Estudio de caso 1: Evaluacin de la inocuidad del maz genticamente modificado resistente a los insectos, evento MON 810

Indice

Parte 3: Estudios de casos ............................................Error! Bookmark not defined. Estudio de caso 1: Evaluacin de la inocuidad del maz genticamente modificado resistente a los insectos, evento MON 810................................................................... 3 Prefacio..................................................................................................................... 5 Nota .......................................................................................................................... 5 Descripcin de la planta de ADN recombinante......................................................... 5 Descripcin de la planta hospedadora y su uso como alimento .................................. 6 Descripcin del organismo u organismos donantes .................................................... 6 Descripcin de la modificacin gentica.................................................................... 7 Caracterizacin de la modificacin gentica .............................................................. 9 Introduccin .......................................................................................................... 9 Caracterizacin molecular ................................................................................... 11 Modificacin de la expresin de la planta ............................................................ 13 El gen cry1a(b) y el nuevo carcter...................................................................... 14 Equivalencia entre la protena bacteriana y la producida en la planta ................... 15 Expresin ............................................................................................................ 17 Compuestos resultantes de la protelisis y metabolismo ...................................... 18 Estabilidad del inserto ......................................................................................... 19 Evaluacin de la posible toxicidad........................................................................... 20 Introduccin ........................................................................................................ 20 Especificidad de la protena ................................................................................. 20 Comparacin con bases de datos de toxinas ......................................................... 20 Toxicidad por dosis nica administrada por va oral a ratones.............................. 20 Contaminantes txicos potenciales ...................................................................... 21 Degradacin metablica en jugos gstricos e intestinales simulados .................... 21 Evaluacin de la posible alergenicidad .................................................................... 22 Anlisis de los componentes esenciales, evaluacin de metabolitos, elaboracin de alimentos y modificacin nutricional ....................................................................... 23 Introduccin ........................................................................................................ 23 Datos sobre la composicin ................................................................................. 23

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Prefacio El Organismo de Productos Alimenticios y Farmacuticos de los Estados Unidos finaliz el estudio del maz genticamente modificado resistente a los insectos, MON 810 en 1996. En 1997, Health Canada notific a Monsanto que el maz MON 810 estaba aprobado como alimento. Ambas autoridades de reglamentacin tomaron las decisiones habiendo estudiado exhaustivamente el maz MON 810 segn los principios internacionalmente aceptados para determinar la inocuidad de los alimentos derivados de plantas genticamente modificadas. El expediente del Organismo de Productos Alimenticios y Farmacuticos de los Estados Unidos se encuentra en el Apndice 1 y en el Apndice 2 el de Health Canada. Monsanto Canada Inc. present la descripcin de la nueva variedad, del organismo u organismos donantes, los mtodos de modificacin gentica y la caracterizacin. La nueva protena se identific, se caracteriz y se compar con la protena bacteriana original, se incluy asimismo una evaluacin de la toxicidad potencial. Se presentaron tambin publicaciones cientficas y la informacin de los ensayos de campo controlados efectuados en Canad y en los Estados Unidos en 1995 y 1996. En esta publicacin se incluyen citas textuales del expediente presentado ante Health Canada que se encuentran entre comillas. Nota Monsanto Canada Inc. ha permitido que se utilice la informacin de la solicitud reglamentaria del maz MON 810 como herramienta de capacitacin. Sin embargo, es necesario recordar que, para utilizar el estudio de caso como herramienta de capacitacin, hemos hecho uso de ciertas licencias con respecto a la informacin proporcionada en las solicitudes originales. Ciertas partes se han condensado en resmenes y la informacin presentada es slo una parte de la solicitud original. El estudio de caso no constituye de ninguna manera una solicitud completa y tampoco debe considerrselo como una evaluacin de inocuidad exhaustiva. La utilizacin de la informacin aqu presentada como herramienta de capacitacin no refleja necesariamente su aprobacin ni tampoco la del producto. Tampoco implica juicio alguno sobre las solicitudes originales. Descripcin de la planta de ADN recombinante El maz MON 810 contiene una parte del gen cryIA(b) de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 que codifica una protena endotoxina delta activa que se expresa en el tejido del maz. La plaga objetivo es el taladro o barrenador del maz; Ostrinia nubilalis, una plaga importante que se alimenta de los tejidos de la planta dandolos. Los tejidos atacados varan segn el nmero de generaciones de Ostrinia nubilalis. Las larvas daan a) las hojas de las que se alimentan, b) los tallos en los que cavan tneles, c) la vaina foliar y el cuello de los que se alimentan y d) la mazorca o choclo. Ostrinia nubilalis altera la translocacin de nutrientes y de agua, provoca la aparicin de enfermedades infecciosas secundarias, causa el vuelco de los tallos, la cada de la mazorca o choclo y daos al grano. Las prdidas anuales de rendimiento del cultivo se estiman entre un 5 y un 10%. La variedad se obtuvo de la siguiente manera. Varias compaas de semillas recibieron semillas F1 de maz MON 810 con el genotipo transformado Hi-II cruzado con varias lneas endogmicas lite. El genotipo lite modificado se recuper cruzando la progenie obtenida con el progenitor endogmico recurrente. Las pruebas de hbridos se efectuaron con el

progenitor endogmico modificado obtenido luego de varios ciclos de autofecundacin. La cantidad de semillas progenitoras para producir semillas hbridas comerciales se aument por autofecundacin. La semilla hbrida de la variedad resistente a los insectos es heterocigtica para el gen cryIA(b) ya que alcanza con que un progenitor endogmico posea el gen para que el fenotipo resistente a los insectos se manifieste en la progenie hbrida. Si bien el maz MON 810 es una variedad forrajera que se destina principalmente a piensos, en algunos casos se utiliza como alimento para consumo humano aunque no es una variedad de maz dulce. El maz MON 810 puede utilizarse, por ejemplo, molido en seco o con un cierto contenido de humedad para elaborar productos a base de maz para consumo humano. Los usos previstos para el maz MON 810 son los mismos que los de otros hbridos forrajeros. Descripcin de la planta hospedadora y su uso como alimento La planta hospedadora es una lnea hbrida de Zea mays de la familia del Mo17X (Hill X B73) que se ha utilizado durante largo tiempo principalmente como pienso ya que no es una variedad de maz dulce sino forrajero. Zea mays L. se ha cultivado durante ms de 8000 aos en Mjico y Amrica Central. Durante el transcurso del ltimo siglo se han registrado aumentos del rendimiento y el rea geogrfica donde se planta esta especie verstil y con gran capacidad de adaptacin se ha expandido debido al desarrollo de hbridos, a los programas de mejoramiento y al uso de fertilizantes. Hoy en da el maz se planta en todos los continentes habitados. En la dcada de los aos treinta, antes de comenzar con los programas de hibridacin, el rendimiento era de 1,3 toneladas por hectrea (h.). En la actualidad, el rendimiento mximo registrado es de 123,5 toneladas/h (con un promedio de aproximadamente 3,73 toneladas por acre en los Estados Unidos). En el ao 2000 la produccin mundial de maz se estima en 648 millones de toneladas. El maz se utiliza para diversos fines y en muchos productos. En varias regiones del mundo es un alimento bsico. Tambin se utiliza en productos elaborados, por ejemplo fculas, alcohol, aceite, para piensos y para producir etanol, un combustible renovable. Descripcin del organismo u organismos donantes En el maz MON 810 se insert el gen cryIA(b) que codifica la protena CryIA(b), una endotoxina delta que confiere a la planta resistencia a plagas de insectos lepidpteros. Este gen se obtiene de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki (B.t.k.) cepa HD-1. Las especies de este gnero de bacterias gram positivas que esporulan, producen una protena cristalina que posee propiedades insecticidas. Estas especies tienen una larga trayectoria de uso comercial para el control de plagas. Cada cepa de Bacillus thuringiensis posee propiedades insecticidas especficas:

Bacillus thuringiensis israelensis para dpteros (familias Culicidae y Simuliidae) Bacillus thuringiensis sandiego y tenebrionis para colepteros (Leptinotarsa decemlineata, Pyrrhalta luteola, Tenebrio molitor)

Bacillus thuringiensis kurstaki, thuringiensis, sotto y aizawai para lepidpteros (Ostrinia nubilabis (Hb.), Phlegethontius quinquemaculatus, Porthetria dispar; Lymantria d., Trichoplusia ni, Heliothis virescens (F.), Heliothis armigera (Hb.)).

Los cristales de endotoxina delta se forman cuando la bacteria esporula. La protena es insoluble a pH neutro o cido, pero es soluble en el pH bsico del estmago de las larvas de los insectos donde se activa con las proteasas estomacales. La protena activada (sin el terminal carboxilo y aproximadamente a 28 aminocidos desde el extremo amino, de aproximadamente 600 aminocidos) penetra la membrana peritrfica por difusin hasta el epitelio del intestino medio cuya superficie contiene receptores especficos de alta afinidad a los que se acopla. Luego se inserta en la membrana y forma poros especficos para iones (los insectos de otras especies distintas a la especie objetivo, las aves, los mamferos y los peces no poseen este tipo de receptores). Estos poros permiten el pasaje del contenido intracelular al lumen del intestino y de agua a las clulas del epitelio intestinal provocando hinchazn y lisis. El intestino se paraliza causando trastornos en la digestin, el insecto deja de alimentarse y muere. En el expediente que present la empresa se prueba que la protena del maz MON 810 resistente a los insectos es idntica a la que produce Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1, que controla las plagas de insectos mediante cristales de una endotoxina delta. El Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki se ha utilizado como agente microbiano para control de plagas durante varios aos y se ha probado que las protenas de Bacillus thuringiensis naturales casi no presentan toxicidad para peces, aves, mamferos y otras especies distintas de la especie objetivo... no se espera que la comercializacin de estos maces cause efectos adversos en la fauna salvaje. Solo los insectos lepidpteros son susceptibles a las propiedades insecticidas de la protena CryIA(b). De los dieciocho insectos estudiados solo siete son sensibles a la protena ... y todos ellos son lepidpteros. La presencia de receptores en los insectos objetivo explica la especificidad de la protena. No se espera que la actividad selectiva de la endotoxina de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki altere las poblaciones de insectos que generan beneficios o de otros animales distintos al objetivo (por ejemplo, aves o peces). Segn los ensayos y estudios (citados en la literatura cientfica), la documentacin de registro y las evaluaciones de inocuidad de los registros, por ejemplo de DIPEL, los pesticidas microbianos disponibles comercialmente no son txicos para mamferos, aves, peces e insectos distintos del objetivo que generan beneficios, incluidos los predadores y parsitos de las plagas de insectos lepidpteros y de la abeja melfera. Descripcin de la modificacin gentica EL ADN del plsmido se introdujo en el tejido vegetal mediante bombardeo con microproyectiles (o transformacin biolstica). La tcnica consiste en precipitar el ADN sobre la superficie de partculas microscpicas de tungsteno u oro utilizando cloruro de calcio o espermidina. Luego se coloca una gota de las partculas recubiertas sobre un macroportador plstico que se acelera a alta velocidad mediante una explosin de plvora a travs de un barril. Una placa de plstico especialmente diseada detiene la trayectoria del macroportador y permite que las partculas recubiertas de ADN continen su trayectoria penetrando las clulas vegetales. Dentro de la clula, el ADN se deposita y se incorpora al cromosoma. Las clulas se incuban en un medio de cultivo con 2,4-D que promueve la formacin de callos. El

ADN de las clulas modificadas contiene genes que codifican la resistencia al glifosato. Estos genes permiten seleccionar las clulas modificadas cultivndolas en presencia de glifosato. En la transformacin biolstica se utilizaron dos plsmidos, PV-ZMBK07 (Figura 1) que contiene el gen cryIA(b) y PV-ZMGT10 (Figura 2) que contiene dos genes marcadores utilizados para la seleccin en medios con glifosato: el gen de la 5-enolpiruvil-siquimato-3fosfato sintetasa de la cepa CP4 y el gen de la glifosato oxidoreductasa. En los Cuadros 1 y 2 se describe el ADN de los plsmidos. El maz MON 810 slo contiene una parte del vector plsmido PV-ZMBK07 y los genes marcadores no estn presentes en la construccin final del MON 810. En el Captulo 3 se detallan los mtodos utilizados para efectuar estas constataciones. "Se cree que los genes que permiten seleccionar las clulas cultivadas en presencia de glifosato se incorporan inicialmente al ADN del genoma de la planta pero luego se pierden en los retrocruzamientos porque en el cruzamiento se segregan los genes que se integran en loci distintos al del gen cryIA(b)." Si bien ambos plsmidos contienen el gen bacteriano que codifica la neomicina fosfotransferasa II controlado por su propio promotor bacteriano que se emple como marcador selectivo para crear el plsmido, se demostr que este gen no se encuentra presente en el maz MON 810. Cuadro 1. ADN del plsmido PV-ZMBK07 (ver Figura 1). Secuencia gentica E35S Intrn hsp 70 cryIA(b) NOS 3' lacZ Tamao (Kb) 0,61 0,80 3,46 0,26 0,24 Funcin Promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada. Intrn del gen que codifica la protena de choque trmico del maz (hsp70) que aumenta el grado de transcripcin del gen. Gen que codifica la protena CryIA(b). Regin 3 sin traducir del gen de la nopalina sintetasa que indica la finalizacin de la transcripcin y rige la poliadenilacin. Secuencia de codificacin parcial de lacI de E. coli, el promotor Plac y una secuencia de codificacin parcial de la -Dgalactosidasa o la protena lacZ del vector pUC119. Origen de replicacin de los plsmidos pUC que permite la replicacin del plsmido en E. coli. Gen que codifica la enzima neomicina fosfotranferasa tipo II que confiere resistencia a los antibiticos aminoglucsidos y por lo tanto permite seleccionar las bacterias que contienen el plsmido.

ori-pUC nptII

0,65 0,79

Cuadro 2. ADN del plsmido PV-ZMGT10 (ver Figura 2). Secuencia gentica Tamao (Kb) Funcin

Secuencia gentica E35S Intrn hsp 70 CTP2

Tamao (Kb) 0,61 0,80 0,31

Funcin Promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada. Intrn del gen que codifica la protena de choque trmico del maz (hsp70) que aumenta el grado de transcripcin del gen. Pptido de trnsito al cloroplasto 2 aislado del gen de la 5enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de Arabidopsis thaliana cuya funcin es dirigir la protena 5-enolpiruvil-siquimato-3fosfato sintetasa de la cepa CP4 al cloroplasto, donde se efecta la sntesis de aminocidos aromticos. Gen que codifica la 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4, aislado de Agrobacterium sp cepa CP4 que permite seleccionar las clulas modificadas cultivadas en presencia de glifosato. Pptido de trnsito al cloroplasto 1 aislado de una pequea subunidad del gen que codifica la ribulosa 1,5 bifosfato carboxilasa (SSU1A) de Arabidopsis thaliana cuya funcin es dirigir la protena de la glifosato oxidoreductasa al cloroplasto, donde se efecta la sntesis de aminocidos aromticos. Gen que codifica la glifosato oxidoreductasa, enzima que metaboliza el glifosato, aislado de Achromobacter sp. (nuevo gnero Ochrobactrum anthropi) cepa LBAA. Regin 3 sin traducir del gen de la nopalina sintetasa que indica la finalizacin de la transcripcin y rige la poliadenilacin. Secuencia de codificacin parcial de lacI de E. coli, el promotor Plac y una secuencia de codificacin parcial de la -Dgalactosidasa o la protena lacZ del vector pUC119. Origen de replicacin de los plsmidos pUC que permite la replicacin del plsmido en E. coli. Gen que codifica la enzima neomicina fosfotranferasa tipo II que confiere resistencia a los antibiticos aminoglucsidos y por lo tanto permite seleccionar las bacterias que contienen el plsmido.

CP4 EPSPS

1,4

CTP1

0,26

gox

1,3

NOS 3' lacZ

0,26 0,24

ori-pUC nptII

0,65 0,79

Segn los resultados obtenidos en los experimentos de transformacin del maz, la frecuencia de obtencin de transformantes tolerantes al glifosato aumenta si se utilizan ambos marcadores de seleccin de origen vegetal. El plsmido PV-ZMBK07 tiene 7794 pares de bases y el PV-ZMGT10 tiene 9427 pares de bases.Caracterizacin de la modificacin gentica Introduccin Entre las tcnicas empleadas para efectuar la caracterizacin molecular del maz MON 810 se incluyen el Southern blot y el Western blot. Utilizando los mapas de los plsmidos se identificaron los nuevos genes posibles y los productos gnicos potenciales del maz MON 810 que se resumen en el Cuadro 3. Cuadro 3. Posibles genes nuevos y productos gnicos potenciales en el maz MON 810.

Gen nuevo PV-ZMBK07 cryIA(b)

Producto gnico nuevo

Secuencia reguladora

Otras secuencias de ADN

Gen Bt

El promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada (0,6Kb) controla la secuencia y un intrn de 0,8 KB del gen que codifica la protena de choque trmico del maz aumenta la transcripcin gnica. Una secuencia de terminacin de 0,24 Kb de la regin 3 sin traducir del gen de la nopalina sintetasa que se encuentra adjunta al gen cry enva las seales de poliadenilacin del ARNm. La bacteria controla el promotor que est unido a la regin 3 sin traducir del gen de la nopalina sintetasa Seguido del origen de replicacin de los plsmidos pUC de 0,7 Kb que permite la replicacin de los plsmidos en E. coli.

lacZ-alpha

Betagalactosidasa. Un poliligador (regin con mltiples sitios de clonacin) que permite clonar los genes deseados en el vector plsmido.

nptII (marcador para la seleccin durante la creacin del plsmido derivado del transposn procariota Tn5).

Neomicina fosfotransferasa Resistencia a antibiticos aminoglucsidos (por ejemplo kanamicina y neomicina)

Cuenta con su propio promotor bacteriano.

PV-ZMGT10 Gen de la glifosato oxidoreductasa clonado de Achromobacter sp. cepa LBAA La glifosato oxidoreductasa es la enzima que metaboliza el glifosato. Degrada el glifosato convirtindolo en cido aminometilfosfonico y glioxilato. Unido al pptido de trnsito al cloroplasto 1 que dirige el gen al plasto. Derivado de una subunidad del gen que codifica la ribulosa 1,5 difosfato carboxilasa (SSU1A) de Arabidopsis thaliana. Controlado por las secuencias descritas del promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada, el intrn del gen que codifica la protena de choque trmico del maz y el

Gen nuevo

Producto gnico nuevo

Secuencia reguladora terminador de la regin 3 sin traducir del gen de la nopalina sintetasa.

Otras secuencias de ADN

Gen que codifica la 5-enolpiruvilsiquimato-3fosfato sintetasa de la cepa CP4 aislado de Agrobacterium sp. cepa CP4 resistente al glifosato

5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintetasa

Unido al pptido de trnsito al cloroplasto 2. Aislado de la 5enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de Arabidopsis thaliana. El tamao del gen y del pptido de trnsito al cloroplasto 2 es de aproximadamente 1,7 Kb. Controlado por las secuencias del promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada, el intrn del gen que codifica la protena de choque trmico del maz y el terminador de la regin 3 sin traducir del gen de la nopalina sintetasa.

Tambin contiene los genes lacZalpha, el origen de replicacin de los plsmidos pUC que permite la replicacin del plsmido en E. coli. y el que codifica la enzima neomicina fosfotranferasa tipo II descritos.

Caracterizacin molecular La caracterizacin molecular del ADN integrado se efectu determinando:

la cantidad de insertos (nmero de sitios de integracin en el genoma del maz), el nmero de copias (de cada gen del ADN integrado) y la integridad del inserto.

Estos parmetros se determinaron con Southern blot.

El maz MON 810 se compar con un maz control no transgnico (homlogo), el MON 818, que tambin pertenece a la familia del Mo17 X (Hi-II X B73). El MON 818 no contiene los genes que codifican las protenas 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4, la glifosato oxidoreductasa, ni la Cry1A(b) de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1. Cantidad de insertos El ADN extrado se digiri con NdeI, una enzima de restriccin, que no corta dentro de los plsmidos utilizados para crear el maz MON 810. En la Figura 3 se observa una nica banda a 5,5 Kb aproximadamente, por lo tanto el ADN del plsmido se encuentra en un solo sitio. Esta disposicin del ADN de los plsmidos se debe a que estos no tienen sitios de restriccin y la enzima corta fuera del ADN insertado, produciendo un fragmento que contiene el ADN insertado y algo de ADN genmico adyacente. Los insertos de ADN se ubican de forma aleatoria dentro de la secuencia del ADN de la planta y por lo tanto la distancia entre el ADN insertado y los sitios de restriccin de la enzima vara. Si hubiera ms de un sitio de insercin, al aadir una enzima de restriccin que slo corta fuera del inserto es probable que el tamao del fragmento que contiene el ADN insertado vare segn la distancia que hubiere hasta el sitio de restriccin de la NdeI. Por otra parte, si hubiera ms de un sitio de insercin, la transferencia Southern mostrara varias bandas. Composicin del inserto El maz MON 810 no contiene las secuencias que codifican la 5-enolpiruvil-siquimato-3fosfato sintetasa de la cepa CP4, la glifosato oxidoreductasa y el origen de replicacin de los plsmidos pUC, segn se demostr con estudios efectuados usando varias sondas. Sin embargo, el fragmento de restriccin obtenido con NdeI de 5,5Kb contiene las secuencias que codifican la neomicina fosfotranferasa tipo II, el promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada, el intrn del gen que codifica la protena de choque trmico del maz y la cryIA(b). cryIA(b) El ADN se digiri con una mezcla de NcoI y EcoRI. Entre los fragmentos resultantes se seleccion el que contiene el gen cryIA(b) que se analiz con la transferencia Southern. En los resultados se observa un fragmento de aproximadamente 3,1 Kb (Figura 4), que alcanza para codificar la protena CryIA(b) con propiedades insecticidas". Si bien en el control de hibridacin positiva (faja 1 Figura 4) se observa un fragmento de 3,46 Kb, que corresponde al tamao esperado del gen cryIA(b), en el ADN del maz control MON 818 (faja 2) no se observa ninguna banda. En el ADN del maz MON 810 se observa una banda de aproximadamente 3,1 Kb. El fragmento del gen cryIA(b) integrado al maz MON 810 codifica la protena resistente a la tripsina de 63 kDa (Figuras 5 y 6), segn se comprob con la transferencia Western. Estos resultados y la eficacia del maz MON 810 permiten afirmar que el gen cryIA(b) codifica una protena CryIA(b) con propiedades insecticidas que protege a la planta de maz contra los ataques de Ostrinia nubilalis eficazmente durante todo el ciclo. Gen que codifica la 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 El ADN se digiri con una mezcla de NcoI y BamHI. Entre los fragmentos obtenidos se encuentra el del gen de de la 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4. Segn la transferencia Southern (Figura 7), el maz MON 810 no contiene el fragmento de 3,1 Kb (el tamao esperado del gen que codifica la 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4) que se encontr en la preparacin de gel con concentraciones conocidas de los

dos plsmidos. La protena de la 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 no se encontr en los tejidos foliares, de la planta en general o del grano, segn los resultados del ensayo ELISA. La transferencia Western confirma la ausencia de la protena en los extractos foliares (Figura 8, faja 9). Gen que codifica la glifosato oxidoreductasa Si el gen que codifica la glifosato oxidoreductasa estuviera presente, la digestin del ADN con una mezcla de NcoI y BamHI (NcoI a NcoI) producira el fragmento correspondiente que tendra aproximadamente 3,1 Kb. La transferencia Southern del maz MON 810 (Figura 7) indica la ausencia del gen que codifica la glifosato oxidoreductasa. El gen tampoco se detect en tejidos foliares analizados con el ensayo ELISA y con la transferencia Western (Figura 9, faja 8). Esqueleto del plsmido El esqueleto del plsmido (secuencias que codifican la neomicina fosfotranferasa tipo II y el origen de replicacin de los plsmidos pUC) se analiz digiriendo el ADN del maz MON 810 y del plsmido PV-ZMBK07 con una mezcla de NcoI y EcoRI. La transferencia Southern utilizando una sonda del gen que codifica la neomicina fosfotranferasa tipo II solo detect bandas en el ADN del plsmido a 2,5 Kb y 1,8 Kb, pero no se observ ninguna banda en el ADN del maz MON 810. Con el agregado de una sonda del gen que codifica el origen de replicacin de los plsmidos pUC, en la transferencia Southern se observ una banda 1,8 Kb en el ADN del plsmido (Figura 10) pero no se observ ninguna banda en el maz MON 810. De acuerdo con los resultados descritos, el ADN que se integr en el genoma del maz MON 810 contiene aproximadamente 4 Kb de ADN del plsmido PV-ZMBK07 compuesto de una porcin potenciada del promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada (que se cree contiene uno de los dos elementos potenciadores adems del promotor), todo el intrn del gen que codifica la protena de choque trmico del maz y 2448 pares de bases del gen cryIA(b) que est compuesto de 3468 pares de bases (Figura 11). No se encontr ADN del esqueleto del vector bacteriano (por ejemplo, del origen de replicacin de los plsmidos pUC), ni de los genes que codifican la neomicina fosfotranferasa tipo II, la glifosato oxidoreductasa o de la 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4. El expediente de la solicitud indica que el maz MON 810 contiene un fragmento de ADN integrado, que se encuentra en un fragmento de digestin con NdeI de 5,5Kb, dentro del cual se encuentra el promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada, el intrn del gen que codifica la protena de choque trmico del maz, y el gen cryIA(b). Los resultados de la transferencia Western demuestran que el maz MON 810 produce la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 de 63 kDa resistente a la tripsina. Integridad y actividad del gen CryIA(b) En el proceso de aceleracin de partculas el ADN del plsmido puede romperse, rotura que ocasiona la integracin de genes parciales en el ADN genmico. Segn se comprob con el Southern blot y con la secuencia de clonacin genmica, de los 3468 pares de bases del gen cryIA(b) solo se integraron al maz MON 810 los primeros 2448 pares de bases. Modificacin de la expresin de la planta El anlisis molecular del maz MON 810 indica que solo contiene el gen cryIA(b) del plsmido PV-ZMBK07 y que no contiene los genes que codifican la 5-enolpiruvil-siquimato-

3-fosfato sintetasa de la cepa CP4, la glifosato oxidoreductasa ni la neomicina fosfotranferasa tipo II y el origen de replicacin de los plsmidos pUC. No hay pruebas de que se hubiera insertado una parte del ADN del plsmido PV-ZMGT10. En el maz MON 810 se integr un fragmento de ADN ubicado en un fragmento de restriccin con NdeI de 5,5Kb, que contiene el promotor del virus del mosaico de la coliflor con la regin potenciadora duplicada, el intrn del gen que codifica la protena de choque trmico del maz, y el gen cryIA(b). El gen cry1a(b) y el nuevo carcter El gen que codifica la protena CryIA(b) se encuentra descrito en la literatura. Si bien los genes insertados en el maz MON 810 se han modificado con el fin de potenciar su expresin, la secuencia de aminocidos de la protena expresada es idntica a la protena natural de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki y tambin se ha comprobado que las propiedades insecticidas de uno y otro son equivalentes. El Cuadro 4 describe los productos gnicos del gen cryIA(b) insertado en el maz MON 810, tal como la empresa lo present en la solicitud. Cuadro 4. Productos gnicos en la planta modificada. Producto gnico Compuestos post desintegracin, subproductos y rutas metablicas Ingrediente activo: Pptido con tripsina Expresin Actividad del producto gnico en la planta Actividad del producto gnico en el medio ambiente Se degrada rpidamente en el suelo y con la digestin (excepto en lepidpteros)

Protena endotoxina delta CryIA(b)

Constitutiva

No afecta otras rutas metablicas

El Western blot se utiliz con el fin de:

evaluar los productos proteicos del gen parcial empleando anticuerpos especficos de las protenas de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki, compararlos con la protena normal que produce E. coli y con extractos de tejidos de otros maces resistentes a los insectos, buscar productos proteicos anmalos o inesperados (por ejemplo, los genes que codifican la 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 y la glifosato oxidoreductasa (Figuras 8, 9, y 12)) y determinar si la protena de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki expresada se poda convertir en el producto proteico del tamao esperado de 63 kDa resistente a la tripsina (Figuras 5 y 6).

El anlisis de las protenas de Bacillus thuringiensis del maz MON 810 y de los otros seis maces resistentes a los insectos (Figura 5, fajas 5 a 11) con la transferencia Western indican la presencia de varios productos proteicos, como ocurre habitualmente. En el maz MON

810, tal como se esperaba, no se encontr el gen completo porque en el genoma solo se incorpor una parte de la totalidad de los pares de bases que componen este gen ... En el maz MON 810 no se observaron diferencias aparentes en los rangos de tamao de los otros productos proteicos que no contenan todos los pares de bases . en comparacin con los otros seis maces resistentes a los insectos a los que se incorpor todo el gen cryIA(b). El peso molecular estimado de la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 obtenida a partir de una parte del gen cryIA(b) es de 92 kDa pero esta no se detecta probablemente debido al bajo grado de expresin o debido a que durante la extraccin se degrada rpidamente al producto resistente a la tripsina. Los resultados de la digestin con tripsina de los extractos proteicos de los siete maces indican que el ncleo de la protena es de 63 kDa aproximadamente (Figura 6). Excepto por la protena de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 incompleta, todas las otras protenas y los otros productos inmunoreactivos del maz MON 810 son similares a los de otros maces resistentes a los insectos. No se detectaron otros productos inesperados. Los resultados obtenidos con tripsina prueban que el trozo de gen cryIA(b) insertado en el maz MON 810 codifica eficazmente la protena de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 resistente a la tripsina. Equivalencia entre la protena bacteriana y la producida en la planta La cantidad de protena CryIA(b) necesaria para efectuar las pruebas, por ejemplo los ensayos de alimentacin, se obtuvo a partir de Escherichia coli con el gen de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki. Es decir que la equivalencia entre la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 producida en el maz resistente a los insectos se compar con la producida por E. coli. El grado de expresin de la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 en los maces resistentes a los insectos es extremadamente bajo. Por lo tanto, no es factible aislar a partir de plantas de maz la cantidad suficiente de esta protena para efectuar los mltiples estudios de inocuidad realizados para registrar el producto. En consecuencia se opt por aislar la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 activa funcionalmente a partir de un hospedador microbiano y verificar su equivalencia fsica y funcional en comparacin con la protena expresada en la planta. Se espera que una vez ingerida, la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 ntegra (~ 131 kDa) se convierta rpidamente en el ncleo de la protena resistente a la tripsina (~ 63 kDa) por lo cual se consider que esta ltima es un material de estudio adecuado para evaluar la primera. Se presentaron dos estudios. En uno de ellos, se compara la protena CryIA(b) de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 de DIPEL, un producto microbiano comercial, con las muestras de tejido foliar del maz 754-10-1. Los plsmidos de transformacin utilizados en el maz 754-10-1 y en MON 810 son los mismos, pero en el primero los grados de expresin de la protena son ms altos y por lo tanto se puede purificar mayor cantidad de protena para los estudios de equivalencia. El estudio prueba que el peso molecular y la reactividad inmunolgica del ncleo de la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 resistente a la tripsina del maz y el de E. coli son equivalentes. DIPEL y el maz 754-10-1 contienen una banda de protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 ntegra de aproximadamente 134 kDa y el mismo ncleo resistente a la tripsina de aproximadamente 63 kDa. La transferencia Western demuestra que el ncleo de la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 del maz 754-10-1 y del MON 810 son equivalentes y por lo tanto se concluy que la protena producida por E.coli es un sustituto adecuado de la protena del maz MON 810.

Los extractos vegetales, DIPEL, el producto microbiano comercial, y la preparacin que contiene la protena ntegra, utilizada en los estudios de toxicidad grave, contienen varios productos proteicos. En respuesta a una pregunta formulada a propsito de otros fragmentos presentes en la transferencia Western que reaccionan con las sondas de anticuerpos CryIA(b) y su significado se inform que no debera presentarse ningn problema ya que el estudio de toxicidad oral por una nica dosis debera haber incluido estos fragmentos. No se encontraron homologas de aminocidos entre las toxinas o alrgenos conocidos y los fragmentos que pudieran encontrarse en los tejidos de maz, excepto el del ncleo de la protena resistente a la tripsina de 28-610 aminocidos (1-28 y 611-11230). La comparacin de la secuencia completa de la protena CryIA(b) con la misma base de datos demuestra que no hay homologa con las toxinas o alrgenos conocidos. El proceso de digestin y sus consecuencias en la protena demuestran que esta se digiere rpidamente y DIPEL, el producto microbiano comercial, tambin contiene varios fragmentos. Los resultados de la transferencia Western en protenas tratadas con tripsina muestran la presencia de bandas equivalentes a la del ncleo de la protena de 63 kDa en ambas muestras. El tamao y la actividad del ncleo resistente a la tripsina del producto proteico en el maz MON 810 equivalen a los del ncleo resistente a la tripsina de la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki del maz 754-10-1. En un estudio ms reciente que el efectuado con el maz 754-10-1, se estableci la equivalencia directa entre las protenas bacterianas y las producidas en el maz MON 810 con la transferencia Western. La tcnica, que se diseo especficamente para protenas Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki, fue de mayor sensibilidad y permiti comparar los pesos moleculares aparentes de protenas con reactivad inmunolgica cruzada en mezclas complejas". El ncleo de la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 resistente a la tripsina se obtuvo de extractos foliares de varios maces resistentes a los insectos y de maces control que se digirieron con tripsina. Luego estos ncleos se compararon con el ncleo de la protena resistente a la tripsina de 63 kDa de E.coli y con la protena del maz de referencia MON 801. En el estudio se incluyeron los maces MON 810 y su homlogo el MON 818 La transferencia Western (Figura 6) muestra que tanto el maz MON 810 como el material de referencia bacteriano contienen una banda prominente en el mismo peso molecular para el. Tambin se constat la presencia de bandas ms pequeas que se presume pertenecen a otros fragmentos de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1. En todos los extractos (tanto de maces control como de los resistentes a los insectos) se observ una banda de 20 kDa que se cree que representa reactividad cruzada no especfica secundaria, sin relacin con la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1. Los resultados obtenidos indican claramente que la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 (es decir, el ncleo resistente a la tripsina) producida por E. coli es equivalente a la de los maces resistentes a los insectos la equivalencia determinada ... justifica la utilizacin de la informacin de inocuidad obtenida a partir de la protena producida por E. coli (lote #I92017) para probar la inocuidad de la expresada en los nuevos maces resistentes a los insectos."

Expresin El grado de expresin de las protenas CryIA(b), la 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4, la glifosato oxidoreductasa y la neomicina fosfotranferasa tipo II se determin en muestras de especmenes de maz resistente a los insectos (MON 810) y del control (MON 818) plantados en campos experimentales en los Estados Unidos. Los maces control (MON 818 y MON 819) no son maces genticamente modificados pero provienen de una familia gentica representativa de las sustancias en estudio. El maz MON 818 es el homlogo del MON 810. Las muestras de tejido foliar y del grano se recolectaron en seis campos experimentales distribuidos en la zona de los Estados Unidos donde se planta maz y constituyen una muestra representativa de las condiciones en las cuales los maces resistentes a los insectos se pudieran plantar comercialmente (dos en Illinois, dos en Iowa, uno en Indiana y uno en Nebraska). Las muestras de polen y de la planta entera se recolectaron una vez en un slo campo experimental (en Illinois). Las muestras de tejido foliar de todo el ciclo (recolectadas cada dos semanas) tambin se recolectaron del mismo campo experimental ubicado en Illinois. Los contenidos de las protenas Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD1, 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 y glifosato oxidoreductasa de todas las muestras excepto las de polen, se midieron con ensayos ELISA validados especficos para cada protena. En las muestras de polen, los contenidos de Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki se midieron con un ensayo ELISA, y los de 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 y de glifosato oxidoreductasa con una transferencia Western. En los tejidos foliares, de la semilla, de polen y de toda la planta los grados de expresin del gen cryIA(b) son bajos (Cuadro 5). Las protenas 5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4, glifosato oxidoreductasa y neomicina fosfotranferasa tipo II no se detectaron. El promedio de la expresin de protenas de los seis sitios es 9,35 g/g (peso hmedo) en tejido foliar y 0,31 g/g (peso hmedo) en semillas. En un sitio la expresin de protenas es 4,15 g/g (peso hmedo) en toda la planta y de 0,09 g/g (peso hmedo) en polen, valores obtenidos de una nica muestra. Los rangos de expresin de protenas son entre 7,93 y 10,34 g/g (peso hmedo) en tejido foliar, entre 0,19 y 0,39 g/g (peso hmedo) en el grano y entre 3,65 y 4,65 g/g (peso hmedo) en toda la planta. Las mediciones de los contenidos de Cry1A(b) en el tejido foliar recolectado a lo largo de todo el ciclo muestran que a medida que la planta crece, la expresin de la protena disminuye. Segn sostiene la empresa, no se espera observar especificidad del tejido ya que el gen cryIA(b) est controlado por un promotor del virus del mosaico de la coliflor. Este promotor es constitutivo y no est restringido por tejidos ni por el desarrollo y por lo tanto no se prev que se exprese especficamente en ciertos tejidos en particular, aunque el promotor del virus del mosaico de la coliflor puede ser ms o menos activo segn el tipo celular, como se constata con la distribucin de las protenas CryIA(b) en los distintos tejidos. No se esperaba encontrar y no se encontr especificidad o inducibilidad segn el estadio de desarrollo, debido a que el promotor del virus del mosaico de la coliflor es un promotor constitutivo y no uno inducible. Cuadro 5. Grado de expresin de las protenas en tejidos del maz MON 8101. Tejido Media Desviacin estndar Rango

Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1

Tejido Hoja Tejido foliar de todo el ciclo2 Polen Toda la planta3 Grano

Media 9,35 9,78, 8,43, 4,91 0,09 4,15 0,31

Desviacin estndar 1,03

Rango 7,93-10,34

0,71 0,09

3,65-4,65 0,19-0,39

5-enolpiruvil-siquimato-3-fosfato sintetasa de la cepa CP4 Hoja, tejido foliar de todo el ciclo, toda la planta, grano Sin medir -

Glifosato oxidoreductasa Hoja, tejido foliar de Sin medir todo el ciclo, toda la planta, grano 1 Expresados en g/g (peso hmedo), salvo que se indique lo contrario. La media, la desviacin estndar y el rango se calcularon con los seis sitios del muestreo, salvo que se indique lo contrario. Consultar las otras notas para aquellas muestras que se recolectaron en un solo sitio. 2 Medias de las tres recolecciones de muestras independientes efectuadas con intervalos de dos semanas entre una y otra. 3 La media y la desviacin estndar se calcularon de un solo sitio. Los resultados del Western blot de muestras de polen (Figura 12) prueban que el gen que codifica la glifosato oxidoreductasa no se expresa en el maz MON 810 (faja 11). En la evaluacin de alimentos genticamente modificados, la expresin en la parte del vegetal que se consume, el grano en el caso del maz, es lo ms importante. El grado de expresin de la nueva protena en el grano de maz es entre 0,19 y 0,39 g/g peso hmedo. En el maz MON 801, uno de los maces empleados en esta prueba, se estudio el grado de expresin de la neomicina fosfotranferasa tipo II codificada por el gen correspondiente que est controlado por el promotor bacteriano especfico. El promotor no se encuentra activo y por lo tanto en la clula vegetal el gen no expresa la protena. Compuestos resultantes de la protelisis y metabolismo En los vegetales la protelisis de la CryIA(b) no produce compuestos especficos. El pH bsico del estmago del insecto solubiliza la protena y las proteasas la cortan. Uno de los productos resultantes de la accin de las proteasas es la endotoxina activa ... En las clulas vegetales que expresan el gen cryIA(b), la transferencia Western de las protenas de Bacillus thuringiensis generalmente revela la presencia de varios polipptidos. Estos son productos de la protelisis que se liberan como resultado de la accin de las proteasas tanto in planta como durante la extraccin."

Estabilidad del inserto La eficacia del maz MON 810 se mantiene durante varias generaciones incluso luego de haber efectuado cruzamientos con otros genotipos. La caracterizacin molecular del maz MON 810 se efectu luego de la tercera generacin de autofecundacin y por lo tanto el nico inserto est integrado de forma estable. El estudio de la segregacin (Cuadro 6) indica que hay un nico inserto activo del gen cryIA(b) regido por los principios mendelianos. Cuadro 6. Segregacin en la progenie del maz MON 810. Generacin Descripcin Real Esperada Chi cuadra do 0,044* 1,786*

BC0F11 BC1F12

Progenie de R0 x una lnea endogmica. Progenie de BC0F1 x la misma lnea endogmica utilizada en el cruzamiento de la R0.

44:47 10:4

45,5:45,5 7:7

Progenie Progenie de BC0F2 x un maz no 69:181:77 81,75:163,5:81,75 4,138# BC1F2 3 transgnico probado. 1 Expresado como el nmero de plantas que expresan la caracterstica: nmero de plantas que no expresan segn el ensayo de alimentacin de Ostrinia nubilalis. 1 Expresado como el nmero de plantas que expresan la caracterstica: nmero de plantas que no expresan segn el ensayo ELISA de CryIA(b). 3 Expresado como nmero de filas de la mazorca con nmero homocigtico de plantas que expresan la caracterstica: nmero de filas de la mazorca en plantas que segregan: nmero de filas de la mazorca en plantas que pueden ser homocigticas segn el ensayo de alimentacin con Ostrinia nubilalis. *Insignificante p=0,05 (2 = 3,94, 1 gl); # insignificante p=0,05 (2= 5,99, 2 gl). Se comprob que el gen cryIA(b) permanece estable durante siete generaciones de cruzamiento con un progenitor recurrente (B73) y durante seis generaciones de cruzamiento con un segundo progenitor endogmico sin relacin alguna (Mo17) (Cuadro 7.) Las distribuciones chi cuadrado de las retrocruzas con B73 y Mo17 obtenidas concuerdan con las esperadas. Cuadro 7. Estabilidad de la transferencia del gen segn la informacin de segregacin obtenida de derivados de retrocruzamiento entre MON 810 y dos lneas endogmicas sin relacin alguna (B73 y Mo17). Generacin1 BC6F1 (B73) Real 8:13 Esperada 10.5:10.5 2 0,762*

BC5F1 (Mo17) 11:11 11:11 0,045* 1 Expresado como el nmero de plantas que expresan la caracterstica: nmero de plantas que no la expresan segn el ensayo ELISA de CryIA(b). *Insignificante p=0,05 (2= 3,84, 1 gl).

Evaluacin de la posible toxicidad Introduccin La mayora de los estudios no se efectuaron con la protena producida por la planta sino con el ncleo resistente a la tripsina con propiedades insecticidas producido por E.coli. Las protenas producidas por E.coli que se probaron son idnticas del punto de vista qumico y funcional a las protenas producidas por la planta (ver apartado 4.1.1.). La caracterizacin de la protena CryIA(b) y los resultados de la degradacin metablica en jugos gstricos e intestinales simulados se utilizan para establecer algunos principios de inocuidad. Especificidad de la protena La protena CryIA(b) en su forma cristalina es insoluble en soluciones acuosas a pH neutro o cido. Sin embargo, se solubiliza en el medio bsico del estmago de las larvas donde las proteasas la activan. La protena activada penetra por difusin a travs de la membrana peritrfica del epitelio del intestino medio. Se une a receptores de superficie de alta afinidad causando cambios en los contenidos de electrolitos y en el pH que paralizan el estmago. El insecto deja de alimentarse y se muere. La superficie de las clulas intestinales de los mamferos no contiene receptores similares para las endotoxinas delta de las especies de Bacillus thuringiensis. Los mamferos, por lo tanto, no son susceptibles a estas protenas. Por otra parte, varios estudios de inocuidad de las protenas de Bacillus thuringiensis indican que no poseen efectos nocivos para el ser humano. Comparacin con bases de datos de toxinas La secuencia de aminocidos de la protena CryIA(b) se compar con la de las toxinas proteicas conocidas porque si hubiera alguna similitud se deben efectuar las pruebas toxicolgicas pertinentes a fin de estudiar el impacto potencial de la homologa. La secuencia de la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 se compar con las secuencias de aminocidos de 2.632 toxinas que se encuentran almacenadas en bases de datos genticas pblicas (GenBank, EMBL, PIR y Swiss Prot). La protena es homloga a las protenas cristalinas con propiedades insecticidas de Bacillus thuringiensis, pero no se encontraron homologas de aminocidos con otras toxinas proteicas. La secuencia ms similar se encuentra en la Figura 14. Toxicidad por dosis nica administrada por va oral a ratas El estudio de toxicidad oral por dosis nica (de 7 das) se efectu con ratas de laboratorio a las que se administr la protena producida por E.coli (convertida al ncleo resistente a la tripsina) de pureza, potencia y estabilidad conocidas. La protena se administr con una sonda en dosis de 0, 400, 1.000 y 4.000 mg/kg. La dosis ms alta equivale al concepto de dosis mxima peligrosa segn las US Subdivision M Guidelines for biochemical pesticides (Guas para pesticidas bioqumicos de los Estados Unidos). Al grupo control se administr una dosis de 4.000 mg/kg de albmina srica bovina, un control proteico. No se observaron efectos nocivos relacionados con el tratamiento (Cuadro 8) y no se constataron diferencias estadsticas en peso corporal o en la ingesta de alimento. Tampoco se observaron patologas claras entre los distintos grupos. La concentracin letal media de la

protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 (truncada) en ratas es superior a 4.000 mg/kg con el nivel sin efectos (adversos) observados fijado en ese valor. Cuadro 8. Resultados del estudio de toxicidad por dosis nica de CryIA(b) administrada por va oral a ratas. Grupo Vehculo control (buffer) Control (albmina srica bovina 4.000*) 400 protena Bacillus thuringiensis 1.000 protena Bacillus thuringiensis 4.000 protena Bacillus thuringiensis [hembras] *mg/kg peso vivo Peso inicial (g) 31,1 [25,5] 31,1 [25,4] 31,1 [25,4] 31,0 [25,3] 31,0 [25,5] Peso final (g) 30,8 [25,1] 31,0 [24,7] 30,5 [25,2] 31,1 [25,0] 30,5 [25,5] Ingesta de alimento (media g/da) 5,3 [6,4] 6,2 [7,3] 5,3 [8,0] 5,3 [8,0] 5,5 [8,0/7,4]

Contaminantes txicos potenciales En respuesta a solicitudes de informacin sobre los posibles cambios en los contenidos de contaminantes provocados por la introduccin del gen cryIA(b), la empresa indica que no se detectaron aflatoxinas en el maz MON 810 del ensayo de campo de 1993 y por lo tanto el anlisis no se repiti. Las semillas de cereales no contienen 2,4-dihidroxi-7-metoxi-1,4-benzoxacin-3-ona, por lo tanto este compuesto no es un peligro para los consumidores de productos a base de cereales. Degradacin metablica en jugos gstricos e intestinales simulados En jugos digestivos simulados, la protena CryIA(b) purificada (Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 expresada en E. coli) se degrada rpidamente in vitro. La transferencia Western prueba que ms del 90% de la protena se degrada en dos minutos (Figura 15). Las fajas 6 a 11 son incubaciones de 0, 10, 20, 30, 60 y 120 segundos. La bioactividad de la protena se midi con un bionensayo en insectos. La protena se degrada rpidamente: entre el 74 y el 90% de la protena aadida se degrada en dos minutos (Cuadro 9), el menor intervalo de tiempo medido. En el estmago humano, aproximadamente el 50% de los slidos ingeridos pasan al intestino en dos horas y los lquidos en aproximadamente 25 minutos. En jugos intestinales simulados se comprob con el Western blot que luego de 19 horas y media la protena purificada Cry1A(b) no se degrada significativamente (Figura 16, las fajas 8 a 11: incubaciones de 0, 60 minutos, 4 horas y 19 horas y media). Los resultados obtenidos en el ensayo con insectos son similares (Cuadro 10). Estos resultados eran previsibles ya que el ncleo con tripsina de las protenas Bacillus thuringiensis con propiedades insecticidas es

relativamente resistente a las proteasas con serina como la tripsina, una de las proteasas clave del jugo intestinal. En los ensayos con insectos se emple Heliothis virescens (F.). Cuadro 9. Prdida de la actividad insecticida de la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1en jugos gstricos simulados. Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 (G/nL) 0,75 7,5 75 Mortalidad de Heliothis virescens (F.) 0 2 minutos % de cambio

29 69 94

3 8 24

-90 -88 -74

Cuadro 10. Prdida de la actividad insecticida de la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 en jugos intestinales simulados. Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 (G/nL) 0,75 7,5 75 Mortalidad de Heliothis virescens (F.) 0 19 horas y media % de cambio

26 76 100

25 61 90

-4 -20 -10

Evaluacin de la posible alergenicidad El ser humano consume diariamente grandes cantidades de protenas y las alergias son raras. Es necesario considerar si la fuente del gen que se introduce en la planta es alergnico. No se conocen alergias causadas por Bacillus thuringiensis. "En ms de 30 aos de utilizacin comercial del Bacillus thuringiensis no existen casos documentados de alergias y tampoco se conocen alergias asociadas a la elaboracin de productos elaborados a partir de l. Por otra parte, los alrgenos deben permanecer estables ante las condiciones cidas del sistema digestivo durante la digestin pptica y con tripsina, de lo contrario no pueden alcanzar y atravesar la mucosa intestinal y provocar una respuesta alrgica. Los estudios efectuados demuestran que la protena CryIA(b) no sobrevive a la digestin con jugos gstricos simulados. Otra caracterstica de las protenas alergnicas es que se presentan en altas concentraciones en los alimentos (por ejemplo los alrgenos en la leche, soja o cacahuetes). La concentracin de la protena CryIA(b) no es alta, el contenido en el grano de maz es entre 0,19 y 0,39 g/g peso fresco. La empresa sostiene que la comparacin de las secuencias de aminocidos con las de alrgenos y gliadinas conocidas sirve de primera aproximacin para evaluar la alergenicidad potencial o las posibles asociaciones con la enfermedad celaca. Se buscaron secuencias similares a las de la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 en 219 secuencias de protenas asociadas con alergias y con la enfermedad celaca obtenidas de las

bases de datos genticas (GenBank, EMBL, PIR y Swiss Prot). La mayora . de los alrgenos alimentarios se han estudiado y se ha construido el mapa gentico de los eptopos de muchas protenas alrgenas que se unen a la IgE. El tamao ptimo para la unin de la cadena pptica es entre 8 y 12 aminocidos. Aparentemente los eptopos de las protenas alrgenas y los fragmentos pptidicos mediados por clulas T tienen por lo menos 8 aminocidos. Las secuencias de los eptopos se conservan con exactitud en alrgenos homlogos de especies muy dispares ... las secuencias importantes del punto de vista inmunolgico son, por definicin, de al menos 8 aminocidos contiguos idnticos. No se encontraron homologas significativas del punto de vista biolgico ni similitudes en las secuencias significativas del punto de vista inmunolgico. La Figura 17 contiene la secuencia ms similar encontrada. De acuerdo con los resultados obtenidos, la protena Bacillus thuringiensis subespecie kurstaki cepa HD-1 no contiene similitudes significativas con otras protenas alrgenas o gliadinas conocidas. En resumen, las bajas concentraciones de la protena en el maz, la labilidad digestiva y la falta de homologa con secuencias alergnicas conocidas, indican que la protena no posee propiedades alergnicas. Adems, se ha empleado como agente microbiano de control que no causa alergias durante varios aos. Por lo tanto no hay motivos para creer que la protena CryIA(b) pueda presentar riesgos de alergias significativos asociados al consumo de productos elaborados a partir de maz resistente a los insectos. Anlisis de los componentes esenciales, evaluacin de metabolitos, elaboracin de alimentos y modificacin nutricional Introduccin La informacin nutricional es importante para determinar la exposicin diettica de los productos elaborados a base de maz. Si bien el ser humano consume poco maz en grano o maz elaborado directamente, consume alimentos elaborados a base de maz, por ejemplo, fcula o aceite de maz. Datos sobre la composicin La composicin se determin al mismo tiempo que el grado de expresin de la protena en el grano del maz, en muestras que se recolectaron el mismo da en los seis campos experimentales. A continuacin se enumeran los parmetros medidos en las muestras de granos de MON 810 y del control MON 818, los que se compararon con los valores citados en la literatura: Composicin aproximada (humedad, protenas, cenizas, grasas, fibra bruta)* Caloras Carbohidratos Almidn Perfil de cidos grasos*

Perfil de azcares Composicin de aminocidos* Tocoferoles* Acido ftico* Minerales (calcio, fsforo)* ver Cuadro 11.

Los parmetros marcados con un * se analizaron para la elaboracin de piensos, los otros parmetros (a menudo obtenidos a partir de clculos) habitualmente no se consideran. Los carbohidratos no se midieron sino que se dedujeron a partir de la siguiente frmula: % de carbohidratos = 100% - (% de protena + % de lpidos + % de cenizas + % de humedad). Las caloras tambin se calcularon utilizando la frmula aprobada por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos: caloras (kcal/100g) = (4 * % de protenas) + (9 * % de lpidos) = (4 * % de carbohidratos). Cuadro 11. Composicin del grano del maz MON 810, del control (MON 818) y valores citados en la literatura. Componente MON 8101 Media (rango) 2 MON 818 Media (rango) 2 Valor citado en la literatura4 Media (rango) [rango MON 800/801]

Anlisis de la composicin aproximada Protenas3 Lpidos Cenizas3 Carbohidratos3 Caloras/100 g % de humedad 13,1 (12,7-13,6) 3,0 (2,6-3,3) 1,6 (1,5-1,7) 82,4 (81,8-82,9) 408,4 (407,0-410,1) 12,4 (11,0-14,4) 12,8 (11,7-13,6) 2,9 (2,6-3,2) 1,5 (1,5-1,6) 82,7 (81,7-83,8) 408,5 (406,0-410,1) 12,0 (10,6-14,2) 9,5 (6,0-12,0) 12,3 (9,7-16,1) [11,2-13,6] 4,3 (3,1-5,7), 4,6 (2,9-6,1) [3,8-4,2] 1,4 (1,1-3,9) [1,5-1,8] No se inform[80,8-83,0] No se inform[412,6-415,7] 16,0 (7-23) [13,0-15,8]

Composicin de aminocidos- esenciales del punto de vista de la nutricin5 Metionina Cistena Lisina Triptfano Treonina Isoleucina Histidina 1,7 (1,6-1,9) 2,0* (1,9-2,1) 2,8 (2,5-2,9) 0,6* (0,5-0,7) 3,9 (3,7-4,4) 3,7 (3,3-4,1) 3,1* (2,9-3,3) 1,7 (1,6-1,7) 1,9 (1,8-2,0) 2,8 (2,7-2,9) 0,6 (0,4-0,6) 3,8 (3,7-3,9) 3,8 (3,6-4,0) 2,9 (2,8-3,0) 1,0-2,1 [2,0-2,6] 1,2-1,6 [1,9-2,3] 2,0-3,8 [2,6-3,4] 0,5-1,2 [0,5-0,6] 2,9-3,9 [3,9-4,2] 2,6-4,0 [3,5-3,8] 2,0-2,8 [2,8-3,3]

Componente

MON 8101 Media (rango) 2 4,5 (4,1-4,9) 15,0 (14,1-16,7) 4,5 (4,2-4,7) 5,6* (5,2-5,6) 3,7 (3,4-4,0)5

MON 818 Media (rango) 2 4,6 (4,3-4,8) 14,5 (13,8-15,0) 4,5 (4,2-4,7) 5,4 (5,2-5,6) 3,7 (3,5-3,8)

Valina Leucina Arginina Fenilalanina Glicina

Valor citado en la literatura4 Media (rango) [rango MON 800/801] 2,1-5,2 [4,2-4,8] 7,8-15,2 [13,6-14,5] 2,9-5,9 [4,1-5,0] 2,9-5,7 [5,2-5,6] 2,6-4,7 [3,4-4,2]

Aminocidos no esenciales Alanina Acido asprtico Acido glutmico Prolina Serina Tirosina Acidos grasos6

8,2* (7,8-8,9) 7,1 (6,4-8,2) 21,9 (20,4-24,4) 9,9* (9,7-10,5) 5,5* (5,3-5,9) 4,4* (4,1-4,8)

7,8 (7,5-8,0) 6,6 (6,3-6,8) 21,1 (201,-21,6) 9,6 (9,4-9,8) 5,2 (5,1-5,4) 4,0 (3,9-4,1)

6,4-8,0 [7,8-8,2] 5,8-7,2 [6,7-7,3] 12,4-19,6 [19,9-21,4] 6,6-10,3 [9,0-9,4] 4,2-5,5 [5,5-6,1] 2,9-4,7 [3,8-4,3]

Palmtico (16:0) Esterico (18:0) Oleico (18:1) Linoleico (18:2) Linolenico (18:3)

10,5 (10,2-11,1) 1,9 (1,7-2,1) 23.2 (21,5-25,4) 62,6 (59,5-64,7) 0,8 (0,7-0,9)

10,5 (10,2-10,7) 1,8 (1,8-1,9) 22,8 (21,6-23,9) 63,0 (61,8-64,6) 0,9 (0,8-0,9)

7-19 [10,2-10,9] 1-3 [1,6-3,1] 20-46 [21,2-25,9] 35-70 [58,9-65,0] 0,8-2 [0,9-1,1]

Fibra y carbohidratos7 Almidn % % de fibra cruda Azcares - Fructosa - Glucosa - Sacarosa % de cido ftico Tocoferoles (mg/kg) alfa beta gama 10,4 (9,7-11,3) 8,5* (8,1-9,2) 20,2 (15,3-24,8) 10,9 (9,9-12,1) 7,5 (7,0-7,9) 21,6 (18,8-27,8) 3,0-12,1 [7,3-12,3] [7,9-10,7] [21,7-42,5]8

67,6 (65,3-69,7) 2,6* (2,5-2,8) 0,32 (0,23-0,35) 0,44 (0,34-0,47)* 0,93 (0,79-1,12) 0,86 (0,81-0,91)

66,9 (64,6-69,0) 2,4 (2,3-2,5) 0,27 (0,22-0,40) 0,93 (0,79-1,12) 0,93 (0,68-1,11) 0,84 (0,79-0,91)

64-78,0 [63,7-71,5] 2,0-5,5 [1,98-2,61] [0,47-0,96] [0,47-1,03] [0,40-0,94] 0,7-1,0 [0,45-0,57]

Compuestos inorgnicos7 % de calcio % de fsforo 0,0036* (0,00330,0039) 0,358 (0,334-0,377) 0,0033 (0,00290,0037) 0,348 (0,327-0,363) 0,01-0,1 [0,003-0,004] 0,26-0,75 [0,311-0,368]

* estadsticamente diferentes a los valores de MON 818. Medias de las seis muestras tomadas en los seis sitios. Los rangos representan los valores mximos y mnimos de los sitios. 3 Porcentaje del peso seco de la muestra. 4 Cada valor indicado corresponde a una fuente publicada. 5 Porcentaje del total de protenas. 6 Porcentaje del total de lpidos. Los valores de otros cidos grasos son inferiores al lmite de deteccin del ensayo. 7 En base al peso seco. 8 Expresados en g/100g. Tambin se midieron los contenidos de lactosa, galactosa y maltosa pero los valores obtenidos eran inferiores al lmite de deteccin.2

1

Las protenas, los lpidos, las cenizas, los carbohidratos, las caloras y la humedad del maz resistente a los insectos y del control no presentaron diferencias significativas y todos los valores se situaron en los rangos citados en las publicaciones cientficas. Los contenidos de los ocho aminocidos detectados en el maz MON 810 (cistina, triptfano, histidina, fenilalanina, alanina, prolina, serina y tirosina) son estadsticamente diferentes a los valores del control. Los valores promedio de seis de ellos (todos excepto cistina e histidina) se encuentran dentro de los rangos citados en la literatura. Los valores de cistina e histidina en ambos maces son estadsticamente superiores a los rangos citados en la literatura, pero dentro del rango de valores (1,9-2,3%) de dos maces similares (MON 800 y 801). El valor de histidina en el maz MON 810 (3,1%) se encuentra dentro del rango de valores de otro estudio realizado con anterioridad en el cual se compararon dos maces con gentica similar. Con referencia a los cidos grasos y carbohidratos medidos (almidn, fructosa, glucosa, sacarosa y cido ftico) no se observaron diferencias significativas entre los maces resistentes a los insectos y el control. El contenido de fibra bruta medido en el grano del maz MON 810 (2,6%) es estadsticamente diferente al de MON 818, pero ambos valores se sitan dentro del rango citado en la literatura (2,0-5,5%). El aceite de maz contiene naturalmente tocoferoles que tienen la potencia de la vitamina E. El tocoferol gama es diez veces menos activo que el alfa por lo cual no se lo considera un componente importante del grano de maz. Los contenidos de tocoferoles alfa y gama del maz 810 son estadsticamente similares a los del control. Sin embargo, el contenido de tocoferol beta es estadsticamente diferente al del maz control (Cuadro 11). El cuanto a los minerales, el contenido de calcio en el maz MON 810 es estadsticamente superior al del MON 818 pero dentro de los rangos obtenidos para MON 800 y 801. No se encontraron diferencias estadsticamente significativas en los valores de fsforo. En conclusin, segn los resultados obtenidos la composicin de los maces resistentes a los insectos es similar a la del control utilizado, MON 818." Por otra parte, la empresa resumi las conclusiones del anlisis nutricional de la siguiente manera: los valores de la composicin nutricional estn comprendidos en el rango de valores de cada nutriente de los maces no modificados. Por consiguiente, se puede concluir que no parece haber un efecto significativo sobre los contenidos de nutrientes de la planta de maz. Se efectuaron asimismo varias medidas de fenotipo pero no se observ que este fuera afectado. Con respecto a las vitaminas y minerales estudiados, no se observaron diferencias

en la prctica. En trminos de la composicin nutricional el maz MON 810 se puede considerar sustancialmente equivalente al maz comn."

Estudio de caso 2: Evaluacin de la inocuidad de la soja genticamente modificada de alto contenido en cido oleico

Indice

Estudio de caso 2: Evaluacin de la inocuidad de la soja genticamente modificada de alto contenido en cido olico 28 (en ingls) Error! Bookmark not defined. Prefacio 30 Nota 30 Descripcin de la planta de ADN recombinante 30 Descripcin de la planta hospedadora y su uso como alimento 31 Descripcin de la modificacin gentica 32 Mtodos empleados para introducir la modificacin gentica .............................. 32 Genes nuevos ...................................................................................................... 32 Construccin gnica ............................................................................................ 34 Caracterizacin de la modificacin gentica 36 Seleccin de las plantas ....................................................................................... 36 Caracterizacin molecular del ADN insertado en las sojas G94-1, G94-19 y G168 ............................................................................................................................ 39 Resmen del locus A ........................................................................................... 45 Estabilidad de las modificaciones genticas ......................................................... 46 Conclusin .......................................................................................................... 46 Genes de resistencia a los antibiticos ................................................................. 47 Caracterizacin de la nueva protena.................................................................... 48 Funcin bioqumica y fenotipo ........................................................................ 48 Anlisis de expresin de las protenas .............................................................. 49 Evaluacin de la posible toxicidad 52 Evaluacin de la posible alergenicidad 54 Anlisis de los componentes esenciales, evaluacin de metabolitos, elaboracin de alimentos y modificacin nutricional55 Estudios de campo y datos................................................................................... 55 Nutrientes esenciales ........................................................................................... 56 Resmen del anlisis de la composicin .............................................................. 62 Protenas alergnicas endgenas .......................................................................... 63 Reactividad radioalergosorbente ...................................................................... 63 Conclusin ...................................................................................................... 64 Consecuencias en la nutricin.............................................................................. 64 Estudios de alimentacin en animales .............................................................. 65 Consecuencias en la nutricin del ser humano ..................................................... 67 Conclusiones 70 Referencias 73 Apndices: Documentos pertinentes del Codex Error! Bookmark not defined.

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Prefacio

En Australia y Nueva Zelandia la venta de alimentos obtenidos a partir de las sojas de alto contenido en cido oleico G94-1, G94-19 y G168 (Expediente A387) se aprob luego de evaluar exhaustivamente su inocuidad en noviembre del ao 2000. El cometido del Organismo de Normas Alimentarias de Australia y Nueva Zelandia (Food Standards Australia and New Zealand, FSANZ) es evaluar la inocuidad de este tipo de alimentos segn los principios internacionales aceptados para determinar la inocuidad de alimentos obtenidos a partir de plantas genticamente modificadas. Las conclusiones de la evaluacin de inocuidad efectuada por el Organismo de Normas Alimentarias de Australia y Nueva Zelandia se publicaron en el Informe Final de Riesgo, Expediente A387, Alimentos obtenidos a partir de sojas de alto contenido en cido oleico G94-1, G94-19 y G168 (Final Risk Analysis Report: Application A387 - Food derived from high oleic soybean lines G94-1, G94-19, and G168). Ciertas partes de la solicitud de aprobacin de las sojas de alto contenido en cido oleico que se present ante el Organismo de Normas Alimentarias de Australia y Nueva Zelandia se resumieron con el fin de utilizar el estudio de caso como herramienta de capacitacin.Nota

A fin de facilitar la presentacin del estudio de caso como herramienta de capacitacin hemos hecho uso de ciertas licencias con respecto a la informacin proporcionada en las solicitudes originales. Ciertas partes se han condensado en resmenes y la informacin presentada es solo una parte de la solicitud original. El estudio de caso no constituye de ninguna manera una solicitud completa y tampoco debe considerrselo como una evaluacin de inocuidad exhaustiva. La utilizacin de la informacin presentada como herramienta de capacitacin no refleja necesariamente su aprobacin ni tampoco la del producto. Tampoco implica juicio alguno con respecto a las solicitudes originales.Descripcin de la planta de ADN recombinante

El objetivo original de Optimum Quality Grains LLC (una empresa conjunta entre DuPont y Pioneer Hi-Bred International Inc.) fue introducir en la soja dos caractersticas: (a) aumentar el contenido de lisina en la harina y (b) aumentar el contenido de cido oleico, un cido graso monoinsaturado, en el aceite. Sin embargo, durante los estudios, la empresa resolvi no continuar investigando los procedimientos para aumentar la cantidad de lisina. La nueva soja ha sido modificada genticamente con el fin de aumentar el contenido de cido oleico y se denomina soja de alto contenido en cido oleico. El contenido de cido oleico se aument insertando en una variedad de soja comercial de alto rendimiento una segunda copia del gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos (GmFad 2-1), que sintetiza el cido linoleico, el cido graso poliinsaturado msimportante del aceite de soja. La presencia de la segunda copia de este gen causa el

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"silenciamiento gnico", es decir que no se expresa ninguna de las dos copias del gen. En consecuencia, en el poroto de la soja en desarrollo no se sintetiza el cido linoleico y por lo tanto se acumula el cido oleico. A continuacin se describe la ruta de sntesis de los cidos grasos de cadena larga en los vegetales.

Palmitic acid (C16)elongation

desaturation

elongation

Stearic acid (C18)desaturation

Palmitoleic (C169)

Longer chain saturated fatty acids

Oleic acid (C189)GmFad 2-1 gene

Linoleic acid (C189,12)GmFad 3 gene

Linolenic acid (C189,12,15)

(adapted from Lehninger 1982)

El aceite de soja es poco estable del punto de vista de la oxidacin ya que contiene gran cantidad de cidos grasos poliinsaturados (por ejemplo, de cido linoleico). El aceite de soja de alto contenido en cido oleico se considera mejor que el aceite de soja convencional debido a que contiene menos cidos grasos poliinsaturados inestables del punto de vista de la oxidacin. El aceite de soja de alto contenido en cido oleico se puede usar para elaborar alimentos, incluso para frer, sin que sea necesario someterlo a hidrogenacin qumica o elaborarlo de otra manera. Tambin se cree que las propiedades nutritivas del aceite de soja de alto contenido en cido oleico son mejores que las del aceite de soja convencional o parcialmente hidrogenado debido al mayor contenido de cidos grasos monoinsaturados. La industria alimentaria y los servicios conexos utilizan el aceite de soja obtenido a partir de sojas de alto contenido de cido oleico principalmente para frer y rociar panes y otros productos horneados y este podra sustituir otros aceites y grasas termoestables, por ejemplo, las mezclas de aceites de palma y otros aceites vegetales o los aceites de colza y de soja hidrogenados.Descripcin de la planta hospedadora y su uso como alimento

La soja (Glycine max) se planta comercialmente en ms de 35 pases del mundo y tiene una larga trayectoria de uso inocuo en alimentos para consumo humano y en piensos. Los principales pases productores de soja son los Estados Unidos, Argentina, Brasil y China, cuya produccin representa el 90% de la produccin mundial. Los tres productos ms importantes de la soja son la harina, el aceite y el poroto (la semilla). Su utilizacin en piensos es escasa, y la soja sin elaborar no se usa como 31

alimento debido a que contiene sustancias txicas y antinutrientes, por ejemplo, lectinas e inhibidores de la tripsina que la hacen inadecuada para el consumo humano. Estos compuestos se inactivan mediante tratamientos con calor adecuados. El poroto de soja entero se utiliza tostado u horneado o para producir brotes de soja. La cscara del poroto se elabora para obtener harina de soja sin desgrasar y productos tradicionales a base de soja, por ejemplo miso, cuajada (tofu), leche y salsa de soja. Los porotos de soja se clasifican, se limpian, se secan y se descascaran antes de elaborarlos. La cscara se puede elaborar para obtener aditivos de fibras para panes, copos o aperitivos y tambin para piensos. El poroto descascarado se lamina en copos sin desgrasar que se usan en piensos o pueden continuar elaborndose para obtener harina sin desgrasar. El aceite de soja crudo se extrae sumergiendo los copos en un disolvente. Se separa la lecitina cruda y el aceite se contina refinando para obtener aceite de cocina, margarina y grasas de repostera. Luego de extraer el aceite de los copos, se retira el disolvente y los copos se secan para utilizarlos en la produccin de harina, concentrados y protenas aisladas de soja. Los copos desgrasados tambin se utilizan en piensos. Las cervezas, los fideos, los panes, las harinas, las tripas comestibles, la pastelera, las galletas finas y crujientes, los dulces y los sucedneos de la leche y de carnes, entre otros son algunos de los productos terminados que contienen soja. El cultivar lite A2396 se utiliz como planta hospedadora. Esta es una soja temprana del grupo II de maduracin, de alto rendimiento, de Asgrow Seed Company, con 40% de protena y 22% de aceite en peso seco, al igual que otras sojas.Descripcin de la modificacin gentica

Mtodos empleados para introducir la modificacin gentica El plsmido de ADN con los genes de inters se introdujo en el tejido meristemtico de la soja A2396 por transformacin biolstica o bombardeo con micropartculas. Las clulas con el ADN introducido se incubaron en un medio de cultivo que promueve la formacin de callos. La seleccin de las clulas que efectivamente incorporaron el ADN insertado se efectu con una protena marcadora fluorescente, codificada por un gen especfico (GUS) que se introdujo para tales fines. Genes nuevos Gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo. En la soja hay dos genes que codifican insaturasas de los cidos grasos, en la semilla en desarrollo solo se expresa uno de ellos (GmFad 2-1) (Heppard et al., 1996), cuyo grado de expresin aumenta cuando el aceite comienza a depositarse, es decir, aproximadamente 19 das despus de la floracin. Su producto gnico regula la sntesis de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite. En la semilla, en la hoja, en los tallos y en la raz el grado de expresin del otro gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos (GmFad 2-2) es

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constante y su producto gnico regula la sntesis de los cidos grasos poliinsaturados que se encuentran en todas las membranas celulares. En la soja la presencia de una segunda copia del gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo provoca un fenmeno que se conoce como silenciamiento gnico, es decir, no se expresa ninguna de las dos copias del gen (ni la copia original de la soja ni la copia que se transfiri). Como ninguna de las dos copias se expresa, en la semilla en desarrollo no se sintetiza el cido linoleico y se acumula el cido oleico. En los vegetales, el silenciamiento gnico puede ocurrir durante la transcripcin o luego de ella. Se cree que el mecanismo bsico del silenciamiento durante la transcripcin es la metilacin de las secuencias de los promotores. Si bien los mecanismos an no se conocen, se cree que la metilacin de los promotores interrumpe la interaccin con los factores de transcripcin o que altera la estructura de la cromatina del ADN impidiendo la transcripcin (Wang y Waterhouse, 2001). El silenciamiento post transcripcin se denomin en un principio co supresin porque en los experimentos de transformacin de petunias con un transgn que codifica la sintetasa en el sentido de las benzalacetofenonas, no se expres ni el transgn ni el gen endgeno correspondiente. En el silenciamiento post transcripcin no se acumula ARNm en el citoplasma y por lo tanto no se generan los productos de la expresin. En la actualidad se sabe que en los vegetales el ARN de cadena doble puede causar el silenciamiento post transcripcin mediante un proceso que degrada el ADN especfico de una secuencia (Voinnet, 2002). Gen que codifica la sintetasa del cido dihidrodipicolnico (Gen dapA) El gen codifica la sintetasa del cido dihidrodipicolnico codifica la enzima que cataliza el primer paso de la ruta metablica de sntesis de la lisina, uno de los aminocidos esenciales (Brock et al., 1984). En los vegetales la lisina inhibe la sintetasa del cido dihidrodipicolnico. El gen que se transfiri a la soja proviene de Corynebacterium y codifica una forma de sintetasa del cido dihidrodipicolnico que no se inhibe con la lisina. Otros ensayos han demostrado que el gen que codifica la sintetasa del cido dihidrodipicolnico que no se inhibe con la lisina de Corynebacterium, provoca que se acumule 100 veces ms lisina libre en la semilla duplicando su contenido total de lisina (Falco et al., 1995). El gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo se insert en la soja con el fin de reducir el contenido de cidos grasos poliinsaturados en el aceite silenciando el gen correspondiente (antes descrito). El gen que codifica la sintetasa del cido dihidrodipicolnico de Corynebacterium que no se inhibe con la lisina se insert con el fin de aumentar el contenido de lisina en la harina. Gen que codifica el marcador visual (Gen uidA) Adems de los genes descritos, la soja tambin contiene un gen de Escherichia coli (Jefferson et al., 1985) que sirve de marcador visual. Este gen codifica una protena,

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la enzima -glucuronidasa, que se emplea para catalizar una reaccin colorimtrica que tie de azul los tejidos vegetales modificados. Construccin gnica La transformacin se efectu con dos plsmidos circulares pBS43 y pML102 que contienen los tres casetes de expresin gnicos, uno por cada gen de interes, uno con el gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo, uno con el gen que codifica la sintetasa del cido dihidrodipicolnico, y otro con el gen que codifica el marcador visual. En ambos plsmidos tambin se insert el gen marcador de resistencia a los antibiticos (bla). Los dos plsmidos con los genes nuevos marcados en negro se esquematizaron de forma lineal en la Figura 1.pBS43 (10303 base pairs):

GmFad 2-1 conglycinin promoter 3 phaseolin terminator

35S promoter uidA

3 NOS

bla

pML102 (6247 base pairs):

KTi3 promoter ssuCTP: dapA

KTi3 ter minator

bla

Cuadro 1: Descripcin de los casetes de expresin gnica en los plsmidos pBS43 y pML102. CaseteCasete de expresin del gen

Elemento genticoPromotor de la conglicinina

FuenteSubunidad 1 de la -conglicinina, protena de almacenamiento del poroto (Barker et al. 1988). Secuencia codificadora de la protena insaturasa -12 del cido graso de la soja (Okuley et al. 1994, Heppard et al. 1996).

FuncinPromotor especfico de la semilla que permite un alto grado de expresin durante el desarrollo de esta. Enzima endgena que agrega un segundo doble enlace al cido oleico convirtindolo en cido linoleico.

que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo(GmFad 2-1) (pBS43)

Regin de codificacin

Gm Fad 2-1Terminador 3 de la faseolina

Regin terminadora 3 de la faseolina, protena de almacenamiento de Phaseolis vulgaris (Doyle et al. 1986).

Contiene las seales para finalizar la transcripcin y gobierna la poliadenilacin.

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Casete de expresin del gen

Promotor 35S

Promotor derivado del virus del mosaico de la coliflor (Odell et al.1985). Lder 5 no traducido del promotor de la protena que se une a la clorofila fotosinttica a/b 22L (Cab22L) de Petunia hybrida var. Mitchell (Harpster et al. 1988). Secuencia que codifica la protena de la enzima - glucuronidasa (gen uidA) de Escherichia coli (Jefferson et al. 1985).

que codifica la protena marcadora fluorescente(GUS ) (pBS43)

Promotor del alto grado de expresin de genes constitutivos en tejidos vegetales.

Lder no traducido de Cab 22L

Secuencia lder no traducida que ayuda a estabilizar al ARNm y a mejorar la traduccin.

Regin de codificacin del gen que codifica el marcador visual (uidA)

Marcador colorimtrico que se utiliza para seleccionar las plantas transformadas.

NOS 3'

Regin 3 del terminador del gen de la nopalina sintetasa del plsmido Ti de Agrobacterium tumefaciens (Depicker et al. 1982, Bevan et al. 1983). Promotor del gen que codifica el inhibidor de la tripsina 3 de Kunitz en la soja (Jofuki y Goldberg 1989).

Contiene las seales para finalizar la transcripcin y gobierna la poliadenilacin.

Casete de expresin del gen

Promotor Kti3

que codifica la sintetasa del cido dihidrodipicolni co (dapA)(pML102) ssu CTP

Promotor especfico de la semilla que durante el desarrollo de esta permite un alto grado de expresin del gen.

Secuencia del terminal N del pptido de transito al cloroplasto de la subunidad rubisco de la soja (Berry-Lowe et al. 1982). Secuencia codificadora del gen que codifica la sintetasa del cido dihidrodipicolnico (dapA) de Corynebacterium que no se inhibe con la lisina (Bonnassie et al. 1990, Yeh et al. 1988).

Dirige la protena al cloroplasto, organelo donde se efecta la biosntesis de la lisina.

Regin de codificacin del gen de la

Expresin de la enzima sintetasa del cido dihidrodipicolnico de Corynebacterium que desregula la ruta de biosntesis de la lisina causando la acumulacin de lisina libre (Falco et al. 1995).

sintetasa del cido dihidrodipicolni co (dapA)Terminador 3 del gen que codifica el inhibidor de la tripsina 3 de Kunitz en la soja (Kti3)

Regin terminadora 3 del gen que codifica el inhibidor de la tripsina 3 de Kunitz en la soja (Jofuki y Goldberg 1989).

Contiene las seales para finalizar la transcripcin y gobierna la poliadenilacin.

Otros elementos genticos Adems de los casetes descritos en el Cuadro 1, el plsmido de ADN contiene otros elementos, por ejemplo, un gen marcador de resistencia a los antibiticos.Cuadro 2: Descripcin de otros elementos genticos transferidos a la soja de alto contenido en cido oleico. Cassettelac

Elemento gentico

Fuente

FuncinNo se transfiri la secuencia completa de estos genes y en E.coli ya no se expresan.

Copia incompleta del opern lac que contiene un secuencia de codificacin parcial lacI, el promotor Plac, y una

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secuencia de codificacin parcial de la -Dgalactosidasa (lacZa). ori Origen de replicacin del gran nmero de copias del plsmido pUC19 de E. coli. Gen que codifica la enzima -lactamasa de E. coli. Bacterifago f1 origen de la replicacin. Permite la replicacin de los plsmidos en E. coli.

bla

Confiere a E. coli resistencia a la ampicilina.

f1 ori

Origen de replicacin reconocido por el bacterifago f1 para producir ADN de una hebra. Si el fago f1 no est presente, no se reconoce el origen f1.

La mayora de los vectores de clonacin de E. coli contienen estos elementos genticos, descritos en detalle por Sambrook et al., 1981, que se utilizan para ayudar a manipular las secuencias de ADN y para dirigir la expresin gnica en E. coli.Caracterizacin de la modificacin gentica

Seleccin de las plantas El mtodo empleado en la transformacin no siempre result en la transferencia de ambos plsmidos a la soja. Por este motivo, fue necesario evaluar gran cantidad de plantas transformadas para identificar aquellas que posean ambas caractersticas. En primer trmino se estudio la poblacin de plantas transformadas en busca de la actividad del gen que codifica la protena marcadora fluorescente que est ligado al gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo. Se seleccionaron las plantas que mostraron la protena marcadora fluorescente y en este grupo de plantas se detect la presencia del gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo con el ensayo de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Con esta primera seleccin se identific una planta (260-05) y se seleccionaron sus semillas (la generacin R1, es decir la F1 en organismos con ADN recombinante). Se analiz la composicin de cidos grasos y se determin el contenido de lisina. La poblacin de semillas R1 estudiada se puede dividir en cuatro grupos con distintos contenidos de cidos grasos y de lisina: 1. Semillas con contenido de cido oleico 80% y contenidos de lisina normales (G168); 2. Semillas con aproximadamente 72% de cido oleico y mayor contenido de lisina (G94); 3. Semillas con aproximadamente 4% de cido oleico y mayor contenido de lisina (G175); y 4. Semillas con contenidos de cido oleico y de lisina similares a los de la planta sin transformar A2396 (G90).

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El ADN del genoma de las semillas de estos cuatro grupos se analiz usando hibridacin Southern blot, tcnica que se utiliza para detectar con precisin secuencias especficas dentro de un fragmento de ADN que se separan con electroforesis en gel (Southern, 1975), para determinar el nmero de insertos de ADNt y el nmero de sitios de insercin (es decir, el nmero de loci) en el genoma de la soja. Tambin permite determinar en cierta medida si la secuencia de ADNt insertada se copi total (copias intactas o ntegras) o parcialmente. El ADN del genoma de las muestras de semillas se extrajo y se digiri con la enzima de restriccin BamHI. Luego se aadi una sonda de la regin 3 del terminador de la faseolina para detectar el casete de expresin del gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo. La enzima BamHI corta el plsmido pBS43 una vez y se espera obtener una banda de hibridacin para cada copia del plsmido insertado en el genoma.

Figura 1 Mapa del plsmido pBS43. Ubicacin de las sondas de hibridacin y los sitios de la enzima de restriccin utilizados en el anlisis de Southern blot del ADN de la soja de alto contenido en cido oleico.

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Figura 2. Southern blot del ADN aislado del tejido foliar de la R1 de la soja 260-05. Las plantas se obtuvieron a partir de trocitos de semillas cuya composicin de cidos grasos era conocida. El ADN del genoma se digiri con BamHI y se utiliz la sonda 3 faseolina para detectar la integracin del gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo (GmFad 2-1).

En la Figura 2 se observan tres patrones de bandas. En la soja G168 se observan dos bandas de 14,0 Kb y 4,5 Kb, que indican la presencia de dos genes que codifican la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo. La soja G175 presenta una sola banda de 12,0 kb. En la soja G94 se observa la presencia de los tres fragmentos de hibridacin. El patrn de hibridacin del ADN de la Figura 2 se interpreta de la siguiente manera. En la primera transformacin (260-05) el gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo se integr al genoma de la soja en dos loci diferentes. La soja G168 contiene uno de los loci (denominado locus A) con dos genes que codifican la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo ligados, tal como lo indican los dos fragmentos de hibridacin de 14,0 kb y 4,5 kb. La soja G175 contiene un segundo locus (locus B) que cuenta con un solo gen que codifica la insaturasa de los cidos grasos poliinsaturados que componen el aceite en la semilla en desarrollo. La soja G94 posee ambo