai parameter regenerasi dari jaringan matriks dan reaksi
inflamatori setelah perawatan ortodontik.
MMP-2 (matriks metaloproteinase-2, gelatinase A, 72 kDA) merupakan enzim
degradatif matriks yang mendegradasi kolagen tipe IV dan V, kolagen yang terdenaturasi,
dan elastin. Ini dihasilkan oleh beberapa tipe sel dan aktivitasnya tergantung pada Ca++ dan
Zn++.
MMP-9 (matrix metalopeptidase-9, gelatinase B, 92 kDa) merupakan anggota dari
familia matriks metaloproteinase (MMP) yang terlibat pada pemecahan matriks ekstraseluler
baik pada proses fisiologis maupun patologis. Ia mendegradasi kolagen tipe IV dan V.
iNOS (macNOS, tipe II NOS) merupakan bentuk dari nitrit oksida sintetase yang
dapat dipicu, dan diekspresikan oleh makrofag. Ia diaktivasi oleh sinyal-sinyal inflamatori,
seperti sitokin dan interferon-γ, atau tekanan oksidatif, seperti paparan pada hidrogen
peroksida (H2O2). Sejumlah penelitian telah dilakukan untuk memaparkan biologi nitrit
oksida dari pulpa gigi.14-16 Tujuan dari penelitian ini adalah untuk melaporkan dampak dari
perawatan ortodontik terhadap aktivitas enzim-enzim tersebut dan menentukan apakah
perubahan yyang dipicu tersebut dapat pulih kembali atau tidak.
2
MATERI DAN METODE
Sepuluh pasien (11 sampai 14 tahun) dengan maloklusi Klas II dan berjejal sedang
sampai berat dirujuk untuk pemeriksaan ortodontik. Pada empat kasus, ekstraksi dilakukan
pada awal perawatan; pada lima kasus, gigi diekstraksi setelah 14 bulan traksi. Hanya pada
satu kasus, ekstraksi dilakukan 6 bulan setelah akhir bulan ke-24 perawatan. Perawatan
terdiri dari teknik kawat lurus menggunakan nikel-titanium atau kawat lengkung baja.
Perawatan selalu diawali dengan lengkung nikel-titanium 0.12” diikuti oleh kawat yang
diameternya semakin besar 0.14″, 0.16″, 0.18″, 0.16 × 0.16″, 0.16 × 0.22″) dengan tekanan
yang diberikan pada gigi ditingkatkan sedikit demi sedikit. Penelitian panduan ekspresi
MMP-2, MMP-9, dan iNOS pada pulpa gigi manusia yang diberikan traksi ortodontik telah
disetujui oleh institusi yang tepat dalam menangani proses peninjauan.
Pulpa gigi yang diekstraksi sebelum perawatan ortodontik ditetapkan menjadi salah
satu dari dua kelompok: Kelompok A terdiri dari pulpa yang diekstraksi setelah 14 bulan
traksi, dan Kelompok B terdiri dari kasus tunggal pulpa yang diekstraksi 6 bulan setelah
akhir bulan ke-24 perawatan. Pulpa diekstraksi dengan menginsisi gigi dalam arah
longitudinal menggunakan bur intan halus di bawah semprotan air. Pemotongan berhenti 2
mm sebelum kavitas pulpa untuk menghindari kerusakan pulpa. Pulpa kemudian dilepaskan
dengan instrumen tajam dan dibilas dalam saline.
Pulpa difiksasi dalam larutan Bouin dan direndam. Potongan-potongan, dengan
ketebalan 7 μm, diproses untuk imunohistokimia dengan antibodi anti-MMP-2, anti-MMP-9,
dan anti-iNOS. Antibodi monoklonal tikus anti manusia MMP-2 (Chemicon, Chemicon
International, Temecula, Calif) (pengenceran 1:800), antibodi poliklonal kelinci anti-tikus
MMP-9 dengan panjang penuh (Chemicon) (pengenceran 1:100 ), dan antibodi poliklonal
kelinci anti-iNOS tipe II (BD Biosciences, Bedford, Mass) (pengenceran 1:25) digunakan.
Imunohistokimia dilakukan menggunakan DakoCytomation EnVision (Dako Amerika Utara,
Carpinteria, Calif) + Sistem-HRP (AEC) dari Dako, sesuai dengan instruksi pabrik. Paket
yang digunakan tersebut memungkinkan kompleks antigen-antibodi dapat terdeteksi sebagai
butiran berwarna kecoklatan.
Spesimen imunohistokimia diperiksa menggunakan mikroskop Leica Laborlux S
(Leica Microsistem GmbH Wetzlar, Jerman) dengan sistem foto digital Nikon DSL2 (Nikon
Corp, Tokyo, Jepang). Masing-masing sampel dianalisis dengan sistem double-blind dan dua
3
orang operator yang berbeda. Kemudian, hasilnya dibandingkan dengan analisis gambar yang
diperoleh dari file TIF digital dengan sistem multispektrum.17,18 Untuk mengaplikasikan
metode ini, dibuat serangkaian bidikan menggunakan filter CoKin (Cokin SAS, Rungis
Cedex, Perancis) untuk mendapatkan semua spektrum warna yang berbeda. Adobe
Photoshop CS2 (Adobe Sistems Inc, San Jose, CA) dengan perangkat analisis gambar
digunakan untuk menguraikan gambar-gambar tersebut.19,20 Pemilihan spektrum terkait
dengan AEC, profil warna gambar diubah dari RGB menjadi CMYK. Kemudian warna
kuning dipilih karena literatur mengindikasikan bahwa warna tersebut memiliki respons
linear terbaik terhadap intensitas warna dan ekspresi protein.21 Perhitungan pewarnaan
colorimetric digambarkan menggunakan skor dengan nilai dari 1+ sampai 5+.21-23 Data
numerik diperoleh dari analisis gambar yang telah diuraikan secara statistik menggunakan
uji-t untuk mengevaluasi kemaknaan.
HASIL
Hasil imunohistokimia diringkas pada Tabel 1 dan gambaran grafik dari data analisis
gambar disajikan pada Gambar 1.
Gambar 1.Gambaran grafik hasil imunohistokimia.
Kelompok A
Kelompok A terdiri dari pulpa yang tidak diberikan perawatan apapun dan mengekspresikan
MMP-2 dan MMP-9 (Gambar 2).
4
Gambar 2. MMP-2 pada pulpa gigi manusia kontrol; warna coklat disekitar dinding pembuluh darah , 10x (panah)
Tepi kanan potongan digambarkan dengan adanya epitelium odontoblas, yang mana
sel-sel positif untuk MMP-2 (+ +). Beberapa sel yang positif juga ditemukan pada regio
subodontoblas (+). Perhatikan bahwa reaktivitas lebih kuat pada pembuluh darah kecil yang
menyebar di dalam pulpa (+ + +). Imunoreaktivitas untuk MMP-9 menunjukkan sifat-sifat
yang sama dengan MMP-2. Selanjutnya, sel-sel positif terdapat di dalam parenkim pulpa
(Gambar 3).
Gambar 3.MMP-9 Pada pulpa gigi manusia kontrol; warna coklat disekitar dinding pembuluh darah, 20x (panah)
Selain itu, reaktivitas iNOS terlihat pada epitelium odontoblas dan pada regio
subodontoblas, akan tetapi reaktivitasnya lemah (+) kecuali untuk sekelompok kecil sel pada
regio subodontoblas, yang menunjukkan pewarnaan yang lebih kuat (++++) (Gambar 4).
5
Gambar 4. iNOS pada pulpa gigi manusia kontrol; kelompok selk-sel yang positif terhadap iNOS pada regio subodontoblastik, 20x (panah)
Kelompok B
Pada kelompok B, imunohistokimia menunjukkan bahwa MMP-2 diekspresikan lemah oleh
odontoblas (+). Sel-sel tersebut yang juga terdapat pada regio subodontoblas positif untuk
MMP-2 (+). Sel-sel sporadik menunjukkan bahwa imunoreaksi tersebar pada parenkim pulpa
(Gambar 5).
Gambar 5. MMP-2 pulpa gigi setelah 14 bulan traksi; sel-sel sporadic dan dinding pembuluh darah positif; (A) Imunohistokimia, (B) Analysis multispektral
Dinding pembuluh darah positif untuk MMP-2 (+ + +) (Gambar 6).
6
Gambar 6. MMP-2 pulpa gigi manusia setelah 14 bulan traksi; dinding pembuluh darah
positif, 10x (panah)
Imunoreaktivitas untuk MMP-9 terlokalisir pada endotelium atau dinding pembuluh
(Gambar 7)
Gambar 7. MMP-9 pulpa gigi manusia setelah 14 bulan traksi, sel-sel odonthelial positif, 20x (panah)
dan pada odontoblas (Gambar 8,9), di mana pewarnaan tampak sangat kuat (+ + + +).
7
Gambar 8. MMP-9 pulpa gigi manusia setelah 14 bulan traksi odontoblas positif, 20x (panah)
Gambar 9. MMP-9 pulpa gigi manusia setelah 14 bulan traksi odontoblas positif; (A) Imunohistokimia, (B) Analysis Multispektral, 40x.
Ekspresi iNOS lemah pada kebanyakan jaringan, dan reaktivitasnya sangat kuat pada dinding-dinding pembuluh (+ + + + +) (Gambar 10).
Gambar 10. iNOS pulpa gigi manusia setelah 14 bulan traksi, parenkim positif lemah, namun pewarnaan kuat pada dinding pembuluh darah. 10x (panah)
8
Pulpa tunggal dari gigi yang diekstraksi 6 bulan setelah akhir perawatan
Imunoreaktivitas sangat lemah untuk MMP-2 (+) (Gambar 11),
Gambar.11 MMP-2 pulpa gigi manusia setelah 24 bulan traksi, imunoreaktivitas sangat lemah. 10x
MMP-9 (Gambar 12),
Gambar.12 MMP-9 pulpa gigi manusia setelah 24 bulan traksi, semua struktur negatif, walaupun nilai positif pada beberapa pembuluh darah sangat lemah.10x.
dan iNOS (Gambar 13).
Gambar 13. iNOS pulpa gigi manusia setelah 24 bulan traksi; beberapa kelompok sel-sel positif sangat lemah
9
Analisis morfologi dari sampel sel-sel tersebut menunjukkan susunan pulpa yang
berubah. Vakuola dengan tepi yang tidak beraturan terlihat pada jaringan, dan morfologi ini
berhubungan dengan menghilangnya aktivitas remodelling dari enzim MMP-2 dan MMP-9.
Hasil dari analisis statistik diringkas pada Tabel 2. Analisis statistik mengindikasikan
bahwa ekspresi MMP-2 menunjukkan reduksi yang signifikan (P<.05) pada regio odontoblas
dan pada dinding pembuluh darah pulpa yang dirawat (pada bulan ke-14 dan 24 perawatan)
jika dibandingkan dengan kelompok kontrol, namun perbedaannya tidak signifikan pada
regio submukosa.
MMP-9 berkurang secara signifikan pada pulpa yang dirawat (pada bulan ke-14 dan
24 perawatan; P<.05) baik pada regio odontoblas maupun submukosa. Perbedaan ekspresi
iNOS antara sampel yang dirawat dan kontrol tidak signifikan pada daerah manapun yang
diteliti.
DISKUSI
Satu pasien menjadi subjek pencabutan gigi premolar 6 bulan setelah 24 bulan traksi
untuk mengurangi overjet (kamuflase ortodontik). Pasien ini menolak pencabutan premolar
pada awal perawatan. Akan tetapi, pada akhir perawatan pasien tidak puas dengan hasilnya
karena overjet-nya yang masih besar dan ia meminta perawatan ulang dengan pencabutan.
Kami ingin menggarisbawahi keganjilan kasus ini yakni dengan menginklusikan kasus ini
dalam penelitian kami, walaupun hal ini tergolong kasus yang unik. Jelas tidak mudah
mendapatkan pulpa dari gigi seseorang yang perawatannya sudah benar-benar tercapai.
Pasien ini merupakan kondisi khusus dan penelitian kami dilakukan menggunakan tiga pulpa
gigi yang telah disebutkan di atas di bawah kondisi berbeda.
Pada penelitian ini kami meneliti ekspresi dari enzim MMP-2, MMP-9, dan iNOS
pada pulpa yang dijadikan subjek perawatan ortodontik. Braket dipasang pada gigi, dan
kawat nikel-titanium dimasukkan pada slot/celah yang tepat dan diikat dengan karet elastik.
Semua sampel diberikan tindakan yang sama (walaupun untuk periode waktu yang berbeda)
dengan tujuan untuk mengurangi variabilitas dan menggunakan parameter dan kondisi
eksperimental yang sekonstan mungkin. Hasil klinisnya adalah kesejajaran gigi-geligi.
10
Kami mendasarkan penelitian pulpa gigi kami pada morfologi jaringan (pewarnaan
hematoksilin-eosin), pada imunoekspresi MMP-2, MMP-9, dan iNOS pada analisis data
multispektrum.
Seperti yang ditunjukkan pada hasil, metaloproteinase diekspresikan oleh pulpa gigi
sampai 14 bulan perawatan. Pulpa yang dijadikan subjek selama 24 bulan perawatan dan
diekstraksi 6 bulan setelah akhir perawatan mengekspresikan kadar MMP-2 dan MMP-9
yang sangat rendah, yang mengesankan suatu kondisi modifikasi metabolik. Hal ini diperkuat
oleh pengamatan morfologi, yang menunjukkan pulpa gigi dengan bukti adanya tanda-tanda
modifikasi struktural, ruang kosong di dalam sel-sel dan tidak ada regenerasi ECM (matriks
ekstraseluler).
Peneliti lainnya yang meneliti dampak dari traksi ortodontik terhadap pulpa gigi
memusatkan perhatiannya pada jaringan yang termineralisasi, misalnya, pengukuran
ketebalan dentin setelah perawatan. Mereka mengamati peningkatan ketebalan pre-dentin
yang berhubungan dengan puncak pergerakan gigi1,24 atau degenerasi odontoblas.25 Hasil
penelitian kami tidak sejalan dengan data dari peneliti lain yang melaporkan bahwa pulpa
yang dijadikan subjek perawatan ortodontik tidak menunjukkan perubahan metabolik apapun.
Akan tetapi, kemungkinan hasil tersebut ditujukan untuk perawatan ortodontik dengan
karakteristik yang berbeda (tekanan dan teknik ortodontik) serta untuk pergerakan gigi yang
berbeda. Meskipun demikian, data tersebut tidak menunjukkan adanya gangguan pulpa
sedangkan data kami menunjukkan adanya gangguan tersebut.
Semua penelitian yang dilakukan hingga saat ini tidak cukup menunjukkan bahwa
perawatan ortodontik dapat memicu kematian pulpa. Dengan demikian, diperlukan penelitian
lebih lanjut, dan menambah pulpa dan molekul yang terlibat dalam fisiologi jaringan pulpa
gigi dengan jumlah yang lebih besar dalam penelitian-penelitian selanjutnya. Dari sudut
pandang ini maka dapat dikatakan bahwa penelitian kami ini berkontribusi pada pemahaman
dampak dari perawatan ortodontik.
SIMPULAN
Reduksi ekspresi protein MMP-2 dan MMP-9 yang signifikan berhubungan dengan
lamanya perawatan ortodontik. Selain itu, sampel pulpa gigi yang diekstraksi 6 bulan
setelah akhir perawatan menunjukkan ekspresi MMP-2 dan MMP-9 yang sangat
11
rendah dan ciri-ciri morfologi yang berubah, yang mengesankan bahwa penurunan
aktivitas metaloproteinase setelah traksi ortodontik menunjukkan kesulitan bagi
regenerasi ECM dan restorasi struktur pulpa gigi.
Kerusakan yang disebabkan oleh traksi ortodontik tidak bisa pulih kembali.
Ekspresi iNOS, tipikal kondisi inflamasi, terlihat pada pulpa gigi kontrol dan pada
sampel yang diberikan tekanan ortodontik; aktivitas iNOS pada jaringan ini bisa
dijelaskan oleh karena adanya respons terhadap tekanan ekstraktif.
12
Tabel 1. Hasil Imunohistokimia
Tabel 2. Hasil Analisis Statistik
13