VÝZKUMNÝ ÚSTAV ROSTLINNÉ VÝROBY, V.V.I.

Určování háďátek Xiphinema diversicaudatum a X. vuittenezi

pomocí polymerázové řetězové reakce

Shesh KumariPraha, 2008

Metodika pro praxi

Určování háďátek Xiphinema diversicaudatum a

X. vuittenezi pomocí polymerázové řetězové reakce

Ing. Shesh Kumari, Ph.D.

Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Odbor rostlinolékařství Drnovská 507, Ruzyně

16106 Praha 6 Česká republika

Email: kumari@vurv.cz

VÚRV, v.v.i., Praha 2008

Tato publikace vznikla s podporou grantu MZe 0002700603

© Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008

ISBN: 978-80-87011-98-0

Metodika je určena pro Státní rostlinolékařskou správu. Bude využita pro molekulární

identifikace háďátek druhu X. diversicaudatum a X. vuittenezi.

Oponenti:

Ing. Vladimír Gaar

Státní rostlinolékařská správa Diagnostická laboratoř Praha Drnovská 507, Ruzyně 161 06 Praha 6

Ing. Petr Svoboda, CSc.

Chmelařský Institut s.r.o. Kadaňská 2525, Žatec 438 46

Metodika byla schválena MZe ČR pod č.j. 47822/2008-18020

Obsah

1 Cíl metodiky.......................................................................................... 1

2 Morfologické a morfometrické metody ............................................. 1

2.1 Úvod ................................................................................................................. 1

2.2 Obecná charakteristika rodu Xiphinema ........................................................... 2

2.3 Stručný popis Xiphinema diversicaudatum ...................................................... 4

2.4 Stručný popis Xiphinema vuittenezi.................................................................. 9

3 Molekulární metodika ....................................................................... 13

3.1 Extrakce DNA ............................................................................................... 13

3.2 Pre-PCR .......................................................................................................... 15

3.3 PCR................................................................................................................. 20

3.4 Post-PCR......................................................................................................... 21

4 Výsledky elektroforézy ...................................................................... 24

5 Srovnání ″novosti postupů″.............................................................. 25

6 Závěr.................................................................................................... 25

7 Literatura............................................................................................ 27

7.1 Použitá literatura ............................................................................................. 27

7.2 Původní poznatky VÚRV, v.v.i. k PCR ......................................................... 29

7.3 Původní poznatky ze světa k PCR .................................................................. 29

8 Přílohy ................................................................................................. 30

8.1 Jak se vyhnout PCR kontaminaci ................................................................... 30

8.2 Přepočty .......................................................................................................... 32

8.3 Potřebné věci .................................................................................................. 34

8.4 Referenční materiál......................................................................................... 36

1 Cíl metodiky

Hlavním cílem této práce je rychlá identifikace druhů háďátek X. diversicaudatum a

X. vuittenezi pomocí spolehlivé, specifické a selektivní metody polymerázové řetězové

reakce (PCR).

2 Morfologické a morfometrické metody

2.1 Úvod

Fytoparazitická háďátka rodu Xiphinema (Nematoda: Longidoridae) způsobují přímé škody

rostlin napadením jejich kořenových buněk. Některé druhy jsou i přenašeči nepovirů a jsou

ekonomicky významné (Taylor and Brown 1997), proto rod Xiphinema postupně dostává větší

taxonomickou pozornost. Nárůst počtu nových druhů, z nichž je mnoho morfologicky a

morfometricky podobných, zdůrazňuje potřebu dalšího precizního zkoumání a diagnostické

charakteristiky. Nutnost přesné identifikace druhů je klíčová pro studia jejich škodlivosti,

vztahu virus-vektor a efektivní kontrolu. Identifikace druhů Xiphinema je založena hlavně na

morfologických znacích a morfometrických datech samiček (Loof a Luc, 1990; 1993; Loof a

kol., 1996). Druhy Xiphinema je taxonomicky těžké identifikovat i pro zkušeného nematologa,

protože morfologické a morfometrické hodnoty jednotlivých druhů se silně překrývají. Kromě

toho se jedna populace může skládat z více druhů. Navíc, jestliže jsou v půdních vzorcích

nalezeny pouze larvy, může být mikroskopická identifikace problematická.

Poměrně nová studia (Wang a kol., 2003; Oliveira a kol., 2005) mají velký potenciál pro

molekulární identifikace druhů Xiphinema. Wang a kol. (2003) navrhovali druhově specifické

primery pro čtyři druhy rodu Xipinema a pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) je

úspěšně aplikovali pro identifikaci druhů X. diversicaudatum; X. index; X. italiae a X. vuittenezi.

Ovšem pro běžnou praxi je optimalizovaná metoda PCR použitím jednotlivých chemikálií

časově náročná, proto je v této metodice zpracována rychlá diagnostika háďátek druhů X.

diversicaudatum a X. vuittenezi použitím PCR kuliček (PCR-beads).

Ačkoli bylo dokázáno, že pro rutinní identifikaci fytoparazitických háďátek je základní

diagnostika DNA rychlejší než tradiční strategie použití morfologie a morfometrických hodnot

(Wang a kol., 2003; Oliveira a kol., 2005), je morfologická identifikace dosud nezbytným

předpokladem pro základní diagnostiku DNA. Kombinace molekulárních a morfologických

studií může být nejspolehlivějším přístupem pro identifikaci druhů Xiphinema. Proto je v této

metodice také prezentován krátký popis dvou druhů.

1

2.2 Obecná charakteristika rodu Xiphinema

Kmen Nematoda Třída Adenophorea Podtřída Enoplia Řád Dorylaimida Podřád Dorylaimina Nadčeleď Dorylaimoidea Čeleď Longidoridae Podčeleď Xiphineminae Rod Xiphinema

Volně žijící fytofágní háďátka rodu Xiphinema (Cobb, 1913) jsou polyfágní a několik

druhů je vektory nepovirů (Taylor a Brown, 1997). Tato dlouhá háďátka (1 až 6 cm) se

odlišují od dalších parazitických háďátek dlouhým styletem od 89 m (X. lamberti) až

po 336 m (X. filicaudatum), s vidlicovitým odontostyletem a odontoforem s patkami.

Odontofor s bazálními křídly je rozlišujícím znakem rodu Xiphinema (obrázek 1).

Odontostylet je spojen s cheilostomou epidermální, různě zahnutou membránou (vodicí

prstenec). Dvojitý vodicí prstenec je umístěn na odontostyletu, těsně před jeho spojením

s odontoforem. Amfidní póry mají širokou štěrbinu a amfidní váček je nálevkovitý.

Hlavová část je kulatá nebo lehce zploštělá, navazuje na tělní obrys nebo je spojená se

spojovacím článkem. Pysky jsou sloučeny, obvykle s uspořádáním papil v počtu 6 + 10.

Dvoudílný jícen je typický pro Dorylaimida - užší přední trubicovitá část (která je

obvykle jako smyčka, když je odontostylet ve stažené pozici) a zduřený žláznatý a

svalnatý zadní bulbus. Jícnové žlázy jsou tři (dvě ventrosublaterální a jedna dorzální).

Střevo je jednoduché, dobře vyvinuté prerektum je několikrát delší než šířka těla v

oblasti anusu. Vulva se obvykle nachází ve středu párových gonád, občas se může

nacházet před nebo za mediánem.

Svalnatá vagina vedoucí k mohutnému ovijektoru leží v pravém úhlu k tělní ose a je

dobře vyvinuta. Genitální trakty jsou typicky amfidelicky zahnuté, ale mohou být i

pseudomonodelfické nebo mono-opistodelfické. Struktura gonád je často rozdílná, s

charakteristickými rysy pro jednotlivé druhy. Samičky mohou mít jeden nebo dva

vaječníky. Pokud se vyskytují oba vaječníky, jsou umístěny naproti sobě a zahnuty.

2

Obrázek 1 . Xiphinema. A: Přední část prvního larválního stadia; B: Přední část

druhého až čtvrtého larválního stadia; C: Přední část samičky; D: Celkový tvar

samečka; E: Celkový tvar samičky; F-M : Ocas samičky a samečka ( X. pachtaicum, X.

vuittenezi, X. diversicaudatum a X. brevicollum). 1: Funkční stylet; 2: Náhradní stylet;

3: Odonstostylet; 4: Odontofor; 5: Vodící kroužek; 6: Bazální křídla; 7: Mukro; 8:

Přídatné kopulační orgány. (částečně podle Kumari, 2005)

3

Genitální trakt samečků je diorchický, protikladný, zadní varle bývá zahnuto. Obě

varlata jsou spojena společným chámovodem těsně před kloakou. Spikuly jsou

dorylaimoidní, velké a párové. Kopulační svaly jsou šikmé a prominentní. Kopulační

přídatné orgány jsou ve formě adanálních párů a poté ventromediální série pěti až

deseti papil. Počet a uspořádání těchto papil má význam pro charakteristiku druhů.

Samečci mají párové spikuly, ale nemají gubernákulum ani burzu.

Tvar ocasu je rozdílný, ale většinou podobný u každého pohlaví. Ocas může být

krátký, zaoblený ale i zúžený, kuželovitý, zřídka i nitkovitý.

2.3 Stručný popis Xiphinema diversicaudatum

Obrázek 2; Tabulky 1 a 2

Samičky

Teplem usmrcení jedinci Xiphinema diversicaudatum (Micoletzky, 1927) Thorne,

1939 jsou na ventrální straně zahnuti do otevřené spirály. Tělní pokožka je hladká,

vnější vrstva užší než vnitřní. Hlavová část je malá, hladce zaoblená, spojená s tělním

obrysem. Amfidy jsou třmínkovité, postlabiální, téměř stejně široké jako oblast pysků.

Délka těla je 3,4-5,4 mm. Odontostylet je dlouhý 120-147 µm, na bázi zřetelně

rozvětvený. Odonofor s nápadnými bazálními křídly měří 67-91 µm. Vodící kroužek

měří 104-135 µm od předního konce. Nervový prstenec je malý a nachází se za

odontoforem. Jícen je dorylaimoidní (dvoudílný jícen - užší trubicovitá přední část a

zduřený žláznatý a svalnatý zadní bulbus). Jádro dorzální jícnové žlázy se nachází

blízko předního konce jícnového bulbusu a subventrální žlázy blízko středu. Vulva ve

tvaru příčné štěrbiny je umístěna ve 38-45% těla. Genitální trakt je amfidelický,

zahnutý. Každý vejcovod a děloha jsou připojeny pomocí svěrače. Nápadný pseudo Z-

orgán je přítomen a skládá se z 10-20 nepravidelných, 3-10 µm dlouhých kulovitých

orgánů podobných květáku. Prerektum je 7-12 krát delší než šířka těla. Rektum je

kratší než šířka těla v oblasti anusu. Ocas je kuželovitý, dorzálně vypuklý, ventrálně

poněkud zploštěný, zakončený s prstovitě zakulaceným, 7-14 µm dlouhým mukrem. U

některých jedinců mukro chybí, což je pravděpodobně způsobeno mechanickým

poškozením.

4

Obrázek 2: Xiphinema diversicaudatum. A-F Celá háďátka. A: Sameček; B: Samička;

C: J4; D: J3; E: J2; F: J1. G: Zadní pohlavní větev (šipka znázorňuje Z-orgán); H:

Bulbus jícnu samičky; I: Vulva; J: Přední část těla samičky; K: Ocas samičky bez

mukra; L: Ocas samičky s mukrem; M: Ocas samečka; N: Ocas J1; O: Ocas J2; P: Ocas

J3; Q: Ocas J4. ( podle Kumari, 2006)

5

6

Samečci

Samečci se obvykle vyskytují ve stejném počtu jako samičky, reprodukce je

amfimiktická. Tvar těla, hlavová část, odontostylet a jícen jsou popsány stejně jako u

samiček. Dvě varlata jsou umístěna napravo od střeva, jedno je zepředu roztaženo,

druhé zahnuto; chámovod je vyplněn vřetenovitými spermiemi. Kopulační přídatné

orgány se skládají z jednoho adanálního páru a 3-7 párů na ventrální straně. V oblasti

přídatných orgánů se nachází silné šikmé kopulační svaly způsobující silné zakřivení

ocasu. Spikuly jsou 63-79 µm dlouhé, v blízkosti středu na ventrální straně zahnuté.

Ocas je podobný jako u samiček, jen více zahnutý díky přítomnosti kopulačních svalů.

Larvy

Přední část těla se podobá dospělým jedincům, ale celkově jsou menší, a s trochu

odlišnými rozměry. Čtyři larvální stadia jsou rozpoznány podle délky těla a podle

funkčního a náhradního odontostyletu. Náhradní odontostylet je vždy přítomen na

přední straně jícnu a v prvním stadiu jeho přední konec leží v odontoforu funkčního

odontostyletu (viz obrázek 1). Délka náhradního odontostyletu jednoho stadia se

shoduje s délkou funkčního odontostyletu dalšího stadia (viz Tabulka 1). Pouze larvy

čtvrtého stadia mají ocas podobný dospělým jedincům, u dřívějších stádií je více zúžen

s nezřetelným mukrem. První larvální stadium má prodloužený kuželovitý, na ventrální

straně obloukovitě prohnutý ocas (obrázek 2).

Lokalita

HostitelJedinci J1 J2 J3 J4 ♀ ♂ ♀ (menší)

n 7 6 18 14 22 10 1L 1010 ± 81 1445 ± 90 2274 ± 210 3241 ± 349 4644 ± 369 4591 ± 307 3245

(873-1102) (1320-1550) (1817-2559) (2636-3859) (3974-5484) (4154-5126)a 42,6 ± 2,80 43,0 ± 2,42 51,9 ± 4,15 59,6 ± 5,07 64,5 ± 3,25 69,5 ± 3,78 52,3

(36,7-45,1) (39,6-45,6) (46,5-60,5) (52,0-71,2) (59,5-69,9) (65,0-76,7)b 4,1 ± 0,40 4,9 ± 0,29 5,9 ± 0,59 7,2 ± 0,76 9,5 ± 0,93 8,9 ± 0,52 7,6

(3,4-4,6) (4,6-5,3) (4,9-7,1) (6,1-8,3) (7,8-11,4) (8,1-10,0)c 18,2 ± 1,14 23,6 ± 1,94 40,0 ± 5,91 61,5 ± 9,00 102,6 ± 8,95 96,0 ± 9,61 75,5

(16,5-20,1) (20,6-26,3) (31,7-56,3) (48,0-78,8) (88,3-121,1) (78,8-108,9)c΄ 3,64 ± 0,28 2,71 ± 0,32 1,84 ± 0,24 1,31 ± 0,13 0,88 ± 0,08 0,99 ± 0,06 0,91

(3,36-4,07) (2,46-3,30) (1,40-2,21) (1,17-1,65) (0,73-1,02) (0,92-1,09)V/spikuly — — — — 40,0 ± 1,49 74 ± 5,09 42,5

(37,7-43,2) (67-85)Náhradní stylet 67 ± 2,27 88 ± 5,05 111 ± 5,32 136 ± 4,99 — — —

(62-69) (81-95) (97-118) (129-145)Odontostylet 51 ± 1,38 64 ± 1,17 87 ± 3,12 108 ± 4,26 132 ± 4,69 132 ± 4,74 111

(49-52) (63-66) (81-93) (99-113) (123-138) (124-140)Odontofor 37 ± 1,90 46 ± 1,67 57 ± 2,06 69 ± 3,07 81 ± 3,11 80 ± 2,79 73

(34-39) (44-49) (53-61) (63-73) (76-86) (75-84)

Celková délka styletu 87 ± 2,69 110 ± 2,32 144 ± 6,51 178 ± 5,87 213 ± 6,36 212 ± 5,87 184

(83-90) (107-114) (125-154) (168-186) (200-224) (202-220)

Největší šířka křídel 7 ± 0,58 9 ± 0,55 10 ± 0,99 11 ± 0,73 12 ± 0,75 12 ± 1,37 13

(6-8) (8-9) (8-11) (10-13) (11-14) (9-14)

41 ± 1,83 54 ± 4,13 79 ± 5,45 94 ± 8,17 120 ± 9,31 120 ± 8,08 108

(39-44) (50-62) (69-93) (78-107) (104-135) (109-133)

Délka bulbusu jícnu 61 ± 5,19 72 ± 4,68 85 ± 5,18 96 ± 6,59 108 ± 6,62 109 ± 5,59 102

(51-65) (64-76) (69-91) (83-109) (94-118) (102-119)

Šířka bulbusu jícnu 14 ± 2,23 20 ± 1,83 24 ± 2,61 27 ± 2,83 32 ± 3,59 31 ± 2,84 34

(12-18) (18-23) (18-28) (23-32) (26-40) (25-35)

Délka ocasu 56 ± 4,47 62 ± 4,42 57 ± 5,07 53 ± 4,60 45 ± 4,19 48 ± 5,35 43

(47-60) (55-66) (42-63) (48-61) (38-52) (40-57)

Délka hyalinních pysků 9 ± 1,11 15 ± 2,28 19 ± 2,32 16 ± 1,79 16 ± 2,68 17 ± 2,23 14

(7-10) (11-18) (14-23) (14-19) (11-21) (14-21)

Průměr těla v oblasti pysků 7 ± 0,53 8 ± 0,52 10 ± 0,84 11 ± 0,61 13 ± 0,75 13 ± 0,74 12

(7-8) (8-9) (8-12) (10-12) (12-14) (12-14)

u vodícího kroužku 16 ± 0,38 23 ± 1,94 29 ± 2,43 35 ± 3,20 45 ± 3,31 42 ± 4,01 40

(16-17) (20-25) (26-35) (29-40) (40-50) (36-47)

na bázi jícnu 23 ± 2,21 32 ± 3,01 41 ± 4,58 51 ± 6,96 63 ± 4,44 59 ± 5,38 56

(20-27) (28-36) (29-48) (37-61) (56-70) (50-66)

u vulvy 24 ± 3,24 34 ± 2,66 44 ± 5,43 55 ± 7,27 72 ± 4,79 66 ± 5,07 62

(20-30) (31-38) (30-54) (37-65) (64-83) (58-73)

u anusu 15 ± 1,38 23 ± 1,94 31 ± 3,53 41 ± 3,46 52 ± 5,15 48 ± 3,62 47

(13-17) (20-26) (25-39) (32-46) (42-63) (42-53)

na počátku hyalinní části 6 ± 0,76 8 ± 0,82 11 ± 0,98 17 ± 1,45 24 ± 3,03 24 ± 4,11 22

(6-8) (7-9) (9-13) (14-19) (19-28) (18-32)

7

višeňBílé Podolí

Vzdálenost od ústního otvoru po vodící kroužek

Tabulka 1. Morfometrické hodnoty Xiphinema diversicaudatum . Všechny hodnoty jsou v µm ve formě: střední hodnota ± směrodatná odchylka (rozpětí) (podle Kumari 2006)

ZeměČeská

republikaJugoslávie Slovensko

Česká republika

Jugoslávie Slovensko

ReferenceKumari a kol.,

2005

Barsi a Lamberti ,

2000a

Lišková a kol., 1992

Kumari a kol., 2005

Barsi a Lamberti,

2000a

Lišková a kol., 1992

Jedinci ♀ ♀ ♀ ♂ ♂ ♂

n 22 17 7 16 10 7L 4679 ± 254 4200 ± 300 4300 4686 ± 244 4200 ± 290 4400

(3993-4991) (3680-4640) (4000-4600) (4304-5133) (3740-4730) (4100-4700)a 66,9 ± 5,38 78 ± 5,31 78,0 70,0 ± 3,98 78,6 4,45 89,0

(57,1-76,5) (65,6-88,3) (73-82) (62,6-75,2) (72,9-86,4) (86-91)b 10,0 ± 0,59 8,9 ± 0,82 9,2 9,1 ± 0,67 8,7 0,43 9,2

(8,8-11,0) (7,6-11,2) (8,7-10,7) (8,2-11,0) (8,1-9,5) (8,2-11,3)c 93,0 ± 9,74 84,8 ± 5,71 86,0 84,1 ± 7,62 78,3 4,71 90,0

(77,5-120,0) (77,2-101,7) (73-94) (73,7-98,3) (70,2-83,3) (80-96)c΄ 1,03 ± 0,09 1,18 ± 0,06 1,20 1,17 ± 0,10 1,22 ± 0,13 1,00

(0,87-1,20) (1,04-1,28) (1,0-1,3) (1,04-1,32) (0,98-1,48) (1,0-1,2)V/spikuly 44 ± 1,18 42,9 ± 1,50 43 72 ± 3,43 69,8 ± 2,66 69

(41-45) (40,4-45,2) (42-45) (63-79) (65,7-72,8) (63-70)Odontostylet 129 ± 3,76 130 ± 3,16 142 131 ± 4,19 130 ± 6,61 135

(121-135) (124-134) (133-147) (125-138) (120-141) (133-143)Odontofor 85 ± 3,12 75 ± 2,26 76 86 ± 3,00 74 ± 2,36 79

(79-89) (70-79) (70-80) (81-91) (70-76) (77-84)Celková délka styletu 213 ± 4,46 204 ± 4,26 217 ± 5,47 204 ± 8,0

(205-221) (196-213) (208-227) (195-216)Největší šířka křídel 13 ± 0,83 13 ± 0,93

(11-15) (11-14)

117 ± 5,93 115 ± 3,79 129 123 ± 5,73 118 ± 5,37 123

(107-126) (107-121) (119-133) (112-131) (112-128) (105-133)Délka bulbusu jícnu 101 ± 5,59 114 ± 6,00

(94-114) (103-126)Šířka bulbusu jícnu 30 ± 3,25 28 ± 2,30

(23-37) (22-32)Délka ocasu 51 ± 4,47 50 ± 3,41 50,00 56 ± 5,00 54 ± 4,84 48

(40-60) (43-54) (49-56) (47-66) (47-64) (44-54)Délka hyalinních pysků 18 ± 1,74 16 ± 2,70 21 18 ± 1,85 17 ± 1,89 19

(15-21) (8-19) (19-21) (14-20) (14-21) (14-22)Délka mukra 10 ± 1,51 12 ± 1,25

(7-13) (9-14)Přídatné orgány — 6 ± 0,93

(4-8)Průměr těla v oblasti pysků 13 ± 0,87 14 ± 0,30 14 14 ± 0,70 14 ± 0,38 13

(12-15) (13-14) (13-14) (12-15) (13-14) (10-14) u vodícího kroužku 43 ± 3,36 38 ± 1,07 38 42 ± 1,67 38 ± 1,38 36

(39-51) (36-40) (35-41) (40-45) (36-40) (35-38) na bázi jícnu 60 ± 5,12 48 ± 1,99 48 58 ± 4,78 48 ± 1,90 48

(53-68) (44-51) (42-49) (49-66) (43-50) (45-49) u vulvy 70 ± 5,52 54 ± 3,53 55 67 ± 4,06 54 ± 2,37 49

(60-79) (48-60) (52-56) (60-72) (47-55) (43-54) u anusu 49 ± 4,11 42 ± 1,59 44 48 ± 2,12 44 ± 2,17 46

(40-57) (38+44) (42-49) (43-52) (41-48) (42-49)

na počátku hyalinní části 24 ± 2,67 19 ± 2,69 25 19 ± 2,21 20 ± 3,37 24(20-31) (10-21) (21-28) (15-23) (15-25) (21-28)

* hodnoty ze Slovenska jsou bez směrodatné odchylky

8

Tabulka 2. Morfometrické hodnoty Xiphinema diversicaudatum z České republiky (Hrušky), Slovenska a Jugoslávie.Všechny hodnoty jsou v µm ve formě: střední hodnota ± směrodatná odchylka (rozpětí)*

Vzdálenost od ústního otvoru po vodící kroužek

2.4 Stručný popis Xiphinema vuittenezi

Obrázek 3; Tabulky 3 a 4 Samičky

Tělo Xiphinema vuittenezi Luc, Lima, Weischer & Flegg, 1964 je protáhle válcovité

(2,6-4,1 mm) a má tvar otevřené spirály s větším zakřivením v jeho zadní polovině.

Kutikula má zřetelnou vnější vrstvu v oblasti pysků. Hlavová část je hemisférická,

zvýrazněna nepatrným důlkem za amfidními póry. Amfidy jsou třmínkovité, se

štěrbinou podobnou pórům téměř stejně dlouhou jako šířka oblasti pysků. Amfidní póry

jsou někdy viditelné jako nezřetelná čára. Odontostylet měřící 116-139 µm, je na bázi

rozvětven, čímž vytváří pevné spojení k 66-92 µm dlouhému odontoforu se třemi

velkými bazálními křídly. Vodicí kroužek měří 91-133 µm od předního konce. Nervový

prstenec je malý a nachází se za odontoforem. Jícen je dorylaimoidní. Střevo obsahuje

rozptýlené granule a vakuoly. Vulva (46-57%) je hluboká, s příčnou štěrbinou a

svalnatým pyskem. Spermatéka je 2-3 krát delší než šířka těla. Vaječníky jsou zahnuty.

V děloze se obvykle nachází tenké, neidentifikované, 8-10 µm dlouhé orgány (pseudo

Z-orgány). Prerektum je 10krát delší než šířka těla. Ocas je kuželovitý, dorzálně

vypuklý, ventrálně poněkud zploštěný, s prstovitě zakulaceným, 2-6 µm dlouhým

mukrem. U některých jedinců mukro chybí, což je způsobeno mechanickým

poškozením. X. vuittenezi má v porovnání s X. diversicaudatum kratší mukro, umístěné

více ve středu ocasu, zatímco X diversicaudatum má mukro delší a je umístěno více

ventrálně.

Samečci

Samečci tohoto druhu jsou hodně vzácní, rozmnožování je partenogenetické. Přední

část těla se podobá samičkám. Zadní část těla je na ventrální straně silně zakřivena. Mají

dvě roztažená varlata, umístěná naproti sobě. Spikuly jsou poměrně rovné, 58-68 µm

dlouhé. Na ventrální straně se nachází jeden adanální pár a 4-5 párů kopulačních

přídatných orgánů. Ocas je podobný jako u samiček, jen více zahnutý díky přítomnosti

kopulačních svalů.

Larvy

Přední část těla se podobá dospělým jedincům, ale celkově jsou menší, a s trochu

odlišnými rozměry. Čtyři larvální stadia jsou rozpoznány podle délky těla a podle

funkčního a náhradního odontostyletu. Náhradní odontostylet je vždy přítomen na

9

10

Obrázek 3: Xiphinema vuittenezi. A-D: Přední část těla J1- J4; E-H: Ocas J1-J4; I:

Stylet samičky; J, K: Přední část těla a ocas samečka; L: Ocas samičky bez mukra; M:

Ocas samičky s mukrem. (podle Kumari, 2004)

Lokalita

Jedinci J1 J2 J3 J4 ♀ ♂n 12 13 17 19 28 3L 850 ± 48 1247 ± 99 1632 ± 93 2430 ± 96 3379 ± 223 3346 ± 33

(798-949) (1086-1402) (1466-1765) (2214-2619) (3008-4109) (3313-3379)a 32,6 ± 2,19 41,0 ± 3,00 38,7 ± 3,10 41,4 ± 2,05 52,3 ± 2,97 55,0 ± 3,40

(29,7-36,3) (36,5-46,9) (33,7-44,6) (36,9-44,9) (48,3-60,9) (52,0-58,7)b 3,6 ± 0,28 4,1 ± 0,35 4,3 ± 0,43 5,3 ± 0,20 6,9 ± 0,54 6,9 ± 0,29

(3,3-4,2) (3,5-4,5) (3,0-4,8) (5,0-5,8) (6,0-8,3) (6,7-7,2)c 18,1 ± 1,13 25,6 ± 1,64 37,4 ± 2,26 59,6 ± 5,08 90,9 ± 8,13 83,1 ± 3,95

(16,3-20,0) (23,4-29,0) (32,1-41,4) (49,7-69,1) (79,0-108,5) (78,6-85,8)c΄ 2,90 ± 0,36 2,34 ± 0,21 1,39 ± 0,14 0,94 ± 0,07 0,81 ± 0,08 0,91 ± 0,06

(2,32-3,42) (2,04-2,72) (1,13-1,71) (0,85-1,05) (0,70-1,03) (0,86-0,98)V/spikuly — — — — 51 ± 1,12 65 ± 2,08

(49-55) (63-67)Náhradní stylet 62 ± 1,42 84 ± 3,96 108 ± 3,98 130 ± 2,55 — —

(60-64) (72-88) (102-114) (126-136)Odontostylet 51 ± 1,07 62 ± 1,26 83 ± 4,25 105 ± 2,95 128 ± 4,44 128 ± 1,00

(48-52) (59-63) (75-90) (100-112) (117-134) (127-129)Odontofor 37 ± 1,04 49 ± 1,90 57 ± 1,80 69 ± 1,92 78 ± 2,39 79 ± 1,15

(36-39) (44-51) (54-60) (66-72) (73-82) (78-80)Celková délka styletu 88 ± 1,23 110 ± 2,61 140 ± 5,71 174 ± 2,79 206 ± 5,30 207 ± 2,08

(85-89) (105-114) (129-150) (167-181) (192-213) (205-209)Největší šířka křídel 8 ± 0,67 9 ± 0,49 11 ± 1,07 12 ± 0,90 13 ± 0,90 13 ± 0,58

(7-9) (8-10) (9-13) (11-14) (11-15) (12-13)41 ± 1,57 57 ± 1,91 76 ± 3,10 96 ± 4,18 108 ± 5,00 105 ± 1,15(38-43) (53-61) (69-81) (86-104) (101-118) (104-106)

Délka bulbusu jícnu 70 ± 3,98 83 ± 4,54 96 ± 5,24 115 ± 5,44 126 ± 5,55 124 ± 2,00(62-76) (76-89) (81-103) (107-129) (115-137) (122-126)

Šířka bulbusu jícnu 14 ± 1,80 15 ± 1,12 20 ± 2,38 24 ± 2,45 29 ± 2,71 30 ± 2,08(11-17) (13-17) (16-24) (19-28) (24-35) (28-32)

Délka ocasu 47 ± 2,31 49 ± 2,69 44 ± 2,66 41 ± 3,33 37 ± 2,88 40 ± 2,30(44-51) (45-55) (39-49) (34-47) (34-43) (39-43)

Délka hyalinních pysků 10 ± 0,88 13 ± 1,36 12 ± 1,91 12 ± 1,66 14 ± 1,81 12 ± 0,58(9-11) (11-15) (7-15) (10-17) (10-17) (11-12)

Přídatné orgány — — — — — 6 ± 0,00(6-6)

Délka mukra — — — — 4 ± 0,89 4 ± 0,58(2-6) (4-5)

Průměr těla v oblasti pysků 8 ± 0,00 9 ± 0,55 10 ± 0,59 12 ± 0,67 14 ± 0,84 14 ± 0,57(8-8) (8-10) (9-11) (11-13) (12-15) (13-14)

u vodícího kroužku 22 ± 1,56 24 ± 1,78 34 ± 3,37 43 ± 2,04 45 ± 2,62 43 ± 1,53(19-24) (22-27) (26-38) (39-45) (40-49) (42-45)

na bázi jícnu 26 ± 2,17 30 ± 3,00 42 ± 4,69 56 ± 2,32 59 ± 3,11 59 ± 2,08(23-29) (25-34) (32-48) (52-59) (53-64) (57-61)

u vulvy 25 ± 2,62 30 ± 3,25 43 ± 4,93 58 ± 3,08 65 ± 4,10 61 ± 4,00(21-28) (26-35) (33-49) (52-65) (55-74) (57-65)

u anusu 16 ± 1,83 21 ± 2,18 32 ± 3,44 43 ± 2,09 46 ± 2,88 44 ± 0,58(14-19) (18-24) (24-38) (40-47) (39-54) (44-45)

na počátku hyalinní části 6 ± 0,58 8 ± 0,77 13 ± 1,84 21 ± 2,11 29 ± 3,51 24 ± 1,53(5-7) (7-10) (8-15) (15-26) (23-37) (23-26)

11

Polešovice

Tabulka 3. Morfometrické hodnoty Xiphinema vuittenezi . Všechny hodnoty jsou v µm ve formě: střední hodnota ±směrodatná odchylka (rozpětí) (podle Kumari a kol. 2005)

Vzdálenost od ústního otvoru po vodící kroužek

Země Česká republika Srbsko Slovensko Česká republika Srbsko

Reference Kumari, 2003Barsi a Lamberti,

2000bLiskova a kol,

1995Kumari a

Decreamer, 2006Barsi a Lamberti,

2000b

n 219♀ 30♀ 20♀ 8♂ 3♂L 3315 ± 221 3400 ± 270 3600 3201 ± 313 3400 ± 150

(2561-3809) (2750-3920) (3100-3800) (2757-3730) (3,25-3,54)a 57,4 ± 4,28 66,9 ± 4,06 63 59,0 ± 3,93 70,2 ± 3,55

(47,7-70,5) (59,9-76,0) (56-72) (54,4-65,3) (66,7-73,8)b 6,7 ± 0,45 6,9 ± 0,50 6,9 7,0 ± 0,75 7,0 ± 0,15

(5,2-7,7) (5,7-7,8) (6,2-8,1) (5,9-8,0) (6,9-7,2)c 85,4 ± 8,49 80,7 ± 5,81 89,0 76,0 ± 8,93 75,4 ± 6,51

(65,6-123,0) (72,3-96,3) (76-101) (64,1-95,6) (67,9-79,6)c΄ 0,95 ± 0,09 1,09 ± 0,07 0,9 1,11 ± 0,14 1,15 ± 0,07

(0,68-1,34) (0,93-1,22) (0,8-1,3) (0.98-1.43) (1,11-1,23)V/spikuly 51,5 ± 1,54 50,1 ± 1,32 50,00 63 ± 2,07 66,1 ± 2,31

(47,6-56,8) (48,0-52,3) (48-53) (59-66) (63,5-67,8)Odontostylet 128 ± 3,97 127 ± 3,09 130 124 ± 4,26 124 ± 3,90

(116-139) (118-131) (120-137) (117-130) (120-128)Odontofor 79 ± 2,79 75 ± 2,12 83 73 ± 0,83 74 ± 1,04

(67-86) (69-78) (77-92) (72-74) (74-76)Celková délka styletu 207 ± 4,37 202 ± 4,64 197 ± 4,11 199 ± 2,90

(194-216) (189-209) (191-203) (196-201)Největší šířka křídel 13 ± 1,02 12 ± 1,04

(9-16) (11-14)

103 ± 4,73 116 ± 6,08 113 104 ± 6,55 117 ± 5,65

(91-129) (91-123) (107-132) (96-117) (111-123)Délka bulbusu jícnu 123 ± 5,25 120 ± 5,34

(106-138) (116-133)Šířka bulbusu jícnu 29 2,91 24 ± 2,05

(23-37) (21-26)Délka ocasu 39 ± 3,16 42 ± 3,71 39 42 ± 2,97 45 ± 2,51

(30-47) (34-48) (37-45) (39-47) (43-48)Délka hyalinních pysků 14 ± 2,00 12 ± 1,23 13 12 ± 2,38 10 ± 1,37

(8-19) (9,4-14,4) (10-17) (8-16) (9-12)Přídatné orgány 5 ± 0,35

(4-5)Průměr těla v oblasti pysků 13 14 ± 0,30 14 13 ± 0,76 14 ± 0,12

(10-15) (14-15) (12-14) (12-14) (14-14) u vodícího kroužku 39 ± 2,24 38 ± 1,02 39 38 ± 2,33 38 ± 0,35

(34-46) (36-41) (35-45) (34-40) (38-38) na bázi jícnu 51 ± 4,02 46 ± 1,96 48 50 ± 3,15 45 ± 0,69

(41-61) (43-50) (45-52) (45-55) (45-46) u vulvy 57 ± 5,07 51 ± 2,81 57 54 ± 5,18 49 ± 2,21

(43-70) (45-55) (52-60) (46-60) (46-51) u anusu 41 ± 2,67 39 ± 1,89 41 40 ± 2,00 39 ± 0,75

(34-48) (35-43) (37-45) (37-44) (39-40)

na počátku hyalinní části 27 ± 2,70 22 ± 2,01 28 25 ± 2,76 19 ± 1,64(17-36) (19-28) (25-32) (22-30) (18-21)

* hodnoty ze Slovenska jsou bez směrodatné odchylky

12

Tabulka 4. Morfometrické hodnoty Xiphinema vuittenezi z České Republiky, Slovenska a Jugoslávie. Všechny hodnoty jsou vµm ve formě: střední hodnota ± směrodatná odchylka (rozpětí)*

Vzdálenost od ústního otvoru po vodící kroužek

přední straně jícnu a v prvním stadiu jeho přední konec leží za odontoforem funkčního

odontostyletu (obrázek 1). Délka náhradního odontostyletu jednoho stadia se shoduje s

délkou funkčního odontostyletu dalšího stadia (Tabulka 3). Pouze larvy čtvrtého stadia

mají ocas podobný dospělým jedincům, u dřívějších stadií je více zúžen s nedostatečně

zřetelným mukrem. První a druhé larvální stadium má prodloužený kuželovitý, na

ventrální straně obloukovitě prohnutý ocas (obrázek 3).

3 Molekulární metodika

3.1 Extrakce DNA

DNA se extrahuje pomocí metody dle Stanton a kol. (1998). Tato metoda extrakce

DNA je jedna z nejefektivnějších a rychlejších metod. Používá se opakovaně od roku

2005 pro extrakce DNA X. diversicaudatum a X. vuittenezi v nematologické laboratoři

VÚRV. Ani jeden vzorek extrahovaný touto metodu nebyl negativní, proto se tato

metoda extrakce celkové DNA doporučuje pro extrakce DNA X. diversicaudatum a X.

vuittenezi.

Potřebné věci (viz obrázek 5)

1) Eppendorf zkumavky (0,5 ml sterilní)

2) Háďátka

3) Chladnička s mrazícím boxem

4) Petriho miska

5) pH-metr

6) Pipeta a špičky

7) Stereomikroskop

8) Sterilní jehly

9) Stojan na zkumavky

10) Termoblok na zkumavky

11) Roztoky: 0,25M NaOH

0,25M HCl

0,5 M Tris-HCl (pH 8)

2% Triton X-100

13

Obrázek 5. Potřebné věci pro extrakce DNA. 1: Inkubátor na zkumavky; 2:

Stereomikroskop; 3: Box se špičkami; 4: Pipeta; 5: 2% Triton (X-100); 6: 0,5M Tris-

HCl; 7: 0,25M HCl; 8: 0,25M NaOH; 9: Rukavice; 10: Stojan na zkumavky; 11: 0,5 ml

Eppendorf zkumavky; 12: Jehly; 13: Živá háďátka v Petriho misce; 14: Háďátka ve

zkumavkách a stojan na zkumavky.

14

Postup

1) Napipetuje se 20 µl 0.25 M NaOH do každé 0,5 ml Eppendorf zkumavky.

2) Pod stereomikroskopem se přidají jednotlivá háďátka pomocí sterilní jehly do

Eppendorf zkumavek.

3) Zkumavky se inkubují přes noc při pokojové teplotě.

4) Druhý den se zkumavky s háďátky inkubují 3 minuty při 99°C v termobloku.

5) Poté se přidá

10 µl 0.25 M HCl

5 µl 0.5 M Tris–HCl (pH 8)

5 µl 2% Triton X–100

6) Zkumavky se znovu inkubují 3 minuty při 99°C.

7) Zkumavky se nechají zchladit.

8) DNA je připravená pro PCR.

Poznámka: DNA se může použít ihned pro PCR nebo se může skladovat pro další

použití v -20°C či pro dlouhodobé použití v -70°C.

3.2 Pre-PCR

Potřebné věci (viz obrázek 6)

1) Čisté PCR stojánky

2) Denaturovaný líh

3) DNA

4) Nádoba s ledem

5) Permanentní fixy

6) Pipety a špičky s filtrem

7) Rukavice

8) Sterilní ddH20

9) Zkumavky s PCR kuličkami

10) Sense primer pro X. diversicaudatum

D24 (5 ̦- GAG ATA TAA AGC GAA AAC CGC GAG -3 ̦) 11) Sense primer pro X. vuittenezi

V18 (5 ̦-GTG GAA CGA AAA GAC CTC-3 ̦) 12) Společný antisense primer

A-ITS1 (5 ̦- ACG AGC CGA GTG ATC CAC CGA TAA G -3 ̦)

15

Obrázek 6. Potřebné věci pro pre-PCR. 1: Stojan na pipety s pipetami; 2: Primery; 3:

Nádoba na led; 4: Led; 5: dd H2O; 6: DNA; 7: Denaturovaný líh; 8: Rukavice; 9: Box

se špičkami s filtrem; 10: Permanentní fixy; 11: Zkumavky s PCR kuličkami; 12: Stojan

na zkumavky; 13: Popsané zkumavky s PCR kuličkami; 14: Špičky s filtrem.

16

Složení PCR kuliček ( IllustraTM PuReTaq Ready-To-Go PCR beads )

PCR kuličky jsou navrženy tak, aby spolehlivě amplifikovaly DNA při standardních

reakčních podmínkách. PCR kuličky obsahují nezbytná činidla pro splnění pre-

optimalizace standardního PCR v reakčním objemu 25µl.

Činidla nacházející se v každé zkumavce:

Přibližně 2,5 jednotky PuReTaq polymerázy

200 µM dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

BSA

Stabilizátory

Reakční pufr (10 mM Tris-HCl pH 9.0; 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2).

Činidla přidaná navíc jsou pouze voda, DNA a primery.

Pokud je to nutné, může být navíc přidán MgCl2; k uchování výpočtů pro determinaci,

kolik roztoku MgCl2 má být přidáno, tabulka je obsažena v příloze 8.2 metodiky.

Skladování a zacházení s PCR kuličkami

Uchovávat v pokojové teplotě ve vzduchotěsném fóliovém sáčku se sušidlem.

Po otevření znovu uzavřít sáček - zahnout několikrát okraj a uzavřít klipem. V

prostředí s vysokou vlhkostí skladovat neotevřený či použity sáček v exsikátoru

pro maximální životnost produktu.

Vyřadit každou kuličku, která byla náhodně vytlačena z příslušné zkumavky.

Nosit vhodné ochranné oblečení, jako laboratorní kombinézu, bezpečnostní

brýle a rukavice.

Dbát na vyhnutí se kontaktu s pokožkou nebo očima. V případě kontaktu s

pokožkou či očima ihned umýt vodou.

17

Příprava PCR kuliček pro PCR

Vyjmout požadované množství zkumavek z fóliového sáčku. Odebrat jednotlivé

zkumavky z pásu po osmi zkumavkách přestřihnutím plastových spojení mezi

zkumavkami nůžkami.

Zkontrolovat tyto zkumavky kvůli ověření, jestli je kulička viditelná na dně

každé zkumavky. Vyřadit každou kuličku, která se zdá být podstatně menší nebo

deformovaná (indikace kontaminace vlhkostí).

Pokud je to nutné, zlehka poklepat zkumavkou o tvrdý povrch, aby se každá

kulička usadila se na dně zkumavky.

Důležité! Při vykonávání PCR amplifikace nutno dodržovat extrémní pozornost

předcházení kontaminace cizí DNA (viz příloha 8.1)

Postup

1) Nasadí se čisté rukavice a stůl se očistí denaturovaným lihem.

2) Na čistém stojánku se nechají rozmrazit alikvoty primerů a sterilní ddH20 při

pokojové teplotě.

3) Po rozmrazení se chemikálie udržují na ledu při teplotě 1-4 °C.

4) Připraví se 0,2 ml zkumavky s PCR kuličkami podle počtu vzorků (viz. výše

“příprava PCR kuliček pro PCR”).

5) Zkumavky s PCR kuličkami se popíší permanentním fixem.

6) Před použitím je nutné alikvoty primerů a vzorky DNA jemně promíchat

pipetou.

7) Nemíchat obsah PCR zkumavek do té doby, než jsou přidána všechna níže

uvedená činidla.

8) Do každé zkumavky s PCR kuličkou se napipetuje

20 µl sterilní ddH20

2 µl specifického primeru (dle zkoumaného druhu)

2 µl univerzálního primeru A-ITS1

9) Přidá se 1 µl DNA.

18

10) Zavřít víčka zkumavek, zatlačit pevně dolů k zabezpečení utěsnění. Zamíchat

obsah zkumavek klepnutím prsty do stěny zkumavky (finger-flick) nebo

pozvolna vortexovat a poté zkumavky centrifugovat po několik sekund, aby se

přesunuly všechny součásti na dno zkumavek.

11) Před PCR amplifikací minimalizovat čas chlazení na ledu, aby se zabránilo

formování nežádoucích produktů.

Pro větší počet vzorků se doporučuje připravit master mix ddH20 a dvou

primerů.

Příklad master mixu pro 25 vzorků X. diversicaudatum:

20µl ddH20 x 25 vzorků = 500 µl

2 µl primeru D24 x 25vzorků = 50 µl

2 µl primeru A-ITS1 x 25vzorků = 50 µl

Celkový objem 600 µl

Počet vzorků 25 = 24 µl master mixu do jedné zkumavky

Do každé zkumavky se napipetuje 24 µl master mixu a poté se přidá 1µl DNA.

Poznámky

Vždy připravit navíc master mix pro jeden dodatečný vzorek.

Ujistit se, že kuličky jsou dostatečně rozpuštěny.

19

3.3 PCR

Potřebné věci (viz obrázek 7)

1) PCR zkumavky připravené z “pre-PCR”

2) Stojan na zkumavky

3) Termocykler

Obrázek 7. Potřebné věci pro PCR. 1: Stojan na zkumavky;

2: Zkumavky z “pre-PCR”; 3: Termocykler

Postup

Zkumavky se vloží do termocykleru a jsou vystaveny následujícím podmínkám:

Počáteční denaturace 94°C = 3:00 min

Denaturace 94°C = 0:30 min

Annealing 55°C = 0:30 min 40X

Extenze 72°C = 0:30 min

Finální extenze 72°C = 10:00 min

20

Za 2 hodiny 4 minuty se termocykler vypne a zkumavky se dají do 4°C nebo pro další

použití do -20°C či do -70°C.

Poznámka

Tento program je optimalizován pro PTC–1148 termocykler (Bio-Rad).

3.4 Post-PCR

Potřebné věci (viz obrázek 8)

1) Agaróza

2) Analytická váha

3) Barvivo (Loading dye)

4) Délkový standard DNA (DNA ladder)

5) Erlenmayerovy baňky

6) Fotoaparát a tmavá komora

7) Horizontální elektroforetický aparát

8) Hřebeny do elektroforetické vany

9) Nádoba s ledem

10) Odměrný válec

11) Pipeta a špičky

12) Tepelná plotýnka

13) Sybr safe nebo ethidium bromid

14) TAE pufr

15) Transiluminátor

16) Vanička na agarózu

17) Váženka

18) Vzorky

19) Zdroj k elektroforéze

21

Obrázek 8. Potřebné věci pro post PCR. 1: Analytická váha; 2: Erlenmayerova baňka;

3: Tepelná plotýnka; 4: Fotoaparát; 5: Tmavá komora; 6: Transiluminátor; 7: Zdroj na

elektroforézu; 8: Horizontální elektroforetický aparát; 9: Pipeta; 10: Sybr safe; 11: Box

se špičkami; 12: Váženka; 13: Loading dye a DNA ladder; 14: Vanička na agarózu; 15:

TAE pufr; 16: Hřebeny; 17: Agaróza; 18: Amplifikované vzorky; 19: Stojan na

zkumavky; 20: Nádoba s ledem.

22

Postup

1) Připraví se vanička (např. 60x80mm) na agarózu a přiloží se hřeben na potřebné

množství vzorků.

2) Na analytické váze se na vážence naváží požadované množství agarózy.

3) Navážená agaróza se přesype do Erlenmayerovy baňky.

4) Na odměrném válci se naměří 40 ml 1x TAE pufru. Naměřený TAE pufr se

nalije do Erlenmayerovy baňky s naváženou agarózou.

5) Směs se ohřeje v Erlenmayerově baňce na plotýnce za průběžného promíchávání

a nechá se zchladit v pokojové teplotě.

6) Připipetuje se 0.4 l sybr safe nebo ethidium bromidu, vše se opatrně zamíchá a

nalije se do předem připravené vaničky s hřebenem. Je třeba dbát na to, aby po

přelití nezůstaly v gelu bublinky vzduchu.

7) Po ztuhnutí gelu (cca 30-45min) se hřeben opatrně vyjme a vanička se vloží do

horizontálního elektroforetického aparátu.

8) Loading dye (5 l) se promíchá s 25 l PCR produktu.

9) Do první a poslední jamky se napipetuje 5 l markeru (DNA ladder). Vzorky

(5l) se nanáší do jamek (z prava do leva). Nakonec se nanáší pozitivní kontrola

a kontrola bez DNA.

10) Elektroforetická vana se uzavře víkem.

11) Připojí se elektroforéza na zdroj a zapne se na 10 min na 40 voltů a poté na 1,5

hodiny na 55 voltů.

12) Po ukončení se elektroforéza odpojí. Gel se vyjme, vloží na transiluminátor a

vyfotí.

Elektroforetická separace PCR produktů na agarózovém gelu poskytuje možnost porovnat

velikost očekávaných amplikonů s délkovým standardem DNA. DNA se separuje

elektroforeticky na základě svého náboje a molekulární hmotnosti. Délka doby elektroforetické

separace je závislá na požadované délce dráhy migrace, protékajícím elektrickém proudu,

použitém elektroforetickém pufru a na koncentraci agarózy v gelu. Přidáním sybr safe nebo

ethidium bromidu do agarózového gelu je umožněno vizualizovat po proběhlé elektroforéze

proužky rozdělené DNA. Vizualizace PCR produktů po elektroforetické separaci probíhá

pomocí UV záření. Sybr safe nebo ethidium bromid se naváže na DNA a při excitaci UV

zářením vyzařuje. Hledaný produkt se pod UV světle zviditelní do podoby svítícího proužku,

podle srovnání pozice tohoto proužku s pozicí DNA fragmentů délkového standardu je pak

určena délka produktu.

23

4 Výsledky elektroforézy

Druhově specifický primer D24 a A-ITS1 amplifikuje 813 bp dlouhý fragment pro X.

diversicaudatum (obrázek 9). Druhově specifický primer V18 se společným opačným

primerem A-ITS1 amplifikuje 591 bp dlouhý fragment pro X. vuittenezi (obrázek 10) .

Porovnání PCR produktů dvou druhů je znázorněno na obrázku 11.

Obrázek 9. Elektroforéza amplifikovaných produktů DNA izolovaných ze šesti jedinců X. diversicaudatum (jamky 1-6). M: 100bp délkový standard DNA (Fermentas).

Obrázek 10. Elektroforéza amplifikovaných produktů DNA izolovaných ze šesti jedinců X. vuittenezi (jamky1-6). M: 100bp délkový standard DNA (Fermentas).

Obrázek 11. Porovnání PCR produktů dvou druhů. XD1, XD 2: X. diversicaudatum; XV1, XV2: X. vuittenezi.

24

5 Srovnání ″novosti postupů″

V předložené metodice jsou optimalizovány postupy molekulární diagnostiky

fytoparazitických háďátek druhů Xiphinema diversicaudatum a X. vuittenezi pomocí

spolehlivé, specifické a selektivní metody polymerázové řetězové reakce za účelem

rychlé identifikace ve srovnání s obtížnou a časově náročnou taxonomickou identifikací.

Výhody této metodiky jsou popsány v úvodu i závěru.

6 Závěr

V první části této metodiky je popsána stručná charakteristika háďátek druhů X.

diversicaudatum a X. vuittenezi, jejichž morfometrické hodnoty jsou uvedeny v

tabulkách. Tato část není daným předmětem metodiky, proto je uvedena jen stručně pro

rychlou orientaci uživatele této metodiky.

Tato metodika se zabývá molekulární identifikací háďátek X. diversicaudatum a X.

vuittenezi. Druh X. vuittenezi je nejrozšířenějším, a X. diversicaudatum druhým

nejrozšířenějším druhem v České republice (Erbenová, 1975; Kumari, 2004; Kumari a

kol., 2005; Kumari 2006). Navíc je X. diversicaudatum prokázaným vektorem dvou

nepovirů – viru latentní kroužkovitosti jahodníku (SLRSV - Strawberry latent ringspot

virus) a viru mozaiky huseníku (ArMV - Arabis mosaic virus) (Talyor a Brown, 1997).

Na základě jejich rozšíření a škodlivosti byly vybrány právě tyto druhy.

Určování háďátek X. diversicaudatum a X. vuittenezi se provádí pomocí časově

náročné morfologické a morfometrické studie. Proto byla optimalizována molekulární

metoda PCR (polymerázová řetězová reakce), která je spolehlivá a rychlá pro

identifikaci těchto druhů. Druhy Xiphinema se typicky vyskytují smíšeně; je tedy nutné,

aby druhově specifické primery byly selektivní a senzitivní. Tyto primery jsou

selektivní, protože amplifikují fragment odlišné velikosti pro X. diversicaudtaum a X.

vuittenezi.

25

Molekulární diagnostika dvou druhů (X. diversicaudatum a X. vuittenezi) na základě

polymerázové řetězové reakce je specifická a spolehlivá. Tento molekulární

diagnostický protokol je díky použitím druhově specifických primerů spolehlivý i pro

detekce všech vývojových stadií larev X. diversicaudatum a X. vuittenezi a je velkým

přínosem fytosanitárních služeb. Použití PCR kuliček (PCR-beads) je zvlášť užitečné ve

fytosanitárních laboratořích a ostatních diagnostických laboratořích.

Výhody PCR-beads

PCR systém puReTaq Ready-To-Go™ je výborný pro méně zkušený personál

laboratoře.

Ke stanovení PCR reakce přidá uživatel pouze specifický primer, ddH2O a

DNA.

PCR-kuličkový kit je velmi robustní a spolehlivý.

Snadné použití pro větší počet vzorků.

Ekonomicky výhodné.

Minimalizace jednotlivých kroků pipetování a redukce potenciálních chyb při

nich.

Zajišťění nejnižší možné úrovně kontaminace prokaryotické a eukaryotické

nukleové kyseliny u každé kuličky. Dodržování některých jednoduchých

opatření předejde reintrodukci kontaminace (viz příloha 8.1).

Zajišťění větší reprodukovatelnosti mezi reakcemi.

Kuličky jsou lyofilizované, proto mohou být uchovány v pokojové teplotě.

Vzorky s PCR kuličkami vyžadují minimální uživatelský vstup, čas a nižší

odbornost a podávají výsledky, které jsou pokaždé přesné a reprodukovatelné.

Poděkování

Autorka děkuje Markétě Vítámvásové za opravu češtiny a technickou pomoc.

26

7 Literatura

7.1 Použitá literatura

1. Barsi, L., Lamberti, F. (2000a): Morphometric variation and juvenile stages of

Xiphinema diversicaudatum (Micoletzky, 1927) Thorne, 1939 and X. index

Thorne et Allen, 1950 (Nematoda: Dorylaimida) from the former territory of

Yugoslavia. Nematologia Meditteranea 28: 171–187

2. Barsi, L., Lamberti, F. (2000b): Morphometric variation and juvenile stages of

Xiphinema vuittenezi (Nematoda: Dorylaimida) in Serbia. Nematologia

Mediterranea 28: 3–12

3. Erbenová, M. (1975): Ektoparazitická háďátka rodu Xiphinema cobb

v ovocných sadech ČSR. Sborník ÚVTI – Zahradnictví 2: 79–86

4. Kumari, S. ( 2003): A single specimen of Xiphinema vuittenezi with posterior

vulva from the Czech republic. International Journal of Nematology 13:

233–235

5. Kumari, S. (2005): Atlas for identification of 28 genera of plant-parasitic

nematodes. RICP,Prague, 60 s

6. Kumari, S. (2004): The occurrence of Xiphinema vuittenezi, X. pachtaicum and

Longidorus leptocephalus (Nematoda: Dorylaimida) in the Central Czech

Republic. Helminthologia 41: 103–108

7. Kumari, S. (2006): Xiphinema simile (Nematoda: Longidoridae) in the Czech

Republic and a note on other Xiphinema species. Helminthologia 43: 43–50

8. Kumari, S., Decreamer, W. (2006): A female of Xiphinema vuittenezi

(Nematoda: Longidoridae) with two vulvae and abundant numbers of males

in a soil sample. Nematology, 8: 943–947

9. Kumari, S., Polák, J., Choutka, R. (2005): Plant-parasitic nematodes of the

genus Xiphinema (Nematoda: Longidoridae) in the vineyards of the Czech

Republic. Nematology 7: 81–93

10. Liskova, M., Brown, D. J. F., Taylor, C. E. (1995): The occurrence and

distribution of Longidoridae and Trichodoridae in the Slovak Republic.

Russian Journal of Nematology 3: 49–60

11. Lišková, M., Sabová, M., Valocká, B. (1992): Contribution to the finding of the

southern border of Xiphinema diversicaudatum (Micoletzky, 1927) Thorne,

1939 distribution range in the Slovak Republic. Helminthologia 29: 181–184

27

12. Loof, P. A. A., Luc, M. (1990): A revised polytomous key for the identification

of species of the genus Xiphinema Cobb, 1913 (Nematoda: Longidoridae)

with exclusion of the X. americanum-group. Systematic Parasitology 16: 35–

66

13. Loof, P. A. A., Luc, M. (1993): A revised polytomous key for the identification

of species of the genus Xiphinema Cobb, 1913 (Nematoda: Longidoridae)

with exclusion of the X. americanum-group: Supplement 1. Systematic

Parasitology 24: 185–189

14. Loof, P. A. A., Luc, M., Baujard, P. (1996): A revised polytomous key for the

identification of species of the genus Xiphinema Cobb, 1913 (Nematoda:

Longidoridae) with exclusion of the X. americanum-group: Supplement 2.

Systematic Parasitology 33: 23–29

15. Oliveira, C. M. G., Fenton, B., Malloch, G., Brown, D. J. F., Neilson, R. (2005):

Development of species-specific primers for the ectoparasitic nematode

species Xiphinema brevicolle, X. diffusum, X. elongatum, X. ifacolum and X.

longicaudatum(Nematoda: Longidoridae) based on ribosoml DNA

sequences. Annals of Applied Biology 146: 281-288

16. Stanton, J. M., McNicol, C. D., Steele, V. (1998): Non-manual lysis of second-

stage Meloidogyne juveniles for identification of pure and mixed samples

based on the polymerase chain reaction. Australasian Plant Pathology 27:

112–115

17. Taylor, C. E., Brown, D. J. F. (1997): Nematode vectors of plant viruses. CABI,

Wallingford, UK.

18. Wang, X., Bosselut, N., Castagnone, C., Voisin, R., Abad, P., Esmenjaud, D.

(2003): Multiplex polymerase chain reaction identification of single

individuals of the longidorid nematodes Xiphinema index, X.

diversicaudatum, X. vuittenezi, and X. italiae using specific primers from

ribosomal genes. Phytopathology 93: 160–166

28

7.2 Původní poznatky VÚRV, v.v.i. k PCR

1. Kumari, S. (2006): Xiphinema simile (Nematoda: Longidoridae) in the Czech

Republic and a note on other Xiphinema species. Helminthologia 43: 43–50

2. Kumari, S., Kundu, J. K., Polák, J. (2004): Identification of Xiphinema vuittenezi

by polymerase chain reaction. Plant Protection Science 40: 1–4

3. Kumari, S., Polák, J., Choutka, R. (2005): Plant-parasitic nematodes of the genus

Xiphinema (Nematoda: Longidoridae) in the vineyards of the Czech Republic.

Nematology 7: 81–93

7.3 Původní poznatky ze světa k PCR

1. Hübschen, J., Kling, L., Ipach, U., Zinkernagel, V., Bosselut, N., Esmenjaud, D.,

Brown, D. J. F., Neilson, R. (2004): Validation of the specificity and sensitivity

of species-specific primers that provide a reliable molecular diagnostic for

Xiphinema diversicaudatum, X. index and X. vuittenezi. European Journal of

Plant Pathology 110: 779–788

2. Leopold, S., Fernández, B. E., Schartl, A., Laimer, M. (2007): Identification of

Xiphinema index in an Austrian vineyard. Vitis 46: 49–50

3. Wang, X., Bosselut, N., Castagnone, C., Voisin, R., Abad, P., Esmenjaud, D.

(2003): Multiplex polymerase chain reaction identification of single individuals

of the longidorid nematodes Xiphinema index, X. diversicaudatum, X. vuittenezi,

and X. italiae using specific primers from ribosomal genes. Phytopathology 93:

160–166

29

8 Přílohy

8.1 Jak se vyhnout PCR kontaminaci

PCR je velmi senzitivní ke kontaminaci cizí DNA. PCR je molekulární biologická

technika, což připouští produkci více než 10 milionů kopií cílové DNA sekvence pouze

z několika molekul DNA. Senzitivita PCR znamená, že vzorek použitý pro PCR by

neměl být kontaminován žádnou další DNA, která se může usadit v laboratorním

prostředí. Proto je nutné provádět kroky, které zredukují kontaminaci.

Důležité! - Negativní kontroly (bez DNA) by měly být přidány do každého stanovení

PCR. Pokud jsou vidět proužky po provedení PCR na negativní kontrole, je

kontaminována.

Tipy jak předejít kontaminaci PCR

Nasazení čistého páru rukavic při zahájení práce s PCR.

Čištění pracovního povrchu 70% etanolem před a po práci.

Častá výměna rukavic.

Použití špiček s filtrem. Špičky do pipet s aerosolovými filtry poskytují prevenci

před mikrokapičkami vstříknutými do směsi PCR, čímž předchází kontaminaci

PCR reakcí.

Nekašlat nad zkumavkami.

Příprava DNA vzorků by se měla provádět ve vzdáleném prostoru nebo alespoň

odděleném od prostoru, kde se připravuje směs na PCR reakci.

Může být použit laminární flowbox, vybavený UV lampou k předcházení

bakteriálního růstu. Tato pracovní plocha může zabránit kontaminaci z předešlé

amplifikované DNA.

Vyhnout se tvorbě aerosolů.

Nedělat při práci prudké pohyby pipetou.

Příprava vlastní sady činidel a jejich udržování v malém alikvotu.

30

Tipy jak se vyvarovat přenosu PCR ″carry-over″ kontaminace

Izolovat DNA extrakce, pre-PCR a post-PCR. Pokud možno používat tři různé

místnosti. Nepřenášet vybavení jako jsou pipety, boxy se špičkami,

mikrocentrifugou atd. z jedné místnosti do druhé.

Každá osoba v laboratoři by měla mít svou vlastní sadu pipet a činidel pro DNA

extrakce, pre-PCR a post-PCR.

Činidla by měla být vytvořena a skladována v malých alikvotech, které mohou

být vyřazeny, jestliže existuje podezření na jejich kontaminaci.

Vždy zacházet se zkumavkami a roztoky z post-PCR s předpokladem, že jsou

zde přítomny amplifikované produkty. Používat pro tuto práci oddělené post-

PCR pipety.

Vyvarovat se vytvoření aerosolů. Aerosoly se snadno vytvoří při vyhazování

špiček, nebo jestliže se s pipetami příliš mává.

Používat špičky s filtrem k redukci rizika přenosu DNA mezi zkumavkami.

Pokud je to možné, používat UV-lampu pro dekontaminaci laboratoře, pokud v

ní nejsou přítomni lidé.

Další tipy při práci s PCR

Koncentrace činidel – “nižší je obvykle lepší” (více specifické).

Krátce vortexovat nebo zamíchat třepáním rukou činidla před použitím.

Spustit negativní kontrolu (y) pro ověření kontaminace.

Spustit pozitivní kontrolu (vzorek který byl opakovaně pozitivně amplifikován).

Vždy spustit délkový standard DNA na gelu (bude indikovat možné selhání PCR

nebo detekčního systému).

Shromáždit reakce na ledu.

Stále ošetřovat pracovní povrch 10% (v/v) roztokem sava. Ideální je nechat savo

působit na povrch nejméně 10 minut a poté setřít sterilní vodou .

31

8.2 Přepočty I) Přepočty molarity chemikálií na 100 ml pro extrakce DNA

a] 0,25M NaoH = 1 gram na 100 ml (0,1 litr)

1Molární na jeden litr = 40g (molekulární hmotnost NaOH) 1M 0,1 litr = 40 x 0,1 4g 0.25M 0,1 litr = 4 x 0,25 1g

b] 0,5M Tris-HCl = 7,88 gramů na 100 ml (0,1 litr)

1Molární na jeden litr = 157,60 g (Molekulární hmotnost Tris-HCl) 1M 0.1 litr = 157,60 x 0,1 15,76g 0.5M 0,1 litr = 15,76 x 0,5 7,88g

c] 0,25M HCl = 2,20 ml 35% HCl na 100 ml (0,1 litr)

1Molární na jeden litr = 36,46 g (Molekulární hmotnost HCl) 1M 0.1 litr = (36,46 x 0,1) 3,646g 0.25M 0,1 litr = (3,646 x 0,25) 0,9115g

1180 g = 1000 ml 0,9115g = X ml (1000x0,9115/1180 0,772 ml)

35% = 0,772 ml 100%= X ml (0,772x100/35 2,20 ml)

II) Přepočty koncentrace primerů pro 10 pmol/1l

10l “stock primeru” (Generi Biotech) na 90 l dd H2O 10 pmol/1l

III) Příprava 1x TAE pufru Zásobní roztok 50x TAE (Fermentas) se naředí deionizovanou vodou v poměru 1:49. Např. pro 1000 ml pracovní koncentrace (1x) se naměří 980 ml deionizované vody a přidá se 20 ml zásobního roztoku TAE (50x)

32

IV) Příprava 1,5 % agarózového gelu

Vanička 1x TAE

pufr Agaróza Ethidium bromid

Sybr safe

60 x 80 mm 40 ml 0,6 g 0,4l 0,4l 100 x 150 mm 80 ml 1,2 g 0,8l 0,8l

V) Denaturovaný líh (cca 70%) 70 ml absolutního ethylalkoholu (99,8%) se smíchá s 30ml deionizované sterilní vody. VI) Koncentrace magnesium chloridu

Pokud je každá PCR kulička dehydratizovaná v reakčním objemu 25 µl, směs se

skládá z 1,5mM MgCl2. Jestliže se požaduje vyšší koncentrace Mg2+, následující

tabulka může být použita k determinaci objemu sterilního roztoku 10mM MgCl2, který

by měl být přidán, aby se zvýšila koncentrace Mg2+ reakce. Jestliže je MgCl2 přidán do

reakce, sníží se množství přidané vody v reakci na finální reakční objem 25ul.

Konečný [MgCl2] Objem 10 mM MgCl2 k přidání 2,0 mM 1,25 l 2,5 mM 2,50 l 3,0 mM 3,75 l 3,5 mM 5,00 l 4,0 mM 6,25 l 4,5 mM 7,50 l 5,0 mM 8,75 l

Přepočet 10 mM MgCl2 = 0,095211g na 100 ml (0,1 litr)

1Molární na jeden litr = 95,211 g (Molekulární hmotnost MgCl2) 1M 0.1 litr = 95,211 x 0,1 9,5211g 1mM 0,1 litr = 9,5211/ 1000 0,0095211g 10mM 0,1 liter = 0,0095211 x 10 0,095211g

33

8.3 Potřebné věci

Informace o konkrétním přístrojovém a materiálním vybavení jsou přiloženy jen jako možná pomoc pro uživatele této metodiky, mohou však být použity i materiály od jiných dodavatelů za předpokladu, že bude dosaženo shodných výsledků. V případě neshody je třeba optimalizovat dané přístrojové a materiální vybavení.

P.č. Věc Katalogové číslo Výrobce Kontakt * 1. Agaróza (TopVision Agarose) R0491 Fermentas Biogen 2. Analytická váha - Radwag Váhy-Radwag 3. Centrifuga MiniSpin EPF5452000018 Eppendorf Maneko 4. DNA ladder 100 bp (50µg) SM0241 Fermentas Biogen 5. Eppendorf zkumavky (0,5 ml) bezbarvé T8911-500EA Eppendorf Sigma-Aldrich 6. Erlenmayerovy baňky (250 ml) KAV632417119250 Simax Maneko 7. Ethidium bromid (roztok) E1510 Sigma Sigma 8. Ethylalkohol 99,8% (1 litr) E 03502 - P-lab 9. Fotoaparát Canon A620 MEGA A620 Canon Schoeller Instruments 10. HCl (Hydrochloric acid -500 g) C6025-500G Lachner Lab Mark 11. Horizontální elektroforéza

s příslušenstvím (Biomax MP1015) IB53000 Biomax Biogen

12. Inkubátor na zkumavky BIO TDB-100 Biosan BioTech 13. Jehly - Medin Medin 14. Loading dye (6x orange) R0631 Fermentas Biogen 15. Nádoba na led R613071.Z Roth P-lab 16. NaOH (Sodium hydroxide) DB0617-500G Lachner Lab Mark 17. PCR kuličky

(illustra™ PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads)

27-9559-01 GE Healthcare AP Czech

18. PCR stojánky: Stojan na 0,2 ml zkumavky Stojan na 0,2-2 ml zkumavky Stojan na 0,5-2 ml zkumavky

5230-29S R181841.R Alpha LW5890AS

Bioplastics - AlphaLaboratories

Labmark P-lab East Port Scientific

19. Petriho miska (40mm) 632 492 002 040 - Vitrum 20. pH metr - inoLab Schoeller Instruments 21. Pipety : 0,5-10 µl

10-100 l 100-1000 µl

3111 000.122 3111 000.149 3111 000.165

Eppendorf Maneko

22. Primery - Generi Biotech Generi Biotech 23. Rukavice vynilové , vel.S

vel M vel L

202VP 202VM 202VG

Mercator Medical Biogen

24. Stereomikroskop Olympus SZX 9 - Olympus Olympus 25. Stojan na pipety 3111 000.003 Eppendorf Maneko 26. Sybr safe S33102 Invitrogen KRD 27. Špičky s filtrem: 0,1-10 µl

2-100 µl 50-1000 µl Špičky bez filtru: 0,1-10 µl 2-200 µl 50-1000 µl

PF0030 077 024 EPF0030 077.067 EPF0030 077.105 EPF0030 000 811 EPF0030 000 870 EPF0030 000 919

Eppendorf Maneko

28. TAE pufr (50x) B49 Fermentas Biogen 29. Tepelná plotýnka - Yellowline Neotec 30. Termocykler MJ Mini PTC-1148 BioRad BioTech 31. Tmavá komora (tubus) - - Schoeller Instruments 32. Transiluminátor 312 nm VIL ECX-26.MX Vilber Lourmat Schoeller Instruments 33. Tris-HCl (250g) DB0103-250G BioBasic Lab Mark 34. Triton X-100 (100 ml) T 8787 Sigma Sigma-Aldrich 35. Vortex (lab-dancer) 336500 IKA Neotec 36. Permanentní fixy (Cryoware marker) 6163 Nalgene Sigma

* adresy těchto firem jsou na následující stránce Poznámka: Katalogové číslo může být staré, proto je potřeba před objednáním zavolat určitou firmu.

34

Kontakty firem AP Czech s.r.o. Hošťálková 48 160 00 Praha 6 Tel/Fax: 220 511 392 220 518 399 220 518 743 apczech@apczech.cz http://www.apczech.cz

Biogen Praha s.r.o. Ke sv. Isidoru 2293/4a 149 00 Praha 4, Chodov Tel: 241 401 693 Fax: 241 401 694 Mob: 602 665 384 biogen@biogen.cz http://www.biogen.cz

BioTech a.s. Služeb 4 108 52, Praha 10 Tel: 272 701 739 Fax: 272 701 742 biotech@biotech.cz http://www.biotech.cz

East Port Scientific, s.r.o. Rubličova 1/969 161 00 Praha 6, Ruzyně Tel: 235 318 177 Fax: 233 312 428 eastport@eastport.cz http://www.genetika.cz

Generi Biotech s.r.o Machkova 587 500 11 Hradec Králové 11 Tel: 495 056 353 Fax: 495 056 316 info@generi-biotech.com http://www.generi-biotech.com

KRD, s.r.o. Pekařská 603/12 155 00 Praha 5, Jinonice Tel: 257 013 400 Fax: 257 013 405 krd@krd.cz http://www.krd.cz

Lab Mark a.s., Pod Cihelnou 23 161 00 Praha 6, Ruzyně Tel: 233 335 548 233 335 930 Fax: 224 311 830 labmark@labmark.cz http://www.labmark.cz

Maneko, s. r. o. na Pískách 71 160 00 Praha 6, Tel: 233 335 638-9 233 336 579 Fax: 233 332 656 maneko@maneko.cz http://www.maneko.cz

Medin Jana Želivského 6 130 00, Praha 3 Tel: 222 592 334 Fax: 222 592 334 Mob.: 606 686 530 medin.praha@seznam.cz http://www.medin.cz

Neotec, spol. s. r.o Jinonická 80, 158 00 Praha 5 Tel: 257 289 511 257 289 515 Fax: 233 312 515 http://www.neotec.cz

Olympus C&S Evropská 176 160 41 Praha 6 Tel: 221 985 211 Fax: 221 985 505 info@olympus.cz http://www.olympus.cz

P-lab a.s. Korunní 127 130 00 Praha 3,Vinohrady Tel: 271 730 800 Fax: 271 131 176 info@p-lab.cz http://www.p-lab.cz

Schoeller Instruments, s. r. o.

Vídeňská 1398/124 148 00 Praha 4 Tel: 261 009 111 261 711 765-6 Fax: 244 470 745 261 009 112 mail@schoeller.cz http://www.schoeller.cz

Sigma-Aldrich spol. s r.o. Sokolovská 100/94 186 00 Praha 8 Tel: 246 003 251 246 003 252 Fax: 246 003 291 246 003 292 czeorders@sial.com http://www.sigmaaldrich.com

Váhy-Radwag Lidická 55 787 01 Šumperk Tel/Fax: 583 210 016 mob: 777 255 695 obchod@vahy-radwag.cz http://vahy-radwag.cz

Vitrum Praha Pražská 442 281 67 Stříbrná Skalice Tel: 321 570 321 Fax: 321 570 320 praha@vitrum.cz http://www.vitrum.cz

35

8.4 Referenční materiál I. Celková izolovaná DNA druhu X. vuittenezi

Tato DNA byla předána Státní rostlinolékařské správě. DNA ze všech vzorků byla

úspěšně amplifikována (obrázek 12). Tyto vzorky se doporučuje používat jako pozitivní

vzorky.

Číslo

vzorku Počet háďátek v jedné zkumavce

Množství DNA

Číslo vzorku

Počet háďátek ve jedné zkumavce

Množství DNA

XV 1 1♀ 39 µm XV 12 1♀ 39 µm XV 2 1♀ 39 µm XV 13 1♀ 39 µm XV 3 1♀ 39 µm XV 14 1♀ 39 µm XV 4 1♀ 39 µm XV 15 1♀ 39 µm XV 5 1♀ 39 µm XV 16 1♀ 39 µm XV 6 1♀ 39 µm XV 17 1♀ 39 µm XV 7 1♀ 39 µm XV 18 1♀ 39 µm XV 8 1♀ 39 µm XV 19 1♀ 39 µm XV 9 1♀ 39 µm XV 20 1♀ 39 µm XV 10 1♀ 39 µm XV 21 15 ♀ 159 µm XV 11 1♀ 39 µm XV 22 15 ♀ 159 µm

Obrázek 12. Amplifikované referenční

vzorky druhu X. vuittenezi.

36

II. Celková izolovaná DNA druhu X. diversicaudatum

Tato DNA byla předána Státní rostlinolékařské správě. DNA ze všech vzorků byla

úspěšně amplifikována (obrázek 13). Tyto vzorky se doporučuje používat jako pozitivní

vzorky.

Číslo

vzorku Počet háďátek v jedné zkumavce

Množství DNA

Číslo vzorku

Počet háďátek ve jedné zkumavce

Množství DNA

XD 1 1♀ 39 µm XD 12 1♂ 39 µm XD 2 1♀ 39 µm XD 13 1♂ 39 µm XD 3 1♀ 39 µm XD 14 1♂ 39 µm XD 4 1♀ 39 µm XD 15 1♂ 39 µm XD 5 1♀ 39 µm XD 16 1♂ 39 µm XD 6 1♀ 39 µm XD 17 1♂ 39 µm XD 7 1♀ 39 µm XD 18 1♂ 39 µm XD 8 1♀ 39 µm XD 19 1♂ 39 µm XD 9 1♀ 39 µm XD 20 1♂ 39 µm XD10 1♀ 39 µm XD 21 15 ♀ 159 µm XD 11 1♂ 39 µm XD 22 15 ♂ 159 µm

Obrázek 13. Amplifikované referenční

vzorky druhu X. diversicaudatum

37

III. Trvalé preparáty Tyto trvalé preparáty byly předány Státní rostlinolékařské správě Číslo preparátu

Druh Datum výroby

Počet jedinců Lokalita Hostitelská rostlina

Datum předělání

XV 1 X. vuittenezi 08.08.2004 1 larva Polešovice vinná réva XV 2 X. vuittenezi 08.08.2004 1 larva Polešovice vinná réva XV 3 X. vuittenezi 08.08.2004 1 larva Polešovice vinná réva XV 4 X. vuittenezi 08.08.2004 1 larva Polešovice vinná réva XV 5 X. vuittenezi 08.08.2004 1 larva Polešovice vinná réva XV 6 X. vuittenezi 08.08.2004 1 larva Polešovice vinná réva

XV 7 X. vuittenezi 17.08.2004 1♀ Kostelec vinná réva 08.10.2008 XV 8 X. vuittenezi 17.08.2004 2♀ Kostelec vinná réva 08.10.2008 XV 9 X. vuittenezi 17.08.2004 2♀ Kostelec vinná réva 08.10.2008 XV 10 X. vuittenezi 17.08.2004 2♀ Kostelec vinná réva 08.10.2008 XV 11 X. vuittenezi 17.08.2004 2♀ Kostelec vinná réva 08.10.2008 XV 12 X. vuittenezi 17.08.2004 2♀ Kostelec vinná réva 08.10.2008 XV 13 X. vuittenezi 17.08.2004 2♀ Kostelec vinná réva 08.10.2008

XV 14 X. vuittenezi 04.10.2004 1♀ bez mukra Hrušky 1 vinná réva 08.10.2008

XV 15 X. vuittenezi 04.10.2004 1♀ Mohyla Míru jabloň 08.10.2008 XV 16 X. vuittenezi 04.10.2004 1♀ Mohyla Míru jabloň 08.10.2008 XV 17 X. vuittenezi 04.10.2004 1♀ Mohyla Míru jabloň 08.10.2008 XV 18 X. vuittenezi 04.10.2004 1♀ Mohyla Míru jabloň 08.10.2008

XV 19 X. vuittenezi 04.10.2004 2♀ Hrušky 1 vinná réva 08.10.2008 XV 20 X. vuittenezi 04.10.2004 2♀ Hrušky 1 vinná réva 08.10.2008

XV 21 X. vuittenezi 27.06.2007 1♂ Slaný jabloň 08.10.2008 XV 22 X. vuittenezi 27.06.2007 1♂ Slaný jabloň 08.10.2008 XV 23 X. vuittenezi 27.06.2007 1♂ Slaný jabloň 08.10.2008

XD 24 X. diversicaudatum 28.08.2003 4 larvy Bílé Podolí broskvoň 08.10.2008 XD 25 X. diversicaudatum 28.08.2003 5 larev Bílé Podolí broskvoň 08.10.2008 XD 26 X. diversicaudatum 28.08.2003 1 larva Bílé Podolí broskvoň 08.10.2008 XD 27 X. diversicaudatum 28.08.2003 1 larva Bílé Podolí broskvoň 08.10.2008 XD 28 X. diversicaudatum 28.08.2003 1 larva Bílé Podolí broskvoň 08.10.2008 XD 29 X. diversicaudatum 28.08.2003 1 larva Bílé Podolí broskvoň 08.10.2008 XD 30 X. diversicaudatum 28.08.2003 1 larva Bílé Podolí broskvoň 08.10.2008 XD 31 X. diversicaudatum 28.08.2003 5 larev Bílé Podolí broskvoň 08.10.2008

XD 32 X. diversicaudatum 17.01.2005 1♀ Třebanice třešeň 08.10.2008 XD 33 X. diversicaudatum 17.01.2005 1♀ Třebanice třešeň 08.10.2008 XD 34 X. diversicaudatum 17.01.2005 1♀ Třebanice třešeň 08.10.2008 XD 35 X. diversicaudatum 17.01.2005 1♀ Třebanice třešeň 08.10.2008 XD 36 X. diversicaudatum 17.01.2005 3♀ (1 bez mukra) Třebanice třešeň 08.10.2008 XD 37 X. diversicaudatum 17.01.2005 3♀ Třebanice třešeň 08.10.2008 XD 38 X. diversicaudatum 17.01.2005 3♀ Třebanice třešeň 08.10.2008 XD 39 X. diversicaudatum 17.01.2005 1♂ Třebanice třešeň 08.10.2008 XD 40 X. diversicaudatum 17.01.2005 1♂ Třebanice třešeň 08.10.2008

XD 41 X. diversicaudatum 24.12.2004 2♂ Lhenice třešeň 08.10.2008 XD 42 X. diversicaudatum 24.12.2004 3♂ Lhenice třešeň 08.10.2008

38

Poznámky

39

40

Poznámky

Centrifuga

Centrifuga (otevřená)

pH metrVortex

Odměrné válce

Název: Určování háďátek Xiphinema diversicaudatum a X. vuittenezi pomocí polymerázové řetězové reakce (Metodika pro praxi)

Autor: Kumari S.

Vydal: Výzkumný Ústav Rostlinné Výroby, v.v.i.Drnovská 507, 16106 Praha 6–Ruzyně

Tisk: VÚRV, v.v.i., Praha

Počet stran: 40

Vydání: první

Rok vydání: 2008

ISBN: 978-80-87011-98-0

Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008