EKSPRESI MMP-2, MMP-9, DAN iNOS PADA PULPA GIGI MANUSIA YANG

MENJADI SUBJEK TRAKSI ORTODONTIK

(MMP-2, MMP-9, and iNOS Expression in Human Dental Pulp Subjected to Orthodontic

Traction)

Angelo Leone, dkk.

AbstrakTujuan: untuk menguji hipotesis bahwa beberapa metaloproteinase (MMP-2, MMP-9) dan enzim inducible nitric oxide synthetase (iNOS) pada sampel pulpa gigi tidak berubah ketika mendapatkan perawatan ortodontik.Materi dan metode: pulpa gigi manusia diambil dari pasien lelaki dan perempuan (N=10, umur 10-14 tahun). Teknik kawat lurus digunakan dengan menggunakan nikel-titanium atau kawat lengkung baja. Peningkatan tekanan yang diberikan pada gigi berangsur sedikit demi sedikit. Lima pasien dilakukan pencabutan gigi premolar setelah 14 bulan perawatan dan satu pasien setelah 24 bulan. Sampel difiksasi dalam Bouin, ditanam dalam malam, dan setelah itu diproses untuk imunohistokimia dengan menggunakan anti-MMP-2, anti-MMP-9, dan antibodi anti-iNOS.Hasil: reduksi ekspresi MMP-2, MMP-9, dan iNOS terjadi pada sampel yang dilakukan perawatan. Hal ini menjadi lebih terbukti seiring berjalannya waktu perawatan.Simpulan: hipotesis ditolak. Reduksi ekspresi dari protein tersebut memperlihatkan hubungan yang terkait dengan waktu.

Kata kunci : imunohistokimia, pulpa gigi, MMP-2, MMP-9, iNOS.

PENDAHULUAN

Pulpa gigi merupakan tipe jaringan ikat longgar khusus yang ditandai oleh adanya

beberapa sel dan matriks ekstraseluler amorf dengan jumlah yang sangat banyak dalam

proteoglikan dan glikosaminoglikan dan serat kolagen yang sedikit. Jaringan mucous sangat

berlimpah selama perkembangan embrionik, sedangkan pada organisme dewasa hanya

terdapat pada pulpa gigi, tali pusar, dan badan vitreous/hialin.

Tipe-tipe seluler yang ada pada pulpa gigi yakni meliputi odontoblas, fibroblas (yang

menghasilkan komponen-komponen matriks ekstraseluler), sel-sel mesenkim, dan sel-sel

sistem imun (makrofag, limfosit, leukosit). Selain itu juga terdapat pembuluh darah dan

nervus. Fungsi utama dari pulpa gigi adalah struktural (sintesis dentin), trofik (menyediakan

1

suplai darah dan pembuluh limfatik pada gigi), protektif (sintesis dentin reparatif atau dentin

sekunder), dan sensorik (menyediakan inervasi nervus pada gigi).

Beberapa laporan menegaskan bahwa beban yang diberikan pada gigi dapat

menyebabkan hilangnya vitalitas pulpa, akan tetapi laporan lainnya menyatakan bahwa

tekanan yang diberikan tidak memiliki dampak negatif tersebut.1-3 Pulpa yang menjadi subjek

traksi ortodontik menunjukkan perubahan morfologi dan struktural. Terdapat peningkatan

vakuolisasi, matriks ekstraseluler (ECM), dan perubahan sirkulasi peredarah darah dengan

adanya peningkatan vaskularisasi selama periode awal perawatan dan selanjutnya terjadi

reduksi diameter pembuluh darah.1,4-7 Terlebih lagi, Perinetti dkk.2 menemukan suatu ekspresi

alkaline fosfatase yang menurun pada fase awal perawatan dan melaporkan perbedaan yang

signifikan dalam ekspresi aspartate aminotransferase antara pulpa yang dirawat dan pulpa

kontrol.3 Beberapa penulis8,9 meneliti respons respiratori pulpa setelah aplikasi tekanan

ortodontik, dan beberapa orang peneliti lainnya10-12 juga meneliti aktivitas alkaline fosfatase

dan sitokin inflamatori pada jaringan gigi setelah pergerakan gigi ortodontik.

Pada penelitian ini diteliti mengenai ekspresi MMP-2, MMP-9, dan inducible nitric

oxide synthetase (iNOS) sebagai parameter regenerasi dari jaringan matriks dan reaksi

inflamatori setelah perawatan ortodontik.

MMP-2 (matriks metaloproteinase-2, gelatinase A, 72 kDA) merupakan enzim

degradatif matriks yang mendegradasi kolagen tipe IV dan V, kolagen yang terdenaturasi,

dan elastin. Ini dihasilkan oleh beberapa tipe sel dan aktivitasnya tergantung pada Ca++ dan

Zn++.

MMP-9 (matrix metalopeptidase-9, gelatinase B, 92 kDa) merupakan anggota dari

familia matriks metaloproteinase (MMP) yang terlibat pada pemecahan matriks ekstraseluler

baik pada proses fisiologis maupun patologis. Ia mendegradasi kolagen tipe IV dan V.

iNOS (macNOS, tipe II NOS) merupakan bentuk dari nitrit oksida sintetase yang

dapat dipicu, dan diekspresikan oleh makrofag. Ia diaktivasi oleh sinyal-sinyal inflamatori,

seperti sitokin dan interferon-γ, atau tekanan oksidatif, seperti paparan pada hidrogen

peroksida (H2O2). Sejumlah penelitian telah dilakukan untuk memaparkan biologi nitrit

oksida dari pulpa gigi.14-16 Tujuan dari penelitian ini adalah untuk melaporkan dampak dari

perawatan ortodontik terhadap aktivitas enzim-enzim tersebut dan menentukan apakah

perubahan yyang dipicu tersebut dapat pulih kembali atau tidak.

2

MATERI DAN METODE

Sepuluh pasien (11 sampai 14 tahun) dengan maloklusi Klas II dan berjejal sedang

sampai berat dirujuk untuk pemeriksaan ortodontik. Pada empat kasus, ekstraksi dilakukan

pada awal perawatan; pada lima kasus, gigi diekstraksi setelah 14 bulan traksi. Hanya pada

satu kasus, ekstraksi dilakukan 6 bulan setelah akhir bulan ke-24 perawatan. Perawatan

terdiri dari teknik kawat lurus menggunakan nikel-titanium atau kawat lengkung baja.

Perawatan selalu diawali dengan lengkung nikel-titanium 0.12” diikuti oleh kawat yang

diameternya semakin besar 0.14″, 0.16″, 0.18″, 0.16 × 0.16″, 0.16 × 0.22″) dengan tekanan

yang diberikan pada gigi ditingkatkan sedikit demi sedikit. Penelitian panduan ekspresi

MMP-2, MMP-9, dan iNOS pada pulpa gigi manusia yang diberikan traksi ortodontik telah

disetujui oleh institusi yang tepat dalam menangani proses peninjauan.

Pulpa gigi yang diekstraksi sebelum perawatan ortodontik ditetapkan menjadi salah

satu dari dua kelompok: Kelompok A terdiri dari pulpa yang diekstraksi setelah 14 bulan

traksi, dan Kelompok B terdiri dari kasus tunggal pulpa yang diekstraksi 6 bulan setelah

akhir bulan ke-24 perawatan. Pulpa diekstraksi dengan menginsisi gigi dalam arah

longitudinal menggunakan bur intan halus di bawah semprotan air. Pemotongan berhenti 2

mm sebelum kavitas pulpa untuk menghindari kerusakan pulpa. Pulpa kemudian dilepaskan

dengan instrumen tajam dan dibilas dalam saline.

Pulpa difiksasi dalam larutan Bouin dan direndam. Potongan-potongan, dengan

ketebalan 7 μm, diproses untuk imunohistokimia dengan antibodi anti-MMP-2, anti-MMP-9,

dan anti-iNOS. Antibodi monoklonal tikus anti manusia MMP-2 (Chemicon, Chemicon

International, Temecula, Calif) (pengenceran 1:800), antibodi poliklonal kelinci anti-tikus

MMP-9 dengan panjang penuh (Chemicon) (pengenceran 1:100 ), dan antibodi poliklonal

kelinci anti-iNOS tipe II (BD Biosciences, Bedford, Mass) (pengenceran 1:25) digunakan.

Imunohistokimia dilakukan menggunakan DakoCytomation EnVision (Dako Amerika Utara,

Carpinteria, Calif) + Sistem-HRP (AEC) dari Dako, sesuai dengan instruksi pabrik. Paket

yang digunakan tersebut memungkinkan kompleks antigen-antibodi dapat terdeteksi sebagai

butiran berwarna kecoklatan.

Spesimen imunohistokimia diperiksa menggunakan mikroskop Leica Laborlux S

(Leica Microsistem GmbH Wetzlar, Jerman) dengan sistem foto digital Nikon DSL2 (Nikon

Corp, Tokyo, Jepang). Masing-masing sampel dianalisis dengan sistem double-blind dan dua

3

orang operator yang berbeda. Kemudian, hasilnya dibandingkan dengan analisis gambar yang

diperoleh dari file TIF digital dengan sistem multispektrum.17,18 Untuk mengaplikasikan

metode ini, dibuat serangkaian bidikan menggunakan filter CoKin (Cokin SAS, Rungis

Cedex, Perancis) untuk mendapatkan semua spektrum warna yang berbeda. Adobe

Photoshop CS2 (Adobe Sistems Inc, San Jose, CA) dengan perangkat analisis gambar

digunakan untuk menguraikan gambar-gambar tersebut.19,20 Pemilihan spektrum terkait

dengan AEC, profil warna gambar diubah dari RGB menjadi CMYK. Kemudian warna

kuning dipilih karena literatur mengindikasikan bahwa warna tersebut memiliki respons

linear terbaik terhadap intensitas warna dan ekspresi protein.21 Perhitungan pewarnaan

colorimetric digambarkan menggunakan skor dengan nilai dari 1+ sampai 5+.21-23 Data

numerik diperoleh dari analisis gambar yang telah diuraikan secara statistik menggunakan

uji-t untuk mengevaluasi kemaknaan.

HASIL

Hasil imunohistokimia diringkas pada Tabel 1 dan gambaran grafik dari data analisis

gambar disajikan pada Gambar 1.

Gambar 1.Gambaran grafik hasil imunohistokimia.

Kelompok A

Kelompok A terdiri dari pulpa yang tidak diberikan perawatan apapun dan mengekspresikan

MMP-2 dan MMP-9 (Gambar 2).

4

Gambar 2. MMP-2 pada pulpa gigi manusia kontrol; warna coklat disekitar dinding pembuluh darah , 10x (panah)

Tepi kanan potongan digambarkan dengan adanya epitelium odontoblas, yang mana

sel-sel positif untuk MMP-2 (+ +). Beberapa sel yang positif juga ditemukan pada regio

subodontoblas (+). Perhatikan bahwa reaktivitas lebih kuat pada pembuluh darah kecil yang

menyebar di dalam pulpa (+ + +). Imunoreaktivitas untuk MMP-9 menunjukkan sifat-sifat

yang sama dengan MMP-2. Selanjutnya, sel-sel positif terdapat di dalam parenkim pulpa

(Gambar 3).

Gambar 3.MMP-9 Pada pulpa gigi manusia kontrol; warna coklat disekitar dinding pembuluh darah, 20x (panah)

Selain itu, reaktivitas iNOS terlihat pada epitelium odontoblas dan pada regio

subodontoblas, akan tetapi reaktivitasnya lemah (+) kecuali untuk sekelompok kecil sel pada

regio subodontoblas, yang menunjukkan pewarnaan yang lebih kuat (++++) (Gambar 4).

5

Gambar 4. iNOS pada pulpa gigi manusia kontrol; kelompok selk-sel yang positif terhadap iNOS pada regio subodontoblastik, 20x (panah)

Kelompok B

Pada kelompok B, imunohistokimia menunjukkan bahwa MMP-2 diekspresikan lemah oleh

odontoblas (+). Sel-sel tersebut yang juga terdapat pada regio subodontoblas positif untuk

MMP-2 (+). Sel-sel sporadik menunjukkan bahwa imunoreaksi tersebar pada parenkim pulpa

(Gambar 5).

Gambar 5. MMP-2 pulpa gigi setelah 14 bulan traksi; sel-sel sporadic dan dinding pembuluh darah positif; (A) Imunohistokimia, (B) Analysis multispektral

Dinding pembuluh darah positif untuk MMP-2 (+ + +) (Gambar 6).

6

Gambar 6. MMP-2 pulpa gigi manusia setelah 14 bulan traksi; dinding pembuluh darah

positif, 10x (panah)

Imunoreaktivitas untuk MMP-9 terlokalisir pada endotelium atau dinding pembuluh

(Gambar 7)

Gambar 7. MMP-9 pulpa gigi manusia setelah 14 bulan traksi, sel-sel odonthelial positif, 20x (panah)

dan pada odontoblas (Gambar 8,9), di mana pewarnaan tampak sangat kuat (+ + + +).

7

Gambar 8. MMP-9 pulpa gigi manusia setelah 14 bulan traksi odontoblas positif, 20x (panah)

Gambar 9. MMP-9 pulpa gigi manusia setelah 14 bulan traksi odontoblas positif; (A) Imunohistokimia, (B) Analysis Multispektral, 40x.

Ekspresi iNOS lemah pada kebanyakan jaringan, dan reaktivitasnya sangat kuat pada dinding-dinding pembuluh (+ + + + +) (Gambar 10).

Gambar 10. iNOS pulpa gigi manusia setelah 14 bulan traksi, parenkim positif lemah, namun pewarnaan kuat pada dinding pembuluh darah. 10x (panah)

8

Pulpa tunggal dari gigi yang diekstraksi 6 bulan setelah akhir perawatan

Imunoreaktivitas sangat lemah untuk MMP-2 (+) (Gambar 11),

Gambar.11 MMP-2 pulpa gigi manusia setelah 24 bulan traksi, imunoreaktivitas sangat lemah. 10x

MMP-9 (Gambar 12),

Gambar.12 MMP-9 pulpa gigi manusia setelah 24 bulan traksi, semua struktur negatif, walaupun nilai positif pada beberapa pembuluh darah sangat lemah.10x.

dan iNOS (Gambar 13).

Gambar 13. iNOS pulpa gigi manusia setelah 24 bulan traksi; beberapa kelompok sel-sel positif sangat lemah

9

Analisis morfologi dari sampel sel-sel tersebut menunjukkan susunan pulpa yang

berubah. Vakuola dengan tepi yang tidak beraturan terlihat pada jaringan, dan morfologi ini

berhubungan dengan menghilangnya aktivitas remodelling dari enzim MMP-2 dan MMP-9.

Hasil dari analisis statistik diringkas pada Tabel 2. Analisis statistik mengindikasikan

bahwa ekspresi MMP-2 menunjukkan reduksi yang signifikan (P<.05) pada regio odontoblas

dan pada dinding pembuluh darah pulpa yang dirawat (pada bulan ke-14 dan 24 perawatan)

jika dibandingkan dengan kelompok kontrol, namun perbedaannya tidak signifikan pada

regio submukosa.

MMP-9 berkurang secara signifikan pada pulpa yang dirawat (pada bulan ke-14 dan

24 perawatan; P<.05) baik pada regio odontoblas maupun submukosa. Perbedaan ekspresi

iNOS antara sampel yang dirawat dan kontrol tidak signifikan pada daerah manapun yang

diteliti.

DISKUSI

Satu pasien menjadi subjek pencabutan gigi premolar 6 bulan setelah 24 bulan traksi

untuk mengurangi overjet (kamuflase ortodontik). Pasien ini menolak pencabutan premolar

pada awal perawatan. Akan tetapi, pada akhir perawatan pasien tidak puas dengan hasilnya

karena overjet-nya yang masih besar dan ia meminta perawatan ulang dengan pencabutan.

Kami ingin menggarisbawahi keganjilan kasus ini yakni dengan menginklusikan kasus ini

dalam penelitian kami, walaupun hal ini tergolong kasus yang unik. Jelas tidak mudah

mendapatkan pulpa dari gigi seseorang yang perawatannya sudah benar-benar tercapai.

Pasien ini merupakan kondisi khusus dan penelitian kami dilakukan menggunakan tiga pulpa

gigi yang telah disebutkan di atas di bawah kondisi berbeda.

Pada penelitian ini kami meneliti ekspresi dari enzim MMP-2, MMP-9, dan iNOS

pada pulpa yang dijadikan subjek perawatan ortodontik. Braket dipasang pada gigi, dan

kawat nikel-titanium dimasukkan pada slot/celah yang tepat dan diikat dengan karet elastik.

Semua sampel diberikan tindakan yang sama (walaupun untuk periode waktu yang berbeda)

dengan tujuan untuk mengurangi variabilitas dan menggunakan parameter dan kondisi

eksperimental yang sekonstan mungkin. Hasil klinisnya adalah kesejajaran gigi-geligi.

10

Kami mendasarkan penelitian pulpa gigi kami pada morfologi jaringan (pewarnaan

hematoksilin-eosin), pada imunoekspresi MMP-2, MMP-9, dan iNOS pada analisis data

multispektrum.

Seperti yang ditunjukkan pada hasil, metaloproteinase diekspresikan oleh pulpa gigi

sampai 14 bulan perawatan. Pulpa yang dijadikan subjek selama 24 bulan perawatan dan

diekstraksi 6 bulan setelah akhir perawatan mengekspresikan kadar MMP-2 dan MMP-9

yang sangat rendah, yang mengesankan suatu kondisi modifikasi metabolik. Hal ini diperkuat

oleh pengamatan morfologi, yang menunjukkan pulpa gigi dengan bukti adanya tanda-tanda

modifikasi struktural, ruang kosong di dalam sel-sel dan tidak ada regenerasi ECM (matriks

ekstraseluler).

Peneliti lainnya yang meneliti dampak dari traksi ortodontik terhadap pulpa gigi

memusatkan perhatiannya pada jaringan yang termineralisasi, misalnya, pengukuran

ketebalan dentin setelah perawatan. Mereka mengamati peningkatan ketebalan pre-dentin

yang berhubungan dengan puncak pergerakan gigi1,24 atau degenerasi odontoblas.25 Hasil

penelitian kami tidak sejalan dengan data dari peneliti lain yang melaporkan bahwa pulpa

yang dijadikan subjek perawatan ortodontik tidak menunjukkan perubahan metabolik apapun.

Akan tetapi, kemungkinan hasil tersebut ditujukan untuk perawatan ortodontik dengan

karakteristik yang berbeda (tekanan dan teknik ortodontik) serta untuk pergerakan gigi yang

berbeda. Meskipun demikian, data tersebut tidak menunjukkan adanya gangguan pulpa

sedangkan data kami menunjukkan adanya gangguan tersebut.

Semua penelitian yang dilakukan hingga saat ini tidak cukup menunjukkan bahwa

perawatan ortodontik dapat memicu kematian pulpa. Dengan demikian, diperlukan penelitian

lebih lanjut, dan menambah pulpa dan molekul yang terlibat dalam fisiologi jaringan pulpa

gigi dengan jumlah yang lebih besar dalam penelitian-penelitian selanjutnya. Dari sudut

pandang ini maka dapat dikatakan bahwa penelitian kami ini berkontribusi pada pemahaman

dampak dari perawatan ortodontik.

SIMPULAN

Reduksi ekspresi protein MMP-2 dan MMP-9 yang signifikan berhubungan dengan

lamanya perawatan ortodontik. Selain itu, sampel pulpa gigi yang diekstraksi 6 bulan

setelah akhir perawatan menunjukkan ekspresi MMP-2 dan MMP-9 yang sangat

11

rendah dan ciri-ciri morfologi yang berubah, yang mengesankan bahwa penurunan

aktivitas metaloproteinase setelah traksi ortodontik menunjukkan kesulitan bagi

regenerasi ECM dan restorasi struktur pulpa gigi.

Kerusakan yang disebabkan oleh traksi ortodontik tidak bisa pulih kembali.

Ekspresi iNOS, tipikal kondisi inflamasi, terlihat pada pulpa gigi kontrol dan pada

sampel yang diberikan tekanan ortodontik; aktivitas iNOS pada jaringan ini bisa

dijelaskan oleh karena adanya respons terhadap tekanan ekstraktif.

12

Tabel 1. Hasil Imunohistokimia

Tabel 2. Hasil Analisis Statistik

13