INOCUIDAD VIRUS TRANSMITIDOS POR ALIMENTOS: PRIMER …

RESUMENLos norovirus (NoV), junto con los rotavirus (RV)humanos, son los principales agentes virales causantesde brotes de gastroenteritis en todo el mundo. Losmoluscos bivalvos, debido a su capacidad de concen-trar partículas virales en su sistema digestivo por filtra-ción de grandes volúmenes de agua, pueden estar con-taminados con estos patógenos. En la costa de nuestropaís pueden distinguirse mejillones (Mitylus edulis),vieiras (Aequipecten tehuelchus) y ostras (Crassostreagigas), como los más relevantes para la actividad pes-quera regional y, potencialmente, para la comercializa-ción internacional. Como consecuencia de brotes cau-sados por el consumo de alimentos contaminados convirus, el mercado internacional ha incrementado las exi-gencias sanitarias sobre la calidad de los productos quese exportan. En este contexto, el objetivo de este trabajofue determinar la presencia de virus en ostras(Crassostrea gigas) del sur de la provincia de BuenosAires. Para ello, se obtuvieron ostras (n=88) a partir deun relevamiento realizado en el año 2015 de la zona surde la costa bonaerense. Se recolectaron ejemplares delas zonas noreste y sureste de Isla Gama, ubicada frentea la localidad de Bahía San Blas, por fuera de las zonasde restricción de SENASA. El procesamiento de las

muestras se realizó según norma ISO/TS 15216-2:2013, con algunas modificaciones. La muestra sedefinió como un pool de ostras de 2g. La detección delos genomas virales se realizó mediante la técnica deRT-PCR en tiempo real. Se evidenció la presencia degenoma de NoV perteneciente al genogrupo II (GII) yRVA, en dos pooles. La caracterización de la cepa deNoV se realizó mediante RT-nested PCR, la cual permi-tió amplificar un fragmento comprendido entre ORF1 yORF2 de 390pb. Estudios filogenéticos demostraronque el genotipo encontrado correspondía a la variantede NoV GII.4, Sidney 2012. Con respecto al RVA, se rea-lizaron cuatro pasajes ciegos en células MA104.Mediante RT-PCR en tiempo real, se mostró una dismi-nución en el valor del CT (ciclo umbral) correspondienteal cuarto pasaje de RVA (CT=25), respecto del valor delCT correspondiente al genoma del virus encontrado ini-cialmente en el pool de ostras (CT=36). La presencia departículas virales infecciosas se evidenció medianteinmunofluorescencia directa, usando un nanoanticuer-po VHH específico contra la proteína VP6 de RVA mar-cado con ALEXA-fluor 488. Este ensayo demostró laviabilidad del RVA encontrado.

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D VIRUS TRANSMITIDOS POR ALIMENTOS:PRIMER REPORTE EN OSTRAS(CRASSOSTREA GIGAS) DE LA PROVINCIADE BUENOS AIRESMozgovoj, Marina1; Barbieri, Elena2;Gonzalez, Cintia3; Victoria Montero, Matías4;López Tort, Fernando4; Cap, Mariana3;Barón, Pedro2; Parreño, Viviana5

1Instituto de Tecnología de Alimentos - InstitutoNacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) - CONICET. Argentina. 2Laboratorio de Oceanografía Biológica LobioCesimar - CCT CONICET-CENPAT. Argentina.3Instituto de Tecnología de Alimentos - Centro deInvestigación de Agroindustria - INTA. Argentina. 4Laboratorio de Biología Molecular - Departamentode Ciencias Biológicas - CENUR Litoral Norte.5Instituto de Virología e IncuINTA - Instituto Nacionalde Tecnología Agropecuaria (INTA) - CONICET [email protected]

En nuestro conocimiento, este trabajo constituye el pri-mer reporte de detección de NoV y RVA en Crassostreagigas de nuestro país, y representa la primera detecciónde virus en alimentos en la Argentina. Ante un fortaleci-miento en los últimos años de la actividad pesquera demoluscos bivalvos en nuestro país, los estudios realiza-dos representan información epidemiológica de rele-vancia para la implementación de estrategias de controlsanitario que permitan la certificación de inocuidadpara la exportación segura de estos frutos de mar dealto valor económico.

INTRODUCCIÓNLas enfermedades transmitidas por alimentos (ETA)representan uno de los principales problemas en saludpública a nivel mundial. Éstas pueden ser causadas porbacterias, virus y contaminantes químicos. Con respec-to a los virus, sólo se requiere una mínima cantidad departículas virales para generar enfermedad. Son muyestables y resistentes en el medio ambiente1. Entreellos, norovirus genogrupo I y II (NoV GI y GII) y rota-virus (RVA) causan gastroenteritis agudas, generandouna elevada morbi-mortalidad en los países en desarro-llo. En la Argentina, alrededor de 1.200.000 de casos dediarrea aguda se reportan anualmente y la mitad deestos ocurre en niños menores de cinco años. NoVafecta a humanos de todas las edades. La infecciónsuele ser autolimitada, sin embargo, en algunos casospuede ser más severa e incluso comprometer la vidadel paciente2. Para el caso particular de NoV, se hademostrado que tiene la capacidad de unirse a recepto-res específicos del tejido de los bivalvos, lo que expli-caría por qué estos virus resisten los procesos depura-tivos, representando un riesgo para el consumo deostras crudas o cocidas ligeramente3. RVA es la princi-pal causa de diarrea en niños menores de dos años,causando la muerte en los casos más graves4. Se handescripto brotes asociados al consumo de alimentoscontaminados con RVA, si bien, son poco frecuentes.Durante estos últimos años se han estudiado las carac-terísticas zoonóticas de algunas cepas de RVA5. Losmoluscos bivalvos (ostras, mejillones, almejas) son ali-mentos especialmente peligrosos porque concentranactivamente los virus al filtrar grandes volúmenes deagua y porque, con frecuencia, se consumen crudos oescasamente cocidos6. La gastroenteritis asociada alconsumo de moluscos bivalvos ha sido ampliamentedocumentada7. En la Argentina, los moluscos costerosincluyen a varias especies en las costas de la Patagoniaque están sujetas a explotación comercial y actividadesacuiculturales o utilizadas para consumo familiar. Los

bancos de ostras se han desarrollado luego de la intro-ducción de especímenes para su producción en el año1982. Desde entonces, la especie ha expandido su dis-tribución desde el estuario de Bahía Blanca hasta la pro-vincia de Río Negro. Las autoridades locales están pro-moviendo activamente el desarrollo de esta industria, lacual ha crecido enormemente durante los últimosaños8. Toda la zona se caracteriza por su cercanía a ciu-dades importantes y balnearios con afluencia turística,siendo susceptibles de concentrar contaminantes deefluentes cloacales. Estudios previos demuestran que laostra Crassostrea gigas es capaz de bioacumular unavariedad de virus, incluyendo patógenos del grupoCalicivirus9. Los virus entéricos pueden persistir en lossedimentos marinos y mariscos durante varias sema-nas o meses, no pudiéndose lograr la inactivación viralcompleta luego de los procesos normales de depura-ción10-11. En nuestro país la importancia real de losvirus en los casos de ETAs está subestimada. En estecontexto, en este trabajo se propone estudiar la presen-cia de NoV y RVA en ostras (Crassostrea gigas) del surde la provincia de Buenos Aires.

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MATERIALES Y MÉTODOSMuestras de ostras (Crassostrea gigas)En colaboración con la Dra. Elena Barbieri y el Dr.Gaspar Soria. se obtuvieron muestras de ostras de laszonas noreste y sureste de Isla Gama.

Preparación de los homogenatos Se realizó acorde la norma ISO/TS 15216-2:201312. En con-diciones de esterilidad se abrió el molusco bivalvo, se sepa-ró el hepatopáncreas mediante un bisturí estéril y se colocóen una placa de Petri. Se realizaron grupos de glándulasdigestivas de varios individuos hasta obtener 2,0±0,2g. Cadagrupo se disgregó mecánicamente hasta lograr una consis-tencia pastosa. Se adicionaron 2ml de proteinasa K (SIGMA)(0,1 mg/ml). La mezcla se incubó a 37°C por 1h en agitación(320 rpm), seguida de una incubación a 65°C durante 15m(inactivación de la enzima). Se realizó la clarificaciónmediante centrifugación a 3000 g, durante 5m para obtenerla fracción soluble. La muestra se conservó a -80°C.Controles de extracción: Como control de proceso se utilizóel bacteriófago PP7, el cual se adicionó al homogenato deostras (10 ul), previo a la adición de proteinasa K.

Extracción de ARN y síntesis de ADNc La extracción de ARN a partir de las muestras de bival-vos se realizó según el protocolo descripto por normaISO/TS 15216-2:201312. El ARN extraído se conservó a-80°C. La síntesis de ADNc se realizó empleando ran-dom hexámeros (Promega) y MMLV (promega) segúnlo descripto por Castells M y col, (2018)13. El ADNc seconservó a -20 hasta su uso.

Cálculo de eficiencia de la extracción.Cuantificación del fago PP7Se cuantificó el fago pp7 (SPC) a partir de una curvaestándar construida previamente en nuestro laborato-rio, según Rajal y col, (2007)14. La eficiencia de extrac-ción en todos los casos fue >1%.

Detección de NoV GII-PCR en tiempo real. Se realizó según Victoria y col (2016)y Pang X y col (2005)15,16. Se utilizó un control sin templadoy un control positivo para NoV GI y GII (muestras de mate-ria fecal cedidas por el Dr. Juan Stupka, ANLIS-Malbrán). -Heminested PCR. Se realizó según Victoria y col.(2016)15. Los primers forward y reverse están dirigidosal sitio de unión ORF1-ORF2 y a una región de 50 pb delgen VP1 (región C), respectivamente. Para NoV GII, seemplearon: COG2F/G2SKR (390 bp) y G2SKF/G2SKR(340 bp) correspondientes al primero y segundo round,respectivamente.

Detección de rotavirus-PCR en tiempo real. Se amplificó un fragmento alta-mente conservado correspondiente a la secuencia de laproteína no estructural de NSP3, según Zeng AQ y col(2008)17. Se utilizaron los primers, sonda y condicionesde ciclado descriptos en dicho trabajo.-Nested PCR. Se realizaron diferentes PCR a fin deamplificar las secuencias codificantes correspondientesa los genes de VP4, VP7, VP6 y NSP4. Para el caso deVP4 y VP7, se realizó según lo descripto Victoria M ycol, (2014)18. Se utilizaron los primers 9con1 y 9con2para el primer round de VP7 y 4con3 y 4con4 para elprimer round de VP4. Para el segundo round, se utiliza-ron los juegos de primers VP7F/VP7reg y VP4F/VP4Rpara VP7 y VP4, respectivamente. A su vez, se utilizaronlos primers descriptos por Garaicoechea L y col(2006)19. Para VP6 y NSP4, los primers utilizados y lasPCR empleadas, se basaron en lo descripto por AfradMH y col. (2013)20.-Aislamiento viral y detección por inmunofluorescen-cia directa (IF). El aislamiento de los RVA se realizósegún lo descripto por Castells y col (2018)13. Se sem-braron por duplicado los homogenatos (que hayanresultado positivos por real time) diluidos ½ en MEM-Dcon 1% pancreatina en placas de MA104 de 96 pocillos(Nunc), se incubaron a 37°C, 5% CO2 durante 1 hora, seretiró el inóculo y se agregaron 100 ul de MEM-D suple-mentado con 1% de pancreatina. Las placas se incuba-ron durante 96 horas a 37°C, 5% CO2. Se realizaroncuatro pasajes ciegos. Luego, se cosechó el virus y setituló en placas de 96 pocillos en células MA104. A 18hsposteriores a la incubación a 37ºC, en atmósfera de 5%de CO2, se descartó el sobrenadante y las monocapasinfectadas se fijaron con acetona al 70% durante 15minutos, a temperatura ambiente. La infección se revelócon un anticuerpo monoclonal contra RVA, marcadocon ALEXA. El número de unidades formadoras defocos fluorescentes (UFF) se determinó por lectura enun microscopio de fluorescencia (Olympus). El títuloinfeccioso se obtuvo a partir de la siguiente fórmula:UFF/ml= (número de focos x inversa dilución) / volumendel inóculo.

Secuenciación y análisis filogenéticoLos amplicones obtenidos mediante la técnica de RT-Nested PCR aplicada se purificaron empleando el KitQIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) según las especifi-caciones del fabricante. Luego se secuenciaron automá-ticamente en ambas direcciones (MACROGEN). Para elcaso de RVA, las secuencias nucleotídicas fueron edita-das y ensambladas utilizando el programa


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SeqMan®(DNASTAR®, Madison, USA) y el programaBioedit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html).Las matrices de datos se construyeron realizando una bús-queda de similitud en la base de datos Genbank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) utilizando laherramienta BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). El alineamientomúltiple de secuencias se realizó utilizando el programaMuscle implementado en Aliview21 (REF) y ClustalX(http://www.clustal.org/clustal2/) implementado en Bioedit.

El análisis filogenético se realizó por el métodode Neighbor-joining (NJ), utilizando el modelo evolutivode Kimura 2-Parameter (K2P) implementado en MEGA6(Kumar et al., 2016). El soporte estadístico se realizómediante el método de remuestreo (bootstrap) con1000 réplicas.

Las cepas argentinas que han sido secuencia-das hasta el momento fueron incluidas en el análisis, ylas cepas de referencia de los diferentes genotipos des-critos para VP7, VP4, VP6 y NSP4 (G, P, I y E, respec-tivamente) fueron obtenidas a través de sus númerosde acceso disponibles en el artículo científico publicadopor Matthijnssens y col. (2011) y de la lista de genoti-pos aceptados disponible en la web del RCWG(https://rega.kuleuven.be/cev/viralmetagenomics/virus-classification/rcwg).

Para el caso de NoV, se utilizó la herramienta NorovirusGenotyping Tool Version 2.022. La reconstrucción filo-genética fue realizada utilizando el método de Neighbor-joining (NJ), utilizando el modelo evolutivo de Kimura2-Parameter (K2P) implementado en MEGA6 (Kumar etal., 2016). El soporte estadístico se realizó mediante elmétodo de remuestreo (bootstrap) con 1000 réplicas.Fue utilizada por lo menos una secuencia de referenciapor cada genotipo del Genogrupo II obtenidas a travésde sus números de acceso disponibles en GenBank•.

RESULTADOS Detección y análisis filogenético de NoVen ostras de Buenos AiresEl análisis filogenético de NoV muestra que la secuen-cia argentina de NoV clasificó como perteneciente algenotipo 4 del Genogrupo II con un bootstrap del 79%(Figura 1).

Detección y análisis filogenético de RVA en ostras de Buenos AiresLa caracterización molecular de las cepas a partir delanálisis filogenético de las secuencias parciales de ADNde los genes VP7, VP4, VP6 y NSP4 obtenidas, demos-tró la circulación de los genotipos G8, P[1], I2 y E2, res-pectivamente, en un pool de ostras positivos para RVA

(Figura 2). No se descarta aun lapresencia de otros genotipos en lamuestra.


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FIGURA 1 - Análisis filogenético realizado a partir de la secuencianucleotídica de NoV GII detectado en ostras

(A) La cepa OystersBA/2019 (l)pertenece al genogrupo II, genotipo 4(GII.4) (Norovirus Genotyping Tool). (B) El árbol filogenético muestra que lacepa argentina agrupa conGII.4/Sidney/2012 y comparte la ramacon cepas de China y Australia.


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Figura 2 (A, B,C y D) - Análisis filogenético realizado a partir de secuencias parciales de los genes VP4, VP7, VP6y NSP4. Referencias de las figuras: cepa identificada en este estudio (l), cepas vacunales (p), cepas argentinas

humanas y animales previamente reportadas (n).

En la figura 2 se muestran los números de acceso decada una de las cepas utilizadas para los análisis. Losnúmeros en los nodos indican los valores de soporteestadístico obtenidos (>75%). La barra de escala que seobserva en la parte inferior del árbol representa la distan-cia nucleotídica entre las cepas (sustituciones por posi-ción nucleotídica). (A) VP4* (P-type). El gen de VP4agrupa con cepas bovinas y humanas genotipo P[1]. Lascepas vacunales (P[8]) y las demás cepas Argentinas nose relacionan con la cepa detectada. (B) VP7 (G-type). Elgen de VP7 agrupa en una rama propia dentro del geno-tipo G8, no relacionada directamente con otras cepas. La

rama próxima contiene cepas humanas y animales. Lascepas vacunales (genotipo G1) no se relacionan con lacepa estudiada. (C) NSP4 (E-type). El gen de NSP4 agru-pa dentro del genotipo E2 relacionado con cepas de bovi-nos de Brasil y cepas humas de Japón, India, Turquía yUSA. Las cepas vacunales agrupan en una rama relacio-nada al gen detectado. (D) VP6 (I-type). El gen de VP6agrupa junto a una cepa canina de Turquía y en la ramapróxima una cepa bovina de Brasil. En las ramas relacio-nadas se observan nuevamente las cepas de Asia. Lascepas vacunales y las cepas argentinas no se relacionancon la cepa estudiada.


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Viabilidad de RVA detectado en ostrasLa capacidad infectiva del aislamiento de RVA fue eva-luó mediante RT-PCR en tiempo real e IF. Se observóuna disminución en el valor del CT (ciclo umbral)correspondiente al cuarto pasaje de RVA (CT=25), res-pecto del valor del CT correspondiente al genoma delvirus encontrado inicialmente en el pool de ostras(CT=36). En cuanto al aislamiento viral, se observó unclaro CPE luego del cuarto pasaje. La viabilidad delvirus se confirmó mediante IFD con un nanoanticuerpoespecífico para la proteína VP6 de RVA (Figura 3).

DISCUSIÓNEl cultivo de moluscos bivalvos en la Argentina es unaindustria en desarrollo. Dentro de los moluscos, lasostras constituyen una parte importante de la explota-ción (www.agroindustria.gob.ar/sitio/areas/acuicultu-ra/cultivos/marina/index.php). Los bivalvos concentranactivamente los virus al filtrar grandes volúmenes deagua y, con frecuencia, se consumen crudos o escasa-mente cocidos, representando un peligro para la saludpública17. La descarga de aguas residuales (tratadas osin tratar) en las zonas costeras ha traído como conse-


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cuencia la disminución de la calidad sanitaria del aguadonde se desarrollan explotaciones de moluscos bival-vos, contaminándolos con patógenos humanos16. Ennuestro estudio, fue posible detectar las variantes NoVGII.4 Sidney 2012 y RVA G8P[1] en un pool de mues-tras de ostras (Crassostrea gigas) del sur de la provin-cia de Buenos Aires.

La detección de NoV y RVA en moluscos bival-vos ha sido reportada previamente6. Sin embargo, esteconstituye el primer reporte realizado en la Argentina.Los NoV genogrupos GI, GII y GIV son los principalesresponsables de las infecciones en humanos. Siendo elGII.4 uno de los genotipos que causa gastroenteritismás severas23. Desde mediados de los ’90 se han regis-trado la aparición de nuevas cepas, incluyendo a la cepaGII.4 Sydney 2012, considerada pandémica24. Un estu-dio realizado por Morozov y col (2018) demostró queNoV GII.4 Sidney 2012 son concentrados por las ostrasmediante receptores similares a los carbohidatros degrupo histosanguíneos humanos (HBGA), lo cual con-tribuye potencialmente a la capacidad de estos organis-mos para retener el patógeno en su estado infeccioso yde transmitir el virus por un tiempo prolongado25. Ennuestro país, se han reportado brotes de gastroenteritisasociados a este genotipo26.

Por otro lado, la detección de RVA genotipoG8-P[1]-I2-E2 en otro pool de ostras de la misma zonapodría indicar que están siendo liberados al agua pató-genos humanos, los que potencialmente pueden serconsumidos por personas, generando así un brote de laenfermedad. El genotipo G8 ha sido detectado en laArgentina en bovinos, cabras, guanacos y en Paraguayen humanos27. Sin embargo, la cepa detectada enostras se relaciona con cepas de RVA humanas prove-nientes de Asia y con una cepa de RVA presente en una

vacuna comercial. Esto podría ser debido a que laindustria pesquera nacional trae barcos provenientes detodo el mundo, los que liberan sus aguas residuales almar dispersando de esa forma los patógenos que luegoson concentrados por los moluscos bivalvos.

Cabe mencionar que es altamente probable queexistan otros genotipos de NoV o de RVA presentes enlas ostras debido a que concentran los virus presentesen agua. Nuestro estudio requiere ser profundizadodado que es muy probable que sólo hayamos detectadolas cepas predominantes. Es importante destacar quese pudo demostrar la viabilidad de RVA aislado, lo cualconfirma el riesgo de enfermedad en caso de consumode ostras contaminadas.

El presente trabajo describe, por primera vezen nuestro país, la presencia de virus patógenos enostras de la provincia de Buenos Aires. Las muestrasutilizadas en este estudio se recolectaron en una zonaubicada frente a la localidad de Bahía San Blas, porfuera de las zonas de restricción de SENASA. Si bien losorganismos de control regulan la producción de molus-cos bivalvos, hasta el momento no contemplan la detec-ción y circulación de virus patógenos como fuente decontaminación. En este sentido, este trabajo demuestrala necesidad de estudiar la presencia de virus en molus-cos bivalvos y aporta información a los organismos decontrol a fin de contribuir en el mejoramiento de políti-cas públicas que aseguren la inocuidad de los produc-tos de consumo humano.

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D Figura 3 - Detección de partículas viralesinfecciosas de RVA mediante IF.

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