WTX und funktionelle Analyse Signalwegs in Wilms Tumoren ??Mutationsscreen und funktionelle Analyse

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WTXMutationsscreenundfunktionelleAnalyse

desRetinsureSignalwegsinWilmsTumoren

DissertationzurErlangungdes

naturwissenschaftlichenDoktorgradesder

JuliusMaximiliansUniversittWrzburg

vorgelegtvon

JennyWegert

ausFrankenberg(Sa.)

Wrzburg2010

Eingereichtam:26.August2010

MitgliederderPromotionskommission:

Vorsitzender:..........................

Gutachter:Prof.Dr.ManfredGessler

Gutachter:Prof.Dr.Dr.ManfredSchartl

TagdesPromotionskolloquiums:......................

Doktorurkundeausgehndigtam:.....................

DieTragdiederWissenschaft

dasErschlageneinerschnenHypothesedurcheinehlicheTatsache

ThomasHuxley

Inhalt

Summary 1

Zusammenfassung 3

1. Einleitung 5

1.1. KlinikdesWilmsTumors 5

1.1.1. Epidemiologie 5

1.1.2. SymptomeundDiagnostik 5

1.1.3. HistologieundKlassifikation 6

1.1.4. Therapie 7

1.1.5. Prognose 9

1.2. GenetischeUrsachen 9

1.2.1. WilmsTumorSuppressorgen1(WT1) 10

1.2.2. Catenin 12

1.2.3. WilmsTumorGenaufdemXChromosom(WTX) 13

1.2.4. ChromosomaleVernderungen 14

1.3. ModellsystemedesWilmsTumors 15

1.4. RetinsureinderTumortherapie 16

2. ZielederArbeit 18

3. Material&Methoden 19

3.1. PrparationvonDNAundRNA 19

3.1.1. IsolierungvonDNAundRNAausTumorundNierengewebe 19

3.1.2. IsolierungvonDNAausBlut 19

3.1.3. IsolierungvonDNAundRNAausZellen 19

3.1.4. LasergesttzteMikrodissektion 20

3.2. PCRAnalysen 20

3.2.1. AgaroseGelelektrophorese 20

3.2.2. PCR 21

3.2.3. UntersuchungvonWTXDeletionen 21

3.3. LOHAnalysemitALFexpress 22

3.4. Sequenzierung 23

3.5. RealtimeRTPCR 25

3.5.1. cDNASynthese 25

3.5.2. RealtimeRTPCR 25

Inhalt

3.6. Zellkultur 28

3.6.1. VerwendeteZelllinien 28

3.6.2. Kultivierung 28

3.6.3. EtablierungprimrerWilmsTumorKulturen 28

3.6.4. Immunhistochemie(IHC) 29

3.6.5. Retinsurebehandlung 29

3.6.6. PhalloidinFrbung 30

3.6.7. SeneszenzassoziierteGalFrbung(SAGal) 30

3.7. Proteinanalysen 31

3.7.1. Proteinisolierung 31

3.7.2. SDSPAGE 31

3.7.3. WesternBlot 32

3.8. MicroarrayAnalyse 33

3.9. Statistik 33

4. Ergebnisse 34

4.1. WTXVernderungeninWilmsTumoren 34

4.1.1. WTXDeletionen 34

4.1.2. GrederdeletiertenRegion 35

4.1.3. WTXExpressionsanalyse 36

4.1.4. PunktmutationenimWTXGen 38

4.1.5. HeterogenittvonWTXMutationen 39

4.1.6. WTX,CTNNB1undWT1Mutationen 42

4.1.7. KorrelationvonWTXVernderungenundklinischenParametern 43

4.2. EtablierungundCharakterisierungprimrerWilmsTumorKulturen 45

4.2.1. KultivierungprimrerZellen 45

4.2.2. MolekulargenetischeCharakterisierungderPrimrkulturen 45

4.2.3. MorphologieprimrerWTZellen 46

4.2.4. WachstumseigenschaftenderPrimrkulturen 49

4.2.5. ImmunhistochemischeCharakterisierung 50

4.3. RetinsureSignalweginWilmsTumoren 53

4.4. EinflussvonRetinsurebehandlungaufprimreWilmsTumorKulturen 56

4.4.1. GenregulationdurchRetinoidbehandlung 57

Inhalt

4.4.2. ZellproliferationunterkurzzeitigerRetinsurebehandlung 59

4.4.3. MorphologischeVernderungenunterRetinsurebehandlung 60

4.4.4. RAinduzierteSeneszenz 63

4.4.5. ApoptoseInduktiondurchFenretinid 63

4.4.6. LangzeitbehandlungmitFenretinid 65

4.4.7. LangfristigeEffekteeinerATRABehandlung 66

4.4.8. RetinoidbehandlungvonNichtWTZellen 68

4.4.9. MicroarrayAnalysevonATRAinduzierterDifferenzierung 70

4.4.10. ValidierungderMicroarrayDaten 73

5. Diskussion 75

5.1. AnalysevonWTXVernderungeninWilmsTumoren 75

5.2. EtablierungprimrerWilmsTumorKulturen 79

5.3. RetinsureSignalweginWilmsTumoren 83

5.4. EinflussvonRetinsurebehandlungaufprimreWilmsTumorKulturen 86

6. Literatur 92

7. Abkrzungen 100

Summary

1

Summary

Wilms tumor (WT) or nephroblastoma is one of themost common solid tumors in

childhood. Itarises fromembryonalblastemaandmost frequentlypresentsasaunilateral

and sporadic tumor. Mutations in WT1 and CTNNB1 are well established as causal

alterations in about 1015 % of cases. Recently, WTX (Wilms tumor gene on the X

chromosome),agene implicated inWNTsignaling,hasbeen identifiedasathirdWTgene,

butforthemajorityofnephroblastomasthegeneticetiologyisstillunclear.

PublishedWTXmutationratesinWilmstumorsarestillbasedonsmallercohortsanddiffer

significantly. Therefore, theWTX, CTNNB1 andWT1mutation statewas determined in a

large set of 429Wilms tumors.GenomicWTX alterationswere identified in 17% ofWT,

equallydistributedbetweenmalesandfemales.Analysisof104WTsamplesforWTXpoint

mutationsrevealedafrequencyofonly2%.Anadditional11,5%oftumorsamples lacked

expressionofWTXmRNA.TheseWTXalterationscanoccur inparallel toWT1orCTNNB1

mutations. Incomplete deletion ofWTX in several cases suggested heterogeneity ofWTX

alterations in tumors and thiswas corroborated by analysis of different regions of such

tumors. IncaseswithheterozygouspointmutationsorLOH, separate tumor fragmentsor

microdissected regions with different histology were analyzed. Despite complete allele

lossesatchromosome11varyingratiosofWTXmutationweredetected.Thissuggeststhat

WTXalteration isnotanessentialandearlymutationneeded todrive tumorigenesis,but

ratheralateeventthatmayaffectonlyafractionofcellswithunclearclinicalrelevance.This

hypothesis is supported by the fact that there is no significant correlation betweenWTX

deletion statusorexpression levelandclinicalparameters suggesting thatWTXmutations

apparentlyhavelittledirectimpactontumorbehaviorandpresentation.

As there isno invitromodel fornephroblastoma that couldbeused to investigategenes

playinga role indevelopmentandprogressionofWTor to testnew treatmentstrategies,

primaryculturesweregenerated from freshtumortissue.Cultures fromtumorsamplesof

12patientswithdifferentgeneticalterationscouldbevalidatedastumorderivedcells.Two

differentcell typescouldbedistinguishedby immunohistochemistryandcellmorphology:

largeround,slowlygrowingcellswithepithelialcharacteristicsandfibroblastlikecellsthat

arelessdifferentiatedandsomeofwhichcouldbekeptincultureformanypassagesbefore

gettingsenescent.InthiswayasetofprimaryWTcellscouldbeestablishedthatissuitable

Summary

2

forinvitroapproachestostudymechanismsofnephroblastomadevelopmentortotestnew

therapystrategies.

Priormicroarray analyses suggested a deregulation of the retinoic acid (RA) pathway in

advancedWilmstumors.Thisshouldbevalidated ina large independenttumorsetof163

WT by realtimeRTPCR. Deregulation of RA signaling and overexpression of NMYC was

foundinhighrisktumorsasopposedtotumorswithlow/intermediateriskandsuggesteda

beneficial impact of retinoic acid on advanced nephroblastoma. To investigate whether

retinoids could be employed as a novel therapeutic agent inWT primaryWTcellswere

treatedwithalltransRA(ATRA),9cisRA,thesyntheticretinoidfenretinideandcombinations

of retinoids and the HDAC inhibitor SAHA. Expression of genes deregulated in high risk

tumorswereanalyzedandshowedoppositechangesupontreatmentsuggestingapositive

effectof retinoids.Forsixofsevenprimarycultures testedcellgrowthwas reducedupon

retinoid administration. No additional synergistic effect could be observed for the

combinationofretinoidswiththeHDACinhibitorSAHA.Whilefenretinideinducedapoptosis

in several cultures tested, ATRA and 9cisRA caused morphological changes suggesting

differentiation upon treatment. Microarray analysis of ATRA treated WTcells revealed

differentialexpressionofmanygenes involved in the formationof theextracellularmatrix

andosteogenic,neuronalormuscledifferentiationprocesses.Thesefindingsprovidefurther

evidenceofapotentialutilityofretinoidsinWilmstumortreatment.

Zusammenfassung

3

ZusammenfassungDerWilmsTumor(WT)auchNephroblastomgenanntisteinerderhufigstenbsartigen

Tumoren im Kindesalter. Er entsteht aus embryonalem undifferenziertem Nierengewebe

undtrittmeistalsunilateralerundsporadischerTumorauf.In1015%derWilmsTumoren

findensichWT1und/oderCTNNB1Mutationen.Whrenddieseschonlngeralsgenetische

Ursachen des Nephroblastoms bekannt sind, wurde erst krzlich WTX als drittes Gen

beschrieben,welcheseineRolleinderTumorentstehungspielt.FreinenGroteilderWTist

diegenetischeUrsachejedochunklar.

Da die bisher publiziertenWTXMutationsraten auf Untersuchungen kleinerWTGruppen

basieren und sich stark unterscheiden, sollten in dieserArbeitWTX, CTNNB1 undWT1

Mutationen in einem groen Set von 429 WT bestimmt werden. Verluste genetischen

Materials in der WTXRegion traten in 17% der Flle auf und waren zwischen den

Geschlechtern gleich verteilt.Die Sequenzierung von104WTProben zeigte,dassnur2%

vonWTXPunktmutationen betroffen sind. In weiteren 11,5% der Proben konnte keine

WTXExpressionnachgewiesenwerden.DieWTXVernderungentratenzumTeilgemeinsam

mitWT1und/oderCTNNB1Mutationenauf.DieunvollstndigeWTXDeletionineinigenWT

legtedieVermutungnahe,dassinnerhalbeinesTumorseineHeterogenittinBezugaufden

WTXStatus mglich ist. Diese