Vojnomedicinska akademija · Tioestarski vezani radikali iz ove grupe jedinjenja mogu biti estri ili amidi karboksilnih kiselina, alkil amini, tioetri, supstituisani benzil radikali

Vojnomedicinska akademija

Cen ta r za ko n t ro lu t r ovan j a Institut za toksikologiju i farmakologiju

Odeljen je za toks ikološku hemi ju

Zl a t ko v i ć Mi l i c a

UTICAJ TERAPIJSKE PRIMENE NATRIJUM HIDROGENKARBONATA

NA TOKSIKOKINETIKU ORGANOFOSFORNIH INSEKTICIDA U

LEČENJU BOLESNIKA SA AKUTNIM TROVANJEM

D o k t o r sk a d i s e r t a c i j a

Beo gr ad , 20 16 .

Milica Zlatković Doktorska disertacija

I

Sadržaj

1. UVOD ....................................................................................................................................................... 1

1.1. ORGANOFOSFORNA JEDINJENJA ......................................................................................................... 1

1.2. HEMIJSKE OSOBINE ORGANOFOSFORNIH INSEKTICIDA ...................................................................... 3

1.2.1. Malation ..................................................................................................................................... 4

1.2.2. Dimetoat ..................................................................................................................................... 5

1.2.3. Diazinon ..................................................................................................................................... 5

1.3. TOKSIČNOST ORGANOFOSFORNIH INSEKTICIDA ................................................................................ 6

1.3.1. Metabolizam OFI ........................................................................................................................ 7

1.3.2. Biotransformacije malationa, dimetoata i diazinona ................................................................. 9

1.4. OSNOVNI PRINCIPI PROCENE ACIDOBAZNOG STATUSA ORGANIZMA I NJEGOVIH POREMEĆAJA ...... 14

1.5. MEHANIZAM DELOVANJA OFI ......................................................................................................... 16

1.5.1. Acetilholinesteraza ................................................................................................................... 17

1.5.2. Butirilholinesteraza .................................................................................................................. 21

1.6. KLINIČKA SLIKA TROVANJA ............................................................................................................. 22

1.7. DIJAGNOZA TROVANJA -TOKSIKOLOŠKE ANALIZE .......................................................................... 24

1.8. TERAPIJA TROVANJA ........................................................................................................................ 26

1.9. PROBLEM .......................................................................................................................................... 29

2. RADNA HIPOTEZA ........................................................................................................................... 31

3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA ................................................................................................................. 32

4. MATERIJAL I METODE RADA ...................................................................................................... 33

4.1. APARATI I PRIBOR ............................................................................................................................ 35

4.2. HEMIKALIJE I REAGENSI ................................................................................................................... 36

4.3. ANALITIČKI STANDARDI................................................................................................................... 36

4.4. ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE OFI U KRVI I URINU ....................................................................... 37

4.4.1. Rastvori analitičkih standarda ................................................................................................. 37

4.4.2. Ekstrakciona procedura ........................................................................................................... 38

4.4.3. Metoda UPLC-MS .................................................................................................................... 38

4.5. ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE METABOLITA OFI U URINU ........................................................... 39

4.5.1. Rastvori analitičkih standarda ................................................................................................. 39

4.5.2. Ekstrakciona procedura ........................................................................................................... 40

4.5.3. Metoda UPLC-MS .................................................................................................................... 40

4.6. ODREĐIVANJE AKTIVNOSTI ACHE I BUCHE.................................................................................... 41

4.6.1. Određivanje aktivnosti AChE ................................................................................................... 41

4.6.2. Određivanje aktivnosti BChE ................................................................................................... 42

4.7. PARAMETRI ACIDO-BAZNOG I GASNOG STATUSA ............................................................................ 43

4.8. IN VITRO EKSPERIMENT .................................................................................................................... 43

4.9. VRSTA STUDIJE I NAČIN OBRADE PODATAKA ................................................................................... 44

5. REZULTATI ........................................................................................................................................ 45


II

5.1. UTICAJ PH NA DEGRADACIJU ISPITIVANIH OFJ ............................................................................... 45

5.2. KONCENTRACIJE OFI I NJIHOVIH METABOLITA U KRVI I URINU KONTROLNE I TEST GUPE BOLESNIKA

................................................................................................................................................................ 48

5.2.1 Koncentracije malationa, malaoksona i malation monokarboksilne kiseline u krvi bolesnika bez

i nakon primene natrijum hidrogenkarbonata .................................................................................... 48

5.2.2. Koncentracije malationa, malaoksona, MCA i alkil fosfata u urinu bolesnika sa i bez natrijum

hidrogenkarbonata ............................................................................................................................. 53

5.2.3. Koncentracije dimetoata u krvi i koncentracije dimetoata i alkil fosfata u urinu za obe grupe

bolesnika ............................................................................................................................................. 58

5.2.4. Koncentracije diazinona u krvi i koncentracije diazinona i alkil fosfata u urinu za obe grupe

bolesnika ............................................................................................................................................. 63

5.3. AKTIVNOST HOLINESTERAZE KOD OBE GRUPE BOLESNIKA ............................................................. 65

5.3.1. Aktivnost AChE u krvi obe gupe bolesnika sa trovanjem malationom ..................................... 65

5.3.2. Aktivnost AChE kod obe grupe bolesnika sa trovanjem dimetoatom ....................................... 67

5.3.3. Aktivnost AChE u krvi obe gupe bolesnika sa trovanjem diazinonom ..................................... 70

5.3.4. Aktivnost BuChE u krvi obe grupe bolesnika sa trovanjem malationom ................................. 73

5.3.5. Aktivnost BuChE u krvi obe grupe bolesnika sa trovanjem dimetoatom .................................. 76

5.3.6. Aktivnost BuChE u krvi obe grupe bolesnika sa trovanjem diazinonom .................................. 79

5.4. KOLIČINA I VREME PRIMENJENIH ANTIDOTA I DUŽINA HOSPITALIZACIJE KOD ISPITIVANIH

BOLESNIKA .............................................................................................................................................. 81

5.5. LABORATORIJSKI I KLINIČKI PARAMETRI KOD OBE GRUPE BOLESNIKA ......................................... 82

5.5.1. pH arterijske krvi kod obe grupe bolesnika sa trovanjem malationom .................................... 82

5.5.2. pH arterijske krvi kod obe grupe bolesnika sa trovanjem dimetoatom .................................... 83

5.5.3. pH arterijske krvi kod obe grupe bolesnika sa trovanjem diazinonom .................................... 85

5.5.4. Koncentracija hidrogenkarbonata u arterijskoj krvi obe grupe bolesnika .............................. 86

5.5.5. Vrednosti aktuelnog baznog ekscesa u arterijskoj krvi obe grupe bolesnika ........................... 88

5.5.6. Parcijalni pritisak ugljendioksida u arterijskoj krvi obe grupe bolesnika ............................... 89

5.5.7. Parcijalni pritisak kiseonika u arterijskoj krvi obe grupe bolesnika........................................ 91

5.5.8. Saturacija arterijske krvi kiseonikom u obe grupe bolesnika ................................................... 92

5.5.9. Telesna temperatura kod obe grupe bolesnika ......................................................................... 94

5.5.10. Kvni pritisak kod obe grupe bolesnika ................................................................................... 95

5.5.11. Frekvencija pulsa kod obe grupe bolesnika ........................................................................... 98

6. DISKUSIJA ........................................................................................................................................ 100

6.1. UTICAJ PH NA BRZINU DEGRADACIJE ISPITIVANIH OFI IN VITRO I KONCENTRACIJE OFI I NJIHOVIH

METABOLITA U KRVI I URINU KONTROLNE I TEST GRUPE BOLESNIKA .................................................. 102

6.2. AKTIVNOST HOLINESTERAZA KOD OBE GRUPE BOLESNIKA ........................................................... 108

6.3. KOLIČINE PRIMENJENIH ANTIDOTA I VREME HOSPITALIZACIJE KOD ISPTIVANIH BOLESNIKA ....... 110

6.4. LABORATORIJSKI I KLINIČKI PARAMETRI KOD OBE GRUPE PACIJENATA ....................................... 111

7. ZAKLJUČCI ...................................................................................................................................... 114

8. LITERATURA ................................................................................................................................... 116


1

1. UVOD

1.1. Organofosforna jedinjenja

Organska jedinjenja petovalentnog fosfora - organofosforna jedinjenja (OFJ) čine veliku grupu

pesticida različite namene (insekticidi, herbicidi, akaricidi, fungicidi, defolijanti, nematocidi i

sredstva za suzbijanje parazita kod domaćih životinja). Ovoj hemijskoj grupi pripadaju i nervni

bojni otrovi, koji su najtoksičniji predstavnici organofosfata. Premda se situacija poslednjih

godina značajno promenila, a njihova primena je ograničena uglavnom na oblast poljoprivrede,

do pre par godina su organofosforni insekticidi široko korišćeni za uništavanje štetočina i u

komunalnoj higijeni i domaćinstvu 1.

Iako su prva OFJ sintetisana u XIX veku, o njihovoj toksičnosti se dugo nije ništa znalo, a prvi

objavljeni izveštaj o toksičnosti OFJ datira iz 1932. godine kada je Gerd von Krueger posle

akscidenta u laboratoriji sa organofosfornim estrima, opisao svoje iskustvo. Sva istraživanja su u

početku bila namenjena pronalaženu novih insekticida, ali kako je uočena visoka toksičnost nekih

OFJ, ubrzo posle toga, već od 1935. godine istraživanja kreću u pravcu otkrića potencijalnih

bojnih otrova. Gerhard Schrader je sa saradnicima u periodu od 1934. do 1944. godine sintetisao

oko 2000 organofosfornih jedinjenja 2,3. Opšta formula organofosfornog jedinjenja može se

prikazati na sledeći način (Slika 1):

Slika 1. Opšta formula organofosfornih jedinjenja


2

Da bi neko organsko jedinjenje fosfora bilo biološki aktivno, za petovalentni fosfor mora

direktno da bude vezan dvostrukom vezom (koordinativno-kovalentnom vezom) atom kiseonika

ili sumpora. Ostale grupe vezane za fosfor mogu da budu različite i to:

R1 i R2 grupa su radikali vezani za fosfor preko kiseonika (alkoksi -OR ili ariloksi -OAr grupe),

preko azota (amido -NR2) ili direktno alkil -R, aril-Ar;

X (acil grupa)–može da bude anjon neorganske ili organske kiseline (-F, -CN, -SCN, -OOCR) ili

neki kiselinski ostatak (enol grupa ili merkapto grupa). Acil grupa može i da se uopšteno prikaže

kao X–Y=Z grupa. Zbog različite strukture acil radikala OFJ možemo svrstati u različite

hemijske grupe 4.

Po hemijskom sastavu, OFJ su estri, anhidridi ili halogenidi potpuno supstituisanih fosfornih

kiselina. Organofosforni pesticidi su najčešće neutralna fosforilna ili tiofosforilna jedinjenja, i to

kao estri fosforne, fosfonske i fosfinske kiseline. Estri fosforne kiseline (fosfati) uglavnom

pokazuju insekticidne i akaricidne osobine ali nalaze i primenu kao fungicidi i herbicidi. Na

njihovu toksičnost ima uticaj priroda supstituenta, a veoma su aktivna jedinjenja sa različitim

radikalima od kojih jedan pokazuje kiseli karakter. Ukoliko je njegova konstanta disocijacije veća

utoliko su estri toksičniji za insekte pa i za toplokrvne životinje. Najveću toksičnost pokazuju

dialkil-flurofosfati i amidi fluorofosforne kiseline. Kad se u estrima fosforne kiseline atom

kiseonika zameni atomom sumpora, dolazi do značajnog smanjenja toksičnosti jedinjenja i

povećanja stabilnosti. Kako se tom prilikom ne menjaju insekticidne i akaricidne osobine, estri

tiofosforne kiseline (paration, diazinon, fenitrotion, kvinalfoks, hlorpirifos i drugi) imaju veliku

primenu u poljoprivredi. Uvođenjem još jednog atoma sumpora u molekul tiofosfata dobijaju se

hemijski stabilnija jedinjenja a koja uglavnom pokazuju manju toksičnost (ditiofosfati).

Tioestarski vezani radikali iz ove grupe jedinjenja mogu biti estri ili amidi karboksilnih kiselina,

alkil amini, tioetri, supstituisani benzil radikali i razne heterociklične grupe. Većina su dobri

insekticidi (malation,dimetoat, fosmet, azinfosmetil), a neki fungicidi i herbicidi 5. Na toksičnost

OFJ utiče i dužina lanaca alkil radikala. Zato je i podela prema alkil odnosno alkoksi-radikalima

(R1 i R2) veoma značajna. Najveću toksičnost pokazuju dietil derivati, dok su dimetil derivati

manje toksični jer pokazuju alkilujuće osobine i brže hidrolizuju. Takođe, metil derivati su manje

liposolubilni (dimetoat) od dietil derivata (hlorpirifos) koji zbog toga imaju mnogo veći volumen

distribucije u organizmu, a time i duže toksično delovanje 6.


3

1.2. Hemijske osobine organofosfornih insekticida

U osnovi strukture organofosfornih insekticida (OFI) je polarizovana fosforilna ili tiofosforilna

grupa. Sam atom fosfora je parcijalno pozitivno naelektrisan, a reakcije supstitucije će zavisiti od

njegovog parcijalnog pozitivnog naelektrisanja na koje imaju uticaj R ostaci. Najznačajnija

reakcija supstitucije kod OFI je hidroliza, jer se hidrolizom dobijaju najčešće netoksična

jedinjenja, a samim tim se smanjuje njihova biološka aktivnost. To su reakcije između fosfornih

estara i nukleofila (kiselina, voda, baza). Brzina hidrolize zavisi od strukture OFI i od drugih

parametara kao što su pH, temperatura, rastvarač i katalizator.

Organofosforni estri su uglavnom stabilni u kiseloj i neutralnoj sredini, a sa povećanjem pH

vrednosti u alkalnoj sredini (pH>7) dolazi do naglog povećanja brzine hidrolize (povećanje jedne

pH jedinice ubrzava hidrolizu 10 puta). Hidroliza estarske veze (P-O-C) može da se odigra u dva

pravca: (1) raskidanje P-O veze nukleofilnim delovanjem na atom fosfora ili (2) dejstvom

nuklefila na atom ugljenika i raskidanje O-C veze. Kod alkalne hidrolize, hidroksilni anjon

reaguje sa kiselijim atomom fosfora, dok u neutralnim i kiselim rastvorima dolazi do reakcije na

ugljenikovom atomu 7-10. Većina OFI su estri tiofosfornih kiselina, a atom sumpora smanjuje

elektrofilnost fosfora u molekulu, zato su ova jedinjenja stabilnija od fosfatnih estara, dok su tiolo

estri manje stabilni (reaktivniji su).

Kod ditiofosfata prilikom hidrolize dolazi do raskidanja P-S veze koja je manje stabilna od C-S

veze, a zbog slabih elektrofilnih osobina S-alkil grupa, reakcije sa nukleofilima su slabije.

Tako na primer hidroliza malationa nastaje raskidanjem P-S veze i tom prilikom se u alkalnoj

sredini u organskom ratvaraču dobija dimetil ditiofosfat (DMDTP), a u vodenoj sredini pri većim

pH vrednostima dimetil tiofosfat (DMTP) 11-13.


4

1.2.1. Malation

Malation (dietil (dimetoksi-fosfin-tioil-tio) sukcinat) je po hemijskom sastavu OFI iz grupe

dimetil derivata ditiofosfata.

Na Slikama 2 i 3 prikazane su strukturne formule malationa i njegovog izomera izomalationa.

Isparljivost malationa je na sobnoj temperaturi relativno visoka, tako da pokazuje dejstvo i u

gasovitom stanju.

Na povišenoj temperaturi malation prelazi u tiolestar, a u jako baznoj sredini skoro se trenutno

hidrolizuje.

Slika 2. Strukturna formula malationa

Slika 3. Strukturna formula izomalationa


5

1.2.2. Dimetoat

Dimetoat je (O,O-dimetil-S-metil-karbamoil-metil-fosforoditioat) OFI koji po hemijskom sastavu

pripada grupi dimetil derivata ditiofosfata.

Strukturna formula dimetoata prikazana je na Slici 4.

Slika 4. Strukturna formula dimetoata

Dimetoat je stabilan u kiseloj i neutralnoj sredini, a u baznoj sredini brzo hidrolizuje.

1.2.3. Diazinon

Diazinon (O,O-dietil-O-[2-isopropil-6-metil-4-pirimidinil]fosforotioat) je po hemijskom sastavu

dietil derivat tionofosfata.

Strukturna formula diazinona prikazana je na Slici 5.

Slika 5. Strukturna formula diazinona

Diazinon u kiseloj i neutralnoj sredini lakše hidrolizuje, a u baznoj sredini je stabilniji.


6

1.3. Toksičnost organofosfornih insekticida

U periodu od nekoliko proteklih decenija organofosforni insekticidi su bili među najčešće

primenjivanim pestcidima, ali se ta praksa značajno promenila što je posledica saznanja o

štetnosti po zdravlje ljudi i životnu sredinu.

Kao i drugi toksični agensi, OFI su prema srednjoj oralnoj smrtnoj dozi za pacova (LD50)

podeljeni na:

1. Veoma toksične LD50 ≤ 25 mg/kg;

2. Toksične LD50 од 25-200 mg/kg;

3. Štetne LD50 од 200-2000 mg/kg.

Do ispoljavanja toksičnih efekata može doći usled:

- akutnog trovanja (slučajnog ili namernog);

- profesionalne izloženosti;

- štetnog delovanja rezidua pesticida preko hrane i vode na opštu populaciju.

Bez obzbira što ne dolazi do biomagnifikacije (povećanje koncentracije akumulirane supstance u

lancu ishrane) organofosfornih jedinjenja, ona ulaze u lanac ishrane. Bazirano na LD50 OFI

spadaju medju najtoksičnije za ptice i sisare 14,15.

Iako se OFI uglavnom koriste van mesta guste naseljenosti, oni su najčešći uzrok trovanja ljudi

pesticidima. Dok je broj žrtava akcidentalnih trovanja oko 1 000 000 godišnje, namerna

samotrovanja su znatno češća, posebno u zemljama u razvoju. Prema podacima Svetske

zdravstvene organizacije na godišnjem nivou se registruje 3 000 000 trovanja OFI od kojih se

preko 300 000 završi fatalno 16,17.


7

1.3.1. Metabolizam OFI

U zavisnosti od vrste hemijske supstance i načina njenog unošenja u organizam, one različitim

transportom dospevaju do krvi, prolaze tkivnu barijeru i prelaze u tkiva. Kroz ćelijske membrane

supstanca može da prođe pasivnim transportom (prosta difuzija i filtriranje) ili specijalizovanim

transportnim sistemom, kojim se prenose hranljivi sastojci u organizmu (aktivni transport). Kod

peroralnih akutnih trovanja OFI do resorpcije dolazi u gastrointestinalnom (GI) traktu. Uglavnom

se jedinjenja iz GI trakta resorbuju prostom difuzijom, a sama distribucija je veoma kompleksna.

Način transporta još uvek nije dovoljno proučen. Pretpostavlja se da se kao veoma liposolubilna

jedinjenja prenose proteinskim frakcijama plazme i to lipoproteinima, i kao takva deponuju se u

masnom tkivu i tkivima bogatim lipidima. Na taj način se smanjuje koncentracija samog

jedinjenja u krvotoku ali posle njegovog oslobađanjanja iz depoa, dolazi do ponovne pojave

simptoma trovanja. Kako su OF insekticidi u svojim formulacijama radi bolje rastvorljivosti i

stabilnosti, uglavnom rastvoreni u različitim organskim rastvaračima, ta činjenica je veoma

značajna, jer su i sami rastvarači veoma toksični, pa u slučajevima namernih trovanja, njihova

veća količina može da komplikuje klinički tok i ishod trovanja.

Distribucija u nervni sistem je ista kao i kroz druge ćelije u telu. Liposolubilnost jedinjenja

olakšava prolaz u mozak, a veća jonizacija molekula smanjuje. Najveći značaj u metabolizmu i

eliminaciji toksičnih supstanci u organizmu, samim tim i OFJ, imaju jetra i bubrezi. Proces

eliminacije zavisi od hidrosolubilnosti jedinjenja, pa se kroz razne metaboličke rakcije u

organizmu menja osnovna struktura jedinjenja a time i solubilnost. Interakcije se odvijaju na

nivou molekula, ćelije, tkiva ili organa. Osnovni hemijski procesi koji dovode do hemijske

transformacije su: oksidacija, redukcija, hidroliza i konjugacija 18.

Svi hemijski procesi transformacije OFJ mogu se podeliti u aktivacione i deaktivacione. Dok se

hidrolizom znatno smanjuje ili potpuno gubi toksičnost primarnog jedinjenja, a procesom

konjugacije organizam u potpunosti brani od njegovih toksičnih efekata, oksidacioni i redukcioni

procesi mogu izazvati nastanak i toksičnih produkata. Aktivacija organotiofosfata (zamena atoma

sumpora atomom kiseonika u molekulu), odnosno njegova oksidacija, najvećim delom se odvija

u jetri. U slučaju dimetoata na aktivnost jetre otpada oko 61%, dok je aktivnost ostalih organa

daleko manja (GI trakt 21%, pluća 13% i bubrezi 1,5%) 18,19. Veliki broj enzima različitom

brzinom razgrađujuje organofosfate, a tim procesima biotransformacije ključnu ulogu ima jetra


8

sa specifičnim enzimskim sistemom koji se nalazi na membrani endoplazmatičkog retikuluma.

Mikrozomalne frakcije endoplazmatičkog retikuluma sadrže enzime nazvane MFO (''microsomal

mixed function oxidases'') u koje spadaju izoenzimi citohrom P450 oksigenaze (CYP450) (EC 1.

14. 14. 1.) i flavin monooksigenaze (FMO) (EC 1. 14. 13. 8). Ovi ezimi učestvuju u rekcijama

prve faze botransformacije (oksidacija, redukcija i hidroliza) 20-22.

Najvažnija reakcija oksidacije u biotransformaciji OFI je reakcija oksidativne desulfuracije, koja

predstavlja reakciju aktivacije manje toksičnih jedinjenja tiofosfata u njegovove toksičnije oksi

metabolite uz pomoć enzima CYP450. U reakciji oksidativne desulfuracije dolazi do oslobađanja

sumpora koji se u mikrozomima resorbuje, a zatim izlučuje urinom. Međutim oslobođeni sumpor

može i da inhibira aktivnost CYP450 (reakcija letalne sinteze). Pošto su po svojoj hemijskoj

strukturi estri, sa organofosfatima reaguju i enzimi iz grupe esteraza. Postoje dve grupe ovih

enzima, koje deluju na istoj estarskoj ili halogenidnoj vezi, ali njihov mehanizam delovanja je

različit 23.

Prvu grupu čine esteraze koje u aktivnom centru imaju serin (serinske esteraze) gde spadaju: (1)

acetilholinesteraza (AChE; EC 3.1.1.7), (2) butirilholinesteraza (BuChE; EC 3.1.1.8), (3)

neurotoksična esteraza (NTE; EC 3.1.1.5), koja je povezana sa odloženom perifernom

neuropatijom izazvanom organofosfatima i (4) karboksilesteraza (CaE; EC 3.1.1.1), dok su u

drugoj grupi esteraze fosfornih triestara (EC 3.1.8) 24.

Dok su enzimi holinesteraza, NTE i CaE inhibirani od strane OFI, ostali uglavnom vrše njihovu

hidrolizu u manje toksične metabolite, što predstavlja drugu značajnu reakciju u prvoj fazi

njihove biotransformacije 25,26.

Kod insekata su ovi enzimi slabo aktivni pa je zato toksičnost OFI kod njih mnogo veća nego kod

sisara. Karboksilesteraze, pored toga što vrše hidrolizu estarskih veza, za sebe vezuju OFI i na taj

način se smanjuju koncentracije aktivnih molekula, a omogućava brža transformacija u neaktivne

metabolite 27.


9

U hidrolizi organofosfata učestvuju još i enzimi arildialkilfosfataze (EC 3.1.8.1) i

diizopropilfluorofosfataze (EC 3.1.8.2), u zavisnosti od toga da li se razgrađuje estarska veza

između fosfora i kiseonika (paraokson) ili između fosfora i acil radikala koji su fluoridni ili

cijanidni joni (sarin, soman, tabun) 28. Veoma je veliki značaj hidrolaza kod trovanja OFI, na šta

ukazuju i predlozi da se ovi enzimi uvrste u standardnu antidotsku terapiju.

U drugoj fazi biotransformacije toksičnih supstanci dolazi do stvaranja hidrosolubilnih jedinjenja

koja se mogu lako izlučiti iz organizma putem urina. Ova faza metabolizma je relativno brza i

uključuje metilaciju, acetilaciju i konjugaciju sa glukuronskom kiselinom, sulfatima, glutationom

i aminokiselinama. Na ovaj način se i organofosforna jedinjenja izlučuju iz organizma 29.

1.3.2. Biotransformacije malationa, dimetoata i diazinona

Sam malation je slabo toksičan. Oksidacijom malationa uz pomoć enzima CYP450 oksigenaze

nastaje mnogo toksičniji malaokson. Hidrolizu estarske veze u molekulu malationa i malaoksona

vrše CaE, pri čemu dolazi do razgradnje samo jedne esterifikovane karboksilne grupe. Ovaj

metabolički put je veoma važan jer hidrolizom nastaju neaktivni metaboliti (monokarboksilne

kiseline). Strukturne formule malaoksona i malation monokarboksilne kiseline (MCA), kao

najznačajnijih metabolita malationa prikazane su na Slikama 6 i 7.

Slika 7. Strukturna formula malation

monokarboksilne kiseline

Slika 6. Strukturna formula malaoksona


10

Degradacijom malationa u prisustvu CYP450 dolazi i do hidrolize P-S veze i tom prilikom se

dobija dimetil ditiofosfat (DMDTP) koji se dalje oksidiše do dimetil tiofosfata (DMTP) i dimetil

fosfata (DMP). Reakcijama demetilacije nastaje dezmetil malation, a malation monokarboksilna

kiselina daljom hidrolizom prelazi u dikarboksilnu kiselinu 30,31. Metabolizam malationa prikazan

je na Slici 8.

Slika 8. Metabolizam malationa


11

Degradacijom dimetoata nastaju mnogo toksičniji produkti, nego što je početna supstanca. Jedan

od produkata degradacije nastaje tiokso-oksidacijom i vodi formiranju oksidovanog homologa

dimetoata koji podleže hidrolizi. Nakon toga se formira tiokarboksil derivat koji se smatra

glavnim metabolitom u organizmu sisara 32.

Tiokarboksil derivati nisu pronađeni u biljkama tretiranim dimetoatom, a oksidovani analozi

dimetoata nađeni su u semenu biljaka. Mehanizam razgradnje dimetoata u biljkama i životinjama

prikazan je na Slici 9.

Slika 9. Mehanizam razgradnje dimetoata


12

Diazinon spada u srednje toksične organofosforne estre. Metabolizam tio organofosfata kod

sisara odvija se aktivacijom u odgovarajući okson najvećim delom u prisustvu CYP450, a zatim

dolazi do njihove hidrolize. Kod insekata je takođe dominantan mehanizam aktivacije u

odgovarajuće oksone u prisustvu izoenzima CYP450, ali kod njih nema hidrolize organofosfata,

pa je zbog toga toksičnost ovih jedinjenja selektivno veća u odnosu na sisare 33. Na Slici 10

prikazana je biodegradacija diazinona.

Slika 10. Metabolizam diazinona

Krajnji produkti metabolizma velikog broja OFI (O,O-dimetil i O,O-dietil supstituisana

jedinjenja) su dialkilfosfati. Sami dialkilfosfati nisu značajno toksični. Dialkil fosfatni metaboliti

ne zadržavaju strukturu koja bi upućivala na pesticid od kog vode poreklo, tako da je nemoguće

odrediti kom pesticidu je osoba bila izložena, ali njihovo prisustvo ukazuje na izloženost

organofosfornim jedinjenjima 34.


13

U Tabeli 1 su prikazani OFI i njihovi dialkil metaboliti (dimetil fosfat-DMP; dimetil tiofosfat-

DMTP, dimetil ditiofosfat-DMDTP; dietil fosfat-DEP i dietil ditiofosfat-DEDTP).

Tabela 1. OFI i njihovi dialkil metaboliti

Pesticid DMP DMTP DMTP DEP DETP

Malation

Dimetoat

Diazinon

Na Slici 11 prikazane su strukturne formule alkil fosfata.

Slika 11 . Strukturne formule alkil fosfata (dimetil fosfat-DMP; dimetil tiofosfat-DMTP, dimetil

ditiofosfat-DMDTP; dietil fosfat-DEP i dietil ditiofosfat-DEDTP)


14

1.4. Osnovni principi procene acidobaznog statusa organizma i njegovih poremećaja

Održavanje normalnog acidobaznog stanja predstavlja jednu od najvažnijih homeostaza u

organizmu. Podrazumeva regulaciju koncentracije vodonikovih jona u ekstracelularnoj tečnosti u

uskim granicama (35-45 nmol/L), sa normalnom pH krvi od 7,35 do 7,45. Takav pH neophodan

je za normalno odvijanje brojnih in vivo procesa, prevashodno biohemijskih-enzimskih, kako

funkcionalnih tako i onih sa posledičnim dejstvom na strukturu, rast i razvoj ćelija i tkiva.

Održavanje stabilne pH unutrašnje sredine omogućavaju puferi, u osnovi rastvori slabih kiselina i

njihovih konjugovanih baza. Intracelularno najvažniji su proteinski puferi, uključujući i

hemoglobin eritrocita (direktno utiče u regulaciju pH krvi), organski fosfati i drugi.

Ekstracelularno, pored proteina, pre svega albumina, a takođe i fosfata, najveći značaj ima

hidrogenkarbonatni pufer koji je nosilac oko 35% puferskog kapaciteta krvi.

Dve su bitne karakteristike hidrogenkarbonatnog puferskog sistema koji se sastoji od ugljene

kiseline (H2CO3) i hidrogen-karbonatnog jona (HCO3 -):

1. Koncentracije ove dve komponente direktno su nadzirane preko funkcije pluća

(hiperventilacija snižava parcijalni pritisak ugljen dioksida (pCO2) a time i koncentraciju

H2CO3, a hipoventilacija ih povećava u krvi) i bubrega koji kontrolišu izlučivanje

vodonikovih jona iz organizma različitim procesima, među kojima je i reapsorpcija

hidrogenkarbonata nazad u krv;

2. U poređenju sa drugima, obe komponente ovog pufera najlakše je analitički pratiti nakon

uzorkovanja krvi.

Stoga se promene acidobaznog stanja uobičajeno izražavaju uz pomoć Henderson - Hasselbalch-

ovog odnosa primenjenog na hidrogenkarbonatni pufer i njegovu konstantu disocijacije pK:

pH = pK + log [HCO3-] / H2CO3

ili pojednostavljeno:

pH = [HCO3-] / pCO2

Zbog principa izohidričnosti, promene u hidrokarbonatnom puferu definisane ovom jednačinom,

istovremeno predstavljaju smer promena svih puferskih parova u analiziranom rastvoru.


15

Patofizološki, postoje dve grupe poremećaja acidobazne ravnoteže: respiratorni i metabolički.

1. Respiratorna acidoza nastaje zbog brojnih uzroka koji primarno dovode do alveolarne

hipoventilacije, a time i porasta pCO2 u krvi; suprotno, kod hiperventilacije smanjuje se

pCO2 i takvo stanje označavamo kao respiratorna alkaloza. Prema navedenoj jednačini

rezultatni pH (manji od 7,35; veći od 7,35 ili u normalnim granicama) zavisi od nivoa

kompenzatornog povećanja ili smanjenja koncentracije HCO3 -.

2. Metabolička acidoza je proces u kome se prevashodno smanjuje koncentracija HCO3- u

plazmi, odnosno krvi. Njeni uzroci mogu biti različiti, uključujući i toksična dejstva

brojnih ksenobiotika. Obrnuto, do metaboličke alkaloze dovodi primarno povišeni

hidrogen-karbonatni jon iznad gornje referentne koncentracije. Među ostalim, razlog za to

može biti i prekomerni egzogeni unos alkalnih supstanci, kao što su rastvori NaHCO3 za

parenteralnu primenu. U metaboličkim poremećajima, kompenzacija se odvija

povećanjem ili smanjenjem plućne ventilacije (pCO2 pada ispod 35 mmHg ili raste preko

45 mmHg), a od stepena ovih promena zavisiće i konačni pH.

Pored merenja promena kocentracije hidrogenkarbonata, kao jednako precizan i istosmeran

indikator metaboličkog poremećaja, koristi se bazni eksces (BE). Bazni eksces označava

koncentraciju titrabilnih baza koja se konstatuje kada je krv titrirana jakom kiselinom ili bazom u

odgovarajućim uslovima pH, pCO2, temperature, kao i parcijalnog pritiska kiseonika (pO2).

Izražava se u istim jedinicima (mmol/L) i ima istu dijagnostičku vrednost kao i koncentracija

hidrogenkarbonata. Povišene vrednosti baznog ekcesa iznad gornje granice normale (BE > +2,5

mmol/L) ukazuju na metaboličku alkalozu tj. deficit kiselina izuzev ugljene. Snižene vrednosti

(BE < -2,7 mmol/L) nedvosmisleno potvrđuju da je acidoza metabolička, da postoji višak

kiselina izuzev ugljene.

Aparati određuju koncentraciju HCO3- i BE kao preračunate veličine. Ukoliko su ostali navedeni

parametri standardni (pH=7,40; pCO2=40 mmHg; pO2=100 mmHg) u pitanju je standardni

hidrogenkarbonat (cHCO3-(st)) i standardni bazni eksces (SBE). Ukoliko se proračun vrši u

odnosu na aktuelni, odnosno realni pO2 tada se radi o aktuelnom hidrogenkarbonatu (cHCO3-

(aP)), kao i aktuelnom baznom ekscesu (ABE).

Promene pCO2 u krvi, bilo primarne, bilo sekundarne, uvek se posmatraju u kontekstu

eventualnih promena parcijalnog pritiska kiseonika (pO2) i saturacije arterijske krvi kiseonikom

(sO2). Patološka pomeranja sadržaja gasova u krvi (respiratorne insuficijencije) su određenom

broju slučajeva povezane sa acidobaznim poremećajima i mogu biti njihov uzrok, ali i posledica 35.


16

1.5. Mehanizam delovanja OFI

Veliki broj jedinjenja inhibira dejstvo holinesteraza (ChE) i to nekovalentnim interakcijama

(reverzibilna inhibicija) ili kovalentnim vezivanjem za aktivno mesto (ireverzibilna ili

progresivna inhibicija). Organofosforna jedinjenja mogu da inhibiraju dejstvo ChE neposredno

po ulasku u organizam-direktni inhibitori ChE (dihlorvos, foksim i trihlorfon), ili se prvo

metabolišu u jetri i drugim organima i tkivima u toksični oblik i tek onda inhibiraju enzim-

indirektni inhibitori (azinfos-metil, dimetoat, fenitroton, fention, fosmet, hlorpirifos, malation i

pirimifos-metil) 36.

AChE i BuChE su enzimi iz grupe hidrolaza koje katalizuju hidrolitičke reakcije u prisustvu

molekula vode. Otkriveni su početkom 30-ih godina prošlog veka u istraživanjima koja su

pokazala da se u krvi i tkivima snižava koncentracija acetilholina (ACh). Ova pojava je pripisana

dejstvu enzima koji hidrolizuje ACh. Oba enzima, kao sastavni deo živih bića, životinja i biljaka i

zbog važne uloge u organizmu i danas su predmet istraživanja u oblasti biomedicine, biohemije i

toksikologije 37-39.

Iako su po svojoj hemijskoj strukturi homolozi, ovi enzimi se razlikuju prema katalitičkoj

aktivnosti.


17

1.5.1. Acetilholinesteraza

AChE hidrolizuje samo acetilholin ili acetil-β-metilholin. ACh je neurotransmiter perifernog i

centralnog nervnog sistema, a sintetiše se iz holina i acetil koenzima A (Ac-CoA) u citoplazmi

presinaptičkih nervnih završetaka. Reakcija je katalizovana od strane holinacetiltransferaza. Pošto

nervne ćelije ne sintetišu holin, one ga unose iz okoline putem aktivnog transporta. ACh se

pakuje u sinaptičke vezikule i iz njih se sekretuje u sinaptičku pukotinu (Slika 12).

Slika 12. Sinteza ACh

AChE oslobađa sinapse od ACh, pa se tako zaustavlja prenos signala sa nervne na mišićnu ćeliju.

ACh se oslobađa na svim preganglijskim nervnim vlaknima (parasimpatičkim i simpatičkim),

kao i na parasimpatičkim postganglijskim neuronima, simpatičkim postganglijskim neuronima za

inervaciju znojnih žlezda, pilo-erektornih mišića kože i krvnih sudova kože 40.

Postoje dve grupe receptora za ovaj neurotransmiter: nikotinski i muskarinski. Naziv su dobili po

jedinjenjima koja ih aktivirajaju (alkaloidi nikotin i muskarin).

http://sr.wikipedia.org/wiki/%D0%9D%D0%B5%D1%83%D1%80%D0%BE%D1%82%D1%80%D0%B0%D0%BD%D1%81%D0%BC%D0%B8%D1%82%D0%B5%D1%80

http://sr.wikipedia.org/wiki/Holin

http://sr.wikipedia.org/w/index.php?title=%D0%90%D1%86%D0%B5%D1%82%D0%B8%D0%BB-%D0%BA%D0%BE%D0%B5%D0%BD%D0%B7%D0%B8%D0%BC_%D0%90&action=edit&redlink=1

http://sr.wikipedia.org/wiki/%D0%A6%D0%B8%D1%82%D0%BE%D0%BF%D0%BB%D0%B0%D0%B7%D0%BC%D0%B0

http://sr.wikipedia.org/w/index.php?title=%D0%A5%D0%BE%D0%BB%D0%B8%D0%BD%D0%B0%D1%86%D0%B5%D1%82%D0%B8%D0%BB%D1%82%D1%80%D0%B0%D0%BD%D1%81%D1%84%D0%B5%D1%80%D0%B0%D0%B7%D0%B0&action=edit&redlink=1

http://sr.wikipedia.org/wiki/Aktivni_transport

http://sr.wikipedia.org/w/index.php?title=%D0%92%D0%B5%D0%B7%D0%BA%D1%83%D0%BB%D0%B0&action=edit&redlink=1

http://sr.wikipedia.org/wiki/%D0%A1%D0%B8%D0%BD%D0%B0%D0%BF%D1%81%D0%B0

http://sr.wikipedia.org/w/index.php?title=%D0%9F%D1%80%D0%B5%D0%B3%D0%B0%D0%BD%D0%B3%D0%BB%D0%B8%D1%98%D1%81%D0%BA%D0%B8_%D0%BD%D0%B5%D1%83%D1%80%D0%BE%D0%BD&action=edit&redlink=1

http://sr.wikipedia.org/wiki/Parasimpatikus

http://sr.wikipedia.org/wiki/Simpatikus


18

Nikotinski receptori

Nikotinski receptori se nalaze u nervnim ćelijama i ćelijama skeletnih mišića. Aktivacijom

nikotinskih receptora, koji su zapravo jonski kanali, dolazi do njihovog otvaranja i ulaska katjona

(Na+; K+ ; Ca+) što dovodi do depolarizacije membrana neurona.

Muskarinski receptori

Muskarinski receptori su vezani za G protein i nalaze se u efektornim tkivima i organima, kao i u

CNS. Postoji pet različitih tipova muskarinskih receptora:

M1 su nervni receptori i nalaze u CNS-u i želucu i izazivaju njihovu ekscitaciju;

M2 su receptori na srčanim mišićnim ćelijama (pretkomore i sprovodni sistem srca)

čijom se aktivacijom smanjuje frekvenca i snaga srca (inhibitorna uloga);

M3 receptori se nalaze na glatkim mišićima i egzokrinim žlezdama i pojačavaju njihovo

dejstvo;

M4 i M5 receptori nalaze se u CNS-u i ostvaruju dejstvo kao M2 i M3 receptori (Slika

13).

đ

Slika 13. Nikotinski i muskarinski receptori

http://sr.wikipedia.org/wiki/%D0%9C%D0%B8%D1%88%D0%B8%D1%9B

http://sr.wikipedia.org/wiki/%D0%9C%D0%B8%D1%88%D0%B8%D1%9B

http://sr.wikipedia.org/w/index.php?title=%D0%96%D0%BB%D0%B0%D0%B7%D0%B4%D0%B0&action=edit&redlink=1


19

AChE se osim u sinapsama, nalazi i u krvi gde je vezana za eritrocite, pa se naziva i eritrocitna

holinesteraza. Njena uloga na eritrocitima za sada nije poznata. Ima je u sivoj masi nervnog

sistema, amnionskoj tečnosti i placenti.

Jedan molekul AChE u toku jednog minuta može da hidrolizuje 6x105 molekula ACh. U

molekulu AChE aktivno mesto enzima je anjonsko i estarsko, a određeno je sekvencom

aminokiselina.

Anjonsko mesto čini glutaminska kiselina sa svojom karboksilnom grupom. Ona privlači

trimetilamonijum radikal ACh.

Estarsko mesto se sastoji od tri aminokiseline (histidin, tirozin i serin). Reakcijom između acetil

grupe ACh i hidroksilne grupe serina dolazi do formiranja kompleksa između enzima i ACh. Na

taj način nastaje acetilovani enzim i oslobađa se molekul holina.

Enzim se regeneriše hidrolizom estarske veze. Katalizator u ovoj rekciji je hidroksilna grupa

tirozina i imidazolijum jon histidina (Slika 14) 41-44.

Slika 14. Hidroliza ACh


20

Određivanje aktivnosti AChE (prave holinesteraze) se vrši u cilju ispitivanja trovanja pesticidima

iz grupe OFJ i karbamata. Inhibicija enzima AChE, vrši se ulaskom organofosfornog molekula u

aktivno mesto enzima i na taj način ne dozvoljava nukleofilni napad na ACh i njegovu hidrolizu.

Tom prilikom dolazi do razlaganja OFI, što posledično vodi do fosforilacije enzima pri čemu se

formira kovalentna veza imeđu ostatka OFI i OH grupe serina (Slika 15).

Slika 15. Vezivanje OFI za AChE

Kompleks OFI i enzima je stabilan i spontana hidroliza je veoma spora. Fosforilovani enzim ne

može da hidrolizuje neurotransmiter (ACh), što dovodi do njegovog nakupljanja. Na taj način ne

dolazi do depolarizacije post-sinaptičke membrane i sinaptička transmisija ne funkcioniše.

Inhibirana acetilholinesteraza u prisustvu oksima može da povrati svoju funkciju, tako što oksim

razgrađuje fosforilisani enzim, vezuje za sebe deo organofosfata i stvara fosforilisani oksim. Ipak,

u određenim slučajevima, jedan deo enzima se ne može reaktivirati ni u prisustvu oksima što

zavisi od hemijske strukture OFI i vremena inhibicije (»starenje fosforilisanog enzima«). Ova

vremenski zavisna intramolekularna transformacija enzima se dešava jer vremenom inhibirani

enzim gubi jedan alkil radikal (R1) koji je vezan za fosfor i nastali oblik inhibiranog enzima ne

može se više reaktivirati (Slika 16) 6,45,46.


21

Slika 16. Reakcije AChE: inhibicija sa OFI; reaktivacija oksimom i „starenje enzima“.

1.5.2. Butirilholinesteraza

BuChE hidrolizuje pored acetilholina, i neke druge biološki važne estre (butirilholin,

propionilholin, benzoilholin, γ-aminibutirilholin). BuChE (pseudoholinesteraza) je enzim koji se

sintetiše u jetri i odmah emituje u cirkulaciju. Nalazi se u gotovo svim tkivima i u krvi. Poluživot

u serumu je relativno kratak, oko 10 dana 42,47. Eksperimenti na životinjama kojima nedostaje

AChE pokazali su da taj enzim može delimično zameniti aktivnost AChE 48. Fiziološka uloga

BuChE nije sasvim razjašnjena, a snižena aktivnost ovog enzima prati određena patološka stanja

organizma (oboljenje jetre, malnutricija, akutna infekcija, karcinom, hronična anemija) 49.

Trovanje OFJ takođe može izazvati smanjenje dejstva enzima, kao i određeni lekovi (cimetidin,

prokainamid, androgeni, estrogeni, oralni kontraceptivi, kontrast agesi itd) 50.

Postoje 2 tipa pseudoholinesteraze: normalna (tipična) i atipična. Tip pseudoholinesteraze se

nasleđuje recesivno. Utvrđeno je da 95% populacije ima tipičnu serumsku holinesterazu.

Fenotipizacija serumske holinesteraze je značajna za utvrđivanje osetljivosti na miorelaksanse

tipa sukcinil-holina. Tipična serumska holinesteraza brzo hidrolizuje sukcinil-holin. Kod osoba sa

atipičnim oblikom holinesteraze hidroliza sukcinil-holina je spora, što se manifestuje


22

produženom mišićnom relaksacijom i apneom nakon hirurške intervencije 50,51. U zavisnosti od

starosne dobi menja se i aktivnost BuChE. Pri rođenju aktivnost enzima niža je za 50% nego kod

odraslih. Onda raste aktivnost od 3-6 godine i ona je za 30% veća nego kod odraslih. Posle 5.

godine opada i stabilizuje se na nivo odraslih u pubertetu. Značajno sniženje i do 30% javlja se u

toku trudnoće 52,53.

Kod trovanja OFJ, osim aktivnosti AChE veoma je važno i odrediti aktivnost BuChE. BuChE

ima višestruki značaj: prvo kao rezerva u zaštiti AChE, jer ima veći afinitet prema daleko

najvećem broju organofosfata, zatim služi kao veoma osetljiv biomarker, ne samo za ekspoziciju

već i za procenu težine stepena trovanja 54. BuChE se u plazmi čoveka nalazi u količini od 50 nM

55, a u organizmu je ima oko 10 puta više od AChE 56, zbog čega predstavlja značajnu zaštitu

AChE kod trovanja inhibitorima AChE.

1.6. Klinička slika trovanja

Osnovni mehanizam delovanja OFI bazira se na ireverzibilnoj inhibiciji AChE i posledičnom

nakupljanju neurotransmitera ACh na holinergičkim sinapsama, što dovodi do ispoljavanja

simptoma i znakova akutnog trovanja. Varijacije u ispoljavanju akutne toksičnosti OFI, posledica

su njihove različite hemijske strukture i brzine spontane reaktivacije i starenja.

Klinički sindromi u koje spadaju akutna holinergička kriza, intermedijerni sindrom, odložena

periferna neuropatija i druge specifične lezije organa, koji se javljaju kod trovanja OFI mogu da

imaju različitiu patogenezu i prognozu, a samim tim zahtevaju i različit tretman.

Neposredno po ekspoziciji, a najkasnije do 12 sati, javljaju se simptomi akutne holinergičke

krize. Kod trovanja OFI u skladu sa inhibicijom dolazi do stimulacije, odnosno paralize prenosa

nervnih impulsa.


23

U kliničkoj slici trovanja se razlikuju:

muskarinski efekti (bradikardija, bronhokonstrikcija, bronhoreja, hipotenzija, pojačani

motilitet gastrointestinalnog trakta, abdominalni grčevi, mioza, hipersalivacija);

nikotinski efekti (hipertenzija, tahikardija, fascikulacije, fibrilacije, nekroza skeletnih

mišića, slabost mišića dijafragme koja progredira do paralize i respiratorne

insuficijencije);

centralni efekti (tremor, inkoordinacija pokreta, konvulzije, centralna depresija disanja,

koma i smrt).

Muskarinski efekti nastali kao posledica nakupljanja ACh, javljaju se pre nikotinskih efekata i

prate lakša trovanja OFJ. To su parasimpatičke manifestacije stimulacije egzokrinih žlezda,

glatke muskulature i kardiocirkulatorng sistema.

Kod teških trovanja javljaju se i nikotinski efekti. Ispoljavaju se na vegetativnim ganglijama i

skeletnoj muskulaturi. Odnos muskarinskih i nikotinskih efekata u centralnom nervnom sistemu

(CNS) iznosi 9:1, a posledica njihovih efekata su simptomi i znaci trovanja od strane CNS-a

(centralni toksični fenomeni) 57.

Neurološki simptomi (mišićna slabost fleksora vrata, respiratornih mišića i mišića ekstremiteta)

koji se javljaju od 24 do 96 sati nakon kupiranja akutne holinergičke krize, su druga manifestacija

trovanja OF jedinjenjima i poznati su kao intermedijarni sindrom. Intermedijarni sindrom, javlja

se pre očekivanog nastanka odložene neuropatije, a nastaje usled neadekvatnog lečenja akutne

epizode trovanja, količine i vremena primene oksima ili neadekvatne ventilacije 58.

U trovanjima pojedinim OFI (hlorpirifos, metamidofos, trihlorfon), usled innhibicije drugih

enzima, a posebno NTE se javlja odložena polineuropatija. Javlja se u periodu od dve do pet

nedelja posle akutne ekspozicije 59,60.

Kao posledica inhibicije drugih enzima kao što je npr. Na-K-ATP-aza, dolazi do poremećaja

energetskog metabolizma i oštećenja ćelija i tkiva, usled čega nastaju lezije raznih organa 61.


24

1.7. Dijagnoza trovanja -Toksikološke analize

U dijagnozi trovanja, pored anamnestičkih i heteroanamnestičkih podataka o ekspoziciji OFI,

značajno mesto ima klinička slika, posebno zbog toga što analitičke dijagnostičke tehnike nisu

široko dostupne. U dijagnostici trovanja merenje inhibicije aktivnosti holinesteraze je prvi test

koji se zahteva od laboratorije, a ne zahteva složeniju opremu.

Analiza organofosfornih jedinjenja i njihovih metabolita u biološkom materijalu je pak veoma

složena, a praćenje niskih koncentracija nalaže primenu veoma osetljivih analitičkih tehnika.

Postoji veliki broj metoda pripreme uzoraka biološkog materijala i hromatografskih metoda za

određivanje organofosfornih jedinjenja, uz različite načine njihove detekcije 62-69.

Sve metode se sastoje iz tri osnovna koraka: ekstrakcije, prečišćavanja i analize dobijenog

ekstrakta. Ekstrakcija organskim rastvaračima (tečno-tečna ekstrakcija) često se primenjuje za

izdvajanje OFJ iz biološkog materijala. U novije vreme, sve češće je u upotrebi primena čvrsto-

tečne (SPE) ekstrakcije.

U analizi ekstrakata koriste se različite tehnike. Primenjuju se gasna hromatografija (GC) sa azot

fosfor selektivnim detektorom (NP), plameno-fotometrijskim detektorom (FPD) ili masenom

spektrometrijom (MS i MS/MS), a u novije vreme i tečna hromatografija sa masenom (LC-MS) i

spregnutom masenom detekcijom (LC-MS/MS).

Maseni spektar, kao analitički prikaz rezultata masenospektrometrijskog merenja je jedini

pouzdan metod za identifikaciju ispitivanih jedinjenja. Savremena toksikološko-hemijska analiza

nalaže pronalaženje i uvođenje novih metoda i tehnika za specifičniju, osetljiviju, precizniju i bržu

analizu. Tečna hromatografija ultravisokih performansi (UPLC) sa masenom spektrometrijom

(MS) daje mogućnost za bržu i pouzdaniju hromatografsku analizu 70.

U Tabeli 2 su prikazane različite metode ekstrakcije i analize OFJ i njihovih metabolita (alkil

fosfata) sa prinosima ekstrakcije i granicama detekcije i kvantifikacije.


25

Tabela 2. Metode određivanja i načini ekstrakcije OFI

Jedinjenje Metoda Način pripreme Prinos % LOQ Ref.

Diazinon

Dimetoat LC/MS/MS

Precipitacija

(ZnSO4 + metanol) 1:1

uzorak

98 0,5 ng/mL 71

Dimetoat,

DMP, DMTP, DMDTP,

DEP, DETP, DEDTP

GC/MS

SPE Toxi R

Tečno-tečna ekstrakcija i

derivatizacija

- 0,5 mg/L;

1,5 mg/L 72

Diazinon, dimetoat,

malation, MCA,

alkilfosfati

LC/MS

SPE HLB Oasis

WAX Oasis

24-100 10 µg/L - 10

mg/L 73

Malation, diazinon

GC/NPD

GC/MS

SP(C18)

Tečno-tečna ekstrakcija

71,83

97,10

1,52 µg/L

6,58 µg/L 74

DMP, DMTP, DMDTP,

DEP, DETP, DEDTP

GC/FPD Tečno-tečna ekstrakcija i

derivatizacija 80-120

5 µg/L; 10

µg/L 75

DMP, DEP, DETP,

DEDTP GC/MS SP i derivatizacija

84,3-

116,11 25-500 76

DMP, DMTP, DMDTP,

DEP, DETP, DEDTP GC/FPD

SP (CN)

derivatizacija 85,8-101 3-62,5 µg/L 77

DMP GC/NPD Tečno-tečna ekstrakcija i

derivatizacija 60 0,06 mg/L 78

DMP, DMTP, DMDTP,

DEP, DETP, DEDTP GC/MS

Tečno-tečna ekstrakcija SP

(Si) i derivatizacija

Visoka

zbog male

količine

urina 250

µg/L

3-6 ng/mL

18 ng/mL 79

DMTP, DMDTP, DETP,

DEDTP GC/FPD SP (SAX) i derivatizacija 20-80 20 µg/L 80

DMP, DMTP, DMDTP,

DEP, DETP, DEDTP GC/MS/MS

Derivatizacija(3-hloro-3-

jodopropan) -

0,05-058

µg/L 81

DMP, DMTP, DMDTP,

DEP, DETP, DEDTP GC/MS/MS SP i derivatizacija 60-109

0,1-0,15

ng/mL 82

DMP, DMTP, DEP,

DETP, DEDTP LC/MS/MS

Urin + tetrabutilamonijum

acetat 78-119 1-2 µg/L 83

DMP, DMTP, DMDTP,

DEP, DETP, DEDT LC/MS/MS

SP jonska iznena

eluiranje sa 20 % TEA 40-70

0,044 -1,549

ng/mL 84

DMP, DMTP, DMDTP,

DEP, DETP, DEDT GC/FID derivatizacija 62,5-82,7 2-10 µg/L 85

DMP, DMTP, DMDTP,

DEP, DETP, DEDT

GC/MS/MS

GC/MS

SP, tečno-tečna ekstrakcija

i liofilizacija sa

derivatizacijom

20-60 0,01-2,97

ng/mL 86


26

1.8. Terapija trovanja

Terapija akutnih trovanja OFJ, pored suportivnih mera i dekontaminacije, uključuje primenu

antidota: parasimpatikolitika (atropin), reaktivatora holinesteraze (oksim) i antikonvulziva

(diazepam).

Kod peroralnih trovanja, eliminacijom toksične supstance iz digestivnog trakta, koja se uz

primenu aktivnog uglja i katarktika postiže lavažom želuca, zaustavlja se njen dalji unos u

organizam. Potrebno je osloboditi vazdušne puteve i uspostaviti adekvatnu ventilaciju i

oksigenaciju. Intubacija je potrebna u slučaju kome, ali i kod nastalog respiratornog distresa

uzrokovanog laringospazmom, bronhospazmom, bronhorejom ili konvulzijama. Potreba za

intubacijom može se eliminisati brzom primenom i adekvatnom dozom atropina.

U lečenju pacijenata sa trovanjem OFJ, gde je neophodna višestruka medikacija i merenje

parametara acido-baznog i gasnog statusa, potreban je centralni venski put i arterijska linija.

Kako se radi o urgentnim pacijentima u jedinicama intenzivne nege, neophodno je kontinuirano

praćenje njihovih vitalnih parametara.

Atropin je osnovni antidot kod trovanja OFJ. On blokira muskarinske receptore na nervnim

završecima postganglijskog parasimpatikusa, prema kojima ima 100 puta veći afinitet od ACh.

Nakon intravenske primene njegovo dejstvo je skoro momentalno, a kod pacijenta dolazi do

sušenja sluznica usta, nosa, bronhija, nestaje spazam glatkih mišića i suzbija se bradikardija i

hipotenzija 87.

Atropin, čiji se mehanizam dejstva bazira na blokadi muskarinskih receptora, u trovanjima OFI

blokira i dejstvo povećanog ACh na egzokrinim žlezdama (pojačana sekrecija u respiratornom

traktu), glatkoj muskulaturi (spazam) i kardiocirkulatornom sistemu (bradikardija i hipotenzija)

88. Pošto atropin ne deluje na nikotinske receptore, možemo ga smatrati nepotpunim antidotom.

Atropin omogućava bolji prolazak oksima do mozga, zato što povećava propustljivost

krvnomoždane barijere 18. U slučaju cijanoze, odnosno u stanju hipoksije treba prvo primeniti

oksigenoterapiju i veštačko disanje, jer davanje atropina pre toga je kontraindikovano, zbog

mogućnosti da dođe do fibrilacije srčanih komora.


27

Terapija atropinom primenjuje se sve dok postoje znaci akutne holinergičke krize. Najpre u dozi

od 2-4 mg intravenski na pet minuta do postizanja hiperatropinizacije („suva pluća“, suvoća usta i

kože, crvenilo lica, midrijaza, tahikardija do 100/min.), a do potpune atropinizacije nekada je

potrebno dati velike količine atropina, čak do stotinu miligrama u toku dana. Terapija atropinom

se primenjuje u narednih 7-10 dana, intermitentno u bolusu intravenski ili u intravenskoj

infuziji.

Oksimi-reaktivatori holinesteraze su takođe specifični antidoti u trovanjima OFJ. Iako je efekat

oksima nedvosmisleno dokazan u eksperimentalnim studijama, klinički značaj još uvek nije

potvrđen. Zbog jačeg afiniteta oksima prema atomu fosfora OFI od AChE, dolazi do raskidanja

veze inhibitora sa enzimom, pri čemu se funkcija enzima obnavlja, a netoksičan fosforilisani

oksim izlučuje urinom. U ranoj fazi trovanja primena oksima zajedno sa atropinom smanjiće

kliničke znake i holinergičke simptome, a i potrebnu količinu atropina. Iako je do danas

sintetisano više hiljada oksima 89,90, dostupni pralidoksim i obidoksim, smatraju se i dalje

nedovoljno efikasnim u različitim trovanjima nervnim agensima. Oksim koji je najviše korišćen u

svetu je pralidoksim. Postoji kao pralidoksim hlorid, mesilat i metil sulfat (Contrathion®) 91.

Najefikasniji u trovanju različitim OFI i tabunom pokazao se obidoksim 92 (sintetisan 1964.

godine od strane Lütringhausa i Hagedorna). Reaktivirajuća svojstva HI-6, HGG-12, HS-6

proučavali su De Jong i Worling 93, pri čemu su zaključili da HI-6 ima veću moć reaktivacije od

pralidoksima i obidoksima. Nijedan od testiranih oksima ne smatra se univerzalno pogodnim

reaktivatorom.

Rezultati koji su pokazali da je efikasna terapijska koncentracija oksima (pralidoksim) u plazmi 4

mg/L, potiču iz eksperimentalne studije Sundwall-a 94 na mačkama otrovanim kvaternernim

analogom sarina. Ova terapijska koncentracija u plazmi efikasno suzbija bradikardiju,

hipotenziju, respiratorne poremećaje i prihvaćena je nekritički od drugih autora.

Količina pralidoksima koja se daje u svetu još nije određena. Svetska zdravstvena organizacija

preporučuje da je za trovanje OFI potrebna terapija pralidoksimom od najmanje 30 mg/kg u

bolusu što je praćeno kontinuiranom infuzijom.

Na reaktivaciju AChE inhibrane OFI utiču mnogi faktori: adekvatna doza oksima,

farmakokinetika OFI i oksima, brzina reaktivacije enzima i dužina lečenja. Korelacija između


28

depresije AChE i kliničkih znakova trovanja je slaba, pa je i zbog toga teško proceniti efikasnost

delovanja oksima. Smatra se da frakcioniranim davanjem oksima nemamo kontinuiranu

terapijsku koncentraciju (zato što je izmenjena farmakokinetika u teškim trovanjima), a

kontinuirana infuzija oksima bi to mogla da obezbedi.

Oksimi imaju različitu sposobnost reaktivacije za datu fosforilisanu AChE, a fosforne rezidue

vezane za holinesterazu nisu jednako osetljive na isti oksim. Nedovoljan terapijski efekat oksima

u kliničkim studijama objašnjava se pored toga i brzinom starenja kompleksa enzim-inhibitor,

mogućnošću reinhibicije ili do nove inhibicije fosforilisanim oksimom, koji je često jači inhibitor

od samog OFJ. Meta-analize nisu pokazale ubedljiv terapijski efekat, što se objašnjava različitim

tipom OFJ (dimetil ili dietil), vremenom proteklim do davanja antidota, neadekvatnog doziranja

oksima i njegove toksičnosti. Efekat je bolji ukoliko se oksim da unutar 2-3 sata (samo se 15%

pacijenata javlja lekaru u ovom optimalnom periodu). Potencijalni štetni efekti oksima i

nedostatak njihove efikasnosti u kliničkim uslovima, pokrenuli su istraživanja vezana za nove

terapijske agense 95-97.

U terapiju trovanja OFJ, diazepam je prvi put uveden 1974. godine 98. Po svojoj hemijskoj

strukturi pripada gupi benzodiazepina. Diazepam se u CNS-u vezuje na postsnaptičkim

neuronima GABA receptora, čime se pojačava inhibitorni efekat GABA na ekcitabilnost neurona

(povećava se permeabilitet membrana postsinaptičkih neurona za jone hlora). U slučaju trovanja

OFJ, dolazi do povećanja ACh i istovremenog smanjenja GABA i cAMP usled čega nastaju

konvulzije. U normalnim uslovima postoji ravnoteža između nivoa GABA, ACh, cAMP i cGMP

i tada nema konvulzija. Upotrebom diazepama, pojačava se dejstvo GABA, dolazi do povećanja

cAMP, a samim tim i smanjenje nivoa ACh i cGMP, i na taj način dolazi do prestanka konvulzija 99,100.


29

1.9. Problem

Jedan od razloga nezadovoljavajuće efikasnosti sadašnjih antidota u terapiji trovanja OF

insekticidima je i njihova dugotrajna perzistencija u organizmu. Naime, oni zbog liposolubilnosti

stvaraju depoe u masnom tkivu, odakle zatim postepeno prelaze u sistemsku cirkulaciju i dovode

do produžene intoksikacije. Iz tih razloga je u poslednje vreme došlo do razvoja novog koncepta

u terapiji tih trovanja koji se zasniva na adjuvantnoj primeni natrijum hidrogenkarbonata.

Razvojni put tog koncepta odvijao se kroz ispitivanja u in vitro uslovima, a zatim kroz klinička

ispitivanja.

U ispitivanjima in vitro, Garcia-Repetto i saradnici 101 su ustanovili da su neki OFI npr. malation

i trihlorofon bili i do pet puta manje stabilni u alkalnoj (pH = 8,5) nego u blago alkalnoj sredini

(pH = 7,5), odnosno, da se njihova razgradnja ubrzava u alkalnoj sredini.

Usledila su zatim predklinička ispitivanja u kojima je na pacovima pokazano da natrijum

hidrogenkarbonat pojačava terapijsku efikasnost atropina i pralidoksima u trovanju diizopropil

fluorofosfatom (DFP) 102, kao i atropina, obidoksima i trimedoksima u trovanju dihlorvosom

(DDVP) 103,104.

Povoljni efekti natrijum hidrogenkarbonata dobijeni na pacovima, potvrđeni su takođe i u

kliničkim studijama. U radovima Balali-Mood i saradnici 105,106 su kod pacijenata sa trovanjem

OFI ustanovili da je ukupna primenjena doza atropina bila manja, vreme hospitalizacije kraće i

smrtnost manja kada je uz standardnu primenu atropina i pralidoksima primenjen i natrijum

hidrogenkarbonat, u odnosu na grupu bolesnika lečenih samo standardnim antidotima.

Rezultati Klinike za urgentnu i kliničku toksikologiju VMA takođe ukazuju da je primena

natrijum hidrogenkarbonata u bolesnika trovanih OF insekticidima dovela do statistički

značajnog smanjenja ukupno primenjene doze atropina kao i smanjene potrebe za mehaničkom

ventilacijom u poređenju sa grupom bolesnika kod kojih nije primenjen natrijum hidrogenkarbonat 107.


30

Na osnovu ovih i drugih dostupnih podataka (prikazi slučajeva), Roberts i Buckley 108 su 2005.

godine napravili sumarnu analizu efikasnosti natrijum hidrogenkarbonata u akutnim trovanjima

OFI. U tom prikazu povoljno se ocenjuje efikasnost natrijum hidrogenkarbonata, ali se on ipak ne

preporučuje za rutinsku primenu iz sledećih razloga: nedovoljan broj pacijenata u dosada

objavljenim kliničkim studijama i još uvek nedovoljno poznati mehanizmi njegovog terapijskog

dejstva.

Na osnovu rezultata predkliničkih i kliničkih ispitivanja, kao moguće objašnjenje za povoljni

efekat natrijum hidrogenkarbonata u terapiji trovanja OFI, navedena je ubrzana razgradnja

otrova u organizmu. Ipak, ova postavka još nije dovoljno proučena kako u eksperimentalnim

tako ni u kliničkim studijama.

U našim ispitivanjima ova pretpostavka je proverena određivanjem koncentracija početnog

(matičnog) jedinjenja i njegovih aktivnih i neaktivnih metabolita u krvi i urinu bolesnika akutno

otrovanih OFI. Ova procedura je izvedena u bolesnika koji su primili standardnu terapiju (oksim i

atropin), ali i u grupi bolesnika koji su pored standardne terapije dobili i natrijum

hidrogenkarbonat.

Treba takođe napomenuti da je za optimalno praćenje toksikokinetike organofosfata (izvornih

molekula i njihovih metabolita) bilo neophodno i modifikovati postojeće analitičke metode, da bi

se omogućila njihova brža i jednostavnija identifikacija i kvantifikacija u biološkom materijalu

kod bolesnika sa akutnim trovanjima OFI.

Imajući upravo sve ovo u vidu, u okviru ove doktorske disertacije postavljena je radna hipoteza.


31

2. RADNA HIPOTEZA

Intravenska primena rastvora natrijum hidrogenkarbonata u kombinaciji sa standardnim

antidotima (atropin/oksim/diazepam), kod bolesnika lečenih zbog akutnog trovanja

organofosfornim insekticidima, dovodi do ubrzane razgradnje otrova i boljeg kliničkog toka i

ishoda trovanja u odnosu na bolesnike tretirane samo standardnim antidotima.


32

3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA

Na osnovu izložene hipoteze, kod bolesnika lečenih zbog akutnog trovanja OFJ standardnim

antidotima (atropin/oksim/diazepam) sa ili bez dodatka natrijum hidrogenkarbonata, u

odgovarajućim vremenskim intervalima, potrebno je bilo izvšiti sledeće ciljeve istraživanja:

1. odrediti koncentracije OFI i njihovih metabolita u krvi i urinu;

2. u krvi odrediti vrednosti pH, koncentraciju HCO3-(st), vrednosti ABE, kao i vrednosti pCO2,

pO2 i sO2;

3. odrediti aktivnost AChE i BuChE;

4. pratiti vitalne parametre (arterijski krvni pritisak, srčana frekvencija i telesna temperatura),

količinu upotrebljenih antidota, broj dana na mehaničkoj ventilaciji, broj dana hospitalnog

lečenja i mortalitet.

U in vitro uslovima ispitati uticaj pH na hidrolizu organofosfornih jedinjenja.

Statistički uporediti dobijene vrednosti praćenih parametara (kliničkih i laboratorijskih) između

bolesnika koji su uz standardne antidote bili tretirani i natrijum hidrogenkarbonatom i onih

lečenih samo strandardnim antidotima.


33

4. MATERIJAL I METODE RADA

U ispitivanje su bili uključeni bolesnici sa akutnim trovanjem OFJ, primljeni na lečenje u Kliniku

za urgentnu i kliničku toksikologiju Centra za kontrolu trovanja VMA (CKT-VMA) u periodu od

2006. do 2014. godine, koji su prema Poison Severity Score (PSS), imali umeren do težak stepen

trovanja (skor 2-3).

Bolesnici su, po dolasku u Kliniku, slučajnim izborom bili podeljeni u 2 grupe:

Kontrolna grupa: bolesnici koji su u terapiji primali samo standardne antidote

(atropin/oksim/diazepam);

Test grupa: bolesnici koji su u terapiji, pored standardnih antidota (atropin/oksim/diazepam),

primali i natrijum hidrogenkarbonat.

Natrijum hidrogenkarbonat je primenjivan tokom 48 sati. Inicijalna doza (doza opterećenja) od 4

mmol/kg i.v. bila je primenjena tokom jednog sata, a zatim se nastavilo dozom održavanja od 4

mmol/kg/24 sata kontinuiranom i.v. infuzijom do kraja terapije, odnosno dok se organofosforni

insekticid detektuje u biološkom materijalu.

Od lečenih pacijenata, srednje teška (PSS 2) i teška trovanja (PSS 3) su bila kod 42 bolesnika (20

osoba u kontrolnoj grupi i 22 osobe u test grupi).

Letalni ishod (PSS 4) je zabeležen kod 14 pacijenata (6 u kontrolnoj grupi i 8 u test grupi), pa su

iz tog razloga isključeni iz istraživanja.


34

Iz studije su bili isključeni bolesnici sa od ranije poznatim oboljenjima koja mogu uticati na

acidobazni status (hronična bubrežna insuficijencija i hronična bolest pluća).

Za određivanje koncentracije OFI i njihovih metabolita u serumu i urinu, uzorkovanje krvi i urina

u test grupi (koja je uz standardne antidote primala i natrijum hidrogenkarbonat) vršilo se pre

početka primene natrijum hidrogenkarbonata i standardnih antidota, na svakih 6 sati tokom

primene natrijum hidrogenkarbonata, a potom i na svakih 24 sata do prestanka standardne

antidotske terapije, a u kontrolnoj grupi, koja je primala samo standardne antidote u

odgovarajućim vremenskim intervalima koji su bili istovetni intervalima uzorkovanja u test

grupi.

Merenje vrednosti pH, koncentracije HCO3-(st), kao i vrednosti ABE, pCO2, pO2, sO2 u obe

grupe bolesnika lečenih zbog akutnog trovanja OFI, vršilo se pre početka primene antidotske

terapije, a zatim na svakih 6 sati tokom primene antidotske terapije.

Uzorkovanje krvi za određivanje aktivnosti AChE i BuChE vršilo se u momentu prijema

bolesnika u bolnicu, a zatim posle 30 minuta, jedan sat, dva sata, potom u intervalima od 6 sati

tokom trajanja primene antidotske terapije i na svakih 24 sata od momenta prekida primene

antidotske terapije.

Monitoring vitalnih parametara (arterijski krvni pritisak, frekvencija rada srca i telesna

temperatura) sprovodio se kontinuirano tokom trajanja hospitalizacije uz registrovanje vrednosti

najmanje na svakih 6 sati. Svakodnevno je registrovana potrošnja atropina, trajanje mehaničke

vantilacije i hospitalizacije, kao i ishod trovanja (mortalitet).


35

4.1. Aparati i pribor

UPLC-MS system - Waters-Acquity UPLCSQ - Sistem sa softveskim programom

MassLynx 4.1

UV-VIS spektrofotometar - GBC CINTRA 10e

gasni analizator ABL 735 - RADIOMETER Copenhagen

integrisani hemijski sistem Dimension RxLMax – SIEMENS;

pH-metar - PHM 26, Radiometer Copenhagen sa kalomelovom elektrodom K 401 i

staklenom elektrodom G 202

analitička vaga - sartorius, BP 221 S

ultrazvučno kupatilo - Iskra UZ 10R, Sentjernej

vorteks - Tehtnica, Železniki, EV-102

mućkalica - IKA - Kreisschüttler KS-50

centrifuga - IEC Centa MP4

centrifuga - Tehnica, Železniki, EV-102

automatske pipete - GILSON 1000μL i 200μL

staklene pipete i stakleno posuđe - Vega, Boral

kolona - ACQUITY UPLC ® HSST3 1,8 μm 2,1×100 mm

kolona - BEH C18 1,8 μm 2,1×100 mm

sistem za SPE ekstrakciju - Waters

sistem za vakuum filtraciju - Millipore

vakuum pumpa

Oasis HLB Extraction Cartridge, 3cc/60 mg


36

4.2. Hemikalije i reagensi

mravlja kiselina - p.a. Merck

amonijum hidroksid - p.a. Merck

voda - HPLC čistoće J.T. Baker

dejonizovana voda - sistem Millipore, Mili- RO 20

bezvodni natrijum sulfat - p.a. Merck

amonijum acetat - p.a. Merck

dietilamin - p.a. Merck

amonijum hidroksid - p.a. Zorka Pharma

acetonitril - HPLC čistoće J.T. Baker

metanol - HPLC čistoće J.T. Baker

tetrabutilamonijum acetat - Sigma

natrijumhidrogenfosfat, p.a. Merck

kalijumdihidrogenfosfat, p.a. Merck

2,2`-dinitro-5,5`-ditio benzoeva kiselina, Merck

acetiltioholin-jodid, Merck

etopropazin (10-[2-Dietilaminopropil]fenotiazin) hidrohlorid, Sigma

4.3. Analitički standardi

malation, malaokson, izo-malation, malation monokarboksilna kiselina, dimetoat,

diazinon - Dr. Ehrenstorfer, Augsburg, Nemačka, analitičke čistoće

dimetil fosfat (DMP), dimetil tiofosfat (DMTP), dimetil ditiofosfat (DMDTP), dietil

fosfat (DEP), dietil tiofosfat (DETP), dietil ditiofosfat (DEDTP) - standardni rastvor

1mg/ml u metanolu, Dr. Ehrenstorfer, Augsburg, Nemačka

atropin - Sigma

diazepam - Sigma

acetilholinesteraza humana - Sigma, enzimska aktivnost - 2624 UNITS/mg proteina


37

4.4. Određivanje koncentracije OFI u krvi i urinu

Validirana je originalna i osetljiva metoda za detekciju i kvantifikaciju organofosfornih pesticida

(dimetoat, diazinon, malation, malation monokarboksilna kiselina i malaokson) u biološkom

materijalu (serum i urin) 70.

4.4.1. Rastvori analitičkih standarda

Osnovni standardni rastvori su pripremani u koncentraciji od 1 mg/mL. Odmerene količine od

0,01 g (± 0,0001 g) svakog jedinjenja, rastvorene su u metanolu (dimetoat, diazinon, malation,

malaokson i izo-malation) u normalnim sudovima od 10 mL.

Od osnovnih rastvora napravljena je serija razblaženja za kalibracione krive. Za malation,

malation monokarboksilnu kiselinu i malaokson u opsegu od 0,05 – 5,00 mg/L, za dimetoat u

opsegu od 0,1 – 5,00 mg/L i diazinon u opsegu od 0,05 – 2,50 mg/L. Izo-malation je korišćen kao

interni standard (IS) i to u koncentraciji od 0,50 mg/L.

Svi standarni rastvori čuvani su na 4⁰ C.

Kalibracione krive opterećenih seruma i urina pravljene su u istim koncentracijama.

Prinosi ekstrakcija dobijeni su iz jednačina pravih recovery testa.


38

4.4.2. Ekstrakciona procedura

Za pripremu uzoraka (čvrsto tečna – ekstrakcija) korišćen je Oasis HLB Extraction Cartridge,

3cc/60 mg.

1. kondicioniranje kolone: 2 mL metanola i 2 mL demineralizovane vode;

2. nanošenje na kolonu: 1 mL uzorka (opterećenje pool seruma i urina sa odgovarajućim

standardom i internim standardom);

3. pranje kolone: 2 mL demineralizovane vode;

4. eluiranje uzorka: 1 mL metanola.

Eluent je filtriran kroz 0,33 μm membranski filter i prebačen u vialu za injektovanje.

4.4.3. Metoda UPLC-MS

Korišćen je Waters-Acquity UPLCSQ-Sistem sa softveskim programom MassLynx 4.1.

ACQUITY UPLC:

Kolona: ACQUITY UPLC ® HSST3 1,8 μm 2,1×100 mm; temperatura kolone 30⁰ C.

Mobilna faza: 5 mM amonijum formijat pH 3,0 (A) i metanol sa 0,1% HCOOH (B) u sledećem

gradijentu: 0–1 min.60% A : 40% B; 1–5,5 min. 40% A : 60% B; 5,5–8,5 min. 10 % A : 90% B;

8,5–9,0 min. 10% A : 90% B i 9–11 min 60% A : 40% B.

Protok mobilne faze bio je konstantan i iznosio je 0,3 mL/min. Zapremina injekcione petlje bila

je 5 μL. Temperatura autosemplera iznosila je 10⁰ C.

Uslovi masenog detektora Waters-SQD: maseni spektar sniman je u MS scan-u (full-scan) u

rasponu masa od 100–350 m/z; naponi na konusu (Cone Voltage) 25, 35, 40, 50 i 70 V i SIM-u

(m/z 230, 305, 315 i 331); napon na konusu 25 V; ukupno vreme bilo je 11 min.; vreme

skeniranja (Scan Time) 0,10 s; a jedinjenja su analizirana u pozitivnom

jonskom modu (ES+). Ostali parametri masenog detektora iznosili su: kapilara 4,30 kV;

ekstraktor 3 V; temperature izvora (Sourse Temperature) 150⁰ C; desolvataciona temperatura

(desolvation temperature) 350⁰ C; protok gasa azota: 1-desolvatacioni 400 L/h; 2-na konusu 50

L/h. Napon elektronskog multiplikatora iznosio je 670 V.


39

4.5. Određivanje koncentracije metabolita OFI u urinu

Primenjena je metoda tečne hromatografije za detekciju i kvantifikaciju šest dialkilfosfata (DAP)

u urinu 83.

4.5.1. Rastvori analitičkih standarda

Od osnovnog standardnog rastvora koncentracije 1 mg/mL, za svako analizirano jedinjenje,

DMP, DMTP, DMDTP, DEP, DETP i DEDTP pripremljen je radni rastvor u koncentraciji od

100 mg/L.

Od radnog standardnog rastvora napravljena je serija razblaženja za kalibracione krive. Za sva

analizirana jedinjenja u opsegu od 0,005 – 5,00 mg/L.

Svi rastvori su pravljeni sa mešavinom acetonitrila i vode u odnosu 50:50.

Svi standarni rastvori čuvani su na 4⁰ C.

Kalibracione krive opterećenih urina pravljene su u istim koncentracijama.


40

4.5.2. Ekstrakciona procedura

Analizirani uzorci urina su centrifugirani 10 minuta na 3500 obrt./min., a zatim je 1,5 ml

centrifugiranog urina prebačeno u vialu za injektovanjei i dodato 100 l 600 mM rastvora

tetrabutilamonijum acetata (TBA).

Ista količina TBA je dodata i u standardne rastvore pre injektovanja u aparat.

4.5.3. Metoda UPLC-MS

Koričćen je Waters-Acquity UPLCSQ-Sistem sa softveskim programom MassLynx 4.1.

ACQUITY UPLC:

Kolona: BEH C18 1,8 μm 2,1×100 mm; temperatura kolone 30⁰ C.

Mobilna faza: 1 mM TBA u vodi (A) i acetonitril, gde se količina acetonitrila menjala u u

sledećem linearnom gradijentu: 0 min. 5%; 3 min. 5%; 7 min. 30%; 11 min. 30% ; 12 min. 5% i

15 min. 5%.

Protok mobilne faze bio je konstantan i iznosio je 0,3 mL/min. Zapremina injekcione petlje bila

je 10 μL. Temperatura autosemplera je iznosila 10⁰ C.

Uslovi masenog detektora Waters-SQD: maseni spektar sniman je u MS scan-u (full-scan) u

rasponu masa od 30–200 m/z; naponi na konusu (Cone Voltage) 20, 30 V i SIM-u (m/z 125, 141,

153, 157, 169 i 185); napon na konusu 20 V; ukupno vreme bilo je 15 min.; vreme skeniranja

(Scan Time) 0,10 s; a jedinjenja su analizirana u negativnom

jonskom modu (ES-). Ostali parametri masenog detektora iznosili su: kapilara 3,0 kV; ekstraktor

3 V; temperature izvora (Sourse Temperature) 150⁰ C; desolvataciona temperatura (desolvation

temperature) 250⁰ C; protok gasa azota: 1-desolvatacioni 400 L/h; 2-na konusu 50 L/h. Napon

elektronskog multiplikatora iznosio je 670 V.

Prikupljeni uzorci krvi i urina pacijenata na Klinici za urgentnu i kliničku toksikologiju CKT

prema protokolu uzorkovanja, obrađeni su pomoću ove metodologije u Odeljenju za toksikološku

hemiju CKT, VMA.


41

4.6. Određivanje aktivnosti AChE i BuChE

4.6.1. Određivanje aktivnosti AChE

Priprema rastvora

Indikator za eritrocitnu holinesterazu (DTNB): 19,82 mg DTNB (2,2`-dinitro-5,5`-ditiobenzoeva

kiselina) rastvoreno u 10 mL fosfatnog pufera. U porcijama od 1 mL čuvano na 20⁰ C.

Supstrat za eritrocitnu holinesterazu (acetiltioholin-jodida): 100,6 mg acetiltioholina-rastvoreno

u 10 mL demineralizovane vode. U porcijama od 1 mL čuvano na 20⁰ C.

Fosfatni pufer: 1,42 Na2HPO4 g rastvoreno u 100 mL demineralizovane vode (komponenta 1);

1,36 g KH2PO4 rastvoreno u 100 mL demineralizovane vode (komponenta 2). Sa komponentom

2 podešen je pH komponente 1 na 7,4. Rastvor je stabilan na 4⁰ C ± 2⁰ C dve nedelje.

Etopropazin (6 mM): 20,94 mg etopropazina rastvoreno u 10 mL 12 mM HCl. U porcijama od

500 µL čuvano na -20⁰ C.

Radni uslovi na spektrofotometru GBC Cintra 10e : λ = 412 nm; brzina snimanja spektra: 60

nm/min; širina proreza: 1,5 nm; ukupno vreme snimanja: 180 s; uzorak se uzima preko protočne

kivete (dužina kivete 10 mm).


42

Metoda pripreme uzorka

Uzorak nekoagulisane krvi (antikoagulans K2EDTA) centrifugiran je 10 min. na 3000 obr./min.

Nakon centrifugiranja odbačen je gornji sloj (plazma). U epruvetu je sipan 1 mL hemolizata (6

mL destilovane vode i 10 μL eritrocita ispranih u fosfatnom puferu), 0,8 mL fosfatnog pufera, 0,1

mL indikatora, 10 µL etopropazina i na kraju 0,1 mL supstrata. Merenje aktivnosti eritrocitne

holinesteraze vršeno je na 412 nm.

Metoda za određivanje aktivnosti AChE validovana je u Odeljenju za toksikološku hemiju

VMA. Metoda je akreditovana pod brojem VDM 43.

Prikupljeni uzorci pacijenata na Klinici za urgentnu i kliničku toksikologiju CKT prema

protokolu uzorkovanja obrađeni su pomoću ove metodologije u Odeljenju za toksikološku

hemiju, CKT, VMA.

4.6.2. Određivanje aktivnosti BChE

Aktivnost BChE određivana je na integrisanom hemijskom sistemu sa gotovim reagens uloškom

za analizu. Metoda se bazira na hidrolizi butiriltioholina (BTC) kao supstrata i redukciji

dobijenog tioholina koji sa 2,6-dihlorofenol-indofenolom (DIP) kao indikatorom daje plavu boju.

Apsorpcija se vrši na 600 nm 109.

Opseg merenja od 0 do 14 U/mL (0-14000 U/L).

Referentne vrednosti: 7000-19000 U/L 110.

Prikupljeni uzorci pacijenata na Klinici za urgentnu i kliničku toksikologiju CKT prema

protokolu uzorkovanja obrađeni su na Institutu za biohemiju VMA.


43

4.7. Parametri acido-baznog i gasnog statusa

Merenje vrednosti pH, koncentracije HCO3-(st), kao i vrednosti ABE, pCO2, pO2, sO2 arterijske

krvi vršilo se standardnom procedurom na gasnom analizatoru.

Referentne vrednosti navedenih parametara date su u proizvođačkoj specifikaciji samog aparata.

pH: 7,35-7,55;

c HCO3-(st): 21,8 – 26,9 mmol/L

ABE : -2,7 do +2,5 mmol/L;

pCO2: 35-45 mmHg;

pO2: 83-108 mmHg;

sO2: 95-99%.

4.8. In vitro eksperiment

Praćena je toksikokinetika malationa, dimetoata i diazinona u hidrogenkarbonatnom puferu pri

različitim pH vrednostima u rasponu od pH =7,35 do pH =7,55.

Za svako jedinjenje određena je stabilnost u koncentraciji od 5,0 mg/L (n=3).

Rastvori analitičkih standarda

Osnovni standardni rastvori su pripremani u koncentraciji od 1 mg/mL. Odmerene količine od

0,01 g (± 0,0001 g) svakog jedinjenja, rastvorene su u metanolu (dimetoat, diazinon i malation) u

normalnim sudovima od 10 mL.


44

Od osnovnih rastvora napravljeni su radni rastvori u koncentraciji od 5,0 mg/L za svako

jedinjenje. Razblaženja su rađena u hidrogenkarbonatnom puferu sa različitim pH vrednostima

(7,35; 7,45 i 7,55). Sva razblaženja su pravljena neposredno pre početka eksperimenta.

Rastvori hidrogenkarbonatnog pufera

Rastvori hidrogenkarbonatnih pufera pH 7,35; pH 7,45 i pH 7,55 dobijeni su podešavanjem pH

vrednosti gotovog infuzionog rastvora natrijum hidrogenkarbonata u koncentraciji od 500

mmol/L (42 g/L) pravljenog u Institutu za farmaciju VMA.

Pocedura rada

Rastvori dimetoata, diazinona i malationa koncentracije 5,0 mg/L postavljeni su u vodeno

kupatilo na 37⁰ C, a zatim je u određenim vremenskim intervalima određivana njihova

koncentracija. Merenja su vršena na svakih 6 sati u vremenskom periodu od 48 sati.

Koncentracije ovih jedinjenja određivane su UPLC/MS metodom.

4.9. Vrsta studije i način obrade podataka

Tip studije po kome je sprovedeno istraživanje je randomizovana, dvostruko slepa, prospektivna

monocentrična klinička studija.

Preliminarna statistička obrada dobijenih rezultata u analitičkim metodama za određivanje

koncentracije OFI, određivanje metabolita OFI, određivanje aktivnosti AChE i u in vitro

eksperimentu (srednja vrednost, standardna devijacija i koeficijent varijacije) izvedena je

korišćenjem računarskog programa Microsoft Exel 2003.

Generalno, rezultati su prikazani parametrima deskriptivne statistike (srednja vrednost,

standardna devijacija, medijana, minimalna i maksimalna vrednost). Zbog odstupanja podataka

od normalne raspodele (proveravano primenom Kolmogorov-Smirnov testa), za procenu

značajnosti razlika korišćen je Kruskal-Wallis test odnosno Mann-Whitney test (parna

poređenja). Regresiona analiza i poređenje regresionih prava korišćene su za procenu pojedinih

bioloških efekata ispitivanih insekticida. Za navedene analize upotrebljen je komercijalni

statistički softver SPSS v. 18.


45

5. REZULTATI

Radi bolje preglednosti rezultati su podeljeni na sledeće celine:

1. Uticaj pH na brzinu degradacije isptivanih OFI;

2. Koncentracije OFI i njihovih metabolita u krvi i urinu kontrolne i test gupe bolesnika;

3. Aktivnost holinesteraza kod obe grupe bolesnika;

4. Količine primenjenih antidota kod ispitivanih bolesnika;

5. Laboratorijski i klinički parametri kod obe grupe bolesnika.

5.1. Uticaj pH na degradaciju ispitivanih OFJ

Da bi se bolje objasnila ispitivanja in vivo, kod akutno otrovanih bolesnika, prvo su izvršena

isptivanja njihove razgradnje in vitro u uslovima različitih pH vrednosti.

Uticaj hidrogenkarbonatnog pufera, na razgradnju malationa in vitro prikazan je u Tabeli 3.

Tabela 3. Uticaj pH na degradaciju malationa

vreme 6h 12h 18h 24h 30h 36h 42h 48h

pH Procenat degradacije (%)

pH 7,35 15,6 26,3 35 48,4 65,2 61,5 65,7 68

pH 7,45 17,8 29,4 39 53,2 61 68,6 72 74,2

pH 7,55 19,4 32,5 43,8 59 66,4 72 77,3 81


46

Razgradnja malationa zavisi od pH vrednosti hidrogenkarbonatnog pufera. Pri pH 7,35 u toku 48

sati dolazi do potpune razgradnje 68% supstance. Sa povećanjem pH vrednosti na 7,45 i 7,55

procenat razgradnje raste na 74,2% odnosno 81% (Tabela 3). Poređenje stepena razgradnje

malationa u funkciji vremena preko njihovih degradacionih pravih (urađena je analiza varijansi

za dva stepena slobode; F=3,855), pokazuje da je razgradnja malationa pri pH 7,55 vrednosti

hidrogenkarbonatnog pufera statistički značajno veća od razgradnje pri pH 7,35 (p=0,05).

Degradacione prave prikazane su na Grafikonu 1.

Grafikon 1. Degradacione prave malationa na pH 7,35 i 7,55

Razgradnja dimetoata pri različitim pH vrednostima hidrogenkarbonatnog pufera prikazana je u

Tabeli 4.

Tabela 4. Uticaj pH na degradaciju dimetoata

vreme 6h 12h 18h 24h 30h 36h 42h 48h


pH 7,35 40,2 61,3 72,5 76,7 78,5 81 81,6 81,2

pH 7,45 45 68,5 80 85,2 87,2 90 90,6 91,2

pH 7,55 50 75,2 87,5 93,6 96,8 98,4 99 99,8


47

U odnosu na malation dimetoat je manje stabilan u rastvoru. Pri pH 7,35 nakon 48h razgradi se

81,2% supstance. Promena pH na 7,45 dovodi do degradacije 91,2% supstance u istom

vremenskom periodu, dok je pri pH 7,55 skoro sva količina supstance razgrađena (99,8%)

(Tabela 4). Stepeni razgradnje pri pH vrednostima 7,35 i 7,55 prikazani si i grafički kao

degradacione prave (Garfikon 2).

Grafikon 2. Degradacione prave dimetoata na pH 7,35 i 7,55

Analizom varijansi za dva stepena slobode (F=6,261) i statistički je potvrđeno da je procenat

degradacije dimetoata žnačajno veći pri pH 7,55 u odnosu na pH 7,35 (p=0,014).

Razgradnja diazinona pri različitim pH vrednostima hidrogenkarbonatnog pufera prikazana je u

Tabeli 5.

Tabela 5. Uticaj pH na degradaciju diazinona

vreme 6h 12h 18h 24h 30h 36h 42h 48h


pH 7,35 0,6 1,4 4 5,2 7,3 9,1 11,8 13,5

pH 7,45 0,2 0,6 1,7 2,5 3,8 4,2 5 6,4

pH 7,55 0 0,1 0,3 0,3 0,7 1 1,2 2


48

Rastvor diazinona relativno je stabilan u toku 48h. Povećanje pH vrednosti ne utiče na pojačanu

degradaciju diazinona, odnosno pri najnižoj praćenoj pH vrednosti procenat degradacije je

najveći i iznosi 13,5% (Tabela 5).

5.2. Koncentracije OFI i njihovih metabolita u krvi i urinu kontrolne i test gupe

bolesnika

5.2.1 Koncentracije malationa, malaoksona i malation monokarboksilne kiseline u krvi

bolesnika bez i nakon primene natrijum hidrogenkarbonata

Koncentracije malationa, malaoksona i malation monokarboksilne kiseline (MCA) u krvi

bolesnika bez i nakon primene infuzije natrijum hidrogenkarbonata (NaHCO3) prikazane su u

Tabeli 6 i na Grafikonu 3.


49

Tabela 6. Koncentracije malationa, malaoksona i MCA u krvi bolesnika sa i bez NaHCO3

Vreme (sati) Grupa N X SD

0

Malation Kontrola 9 3,5796 6,1976

NaHCO3 10 2,5610 5,8871

MCA Kontrola 9 2,2863 2,9045

NaHCO3 10 2,3404 4,8952

Malaokson Kontrola 9 0,0688 0,1762

NaHCO3 10 0,0366 0,0874

6


NaHCO3 10 1,7498 3,6451

MCA Kontrola 9 2,5399 5,2748

NaHCO3 10 1,4197 2,7431


NaHCO3 10 0,0302 0,0569

12


NaHCO3 10 1,2146 2,4281

MCA Kontrola 9 1,1347 1,5864

NaHCO3 10 0,9594 1,6707


NaHCO3 10 0,0059 0,0119

18


NaHCO3 10 0,5023 0,5535

MCA Kontrola 9 0,9033 1,1248

NaHCO3 10 0,4376 0,4686


NaHCO3 10 0,0000 -

24


NaHCO3 10 0,2822 0,3243

MCA Kontrola 9 0,6776 0,5669

NaHCO3 10 0,2060* 0,2046


NaHCO3 10 0,0000* -

* p < 0,05 vs Kontrola

nastavak Tabele 6. na sledećoj strani.


50

nastavak Tabele 6 sa prethodne strane.


30


NaHCO3 10 0,2253 0,2946

MCA Kontrola 9 0,5398 0,5471

NaHCO3 10 0,1480 0,1747


NaHCO3 10 0,0024* 0,0073

36


NaHCO3 10 0,1376 0,2256

MCA Kontrola 9 0,4577 0,6824

NaHCO3 10 0,1041 0,1491


NaHCO3 10 0,0000 -

42


NaHCO3 10 0,0783 0,1437

MCA Kontrola 9 0,4176 0,7868

NaHCO3 10 0,0803 0,1405


NaHCO3 10 0,0000 -

48


NaHCO3 10 0,1895 0,3117

MCA Kontrola 9 0,2117 0,3938

NaHCO3 10 0,1570 0,1826


NaHCO3 10 0,0000 -



51

Rezultati su grafički prikazani na Grafikonu 3.

Grafikon 3. Koncentracije malationa, malaoksona i MCA u krvi bolesnika sa i bez NaHCO3

Tabela 6 pokazuje da su koncentracije malationa i MCA kod kontrolne grupe bolesnika u nultom

vremenu iznosile 3,57 mg/L i 2,29 mg/L, dok je koncentracija malaoksona iznosila 0,069 mg/L.

Koncentracije ispitivanih jedinjenja nakon 96h od prijema (Grafikon 3) bile su ispod limita

kvantifikacije primenjene analitičke metode. Početne koncentracije malationa i malaoksona kod

bolesnika koji su primali natrijum hidrogenkarbonat bile su nešto niže u odnosu na kontrolnu

grupu (2,56 mg/L; 0,036 mg/L), a koncentracija MCA slična kao kod kontrolne grupe pacijenata

(2,34 mg/L). Statistički značajne razlike u koncentraciji metabolita malationa (MCA i

malaoksona) u odnosu na kontrolnu grupu zabeležene su u 24. i 30. satu (p<0,005).


52

Na Grafikonima 4 i 5 prikazane su krive eliminacije malationa i njegovog metabolita MCA iz

krvi. Brzine eliminacije ovih jedinjenja predstavljene su u koordinatnom sistemu kao prirodni

logaritmi koncentracije (ln c) u funkciji merenog vremena (t = sati).

Grafikon 4. Krive eliminacije malationa Grafikon 5. Krive eliminacije MCA

u krvi bolesnika sa i bez NaHCO3 u krvi bolesnika sa i bez NaHCO3

Za poređenje razlika između dve regresione krive eliminacije, urađena je analiza varijansi za dva

stepena slobode (malation F=19,767; MCA F=13,846). Statistička analiza pokazuje da kod

eliminacije malationa postoji statistički značajna razlika između nagiba regresionih krivih

kontrolne i test grupe (t=3,112; p=0,008), dok su za MCA razlike na granici značajnosti

(t=1,990; p=0,066).

Iz krive eliminacije izračunata su i poluvremena eliminacije malationa i MCA iz krvi kod obe

grupe bolesnika.

U Tabeli 7 prikazane su vrednosti poluvremena eliminacije za malation i MCA.

Tabela 7. Vrednosti poluvremena eliminacije malationa i MCA bez i nakon primene NaHCO3

Grupa t½ malationa (h) t½ MCA (h)

Kontrola 6,8 9,6

NaHCO3 4,4 2,2

Ln

ko

nc

en

tra

cij

e M

CA

u k

rvi

(mg

/L)

Ln

ko

nc

en

tra

cij

e M

CA

u k

rvi

(mg

/L)


53

Poluvremena eliminacije oba jedinjenja su statististički značajno kraća kod pacijenata lečenih

natrijum hidrogenkarbonatom u odnosu na kontrolnu grupu pacijenata.

5.2.2. Koncentracije malationa, malaoksona, MCA i alkil fosfata u urinu bolesnika sa i bez

natrijum hidrogenkarbonata

Koncentracije malationa, malaoksona, malation monokarboksilne kiseline (MCA) i alkil fosfata

(dimetil fosfata-DMP, dimetil tiofosfata-DMTP i dimetil ditiofosfata-DMDTP) u urinu bolesnika

sa i bez natrijum hidrogenkarbonata prikazane su u Tabeli 8 i na Grafikonu 6.

(Tabela 8. tendenciozno na sledećoj strani)


54

Tabela 8. Koncentracije malationa, malaoksona, MCA i alkil fosfata u urinu bolesnika sa i bez

NaHCO3


0


NaHCO3 10 0,6551 1,1808

MCA Kontrola 9 4,4914 3,1903

NaHCO3 10 3,4074 3,0612


NaHCO3 10 0,0157 0,0382

DMP Kontrola 9 0,0510 0,13050

NaHCO3 10 0,0098 0,0274

DMTP Kontrola 9 0,1088 0,2832

NaHCO3 10 0,1218 0,2836

DMDTP Kontrola 9 0,1082 0,2988

NaHCO3 10 0,1010 0,2715

6


NaHCO3 10 0,4837 0,7585

MCA Kontrola 9 5,7289 7,3713

NaHCO3 10 5,1880 6,8316


NaHCO3 10 0,0146 0,0288

DMP Kontrola 9 0,0520 0,0758

NaHCO3 10 0,3433 0,4640


NaHCO3 10 0,2835 0,4388


NaHCO3 10 0,2082 0,4262

12


NaHCO3 10 0,3343 0,4203

MCA Kontrola 9 3,8966 3,3979

NaHCO3 10 3,4666 3,7350


NaHCO3 10 0,0046 0,0140

DMP Kontrola 9 0,1261 0,1328

NaHCO3 10 0,1411 0,1768


NaHCO3 10 0,2064 0,3500


NaHCO3 10 0,2102 0,3806



55

nastavak Tabele 8. sa prethodne strane.


18


NaHCO3 10 0,2548 0,3288

MCA Kontrola 9 3,7445 3,9312

NaHCO3 10 3,8388 4,3842


NaHCO3 10 0,0000 -

DMP Kontrola 9 0,0646 0,0465

NaHCO3 10 0,0925 0,0819


NaHCO3 10 0,3110 0,5524


NaHCO3 10 0,2736 0,5285

24


NaHCO3 10 0,1634 0,1845

MCA Kontrola 9 3,9023 3,6750

NaHCO3 10 2,8898 3,6204


NaHCO3 10 0,0000 -

DMP Kontrola 9 0,0337 0,0487

NaHCO3 10 0,0977* 0,0723


NaHCO3 10 0,2903* 0,5824


NaHCO3 10 0,3010 0,5831

30


NaHCO3 10 0,1030 0,1036

MCA Kontrola 9 4,1321 4,3060

NaHCO3 10 4,0957 5,4550


NaHCO3 10 0,0037 0,0113

DMP Kontrola 9 0,0460 0,0483

NaHCO3 10 0,0541 0,0431


NaHCO3 10 0,2782 0,6043


NaHCO3 10 0,2652 0,5709




56



36


NaHCO3 10 0,0645 0,1044

MCA Kontrola 9 3,0221 3,0094

NaHCO3 10 1,9472 2,5449

Malaokson Kontrola 9 0,0000 -

NaHCO3 10 0,0000 -

DMP Kontrola 9 0,1999 0,3720

NaHCO3 10 0,1792 0,3619


NaHCO3 10 0,4226 0,8352


NaHCO3 10 0,4367 0,8619

42


NaHCO3 10 0,0264 0,0489

MCA Kontrola 9 3,1481 3,3275

NaHCO3 10 2,2073 3,5629


NaHCO3 10 0,0000 -

DMP Kontrola 9 0,1205 0,1508

NaHCO3 10 0,0972 0,1769


NaHCO3 10 0,3146 0,7236


NaHCO3 10 0,3785 0,7801

48


NaHCO3 10 0,0135 0,0270

MCA Kontrola 9 3,3485 4,1163

NaHCO3 10 5,0377 5,1643


NaHCO3 10 0,0000 -

DMP Kontrola 9 0,0816 0,1644

NaHCO3 10 0,0855 0,1598


NaHCO3 10 0,3235 0,6193


NaHCO3 10 0,3090 0,5421


57


Grafikon 6. Koncentracije malationa, malaoksona, MCA i alkil fosfata u urinu bolesnika sa i bez

NaHCO3

Tabela 8 i Grafikon 6 pokazuju da su koncentracije malationa u urinu u nultom vremenu kod obe

grupe bolesnika bile relativno niske (1,93 mg/L: 0,65 mg/L). Koncentracije MCA u obe grupe su

bile značajno više ne samo u odnosu na matično jedinjenje, već i u odnosu na druge metabolite

(malaokson i alkil fosfate). Kod obe grupe bolesnika, posle nultog vremenena koncentracije

MCA u urinu su bile bifaznog karaktera (koncentracija je opadala do 36.h uz povremene

skokove). Te koncentracije su dostigle maksimum između 48. i 60.h, kod grupe pacijenata

lečenih natrijum hidrogenkarbonatom, posle čega su naglo opadale, dostižući najniži nivo (1,25

mg/L) posle 78h sa ponovnim blažim porastom koncentracije koji nije bio statistički značajan,

dok su kod kontrolne grupe pacijenata kontinuirano padale do kraja posmatranog perioda. Što se

tiče alkil fosfata (DMP, DMTP i DMDTP) tabela pokazuje da je opadanje njihove koncentracije

u toku vremena bilo ravnomerno u obe grupe bolesnika, s tim što su kod gupe bolesnika lečenih

natrijum hidrogenkarbonatom bile na neznatno višem nivou. Statistička značajnost za DMTP i

DMDTP je zabeležena u 24.h (1:3; 1:1,5; p<0,05).


58

5.2.3. Koncentracije dimetoata u krvi i koncentracije dimetoata i alkil fosfata u urinu za

obe grupe bolesnika

Koncentracije dimetoata u krvi i koncentracije dimetoata i alkil fosfata (dimetil fosfata-DMP,

dimetil tiofosfata-DMTP i dimetil ditiofosfata-DMDTP) u urinu za obe grupe bolesnika

prikazani su u Tabeli 9 i na Grafikonu 7.

Tabela 9. Koncentracije dimetoata u krvi (K) i dimetoata i alkil fosfata u urinu (U) bolesnika sa i

bez NaHCO3


0

Dimetoat K Kontrola 7 11,8633 12,5652

NaHCO3 8 13,2714 9,2036

Dimetoat U Kontrola 7 12,0315 19,7046

NaHCO3 8 8,5617 11,5320

DMP U Kontrola 7 0,1786 0,2098

NaHCO3 8 0,1110 0,2322

DMTP U Kontrola 7 0,0938 0,1449

NaHCO3 8 0,1370 0,2275

DMDTP U Kontrola 7 0,0132 0,0249

NaHCO3 8 0,3017 0,4530

6


NaHCO3 8 8,3322 4,9128


NaHCO3 8 3,9434 5,6334


NaHCO3 8 0,3841 0,9722


NaHCO3 8 0,2745 0,4987


NaHCO3 8 0,0302 0,0801

12


NaHCO3 8 7,4125 4,3823


NaHCO3 8 4,2776 4,8079


NaHCO3 8 0,6145* 1,6105


NaHCO3 8 0,3420* 0,8873


NaHCO3 8 0,0208** 0,0551

* p < 0,05 vs Kontrola; ** p < 0,01 vs Kontrola



59



18


NaHCO3 8 5,4941 3,5884


NaHCO3 8 2,8478 3,9848


NaHCO3 8 0,7654* 1,9603


NaHCO3 8 0,5347 0,8265


NaHCO3 8 0,3762 0,3071

24


NaHCO3 8 4,6838 3,2805


NaHCO3 8 0,7914* 2,0632


NaHCO3 8 0,4858 1,2178


NaHCO3 8 0,3441 0,6178


NaHCO3 8 0,4655 0,6763

30


NaHCO3 8 2,3154 1,7775


NaHCO3 8 0,3658* 0,9233


NaHCO3 8 0,4120 1,0667


NaHCO3 8 0,3551 0,5883


NaHCO3 8 0,2488 0,4415


nastavak Tabele9. na sledećoj strani.


60



36


NaHCO3 8 0,6962 0,5339


NaHCO3 8 0,2731 0,6245


NaHCO3 8 0,3804 0,9999


NaHCO3 8 0,2260 0,4926


NaHCO3 8 0,0678 0,1717

42


NaHCO3 8 0,2555 0,2109


NaHCO3 8 0,2170 0,4167


NaHCO3 8 0,2111 0,5489


NaHCO3 8 0,1675 0,2977


NaHCO3 8 0,1387 0,2572

48


NaHCO3 8 0,1064 0,1262


NaHCO3 8 0,0100* 0,0223


NaHCO3 8 0,2766 0,6157


NaHCO3 8 0,1462 0,2858


NaHCO3 8 0,0256 0,0572



61


Grafikon 7. Koncentracije dimetoata u krvi (K) i dimetoata i alkil fosfata u urinu (U) bolesnika sa i

bez NaHCO3

Tabela 9 i Grafikon 7 pokazuju da su koncentracije dimetoata u krvi kod obe ispitivane grupe bile

slične (11,86 mg/L u kontrolnoj i 13,27 mg/L u test grupi). Koncentracija dimetoata u kontrolnoj

grupi se smanjila na pola nakon 24h, a u grupi koja je primala natrijum hidrogenkarbonat nakon

18h. Tabela pokazuje i da je dimetoat bio detektabilan do 60.h u kontrolnoj, odnosno do 36.h u

grupi koja je primala natrijum hidrogenkarbonat.


62

Na Grafikonu 8 prikazane su krive eliminacije dimetoata iz krvi kod obe grupe bolesnika, kao

logaritam vrednosti koncentracije dimetoata (ln cdimetoat) u funkciji vremena.

Grafikon 8. Krive eliminacije dimetoata u krvi bolesnika bez i nakon primene NaHCO3

Iz krivih eliminacije (Grafikon 8) izračunata su i poluvremena eliminacije dimetoata iz krvi kod

obe grupe bolesnika (kontrolna grupa t½ = 25,3h; test grupa t½ = 18,4h).

Analizom varijansi za dva stepena slobode (F=7,883) pokazano je da postoji statistički značajna

razlika između dve regresione krive, pri čemu je takođe nađena statistički značajna razlika nagiba

krivih (t=2,909; p=0,011).

Rezultati pokazuju da se koncentracija dimetoata u urinu u obe grupe kontinuirano smanjivala do

nivoa detektabilnosti metode. Statistička značajnost u koncentraciji dimetoata u praćenim

grupama zabeležena je u 24., 30. i 48.h od prijema (Tabela 9).

Koncentracije alkilfosfata u urinu obe grupe bolesnika su bile veoma niske i mogle su se

detektovati do 72h. Statistčki značajne razlike u koncentraciji zabeležene su u 12. satu za sva tri

metabolita (DMTP i DMDTP veći u kontrolnoj grupi; p<0,05, a DMP veći u test grupi; p<0,01) i

18. satu sa većom koncentracijom DMP-a u test grupi (p<0,05), kada je i postignuta najveća

zabeležene koncentracija ovog metabolita (0,765 mg/L).

Ln

ko

nce

ntr

acij

e d

imeto

ata

u k

rvi

(mg

/L)

Ln

ko

nce

ntr

acij

e d

imeto

ata

u k

rvi

(mg

/L)


63

5.2.4. Koncentracije diazinona u krvi i koncentracije diazinona i alkil fosfata u urinu za obe

grupe bolesnika

Koncentracije diazinona u krvi i koncentracije diazinona i alkil fosfata (DEP i DETP) u urinu za

obe grupe bolesnika prikazani su u Tabeli 10 i na Grafikonu 9.

Tabela 10. Koncentracije diazinona u krvi (K) i diazinona i alkil fosfata u urinu (U) bolesnika sa i

bez NaHCO3


0

Diazinon K Kontrola 4 0,5460 0,8936

NaHCO3 4 4,5706 5,6294

Diazinon U Kontrola 4 0,1245 0,1878

NaHCO3 4 2,5503 1,9147

DEP U Kontrola 4 0,0310 0,0576

NaHCO3 4 0,1390 0,2529

DETP U Kontrola 4 0,4280 0,6734

NaHCO3 4 0,9391 1,5572

6


NaHCO3 4 2,6798 3,0264


NaHCO3 4 4,0706 2,4137


NaHCO3 4 0,4653 0,4922


NaHCO3 4 1,5336 1,2739

12


NaHCO3 4 1,3508 1,4844


NaHCO3 4 3,1946 3,1444


NaHCO3 4 0,4088 0,3083


NaHCO3 4 1,6768 0,7967

Rezultati su prikazani i grafički na Grafikonu 9.


64

Grafikon 9. Koncentracije diazinona u krvi (K) i diazinona i alkil fosfata u urinu (U) bolesnika sa i

bez NaHCO3

Početna koncentracija diazinona u krvi kod bolesnika u kontrolnoj grupi je iznosila 0,55 mg/L, i

postepeno je opadala, sve do 48. sata, kada diazinon nije više bio detektabilan.

Kod bolesnika lečenih natrijum hidrogenkarbonatom, koncentracija diazinona u krvi na prijemu

iznosila je 4,57 mg/L i kao u i kontrolnoj grupi postepeno opadala do 66. sata, nakon čega više

nije bila detektabilna.

Koncentracija diazinona u urinu kontrolne grupe u nultom vremenu bila je jako niska (0,12 mg/L)

i kontinuirano se smanjivala do 36. sata. Za razliku od toga, kod grupe bolesnika lečenih natrijum

hidrogenkarbonatom, koncentracija diazinona je značajno veća (2,55 mg/L). U 6. satu je

zabeležen njen porast (4,07 mg/L), da bi sa vremenom koncentracija opadala do 42. sata. Iz

grafikona se vidi da je registrovan porast koncentracije diazinona u urinu u 48. satu. Opadanje

koncentracije je registrovano do 96 sata, kada diazinon više nije detektovan u urinu.

Koncentracije metabolita DEP i DETP u odnosu na diazinon bile su niske kod obe grupe

pacijenata, s tim što su koncentracije DETP bile veće u odnosu na DEP. Metaboliti su u test grupi

bili detektabilni i posle 102 sata.


65

5.3. Aktivnost holinesteraze kod obe grupe bolesnika

5.3.1. Aktivnost AChE u krvi obe gupe bolesnika sa trovanjem malationom

Aktivnost AChE u krvi obe gupe bolesnika sa trovanjem malationom prikazane su u Tabeli 11 i

na Grafikonu 10.

Tabela 11. Aktivnost AChE u krvi bolesnika sa i bez NaHCO3

Vreme (sati) Grupe N AChE IU/L Poređenje (p)

0 Kontrola 9 1973 z = 0,26

p = 0,82 NaHCO3 10 1624

6 Kontrola 9 2485 z = 0,11

p = 0,94 NaHCO3 10 3102

12 Kontrola 9 2550 z = 0,19

p = 0,88 NaHCO3 10 2917

18 Kontrola 9 2482 z = 0,64

p = 0,55 NaHCO3 10 2713

24 Kontrola 9 2273 z = 0,038

p = 1,00 NaHCO3 10 2660

30 Kontrola 9 2256 z = 1,17

p = 0,26 NaHCO3 10 3227

36 Kontrola 9 2656 z = 0,34

p = 0,76 NaHCO3 10 3152

42 Kontrola 9 2194 z = 1,78

p = 0,08 NaHCO3 10 3394

48 Kontrola 9 2146 z = 0,99

p = 0,35 NaHCO3 10 3082


66

Rezultati su radi lakšeg sagledavanja prikazani i grafički na Grafikonu 10.

Grafikon 10. Aktivnost AChE u krvi bolesnika sa i bez NaHCO3

Aktivnost AChE kod kontrolne grupe bolesnika je bila veoma niska (1973 IU/L na prijemu).

Najveći porast aktivnosti ovog enzima zabeležen je u 192. satu od trenutka prijema (3982 IU/L).

Aktivnost AChE kod bolesnika lečenih natrijum hidrogenkarbonatom pre početka terapije

iznosila je 1624 IU/L, uz neznatni porast sve do 120 sati, kada je je došlo do porasta njegove

aktivnosti na 4280 IU/L (Tabela 11 i Grafikon 10) .

Radi bolje preglednosti razlika u aktivnosti enzima između grupa, rezultati su predstavljeni i kao

procenti preostale aktivnosti enzima. Na Grafikonu 11 prikazane su aktivnosti AChE u

procentima pri prijemu, posle 24h, 48h i na kraju lečenja kod obe gupe bolesnika (za 100 %

aktivnosti enzima računata je donja granica referntnih vrednosti).


67

Grafikon 11. Procenat očuvane aktivnosti AChE u krvi obe grupe bolesnika sa trovanjem

malationom

Iako je procenat očuvane aktivnosti AChE kod bolesnika lečenih natrijum hidrogenkarbonatom u

toku tarapije (24h i 48h) i na kraju lečenja, bio veći od kontrolne grupe, ta razlika nije bila

statistički značajna.

5.3.2. Aktivnost AChE kod obe grupe bolesnika sa trovanjem dimetoatom

U Tabeli 12 i na Grafikonu 12 prikazane su aktivnosti AChE kod bolesnika obe grupe sa

trovanjem dimetoatom.


68


Vreme (sati) Grupe N AChE (IU/L) Poređenje (p)

0 Kontrola 7 2318 z = 0,34

p = 0,77 NaHCO3 8 2169

6 Kontrola 7 1917 z = 0,23

p = 0,86 NaHCO3 8 1663

12 Kontrola 7 2692 z = 1,85

p = 0,072 NaHCO3 8 1363

18 Kontrola 7 2481 z = 2,08

p = 0,04 NaHCO3 8 1360

24 Kontrola 7 2605 z = 1,42

p = 0,18 NaHCO3 8 1574

30 Kontrola 7 2190 z = 0,48

p = 0,69 NaHCO3 8 2190

36 Kontrola 7 2191 z = 0,48

p = 0,69 NaHCO3 8 2019

42 Kontrola 7 1873 z = 0,36

p = 0,79 NaHCO3 8 1801

48 Kontrola 7 2191 z = 0,54

p = 0,66 NaHCO3 8 1817




69

Tabela 12 i Grafikon 12 pokazuju da je početna (nulta aktivnost) AChE pri prijemu (pre početka

terapije) kod kontrolne grupe bolesnika iznosila 2318 IU/L. Aktivnost enzima, uz manje padove i

poraste, je ostala na približno istoj vrednosti i nakon 120h.

Kod bolesnika lečenih natrijum hidrogenkarbonatim početna aktivnost enzima AChE iznosila je

2169 IU/L. Smanjenje aktivnosti enzima zabeleženo je do 18h, kada počinje da se beleži porast

ove vrednosti. Maksimalna vrednost iznosila je 3119 IU/L i postignuta je posle 114 sati. U daljem

toku lečenja zabeležene su oscilacije u aktivnosti enzima, a u 168.h je vrednost bila približna

maksimalno izmerenoj u ovoj grupi.

Radi bolje preglednosti razlika u aktivnosti enzima između grupa, rezultati su predstavljeni kao

procenti preostale aktivnosti enzima.

Na Grafikonu 13 prikazane su aktivnosti AChE (% aktivnosti) pri prijemu, posle 24h, 48h i na

kraju lečenja kod obe gupe bolesnika (za 100 % aktivnosti enzima računata je donja granica

referntnih vrednosti).


dimetoatom

Procenat očuvane aktivnosti AChE u prvih 24 sata je u kontrolnoj grupi bila veća a u 48.h i na

kraju lečenja manja u odnosu na test grupu, ali te razlike nisu bile statistički značajne.


70

5.3.3. Aktivnost AChE u krvi obe gupe bolesnika sa trovanjem diazinonom

Aktivnost AChE u krvi obe grupe bolesnika sa trovanjem diazinonom prikazane su u Tabeli 13 i

na Grafikonu 14.


Vreme (sati) Grupe N AChE (IU/L) Poređenje (p)

0 Kontrola 4 869 z = 1,50

p = 0,28 NaHCO3 4 2345

6 Kontrola 4 6449 z = 0,00

p = 1,00 NaHCO3 4 9038

12 Kontrola 4 6360 z = 0,00

p = 1,00 NaHCO3 4 7839

18 Kontrola 4 4125 z = 1,00

p = 0,57 NaHCO3 4 7615

24 Kontrola 4 9146 z = 0,50

p = 0,85 NaHCO3 4 7454

30 Kontrola 4 9700 z = 0,87

p = 0,66 NaHCO3 4 7285

36 Kontrola 4 6496 z = 0,87

p = 0,66 NaHCO3 4 8424

42 Kontrola 4 7616 z = 0,29

p = 1,00 NaHCO3 4 7268

48 Kontrola 4 9970 z = 0,87

p = 0,66 NaHCO3 4 7735



71


Početna (nulta aktivnost) AChE u kontrolnoj gupi pacijenata otrovanih diazinonom iznosila je

869 IU/L da bi u narednih 48 sati dostigla svoj maksimum od 9970 IU/L. Vrednosti za aktivnost

AChE su varirale, da bi na kraju posmatranog perioda od 198 sata aktivnost enzima bila 2,5 puta

veća od početnog nivoa.

Kod gupe bolesnika lečenih natrijum hidrogenkarbonatom početna (nulta aktivnost) AChE

iznosila je 2345 IU/L da bi 6 sati kasnije dostigla najviši nivo aktivnosti (9038 IU/L). I u ovoj

grupi bolesnika, vrednosti za aktivnost AChE su varirale, da bi u poslednjem merenju aktivnost

bila približno jednako početnoj.

Procenat preostale aktivnosti enzima (za 100 % aktivnosti enzima računata je donja granica

referntnih vrednosti) prikazan je na Grafikonu 15 i to po prijemu, posle 24h, 48h i na kraju

lečenja kod obe gupe bolesnika.


72


diazinonom

Očuvana aktivnost enzima bila je u toku primene terapije (24h i 48h) veća u kontrolnoj grupi ali

ona nije bila statistički značajna u odnosu na test grupu. Na kraju lečenja aktivnost enzima bila

je skoro isto očuvana.


73

5.3.4. Aktivnost BuChE u krvi obe grupe bolesnika sa trovanjem malationom

Aktivnost BuChE u krvi obe grupe bolesnika sa trovanjem malationom prikazani su u Tabeli 14 i

na Grafikonu 16.

Tabela 14. Aktivnost BuChE u krvi pacijenata sa i bez NaHCO3

Vreme (sati) Grupe N BuChE (U/L) Poređenje (p)

0 Kontrola 9 1485 z = 0,36

p = 0,72 NaHCO3 10 1748

6 Kontrola 9 1885 z = 1,14

p = 0,27 NaHCO3 10 2990

12 Kontrola 9 1717 z = 1,38

p = 0,18 NaHCO3 10 3064

18 Kontrola 9 2203 z = 0,98

p = 0,35 NaHCO3 10 3066

24 Kontrola 9 1981 z = 1,30

p = 0,21 NaHCO3 10 3099

30 Kontrola 9 1639 z = 2,25

p = 0,024 NaHCO3 10 3497

36 Kontrola 9 1742 z = 2,42

p = 0,014 NaHCO3 10 3804

42 Kontrola 9 1955 z = 2,51

p = 0,011 NaHCO3 10 4220

48 Kontrola 9 2076 z = 2,40

p = 0,015 NaHCO3 10 4331



74

Grafikon 16. Aktivnost BuChE u krvi bolesnika sa i bez NaHCO3

Aktivnost BuChE po prijemu kod kontrolne grupe pacijenata bila veoma niska (1485 U/L). U

toku čitavog vremenskog perioda posmatranja, aktivnost enzima je kontinuirano rasla, i na kraju

posmatranja, u 204. satu je iznosila 5538 U/L.

Kod grupe bolesnika lečenih natrijum hidrogenkarbonatom početna aktivnost BuChE iznosila je

1748 U/L. U kasnijem toku došlo je do postepenog obnavljanja aktivnosti enzima, a maksimalna

aktivnost dostignuta je posle 156 sati i iznosila je 9937 U/L (Tabela 14 i Grafikon 16).

Radi bolje preglednosti razlika u aktivnosti enzima između grupa, rezultati su predstavljeni kao

procenti preostale aktivnosti enzima.

Na Grafikonu 17 prikazane su aktivnosti BChE (% aktivnosti) pri prijemu, posle 24h, 48h i na

kraju lečenja kod obe gupe bolesnika (za 100% aktivnosti enzima računata je donja granica

referntnih vrednosti).


75

Grafikon 17. Procenat očuvane aktivnosti BuChE u krvi obe grupe bolesnika sa trovanjem

malationom

Očuvanost enzima BuChE od prijema do kraja lečenja bila je bolja kod bolesnika lečenih

natrijum hidrogenkarbonatom, ali ona nije bila statitički značajno veća.


76

5.3.5. Aktivnost BuChE u krvi obe grupe bolesnika sa trovanjem dimetoatom

Aktivnost BuChE obe grupe bolesnika sa trovanjem dimetoatom prikazani su u Tabeli 15 i na

Grafikonu 18.

Tabela 15. Aktivnost BuChE u krvi bolesnika sa i bez NaHCO3


0

Kontrola 7 3921 z = 0,34

p = 0,77 NaHCO3 8 3055

6

Kontrola 7 3328 z = 1,39

p = 0,18 NaHCO3 8 1610

12

Kontrola 7 3814 z = 1,96

p = 0,054 NaHCO3 8 1773

18

Kontrola 7 3730 z = 1,85

p = 0,073 NaHCO3 8 1654

24

Kontrola 7 4155 z = 0,85

p = 0,44 NaHCO3 8 2236

30

Kontrola 7 4264 z = 0.96

p = 0,39 NaHCO3 8 2737

36

Kontrola 7 3703 z = 0,64

p = 0,58 NaHCO3 8 2841

42

Kontrola 7 4140 z = 0,73

p = 0,53 NaHCO3 8 3096

48

Kontrola 7 4253 z = 0,64

p = 0,61 NaHCO3 8 3234


77

Rezultati su radi lakšeg sagledavanja prikazani i grafički na Grafikonu 18


Tabela 15 i Grafikon 18 pokazuju da je početna aktivnost BuChE u kontrolnoj grupi bolesnika na

prijemu iznosila 3921 U/L. Ova vrednost se postepeno povećavala, ali ja na kraju lečenja ponovo

pala na početni nivo.

Početna aktivnost BuChE kod bolesnika lečenih natrijum hidrogenkarbonatom iznosila je 3055

U/L. Uz neznatni pad, od 42. sata došlo je kontinuiranog povećanja aktivnosti enzima, koji je na

kraju lečenja iznosio 9600 U/L.

Radi bolje preglednosti razlika aktivnost BuChE između kontrolne i test grupe rezultati su

prikazani na Grafikonu 19 u vidu histograma. Preostala aktivnost BuChE je data u % (računato

na donju referentnu vrenost) i to pri prijemu, posle 24 i 48 sata, i na kraju lečenja.


78


dimetoatom

Procenat očuvanosti BuChE na prijemu i u toku terapije bio je veći u kontrolnoj u odnosu na test

grupu, ali ta razlika nije bila statistički značajna.


79

5.3.6. Aktivnost BuChE u krvi obe grupe bolesnika sa trovanjem diazinonom

Aktivnost BuChE u krvi obe grupe bolesnika sa trovanjem diazinonom prikazani su u Tabeli 16 i

Grafikonu 20.

Tabela 16. Aktivnost BuChE u krvi bolesnika sa i bez NaHCO3


0 Kontrola 4 516 z = 0,0

p = 1,00 NaHCO3 4 527

6 Kontrola 4 152 z = 1,0

p = 0,57 NaHCO3 4 746

12 Kontrola 4 104 z = 1,5

p = 0,28 NaHCO3 4 676

18 Kontrola 4 52 z = 1,5

p = 0,28 NaHCO3 4 557

24 Kontrola 4 518 z = 0,5

p = 0,85 NaHCO3 4 766

30 Kontrola 4 1385 z = 1,46

p = 0,33 NaHCO3 4 634

36 Kontrola 4 790 z = 0,87

p = 0,66 NaHCO3 4 719

42 Kontrola 4 466 z = 0,29

p = 1,00 NaHCO3 4 487

48 Kontrola 4 134 z = 1,46

p = 0,33 NaHCO3 4 719




80

Tabela 16 i Grafikon 20 pokazuju da je aktivnost BuChE u kontrolnoj grupi bolesnika pri

prijemu, bila veoma niska (516 U/L). Najniža vrednost zabeležena je posle 18 sati (52 U/L).

Vrednosti aktivnosti enzima su varirale u čitavom periodu praćenja, uz konstantno održavanje

niskog nivoa. Aktivnost BuChE bolesnika lečenih natrijum hidrogenkarbonatom pri prijemu

iznosila je 527 U/L. Porast aktivnosti beleži se od 60. sata, a maksimalna vrednost je postignuta

posle 90 sati (1615 U/L). I u ovoj grupi su vrednosti aktivnosti BuChE veoma varirale, ali su bile

više nego u kontrolnoj grupi. Razlike aktivnosti BuChE između kontrolne i test grupe prikazani

su i na Grafikonu 21 u vidu histograma. Preostala aktivnost BuChE je data u % (računato na

donju referentnu vrenost) i to pri prijemu, posle 24 i 48 sata, i na kraju lečenja.


diazinonom

Aktivnost BuChE kod obe grupe bolesnika je slabo bila očuvana, sa malim razlikama u aktivnosti

između grupa.


81

5.4. Količina i vreme primenjenih antidota i dužina hospitalizacije kod ispitivanih

bolesnika

Količina i vreme primenjenih antidota, kao i dužina hospitalizacije u zavisnosti od težine trovanja

prikazani su na Tabeli 17.

Tabela 17. Količina i vreme primenjenih antidota, kao i dani na mehaničkoj ventilaciji (MV) i

dužina hospitalizacije

Grupe Parametri Atr

(mg/kg)

Dani primene (trajanje)

PAM-Cl NaHCO3 Dani na MV Hospitalizacija

Kontrola

N 20 20 20 20

X 287,83 3,45 6,74 16,25

SD 237,66 2,32 5,97 7,99

Medijana 279,00 2,50 6,00 15,50

Min. 1,0 2 0 7

Maks. 803,0 11 17 33

NaHCO3

N 22 22 22 22 22

X 206,31 2,55 2,14 2,64 11,68

SD 219,08 1,10 0,83 3,47 5,02

Medijana 120,00 2,50 2,00 0,50 11,00

Min. 1,5 1 1 0 5

Maks. 735,0 5 4 13 22

Poređenje z = 1,15

p = 0,25

z = 1,11

p = 0,27

z = 2,35

p = 0,019

z = 1,75

p = 0,079

Tabela 17 pokazuje da je stepen težine trovanja bio podjednako raspoređen u kontrolnoj gupi i u

grupi bolesnika lečenih natrijum hidrogenkarbonatom.

Iako je količina primenjenog atropina, kao i dužina primene pralidoksima u grupi koja je primala

hidrogenkarbonat u odnosu na kontrolnu grupu manja, statistička značajnost između grupa ne

postoji. Statistička značajna razlika među grupama zabeležena je u broju dana na mehaničkoj

ventilaciji koji je u kontrolnoj grupi iznosio 6,74 dana, a u test grupi 2,64 dana, p =0,019, dok je

dužina hospitalizacije bila granično značajna (kontrolna grupa 16,25 dana, test grupa 11,68 dana

0,1> p >0,05).


82

5.5. Laboratorijski i klinički parametri kod obe grupe bolesnika

5.5.1. pH arterijske krvi kod obe grupe bolesnika sa trovanjem malationom

U tabeli 18 prikazani su pH arterijske krvi kod bolesnika kontrolne i test grupe u prvih 24h.

Tabela 18. pH arterijske krvi kod bolesnika sa trovanjem malationom u grupi sa i bez NaHCO3


0

Kontrola 9 7,33 0,06

NaHCO3 10 7,34 0,09

6


NaHCO3 10 7,48** 0,06

12


NaHCO3 10 7,42* 0,13

18


NaHCO3 10 7,47** 0,03

24


NaHCO3 10 7,51** 0,04

* p < 0,05, ** p < 0,01 vs Kontrola

Prosečna vrednost pH krvi u nultom vremenu za obe analizirane grupe je bila gotovo identična

(7,33, odnosno 7,34).

U kontrolnoj grupi vrednosti pH ostaju praktično iste do isteka praćenja, sve vreme bez bitnijih

odstupanja od fizioloških okvira.

U test grupi registruje se porast vrednosti pH u okviru grupe tokom primene terapije (od

normalnih do lake alkalemije). Povećava se i razlika u odnosu na kontrolnu grupu i ona je

najznačajnija nakon 6,12 i 24h (p<0,01) a nešto manja značajna nakon 12h (p<0,05).



83

Grafikon 22. pH arterijske krvi kod bolesnika sa trovanjem malationom u grupi sa i bez NaHCO3

5.5.2. pH arterijske krvi kod obe grupe bolesnika sa trovanjem dimetoatom

U tabeli 19 prikazani su pH arterijske krvi bolesnika kontrolne grupe i bolesnika lečenih natrijum

hidrogenkarbonatom u prvih 24h.

Tabela 19. pH arterijske krvi kod bolesnika sa trovanjem dimetoatom u grupi sa i bez NaHCO3


0 Kontrola 7 7,32 0,14

NaHCO3 8 7,41 0,06

6 Kontrola 7 7,34 0,11

NaHCO3 8 7,46* 0,06

12 Kontrola 7 7,36 0,13

NaHCO3 8 7,48* 0,04

18 Kontrola 7 7,35 0,08

NaHCO3 8 7,49* 0,03

24 Kontrola 7 7,36 0,06

NaHCO3 8 7,50* 0,03



84

Tabela 19 pokazuje da je početna srednja vrednost pH kvi u nultom vremenu kod kontrolne grupe

iznosila 7,32, i bila niža, ali bez statističke značajnosti u odnosu na vrednosti test grupe (7,41).

U kontrolnoj grupi vrednosti pH ostaju praktično iste do kraja praćenja, sve vreme u granicama

referentnih vrednosti.

U grupi pacijenata tretiranih hidrogenkarbonatom dokazuje se porast vrednosti pH do

maksimalnih 7,50 nakon 24h. U svim periodima nakon početnog, pH vrednosti arterijske krvi test

grupe su statistički signifikantno više u odnosu na kontrolnu grupu (p<0,05).


Grafikon 23. pH arterijske krvi kod bolesnika sa trovanjem dimetoatom u grupi sa i bez NaHCO3


85

5.5.3. pH arterijske krvi kod obe grupe bolesnika sa trovanjem diazinonom

U Tabeli 20 prikazani su pH arterijske krvi kod bolesnika kontrolne grupe i bolesnika lečenih

natrijum hidrogenkarbonatom u prvih 24h.

Tabela 20. pH arterijske krvi kod bolesnika sa trovanjem diazinonom u grupi sa i bez NaHCO3


0 Kontrola 4 7,43 0,07

NaHCO3 4 7,44 0,09

6 Kontrola 4 7,41 0,08

NaHCO3 4 7,50* 0,06

12 Kontrola 4 7,40 0,09

NaHCO3 4 7,48* 0,08

18 Kontrola 4 7,40 0,09

NaHCO3 4 7,47 0,06

24 Kontrola 4 7,41 0,07

NaHCO3 4 7,44 0,05


Početne vrednosti pH arterijske kvi kod obe grupe bolesnika su bile slične (7,43; 7,44). Posle

toga došlo je do statistički značajnog porasta pH vrednosti arterijske krvi u test grupi i on se

održavao na željenom nivou do kraja terapije, dok je u kontrolnoj gupi bio u granicama

referentnih vrednosti (Tabela 20).


86

Rezultati su do kraja terapije prikazani i grafički na Grafikonu 24.

Grafikon 24. pH arterijske krvi bolesnika sa trovanjem diazinonom u grupi sa i bez

NaHCO3

5.5.4. Koncentracija hidrogenkarbonata u arterijskoj krvi obe grupe bolesnika

Koncentracija HCO3- u arterijskoj krvi kod obe grupe bolesnika za sva tri OFI prikazana je u

Tabeli 21.

Tabela 21. Koncentracija HCO3- (mmol/L) u arterijskoj krvi u grupi sa i bez NaHCO3


0 Kontrola 20 20,97 3,34

NaHCO3 22 21,53 4,47

6 Kontrola 20 19,41 6,61

NaHCO3 22 27,21a*,b** 5,89

12 Kontrola 20 22,27 2,09

NaHCO3 22 26,40a*,b** 3,26

18 Kontrola 20 24,60

NaHCO3 22 25,44 b* 4,76

24 Kontrola 20 27,80

NaHCO3 22 27,71b*** 3,25

a* p < 0,05 vs Kontrola

b*,**,*** p <0,05; p <0,01; p <0,001 u odnosu na vrednost na prijemu


87

Tabela 21 pokazuje da su početne srednje vrednosti koncentracije hidrogenkarbonata kod obe

grupe bolesnika za sva tri toksična agensa bile ujednačene, nesignifikantno niže u kontrolnoj

grupi. Statistički značajan porast koncentracija u test grupi u odnosu na kontrolnu objektiviziran

je nakon 6h i 12h po prijemu i datoj terapiji i iznosio je +7,8 mmol/L, odnosno +4,13 mmol/L

(p<0,05). U preostalim vremenskim presecima do kraja praćenja rezultati su bili slični onima u

kontrolnoj grupi.

Tokom navedenih perioda, u test grupi je registrovan stalan i statistički značajan porast

prosečnih koncentracija hidrogenkarbonata u odnosu na startnu, zaključno sa 24h kada je iznosio

+6,18 mmol/L (p<0,001).


Grafikon 25. Koncentracija HCO3- (mmol/L) u arterijskoj krvi u grupi sa i bez NaHCO3


88

5.5.5. Vrednosti aktuelnog baznog ekscesa u arterijskoj krvi obe grupe bolesnika

Vrednosti ABE u arterijskoj krvi kod obe grupe bolesnika za sva tri OFI prikazani su u Tabeli 22.

Tabela 22. Vrednosti aktuelnog baznog ekcesa (ABE) u arterijskoj krvi u grupi sa i bez NaHCO3

Vreme (sati) Grupa* N X SD

0 Kontrola 20 -2,44 6,76

NaHCO3 22 -4,03 5,05

6 Kontrola 20 0,90 6,04

NaHCO3 22 3,94*** 5,90

12 Kontrola 20 -0,58 3,66

NaHCO3 22 1,99** 5,09

18 Kontrola 20 1,50 2,40

NaHCO3 22 2,36** 6,03

24 Kontrola 20 2,35 1,76

NaHCO3 22 2,93*** 3,85

*, **,*** p < 0,05; p < 0,01; p < 0,001 u odnosu na vrednost na prijemu

U Tabeli 22 vidimo da je pri prijemu registrovana minimalna razlika prosečnih vrednosti ABE: u

kontrolnoj grupi ona je u granicama normale (-2,44 mmol/L), a u test grupi nalazi se u zoni

sasvim lake metaboličke acidoze (-4,03 mmol/L).

Do završetka praćenja u navedenim vremenskim tačkama u kontrolnoj grupi nema statistički

signifikantnih promena, sve vreme u granicama fizioloških vrednosti.

S druge strane, u test grupi objektiviziran je statistički značajan porast srednjih vrednosti ABE u

odnosu na inicijalnu: najviše nakon 6. i 24. sata (+7,97 mmol/L i +6,96 mmol/L; p<0,001), a

nešto manje nakon 12. i 18. sata (+6,02 mmol/L i +6,39 mmol/L; p<0,01).



89

Grafikon 26. Vrednosti aktuelnog baznog ekcesa (ABE) u arterijskoj krvi u grupi sa i bez NaHCO3

5.5.6. Parcijalni pritisak ugljendioksida u arterijskoj krvi obe grupe bolesnika

Parcijalni pritisak ugljendioksida u arterijskoj krvi obe grupe bolesnika za sva tri OFI u prvih 24

h prikazani su u Tabeli 23.

Tabela 23. Parcijalni pritisak ugljendioksida (mmHg) u arterijskoj krvi u grupi sa i bez NaHCO3

Vreme (sati) Grupa X SD

0 Kontrola 35,54 11,57

NaHCO3 34,62 8,99

6 Kontrola 48,41 13,38

NaHCO3 36,31* 7,11

12 Kontrola 38,62 6,59

NaHCO3 34,40 2,72

18 Kontrola 36,00 2,82

NaHCO3 34,35 8,99

24 Kontrola 35,65 0,91

NaHCO3 33,99 6,03



90

Tabela 23 pokazuje da je kod obe grupe bolesnika srednji početni pCO2 bio gotovo identičan

(35,54 mmHg i 34,62 mmHg). Sa maksimalnih 48,41 mmHg nakon 6h, srednji pCO2 kontrolne

grupe je bio statički signifikantno viši u odnosu na istovremeni rezultat test grupe od 36,31

mmHg (p<0,05).

U ostalim analiziranim vremenskim periodima nije bilo značajnijih razlika između dve grupe, niti

varijacija unutar grupa. Prosečni rezultati su se sve vreme održavali aproksimativno u referentnim

granicama za pCO2 u arterijskoj krvi.


Grafikon 27. Parcijalni pritisak ugljendioksida (mmHg) u arterijskoj krvi u grupi sa i bez NaHCO3


91

5.5.7. Parcijalni pritisak kiseonika u arterijskoj krvi obe grupe bolesnika

Parcijalni pritisak kiseonika u arterijskoj krvi obe grupe bolesnika za sva tri OFI u prva 24h

prikazani su u Tabeli 24.

Tabela 24. Parcijalni pritisak kiseonika (mmHg) u arterijskoj krvi u grupi sa i bez NaHCO3


0 Kontrola 20 82,31 38,85

NaHCO3 22 86,67 35,19

6 Kontrola 20 79,34 13,34

NaHCO3 22 82,24 28,87

12 Kontrola 20 120,80 24,90

NaHCO3 22 82,15* 37,15

18 Kontrola 20 77,10 15,69

NaHCO3 22 84,68 41,76

24 Kontrola 20 91,15 15,34

NaHCO3 22 93,72 41,09


Tabela 24 pokazuje da je srednji pO2 u kontrolnoj grupi bolesnika u nultom vremenu iznosio

82,31 mmHg, da je dostigo maksimum od 120,80 mmHg posle 12 sati uz dalji pad u 18. satu i

blagi porast u narednih 6 sati.

Prosečni pO2 u grupi bolesnika lečenih natrijum hidrogenkarbonatom u nultom vremenu iznosio

je 86,67 mmHg da bi u 12. satu dostigo svoj minimum (82,15 mmHg) koji je bio statistički

značajno niži u odnosu na kontrolnu grupu.

Sve prikazane vrednosti u svim vremenskim presecima za obe grupe su se održavale

aproksimativno u granicama referentnih vrednosti.



92

Grafikon 28. Parcijalni pritisak kiseonika (mmHg) u arterijskoj krvi u grupi sa i bez NaHCO3

5.5.8. Saturacija arterijske krvi kiseonikom u obe grupe bolesnika

Saturacija arterijske krvi kiseonikom u obe grupe ispitanika za sva tri OFI u prva 24h prikazana

je u Tabeli 25.

Tabela 25. Saturacija arterijske krvi kiseonikom (%) u u grupi sa i bez NaHCO3


0 Kontrola 20 94,785 3,3070

NaHCO3 22 94,409 4,8338

6 Kontrola 20 94,664 3,1165

NaHCO3 22 94,874 5,7049

12 Kontrola 20 98,229 ,7889

NaHCO3 22 93,788* 6,8398

18 Kontrola 20 95,400 1,9799

NaHCO3 22 93,200 7,0685

24 Kontrola 20 97,150 1,2021

NaHCO3 22 94,567 6,9701



93

Prosečna saturacija kiseonikom u arterijskoj krvi bolesnika obe grupe pri prijemu je bila

ujednačena (94,785% i 94,409%).

U ostalim analiziranim vremenskim presecima nije bilo značajnijih razlika između dve grupe, niti

varijacija unutar grupa. Izuzetak je period 12h nakon prijema kada je sO2 u test grupi, inače tek

nešto niži od donje granice normale (93,788%) bio ujedno i statistički značajno niži u odnosu na

vremenski paralelni rezultat kontrolne grupe od 98,229% (p<0,05).

U svim analiziranim i prikazanim tačkama, rezultati su bili aproksimativno u referentnim

granicama za saturaciju O2 u arterijskoj krvi (Tabela 25).


Grafikon 29. Saturacija arterijske krvi kiseonikom (%) u u grupi sa i bez NaHCO3


94

5.5.9. Telesna temperatura kod obe grupe bolesnika

Vrednosti telesne temperature kod obe grupe bolesnika prikazane su u Tabeli 26 i na Grafikonu

30.

Zbog velikog broja merenja u tabeli su prikazane vrednosti telesne temperatura samo u prvih 48

sati lečenja, a na Grafikonu 30 do kraja lečenja.

Tabela 26. Telesna temperatura (t⁰ C) bolesnika u grupi sa i bez NaHCO3


0 Kontrola 20 36,8 0,67

NaHCO3 22 36,8 0,54

6 Kontrola 20 37,4 0,78

NaHCO3 22 36,9* 0,63

12 Kontrola 20 37,4 0,78

NaHCO3 22 37,1 0,81

18 Kontrola 20 37,3 0,75

NaHCO3 22 37,1 0,81

24 Kontrola 20 37,3 0,64

NaHCO3 22 37,2 0,69

30 Kontrola 20 37,3 0,65

NaHCO3 22 36,9* 0,40

36 Kontrola 20 37,3 0,84

NaHCO3 22 36,8* 0,47

42 Kontrola 20 37,4 0,63

NaHCO3 22 37,0* 0,45

48 Kontrola 20 37,4 0,93

NaHCO3 22 37,0* 0,61




95

Grafikon 30. Telesna temperatura (t ⁰ C) bolesnika u grupi sa i bez NaHCO3

Tabela 26 pokazuje statistički značajnu razliku u telesnoj temperaturi između kontrolne i test

gupe u 6., 30., 36., 42. i 46. satu (p<0,05).

5.5.10. Kvni pritisak kod obe grupe bolesnika

Vrednosti sistolnog krvnog pritiska kod obe grupe bolesnika prikazani su u Tabeli 27 i na

Grafikonu 31.


96

Tabela 27. Vrednosti sistolnog krvnog pritiska (mmHg) u grupi sa i bez NaHCO3


0 Kontrola 20 129,25 21,23

NaHCO3 22 129,09 30,53

6 Kontrola 20 137,75 23,59

NaHCO3 22 138,18 28,26

12 Kontrola 20 129,50 10,62

NaHCO3 22 129,32 20,77

18 Kontrola 20 129,00 20,23

NaHCO3 22 137,59 22,81

24 Kontrola 20 128,42 19,51

NaHCO3 22 136,19 21,14

30 Kontrola 20 132,63 19,67

NaHCO3 22 140,79 20,49

36 Kontrola 20 132,11 16,10

NaHCO3 22 130,28 16,31

42 Kontrola 20 130,28 12,65

NaHCO3 22 134,12 21,00

48 Kontrola 20 135,94 17,90

NaHCO3 22 128,93 16,07

Vrednosti sistolnog krvnog pritiska su bile u granicama normale.


Grafikon 31. Vrednosti sistolnog krvnog pritiska (mmHg) u grupi sa i bez NaHCO3


97

Vrednosti dijastolnog krvnog pritiska kod obe grupe bolesnika prikazani su u Tabeli 28 i na

Grafikonu 32.

Tabela 28. Vrednosti dijastolnog krvnog pritiska (mmHg) u grupi sa i bez NaHCO3


0 Kontrola 20 78,50 15,90

NaHCO3 22 77,50 17,09

6 Kontrola 20 77,25 13,02

NaHCO3 22 79,77 15,23

12 Kontrola 20 74,50 7,59

NaHCO3 22 78,18 10,29

18 Kontrola 20 72,75 14,91

NaHCO3 22 80,23 12,39

24 Kontrola 20 75,79 11,69

NaHCO3 22 81,67 13,63

30 Kontrola 20 78,68 15,17

NaHCO3 22 86,32 13,72

36 Kontrola 20 81,05 12,42

NaHCO3 22 82,50 11,78

42 Kontrola 20 78,89 7,18

NaHCO3 22 82,06 13,23

48 Kontrola 20 81,88 9,28

NaHCO3 22 81,07 12,73

Vrednosti dijastolnog pritiska bile su granicama normale.


Grafikon 32. Vrednosti dijastolnog krvnog pritiska (mmHg) u grupi sa i bez NaHCO3


98

Tabele 27 i Tabela 28 pokazuju da nema statistički značajnih razlika u sistolnom i dijastolnom

pritisku između ispitivanih grupa bolesnika.

5.5.11. Frekvencija pulsa kod obe grupe bolesnika

Vrednosti frekvencije pulsa kod obe grupe bolesnika prikazane su u Tabeli 29 i na Grafikonu 33.

Tabela 29. Frekvencija pulsa (otk./min.) u grupi sa i bez NaHCO3


0 Kontrola 20 106,95 21,76

NaHCO3 22 103,73 20,37

6 Kontrola 20 104,85 13,75

NaHCO3 22 107,62 18,35

12 Kontrola 20 110,16 11,62

NaHCO3 22 106,81 20,47

18 Kontrola 20 104,00 10,67

NaHCO3 22 104,10 19,22

24 Kontrola 20 103,39 13,89

NaHCO3 22 100,15 18,69

30 Kontrola 20 102,56 13,27

NaHCO3 22 98,40 21,44

36 Kontrola 20 102,00 15,31

NaHCO3 22 95,39 15,89

42 Kontrola 20 98,61 14,09

NaHCO3 22 95,00 15,61

48 Kontrola 20 99,94 14,79

NaHCO3 22 98,11 17,75


99


Grafikon 33. Frekvencija pulsa (otk./min.) u grupi sa i bez NaHCO3

Nije uočena statistički značajna razlika u frekvenciji pulsa u kontrolnoj i test grupi.


100

6. DISKUSIJA

Organofosforni insekticidi su, s obzirom na široku primenu u poljoprivredi tokom proteklih

decenija, povezani sa većim brojem fatalnih trovanja od bilo koje klase hemikalija 6. Trovanja su

najčešća u nerazvijenim i zemljama u razvoju, pa se tako u Šri Lanki godišnje registruje do 20

000 hospitalizacija zbog trovanja OFI 111, a broj suicidalnih trovanja ovim agesima u svetu je

porastao na 371 594 na godišnjem nivou 112. U Evropi OFI nisu čest uzrok samotrovanja, po

podacima iz 14 medicinskih centara oni su samo 3% od prijavljenih slučajeva. Izuzetak je

Mađarska koja prijavljuje čak 17% slučajeva samotrovanja OFI u reonu Segedina 16,113. Podaci

Nacionalnog centra za kontrolu trovanja VMA pokazuju da akutna trovanja OFJ u odnosu na

trovanja drugim agensima, kao što su alkohol i lekovi, nisu tako česta, te su 23 pacijenta sa

samotrovanjem OFI hospitalizovana tokom 2014. Godine 114. Međutim, trovanja su često sa

teškom kliničkom slikom, zahtevaju kontinuirano praćenje bolesnika u jedinici intenzivne nege,

uz primenu odgovarajuće antidotske i suportivne terapije i produženo lečenje čestih komplikacija.

Nepouzdani anamnestički podaci kao i nemogućnost precizne procene ingestirane doze, posebno

u suicidalnim trovanjima, otežavaju prognozu ishoda trovanja. Čak i pacijenti koji su primljeni u

relativno dobrom opštem stanju, u kratkom vremenskom periodu mogu postati vitalno ugroženi i

zahtevati intubaciju i mehaničku ventilaciju. Poznato je da težina trovanja, kao i prognoza zavisi

od doze i toksičnosti pojedinih OFI, pre svega njihovog neurotoksičnog potencijala,

farmakokinetskih i farmakodinamskih osobina, brzine starenja kompleksa OFI-AChE, hemijskih

karakteristika (dimetil ili dietil jedinjenje) itd. Pored toga na prognozu utiče i to koliko je

vremena proteklo od ingestije i da li su terapijske mere adekvatne i pravovremeno primenjene

115,116. Intenzivne mere lečenja, pored podrške vitalnih funkcija, podrazumevaju primenu trojne

antidotske terapije (atropin, oksim, diazepam) (1-3), koja se i pored nedoumica oko načina

primene atropina (individualizovan pristup naspram rastućih doza atropina do hiperatropinizacije)

117 i doze oksima 118 smatra okosnicom terapije trovanja OFI. S obzirom na slabu dostupnost i

kontraverze oko efikasnosti oksima, već decenijama se sprovode istraživanja adjuvantne terapije

u trovanjima OFI. U revijalnom prikazu terapijskih mera koje su primenjene ili istraživane za

trovanja OFI, kao jedan od agenasa za koje se smatra da su verovatno efikasni izdvojen je


101

glikopirolat kao antiholinergik, dok su u grupi agenasa za koje se još uvek ne zna sa sigurnošću

koliko su klinički efikasni oksimi, butirilholinesteraza, magnezijum sulfat, N-metil-D-aspartat

antagonisti, organofosforne hidrolaze i natrijum hidrogenkarbonat 118. U vezi sa terapijom

natrijum hidrogenkarbonatom, izdvojene su eksperimentalne studije na animalnom modelu i

kliničke studije iranskih autora 105,119,120. Iako je bilo trenda bržeg oporavka pacijenata koji su

dobijali natrijum hidrogenkarbonat, pre svega u smislu manje potrebe za atropinom i kraće

hospitalizacije, nije bilo statistički značajne razlike u odnosu na standardnu terapiju. Kao osnovni

nedostatak studija, navedeno je to da nisu randomizirane, da postoji značajna heterogenost uzorka

u odnosu na vrstu agensa, vreme započinjanja terapije kao i samog terapijskog modela, s obzirom

na različite režime primene natrijum hidrogenkarbonata. Stoga je predloženo da se nastavi sa

istraživanjem efikasnosti ovog terapijskog modaliteta pre nego što se preporuči za rutinsku

primenu 118,121. S druge strane pojedini autori, shodno iskustvima sa trovanjem OFI, predlažu

terapiju natrijum hidrogenkarbonatom i za trovanja nervnim bojnim otrovima 122.

S obzirom na rezultate dosadašnjih istraživanja efektivnosti terapije natrijum

hidrogenkarbonatom u trovanjima organofosfornim jedinjenjima, zajedno sa standardnom

antidotskom terapijom (oksim, atropin i diazepam), cilj ovog rada bio je da objasni da li i na koji

način dolazi do bržeg oporavka bolesnika. Da bi se dobila bolja slika o sudbini OFI u organizmu,

izvršena su prvo in vitro ispitivanja stabilnosti ovih jedinjenja. Nakon toga je izvršeno ispitivanje

na dve grupe bolesnika sa trovanjima OFI od kojih je jedna (kontrolna grupa) lečena

standardnom antidotskom terapijom, dok je druga uz standardnu terapiju dobijala i natrijum

hidrogenkarbonat (test grupa). U obe ispitivane grupe bolesnika praćen je metabolizam i

izlučivanje metabolita OFI in vivo. Takođe su praćene i aktivnosti enzima AChE i BuChE, acido-

bazni status i drugi parametri, da bi se proverilo da li će primena infuzije natrijum

hidrogenkarbonata, uz standardnu terapiju, povoljno uticati na oporavak bolesnika sa trovanjima

OFI.


102

6.1. Uticaj pH na brzinu degradacije ispitivanih OFI in vitro i koncentracije OFI i

njihovih metabolita u krvi i urinu kontrolne i test grupe bolesnika

U cilju potpunijeg razjašnjenja uticaja natrijum hidrogenkarbonata na razgradnju OFI in vivo,

izvršena je i provera njihove stabilnosti pri različitim pH vrednostima in vitro (Tabele 3, 4 i 5).

Dobijeni rezultati pokazuju da sa porastom pH vrednosti bikarbonatnog pufera dolazi do ubrzane

razgradnje malationa i dimetoata. Naime, pri pH vrednosti od 7,35, koja odgovara fiziološkoj

vrednosti pH krvi, nakon 48h dolazi do razgradnje 68% malationa. Sa porastom pH, procenat

razgradnje raste na 74,2%, pri pH 7,45, odnosno 81% pri pH vrednosti od 7,55. Razgradnja

malationa je pri pH 7,55 statistički značajno veća od razgradnje pri pH 7,35 (p<0,05) (Tabela 3 i

Grafikon 1).

Kada je u pitanju dimetoat, rezultati in vitro ispitivanja pokazuju da je njegova stabilnost manja u

poređenju sa malationom. Naime, pri pH vrednosti od 7,35 nakon 48h razgradi se 81,2%

dimetoata (Tabela 4). U sredini čija je pH vrednost veća, više od 90% supstance se degradira

(91,2% dimetoata se razgradi pri pH 7,45, odn. 99,8% pri pH 7,55). Statističkom analizom je

potvrđeno da je degradacija dimetoata značajno veća pri pH 7,55 u odnosu na pH 7,35 (p<0,05).

Nestabilnost malationa i dimetoata u slabo baznoj sredini može se objasniti hidrolizom P-S veze.

Ovi podaci su u skladu sa literaturnim 10-13. Nasuprot nestabilnosti malationa i dimetoata u slabo

baznoj sredini, razgradnja diazinona bila je najveća pri najnižoj pH vrednosti (pH 7,35) i iznosila

je 13,5%. Naime, posle 48h pri pH 7,55 razgradilo se samo 2% diazinona. Veća nestabilnost

diazinona u manje baznoj sredini je u skladu sa njegovom hemijskom strukturom

(pKa=2,6)101,123,124.

Ispitivanja izvršena u in vitro uslovima ukazuju na to da bi promena pH vrednosti krvi u smislu

alkalizacije mogla da ubrza metaboličku razgradnju organofosfata. Da bi se proverila mogućnost

ubrzane eliminacije OFI nakon primene infuzije natrijum hidrogenkarbonata, određene su

koncentracije ovih jedinjenja i njihovih metabolita u krvi.

Praćenje koncentracija OFI u krvi veoma je značajno, jer one ukazuju na dalji razvoj kliničke

slike, i u skladu sa tim, na preduzimanje odgovarajućih terapijskih mera.


103

Ingestija preparata koji sadrže malation je najčešći put unošenja u cilju suicida. Simptomi

trovanja se javljaju veoma brzo i ispoljavaju u vidu holinergičke krize, odnosno muskarinskih,

nikotinskih i centralnih nervnih simptoma. U cilju dijagnostike trovanja, određivana je njegova

koncentracija u krvi bolesnika sa akutnim trovanjem.

Literaturni podaci pokazuju da su koncentracije malationa u krvi u trovanjima ovim pesticidom

veoma različite. Koncentracija malationa, prikazana u slučaju samotrovanja malationom nakon

intravenske aplikacije 1,8 g ove supstance, iznosila je 0,349 mg/L 125. Kada je u pitanju peroralno

trovanje malationom sa letalnim ishodom, njegove koncentracije u krvi iznosile su od 0,3-7,4

mg/L (23 smrtna slučaja nakon trovanja malationom) 126. Opisani su i slučajevi trovanja

malationom sa letalnim ishodom gde je njegova koncentracija u krvi bila 5,5 mg/L 75, odnosno

8,7 mg/L 124. Trovanje malationom 84-godišnje žene završeno je letalno, a post mortem

koncentracija malationa u krvi iznosila je 0,34 mg/L, dok je od metabolita detektovana malation

monokarboksilna kiselina (21,7 mg/L), a malaokson nije detektovan u krvi 62. Srednja vrednost

koncentracije malationa koji je određivan post mortem u 31 slučaju trovanja iznosila je 0,82

mg/L 127. Nasuprot ovim podacima, u radu Seth-a i saradnika 128, ukupne koncentracije rezidua

pesticida bile su u opsegu od 382-500 mg/L.

U trovanjima malationom bolesnika koji su lečeni na Klinici za urgentnu i kliničku toksikologiju

srednja koncentracija ovog jedinjenja u krvi kontrolne grupe na prijemu iznosila je 3,57 mg/L, a u

test grupi 2,56 mg/L. Prema podacima iz literature ove koncentracije su povezane sa letalnim

ishodom 126.

Metabolizam malationa se odvija u jetri i obuhvata dva metabolička puta. Oksidacijom

malationa, oksidativnom desulfuracijom, nastaje malaokson. Malaokson pokazuje veću

toksičnost u poređenju sa malationom. Molekul malationa sadrži i estarsku grupu, koja lako može

da hidrolizuje. Drugi metabolički put obuhvata upravo hidrolizu estarske grupe u molekulu

malationa, uz nastajanje malation monokarboksilne kiseline. Primena infuzije natrijum

hidrogenkarbonata, usled povećanja pH vrednosti krvi, mogla bi da ima povoljan uticaj na

preusmeravanje metaboličkog puta u smislu nastajanja manje toksičnog metabolita malation

monokarboksilne kiseline. Zbog toga su praćene i koncentracije malaoksona i MCA u krvi

bolesnika sa trovanjima malationom.


104

Tabela 6 pokazuje da nije bilo statistički značajne razlike u koncentracijama metabolita malationa

(malaokson i MCA) u krvi bolesnika na prijemu u kontrolnoj (0,069 mg/L i 2,28 mg/L) i test

grupi (0,036 mg/L i 2,34 mg/L). U poređenju sa literaturom, koncentracija MCA je bila manja od

odgovarajuće koncentracije u post mortem krvi 62. Iako nije bilo značajne razlike u

koncentracijama metabolita malationa na prijemu, promene koncentracija malationa i njegovih

metabolita u praćenim vremenskim intervalima od prijema do 48. sata, ukazuju da je

koncentracija malaoksona i MCA u 24. i 30. satu bila statistički značajno niža u test grupi

(p<0,05). Kod eliminacije malationa postoji statistički značajna razlika između nagiba

regresionih krivih između kontrolne i test grupe (p<0,01), dok su za MCA razlike na granici

značajnosti (0,05<p>0,1) (Grafikoni 4 i 5). Na osnovu krivih eliminacije izračunata su i

poluvremena eliminacije malationa i MCA iz krvi kod obe grupe bolesnika (Tabela 7). U

kontrolnoj grupi koncentracija malationa se smanji za 50% u toku 6,8h, dok je u grupi koja je

primala natrijum hidrogenkarbonat ovo vreme 4,4h. Kada je u pitanju MCA, poluvreme

eliminacije u kontrolnoj grupi je 9,6h, a u test grupi 2,2h. Ovi podaci ukazuju na to da primena

natrijum hidrogenkarbonata kod trovanja malationom ima povoljan uticaj na ubrzavanje

metabolizma i eliminaciju kako samog malationa, tako i njegovog metabolita MCA.

Kada je u pitanju eliminacija malationa i njegovih metabolita iz urina, iz Tabele 8 se može videti

da su koncentracije malationa na prijemu u obe grupe bile relativno niske, s tim što je ova

koncentracija u test grupi bila manja (1,93 mg/L kontrolna grupa; 0,65 mg/L test grupa). U

poređenju sa malationom i ostalim metabolitima (malaokson i alkil fosfati), MCA je imala

značajno veće koncentracije. Eliminacija MCA je imala bifazni karakter. Maksimalne

koncentracije su postignute između 48. i 60. sata u test grupi (Tabela 8 i Grafikon 6) (statistički

značajna razlika u odnosu na kontrolnu grupu; p<0,05), dok je najniži nivo postignut u 78. satu

od prijema. Takođe, veće koncentracije eliminisane MCA u urinu u odnosu na malation u test

grupi u poređenju sa kontrolnom govori u prilog činjenici da je malation nestabilniji u baznijoj

sredini 129,130, koja je postignuta primenom infuzije natrijum hidrogenkarbonata.

Što se tiče alkil fosfata (DMP, DMTP i DMDTP) tabela pokazuje da je opadanje njihove

koncentracije u toku vremena bilo ravnomerno u obe grupe bolesnika. Koncentracije ovih

jedinjenja su u grupi bolesnika lečenih natrijum hidrogenkarbonatom bile na nešto višem nivou u


105

poređenju sa kontrolnom grupom. Statistička značajnost za DMTP i DMDTP je zabeležena u 24.

satu (1:3; 1:1,5; p<0,05).

Trovanja dimetoatom su i po literaturnim podacima često teža u odnosu na ona izazvana drugim

organofosfornim insekticidima. Eddleston i saradnici 115 su pokazali da je smrtnost u trovanjima

dimetoatom bila 23,1% u poređenju sa trovanjima hlorpirifosom (8%) i fentionom (16,2%), pri

čemu je koncentracija dimetoata najviše iznosila 81,6 mg/L. Takođe je ispitivan i uticaj etanola

na koncentraciju dimetoata u trovanjima ovim supstancama. U ovom istraživanju srednja

koncentracija dimetoata u krvi 35 bolesnika otrovanih samo dimetoatom bila je 33,2 mg/L 131,

dok je istovremena ingestija etanola sa dimetoatom značajno povećala njegovu koncentraciju u

krvi na 109,6 mg/L.

Davies i saradnici 132 su opisali tri slučaja teških trovanja dimetoatom koja su završila letalno.

Koncentracije dimetoata nakon prijema bile su u opsegu od 1,17 do 1,67 µM.

U literaturi su prikazani i podaci o akutnom trovanju dimetoatom sa letalnim ishodom, gde je

koncentracija dimetoata u krvi iznosila 38 mg/L 73.

Prikazan je i slučaj akutnog trovanja formotionom, insekticidom koji hidrolizom daje dimetoat.

Koncentracija dimetoata u krvi bolesnika starog 54 godine na prijemu iznosila je 21,4 mg/L 133.

U radu Naglera i saradnika 134 koncentracija dimetoata u krvi bolesnika starog 34 godine iznosila

je 2,34 mg/L 30 min., odnosno 3,11 mg/L, 2,5h nakon ingestije.

Naši podaci pokazuju da je srednja koncentracija dimetoata u krvi kontrolne grupe na prijemu

bolesnika iznosila 11,86 mg/L, a kod test grupe 13,27 mg/L. Trovanja su bila srednje teška i

teška. Koncentracija dimetoata u krvi, u kontrolnoj grupi se smanjila oko 50% nakon 24h, a u

grupi koja je primala natrijum hidrogenkarbonat nakon 18h (Tabela 9). Poluvreme eliminacije

dimetoata iz krvi u kontrolnoj grupi iznosilo je 25,3h, a u test grupi je bilo 18,4h što je značajno

kraće (p<0,05) (Grafikon 8). Kraće poluvreme eliminacije dimetoata iz krvi u test grupi u odnosu

na kontrlonu, navodi na zaključak da se dimetoat brže metaboliše u slabo alkalnoj sredini, pa

samim tim i njegova koncentracija u krvi opada brže. Ovi nalazi su u skladu sa literaturnim

podacima 135.


106

Rezultati pokazuju da koncentracije dimetoata u urinu pacijenata iz kontrolne i test grupe na

prijemu nisu bile značajno različite, s tim što je koncentracija u test grupi bila manja (8,56 mg/L

test grupa; 12,03 mg/L kontrolna grupa). Koncentracije su se u obe grupe kontinuriano

smanjivale sa statistički značajnim padom koncentracija u test grupi u 24., 30. i 48. satu (p<0,05).

Koncentracije alkilfosfata u urinu obe grupe bolesnika su bile veoma niske i mogle su se

detektovati do 72h. Statistčki značajne razlike u koncentraciji zabeležene su u 12. satu za sva tri

metabolita (DMTP i DMDTP veći u kontrolnoj grupi; p<0,05, a DMP veći u test grupi; p<0,01) i

18. satu sa većom koncentracijom DMP-a u test grupi (p<0,05), kada je i postignuta najveća

zabeležena koncentracija ovog metabolita (0,765 mg/L).

Ovo je u skladu i sa literaturnim podacima u kojima su te koncentracije bile u rasponu od 0,001-

3,6 mg/L za DMP; 0,004-1,56 mg/L za DMTP; 0,2-8,29 mg/L za DMDTP; 0,1-10,9 mg/L za

DEP i 0,001-14,7 mg/L za DETP 76,80. Naši rezultati govore u prilog tome da se nakon primene

natrijum hidrogenkarbonata ubrzava razgradnja dimetoata, što se vidi kroz kraće vreme u kome

se dimetoat detektuje i porastu koncentracije dimetil fosfata (DPM) u urinu test grupe.

Praćenje koncentracija diazinona u biološkom materijalu je veoma važno, jer on pored opštih

toksičnih dejstava takođe ispoljava i produžene neurotoksične i neurobihejvioralne poremećaje.

Ovo je ustanovljeno na jednoj sedmočlanoj porodici u SAD, čiji je stan prilikom dezinfekcije

umesto permetrinom obavljen primenom diazinona 136.

U literaturi je prikazan i slučaj trovanja diazinonom 42-godišnjeg muškarca koji je otpušten iz

bolnice nakon 7 dana lečenja. Koncentracija diazinona u krvi na prijemu iznosila je 0,39 mg/L137,

dok su koncentracije metabolite DEP i DETP u urinu 11 h od prijema bile 26 mg/L i 45 mg/L.

Nešto niže koncentracije diazinona u krvi (0,102 mg/L) 138 zabeležene su u trovanju 21-godišnje

ženske osobe koja je hospitalno lečena 4 dana. Koncentracije od 1,7 mg/L 138 i 2,36 mg/L 139

zabeležene su u dva trovanja diazinonom sa povoljnim ishodom. U ovim slučajevima

koncentracije metabolita DEP i DETP su bile 40,8 mg/L i 35,1 mg/L za prvi, odnosno 85,2 mg/L

i 101 mg/L za drugi prikazani slučaj.

Poklis i saradnici 140 su opisali letalno trovanje diazinonom, pri čemu je njegova koncentracija u

krvi iznosila 277 mg/L.


107

Rezultati istraživanja izvršenih na Klinici za urgentnu i kliničku toksikologiju pokazuju da je

inicijalna koncentracija diazinona na prijemu u kontrolnoj grupi iznosila 0,55 mg/L, a u grupi

pacijenata lečenih natrijum hidrogenkarbonatom 4,57 mg/L.

Na osnovu ovoga bi moglo da se zaključi da su navedene koncentracije u skladu sa prethodno

navedenim literaturnim podacima, jer su koncentracije diazinona u smrtnim slučajevima bile

daleko veće 140.

Koncentracija diazinona se u kontrolnoj grupi postepeno smanjivala do 48h, kada više nije bio

detektabilan, dok se u test grupi mogao detektovati do 66h (Tabela 10). Duži period detekcije

diazinona u test grupi može se objasniti hemijskom strukturom diazinona, odnosno njegovom

manjom stabilnošću u kiseloj sredini u odnosu na sredinu sa većom pH vrednošću. Takođe, treba

naglasiti i da je koncentracija diazinona u test grupi na prijemu bila devet puta veća u odnosu na

kontrolnu, te je potrebno i duže vreme za eliminaciju ovog jedinjenja.

Metabolizmom diazinona nakon hidrolize i odvajanja izopropil metil pirimidinola nastaje

dietiltiofosfat (DETP), od koga daljom oksidacijom sumpora nastaje dietilfosfat (DEP). Sam

diazinon i njegovi metaboliti DETP i DEP su određivani u urinu.

Diazinon u urinu kontrolne grupe nije detektovan. Koncentracije metabolita DEP i DETP u urinu

prikazane su u Tabeli 10 i na Grafikonu 9. Dobijeni rezultati pokazuju da su ova jedinjenja bila

detektabilna do 102h.

Koncentracije metabolita diazinona u kontrolnoj grupi bile su manje u poređenju sa

koncentracijama istih jedinjenja u test grupi, što se takođe može objasniti većom koncentracijom

samog diazinona u krvi u test grupi u odnosu na kontrolnu. Takođe, vidi se i da je koncentracija

DETP kao prvog metabolita bila veća u odnosu na koncentraciju DEP u obe grupe, ali bez

statističke značajnosti. Literaturni podaci vezani za koncentracije DEP i DETP pokazuju da su

koncentracije DETP u trovanjima diazinomom takođe bile veće od koncentracija DEP 137,141.

Nasuprot tome, u dva opisana slučaja koncentracija DETP u urinu bila je manja od koncentracije

DEP 141.

Prikazani rezultati o koncentacijama sva tri ispitivana OFI kod bolesnika lečenih u Klinici za

urgentnu i kliničku toksikologiju NCKT govore o tome da su one bile u skladu sa kliničkom


108

slikom trovanja. Takođe, ove koncentracije su bile manje od literaturno opisanih letalnih

koncentracija, što je ukazivalo na veliku verovatnoću povoljnog ishoda terapije.

Značajan faktor u toksikokinetici otrova je njihova perzistencija u krvi. S obzirom da se radi o

liposolubilnim supstancijama, sa širokom distribucijom u organizmu, one po dospevanju u

organizam, prelaze u masno tkivo organa, odakle se zatim postepeno vraćaju u cirkulaciju.

U prilog tome govore i rezultati ovog ispitivanja kojima je ustanovljeno da su malation i dimetoat

u krvi kontrolne grupe mogli biti detektovani i posle 48 sati. U skladu sa tim, malation i dimetoat

su se mogli detektovati u urinu duže nego u krvi (96h). Nasuprot kontrolnoj grupi, kod bolesnika

koji su lečeni natrijum hidrogenkarbonatom koncentracija malationa i dimetoata perzistirale su

znatno kraće u urinu.

6.2. Aktivnost holinesteraza kod obe grupe bolesnika

U trovanjima organofosfornim insekticidima aktivnosti AChE i BChE su vrlo važni indikatori

koji govore o težini trovanja. U tom smislu, ustanovljeni su i relativni kvantitativni odnosi

između aktivnosti ta dva enzima i težine trovanja. Inhibicija holinesteraza, odnosno preostali deo

njene aktivnosti od 20-50% odgovara lakom, 10-20% srednjem teškom, a manji od 10% teškom

stepenu trovanja. Praćenjem neurofizioloških parametara brojni autori su ustanovili da

reaktivacija holinesteraze i povećanje njene aktivnosti iznad 20-30% u odnosu na normalnu

vrednost korelira sa smanjenjem holinergičke krize i potrebom za asistiranim disanjem 142-144. Pri

ovom, takođe treba napomenuti da su u slučajevima teških trovanja, aktivnosti ovih enzima bile

skoro nemerljive ili najviše do 10%. Ove aktivnosti odnose se na krv (eritrociti i plazma), ali nije

poznato kolika je aktivnost AChE na neuromišićnim sinapsama ili u CNS 145. Međutim, može se

opravdano smatrati, da se inhibicija javlja na obe lokalizacije praktično u istoj meri 146.

Aktivnost holinesteraze ima takođe posebnu ulogu u praćenju toka i prognoze ishoda trovanja.

Naime, dobra aktivnost AChE kod primene oksima kao specifičnog antidota, je dobar

prognostički znak za povoljan ishod terapije. Nasuprot tome, njena kontinuirana supresija, a


109

pogotovu njeno dalje smanjenje u toku trovanja, pokazuje da dolazi do njene reinhibicije po

oslobađanju otrova iz depoa i loše prognoze trovanja 91.

Jedan od problema u terapiji trovanja OFI je i starenje AChE. To starenje zasniva se na

dealkilaciji AChE, čime kompleks postaje „ostareo“ i više nije podložan reaktivaciji oksimima.

Primeri ovakvog starenja AChE su na primer soman kod koga je poluvreme starenja AChE

humanih eritrocita in vitro svega nekoliko minuta 147. Slična situacija je i sa OFI, s tim što je u

ovim trovanjima starenje nešto sporije, a zavisi i od hemijske strukture OFI tj. alkil-alkoksi

radikala. Tako na primer, kod trovanja dietoksi derivatom (hlorpirifos) posle 12 sati AChE ostari

za oko 19,8%, dok u trovanjima dimetoksi derivatima (dimetoat, fention) za isto vreme ostari čak

84,5% i 85,7% 115.

BuChE služi ne samo kao indikator trovanja OFI već i kao dodatni parametar u cilju dijagnoze

trovanja OFI. Tako naprimer, u slučaju da se OFI više ne može dokazati hemijskim metodama, u

tu svrhu se može upotrebiti BuChE zdrave osobe. To se može izvršiti tako što se u plazmu

dobijenu od zdravog dobrovoljca doda određena zapremina plazme dobijene od bolesnika koji je

otrovan OFI. Prisustvo OFI čak i u tragovima dovešće do inhibicije BuChE u uzorku plazme

zdravog dobrovoljca. Na ovaj način može se dokazati da je OFI još uvek prisutan u krvi 54.

BuChE ima trostruki značaj: (1) kao indikator u trovanju OFI (2) kao dodatno sredstvo za

detekciju malih količina OFI ili aktivnih metabolita u trovanjima ovim jedinjenjima i (3) kao

antidot u ratnoj sanitetskoj opremi protiv trovanja nervnim bojnim otrovima (Armija SAD

Protexia® - pegilirana rekombinantna plazmatska humana holinesteraza) 148,149. Aktivnosti AChE

i BuChE u trovanjima bolesnika lečenih u Klinici za urgentnu i kliničku toksikologiju su na

prijemu bile snižene. Određivanje stepena inhibicije holinesteraza prilikom prijema pacijenata i

za vreme lečenja u obe grupe pacijenata vršeno je prema postojećim literaturnim podacima za

AChE (4000-8000 IU/L), i preporuci proizvođača imunohemijskog analizatora na kome su

određivanje aktivnosti BuChE (7000-19000 U/L) 110.

Obzirom da referentne vrednosti za AChE i BuChE u svetu značajno variraju, jedan od problema

u određivanju težine stepena ekspozicije na organofosfate je i određivanje procenta inhibicije ova

dva enzima 150-152. Zbog toga se preporučuje da se u praksi inhibicija tih enzima određuje prema

prosečnim srednjim vrednostima populacije 153. U odsustvu vlastitih kontrolnih vrednosti, može


110

se smatrati da je do ekspozicije OFI, koja bi mogla životno da ugrozi otrovane osobe, došlo kada

je aktivnost AChE bila niža od 80% u odnosu na donju granicu aktivnosti prema literaturi 154.

Za potrebe ovog rada urađena je i pilot studija na zdravim dobrovoljcima u kojoj su određene

referentne granice za aktivnost AChE (n=821; 4037,7 – 11733,8 IU/L) i aktivnost BuChE

(n=251; 9053,7 – 23671,8 U/L) u našoj populaciji 155.

Nivoi aktivnosti AChE i BuChE u krvi bolesnika sa akutnim trovanjem malationom, po završetku

terapije natrijum hidrogenkarbonatom, su bile veće od početnih vrednosti, ali nije bilo značajne

razlike između kontrolne i test grupe. U trovanju dimetoatom, vrednosti AChE su na kraju

lečenja bile niže od početnih, a vrednosti BuChE veće od početnih, ali ni u ovih bolesnika nije

bilo značajne razlike između grupa. U bolesnika sa trovanjem diazinonom aktivnosti AChE kod

obe grupe bolesnika po završetku terapije natrijum hidrogenkarbonatom, su bile u granicama

referentnih vrednosti, dok aktivnost BuChE ostaje na istom nivou kao na prijemu u obe grupe

pacijenata.

Ovi rezultati su u skladu sa objavljenim u studiji Balali-Mood-a i saradnika 105,106 koji takođe

nisu registrovali promene vrednosti holinesteraza nakon terapije natrijum hidrogenkarbonatom.

6.3. Količine primenjenih antidota i vreme hospitalizacije kod isptivanih bolesnika

U odnosu na stepen težine trovanja nije bilo razlika između kontrolne i test grupe. Praćenjem

potrošnje antidota (dužina primene pralidoksima i količina atropina) ustanovljeno je da su

njihove količine bile nešto manje kod bolesnika lečenih natrijum hidrogenkarbonatom (2,55

dana; atropin 206,3 mg) u odnosu na kontrolnu grupu (3,45 dana; atropin 287,8 mg). Međutim

ove razlike, iako evidentne, nisu bile statistički značajne.

Što se tiče atropina i drugi autori su našli da je njegov utrošak tokom perioda lečenja bio manji u

grupi pacijenata sa akutnim trovanjem OFI koji su u terapiji imali natrijum hidrogenkarbonat 105-

107.


111

Povoljan uticaj terapije natrijum hidrogenkarbonatom, uz standardnu antidotsku terapiju, ogleda

se i u kraćem vremenskom periodu tokom kojeg su pacijenti zahtevali primenu mehaničke

ventilacije (2,64 dana u test grupi i 6,75 dana u kontrolnoj grupi) (p<0,05) i granično statistički

značajnom (0,1>p>0,05) kraćom hospitalizacijom (11,68 dana u test grupi i 16,25 dana u

kontrolnoj grupi). Takođe je i prema literaturnim podacima dužina hospitalizacije bolesnika

lečenih natrijum hidrogenkarbonatom bila kraća (4,33 dana) u odnosu na kontrolnu grupu (5,59

dana), dok je broj bolesnika na mehaničkoj ventilaciji bio isti u obe grupe (11 bolesnika) 105.

6.4. Laboratorijski i klinički parametri kod obe grupe pacijenata

Izbor grupe laboratorijskih i kliničkih parametara koji su praćeni u ovom radu, izvršen je na

osnovu dva osnovna kriterijuma. Prvi se odnosio na mogući uticaj od strane samog toksičnog

agensa i/ili komplikacija tokom intoksikacije, dok je drugi predstavljao svojevrstan monitoring

efekta terapije hidrogenokarbonatom u smislu dostizanja odgovarajućeg stepena alkalizacije krvi

i mogućih sekundarnih posledica tog procesa.

S jedne strane, određivani su biohumoralni parametri uzorkovani iz arterijske krvi: pH,

standardna koncentracija HCO3-, ABE, pCO2, pO2 i sO2. S druge strane, praćeni su najvažniji

klinički pokazatelji kardiocirkulatorne komponente objektivnog statusa: frekvenca srčanog rada

tj. pulsa i sistolni i dijastolni krvni pritisak. Takođe je periodično registrovana telesna

temperatura.

Kada su upitanju prosečne inicijalne pH vrednosti arterijske krvi kod bolesnika sa trovanjem

malationom, one su u obe ispitivane grupe bile gotovo jednake: 7,33 i 7,34. Statistički značajno

veće vrednosti pH arterijske krvi (maksimum 7,51 nakon 24h) u test grupi u odnosu na kontrolnu

zabeležene su u svim ostalim periodima vremena (Tabela 18, Grafikon 22). Slični rezultati

dobijeni su i kod trovanja dimetoatom (Tabela 19, Grafikon 23), kao i diazinonom kod koga je

značajnost dokazana nakon 6h (maksimalni pH=7,50) i 12h (Tabela 20, Grafikon 24).

Ukupno za sve tri etiološke grupe, promene cHCO3-(st) i ABE imale su ekvivalentan i istosmeran

trend kao i promene pH. Prosečne vrednosti ova dva parametra unutar grupe koja je dobijala


112

hidrogenokarbonat, zabeležile su očekivani porast u odnosu na nulte koncentracije. Nakon 24h

naprimer, on je bio statistički značajan (p <0,001) i iznosio za cHCO3-(st) +5,18 mmol/L, a za

ABE + 6,96 mmol/L. U većini vremenskih preseka ove koncentracije iz test grupe bile su

signifikantno veće u odnosu na one iz kontrolne grupe (Tabele 21 i 22, Grafikoni 25 i 26).

Istovremeno, sem vrednosti nakon 6h, prosečni pCO2 u obe grupe minimalno je i nesignifikantno

varirao, održavajući se u približno referentnim vrednostima: u test grupi 34,7 mmHg, a u

kontrolnoj 38,8 mmHg (Tabela 23, Grafikon 27).

Na osnovu izloženog, nedvosmisleno je zaključeno da je terapijski primenjeni hidrogenkarbonat

doveo do kontrolisanog i poželjnog stepena alkalizacije krvi, uz dostizanje maksimalnih

prosečnih vrednosti pH od 7,50. Efekat je isključivo metabolički (porast cHCO3-(st) i ABE) i

jatrogeni, bez značajnije promene pCO2, koji bi mogao uticati na rezultatni pH prema Henderson-

Hasselbalchovoj jednačini 35. Takođe, prosečne vrednosti pO2 i sO2 arterijske krvi nisu ukazivale

na evidentnu respiratornu insuficijenciju, a time ni na mogućnost da bi ona mogla biti neželjena

posledica terapije hidrogenkarbonatima (Tabele24 i 25, Grafikoni 28 i 29)

Naše vrednosti za pH krvi su u skladu sa literaturnim, gde je primenom natrijum

hidrogenkarbonata u lečenju trovanja OFI postignuta pH vrednost 7,48, dok su literaturni

prikazani parcijalni pritisci gasova (pCO2= 29,2 mmHg; pO2= 79,6 mmHg) bili niži nego u našoj

grupi bolesnika 105.

Podaci iz Tabela 26-29 i sa Grafikona 30-33 pokazuju da nije bilo statistički značajne razlike u

telesnoj temperaturi, krvnom pritisku i frekvenciji pulsa između test i kontrolne grupe, odnosno

da porast pH vrednosti krvi nije imao uticaja na navedene vitalne parametre. Pri tome je

neophodno imati u vidu istovremenu primenu kako specifične-antidotske terapije trovanja, tako i

brojnih simptomatskih i suportivnih mera lečenja koje su sprovedene kod ovih bolesnika tokom

hospitalnog tretmana.

Sumarno gledano, dobijeni rezultati pokazuju da povećanje pH hidrogenkarbonatnog pufera in

vitro dovodi do ubrzane razgradnje malationa i dimetoata, ali ne i diazinona. Takođe, upoređenju

sa standardnom terapijom, primena natrijum hidrogenkarbonata značajno ubrzava eliminaciju

malationa i dimetoata iz krvi bolesnika sa trovanjima ovim OFI invivo. Pored toga, primena


113

natrijumhidrogenkarbonata smanjuje broj dana na mehaničkoj ventilacijii vreme hospitalizacije u

odnosu na kontrolnu grupu lečenih standardnom terapijom.

Od laboratorijskih parametara, natrijumhidrogenkarbonat je značajno povećavao pH krvi, bez

negativnog sekundarnog uticaja na respiratorni status: prosečni pO2 je bio približnih vrednosti i u

granicama normale (u test grupi 85,9 mmHg, u kontrolnoj 90,1 mmHg) a prosečni pCO2 u

arterijskoj krvi pacijenata test grupe (34,7 mmHg) čak i niži u odnosu na kontrolnu grupu (38,8

mmHg).

Naši rezultati uskladu su sa eksperimentalnim i kliničkim nalazima drugih autora, koji su takođe

pokazali da natrijumhidrogenkarbonat povećava zaštitno dejstvo antidota u trovanju OF

insekticidima, kao i da smanjuje potrošnju atropina u kliničkim uslovima trovanja tim

jedinjenjima.

Navedeni efekti natrijum hidrogenkarbonata u trovanju OFI smatraju se veoma povoljnim i mogu

se pripisati regulaciji acidobazne ravnoteže, odnosno reverzije pH krvi iz zone acidemije u slabo

alkalnu sredinu koja omogućuje da se biohemijski procesi u organizmu odvijaju na mnogo

optimalniji način.

O povoljnim rezultatima hidrogenokarbonata kao dodatka u terapiji trovanjima OFI postoji i

opšta saglasnost i drugih autora. Ali, imajući u vidu nedovoljna iskustva u ovoj oblasti treba

prihvatiti stavove Buckley-a i nekih drugih autora 108,115,122 koji uvažavaju pozitivna dejstva

natrijum hidrogenkarbonata, uz napomenu da dosadašnja klinička iskustva u tom pogledu nisu

dovoljna da bi se natrijum hidrogenkarbonat uvrstio u standardnu adjuvantnu terapiju kod

trovanja OFI.

Naš stav je ipak da bi natrijum hidrogenkarbonat kao adjuvant trebalo redovno koristiti u trovanju

OFJ jer su njegova pozitivna dejstva evidentna, a da pri tome ne ispoljava praktično nikakva

neželjena dejstva. U svakom slučaju dalja sudbina primene natrijum hidrogenkarbonata u

rutinskoj praksi zavisiće od ubedljivosti njegovih efekata kod daleko većeg broja trovanja.


114

7. ZAKLJUČCI

Na osnovu rezultata ispitivanja bolesnika akutno otrovanih OFI koji su grupisani na osnovu

primenjene terapije (standardna antidotska terapija-kontrolna grupa i standardna antidotska

terapija u kombinaciji sa natrijum hidrogenkarbonatom-test grupa) izvedeni su sledeći zaključci:

Povećanje pH vrednosti hidrogenkarbonatnog pufera in vitro dovodi do ubrzane

razgradnje malationa i dimetoata, ali ne i diazinona.

Poluvreme eliminacije malationa i dimetoata iz krvi bolesnika sa trovanjima ovim

OFI nakon primene natrijum hidrogenkarbonata u kombinaciji sa standardnom

terapijom kraće je u odnosu na poluvreme eliminacije ovih supstanci nakon

primene samo standardne terapije. Primena natrijum hidrogenkarbonata nema

uticaja na brzinu eliminacije diazinona.

Primena natrijum hidrogenkarbonata ubrzava eliminaciju malationa i dimetoata,

usled skraćenja poluvremena eliminacije malationkarboksilne kiseline (MCA) iz

krvi i povećanje koncentracije alkilfosfata (DMP; DMTP i DMDTP) u urinu

bolesnika koji su lečeni natrijum hidrogenkarbonatom.

Terapijska primena natrijum hidrogenkarbonata nije značajno uticala na nivo

aktivnosti AChE i BuChE.

Potrošnja antidota (količina atropina i dužina primene pralidoksima) bila je manja

kod bolesnika lečenih natrijum hidrogenkarbonatom u odnosu na kontrolnu grupu,

bez statistički značajne razlike. Broj dana na mehaničkoj ventilaciji bio je

značajno kraći (p<0,05), i dužina hospitalizacijije granično značajno kraća

(0,1>p>0,05) kod bolesnika koji su uz standardnu antidotsku terapiju lečeni

natrijum hidrogenkarbonatom.

Od laboratorijskih parametara, natrijum hidrogenkarbonat je značajno povećavao

pH krvi, bez negativnog sekundarnog uticaja na respiratorni status.


115

Natrijum hidrogenkarbonat kao adjuvant bi trebalo redovno koristiti u trovanju

OFI (dimetoatom i malationom) jer su njegova pozitivna dejstva evidentna, a da

pri tome ne ispoljava praktično nikakva neželjena dejstva. U svakom slučaju dalja

sudbina primene natrijum hidrogenkarbonata u rutinskoj praksi zavisiće od

ubedljivosti njegovih efekata kod daleko većeg broja trovanja.


116

8. LITERATURA

1. Aaron S. Organophaspates and Carbamates. In: Clinical Toxicology. W.B. Saunders

Company (Phil); 2001: 819-34.

2. Kambiz Soltaninejad and Shahin Shadnia History of the Use and Epidemiology of

Organophosphorus Poisoning In: Basic and Clinical Toxicology of Organophosphorus

Compounds. Springer, London; 2014: 25-43.

3. Petroianu GA. Histori of organophosphorus cholinesterase inhibitors & reactivators. Mil

Med Sci Lett. 2015; 84 (4): 182-185.

4. Fukuto, TR. Mechanism of action of organophosphorus and carbamate

insecticides. Environmental Health Perspectives 1990; 87: 245-254.

5. Minić DJ. Hemija pesticida-dobijanje i primena, Beograd: Poljoprivredni fakultet; 1994.

6. Eddleston M, Clark R. Insecticides: organic phosphorus compounds and carbamates. In:

Goldfranks Toxicologic Emergencies. McGraw Hill Medica, London; 9th Ed, 2011: 1450-

1466.

7. Virgil FH, Chiou CT and Schmedding DW. Degradation of selected organophosphate

pesticides in water and soil. Journal of Agricultural and Food Chemistry 1979 27 (4):

706-708.

8. Chamberlain E, Shi H, Wang T, Ma Y, Fulmer A & Adams C. Comprehensive screening

study of pesticide degradation via oxidation and hydrolysis. Journal of agricultural and

food chemistry 2011; 60 (1): 354-363.

9. Faust SD and Gomaa HM. Chemical hydrolysis of some organic phosphorus and

carbamate pesticides in aquatic environments. Environ Lett 1972; 3 (3): 171-201.

10. Kazimierowicz ED, Roszak S and Sokalski WA. Alkaline Hydrolysis of

Organophosphorus Pesticides: The Dependence of the Reaction Mechanism on the

Incoming Group Conformation. J Phys Chem 2014; 118: 7277−7289.

11. Brogan III WR and Relyea RA. A new mechanism of macrophyte mitigation: How

submerged plants reduce malathion’s acute toxicity to aquatic animals. Chemosphere

2014; 108: 405–410.


117

12. Lai K, Stolowich NL and. Wild JR. Characterization of P-S Bond Hidrolysis in

Organophosphorothioate Pesticides by Organophosphorus Hydrolase. Arch Biochem

Biophys 1995; 318: 59-64.

13. Bender ME. The toxicity of the hydrolysis and breackdown products of malation to the

fathead minnow (pimephales, promelas, rafinesque). Water Research Pergamon Press

1969; 3: 571-582.

14. Paramveer DS, Chanchal MK, Paresh M, Ran A, Shrivastava B & Nema RK. Effective

alternative methods of LD50 help to save number of experimental animals. J Chem Pharm

Res 2010; 2 (6): 450-453

15. Blasiak J, Jaloszynski P, Trzeciak A, Szyfter K. In vitro studies on the genotoxicity of the

organophosphorus insecticide malathion and its two analogues. Mutat Res 1999; 445 (2):

275-283.

16. WHO, 2002. The World Health Report 2002. Redicing risks, promoting healthy life.

WHO, Geneva.

17. WHO, 2007. Public Health Impact of Pesticides used in Agriculture. Geneva.

18. Jokanović M. Toksikologija. Beograd: Princip-Press-Portal; 2010.

19. Mileson BE et al. Common Mechanism of Toxicity: A Case Study of Organophosphorus

Pesticides. Toxicological Sciences 1998; 41(1): 8-20.

20. Singh D K. Pesticide Chemistry and Toxicology. Bentham Science Publishers; 2012.

21. Ma Q and Lu AY. Pharmacogenetics, Pharmacogenomics and Individualized. Medicine

Pharmacol Rev 2011; 63: 437–459.

22. Pelkonen O, Turpeinen M, Hakkola J, Honkakoski P, Hukkanen J & Raunio H. Inhibition

and induction of human cytohrome P450 enzymes: curent status. Arch Toxicol 2008; 82:

667-715.

23. Jokanović M. Biotransformation of organophosphorus compounds. Toxicology 2001;

166: 139-160.

24. Enzyme Nomenclature, Recommendations of the Nomenclature Comitee of the

International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the Nomenclature and

Classification of Enzymes. San Diego (CA): Academic Press Inc; 1992.


118

25. Schenk G. Organophosphate-degrading metallohydrolases: Structure and function of

potent catalysts for applications in bioremediation. Coordination Chemistry Reviews

2016; 317: 122–131.

26. Sogorb MA and E. Vilanova. Enzymes involved in the detoxification of

organophosphorus, carbamate and pyrethroid insecticides through hydrolysis. Toxicology

Letters 2002; 128: 215–228.

27. Hatfield MJ, Umans RA, Hyatt JL, Edwards CC, Wierdl, M, Tsurkan, L et al.

Carboxylesterases: General detoxifying enzymes. Chemico-Biological Interactions 2016;

xxx : 1-5. [Article in press].

28. Reiter G. In vitro toxicokinetic studies of cyclosarin: Molecular mechanismsof

elimination. Toxicology Letters 2014; 227: 1–11.

29. Parkinson A. Biotransformation of xenobiotics. New York: McGraw-Hill; 2001.

30. Chen L, Zhao T, Pan C, Ross J, Ginevan M, Vega H et al. Absorption and excretion of

organophosphorous insecticide biomarkers of malathion in the rat: Implications for

overestimation bias and exposure misclassification from environmental biomonitoring.

Regulatory Toxicology and Pharmacology 2013; 65: 287–293.

31. Buratti FM, D'Aniello A, Volpe M, Meneguz A, Testai E. Malathion Bioactivation in the

Human Liver: the Contribution of Different Cytochrome P450 Isoforms. Drug Metab

Dispos. 2005; 33: 295-302.

32. Tetsuo U and O'Brien RD. Dimethoate degradation by human liver and its significance

for acute toxicity. Toxicology and applied pharmacology 1967; 10 (1): 89-94.

33. Sams C, Cocker J, and Lennard MS. Biotransformation of chlorpyrifos and diazinon by

human liver microsomes and recombinant human cytochrome P450s (CYP).

Xenobiotica 2004; 34 (10): 861-873.

34. Kavvalakis MP and Tsatsakis AM. The atlas of dialkylphosphates; assessment of

cumulative human organophosphorus pesticides’ exposure. Forensic Science International

2012; 218: 111–122.

35. Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE. Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular

Diagnosis, W.B. Saunders Company; 2012.

36. Marrs TC. Organophosphates: History, Chemistry, Pharmacology. In: Organophosphates

and helat. Imperial College Press, London, 2001: 1-36.


119

37. Whittaker VP. How the cholinesterases got their modernnames. Chem Biol Interact

2010;187:23-6.

38. Sagane Y, Nakagawa T, Yamamoto K, Michikawa S, Oguri S & Momonoki YS.

Molecular characterization of maize acetylcholinesterase: a novel enzyme family in the

plant kingdom. Plant Physiol 2005; 138: 1359-71.

39. Bosak A, Katalinić M, Kovarik Z. Kolinesteraze: struktura, uloga, inhibicija. Arh Hig

Rada Toksikol 2011; 62: 175-190.

40. Chen Y. Organophosphate-induced brain damage: Mechanisms, neuropsychiatric and

neurological consequences, and potential therapeutic strategies. Neuro Toxicology 2012;

33: 391–400.

41. Čolović M, Krstić D, Lazarević-Pašti T, Bondžić A, Vasić V. Acetylcholinesterase

inhibitors: Pharmacology and Toxicology. Curr Neuropharmaco 2013; 11 (3): 315-335.

42. Pohanka M. Cholinesterases, a Target of pharmacology and toxicology. Biomed Pap

2011; 155 (3): 219–230.

43. Zhou Y, Wang S and Zhang Y. Catalytic Reaction Mechanism of Acetylcholinesterase

Determined by Born−Oppenheimer Ab Initio QM/MM Molecular Dynamics Simulations.

J Phys Chem B 2010; 114 (26): 8817–8825.

44. Bennion BJ, Lau EY, Fattebert, JL, Huang P, Schwegler E, Corning W et al. Modeling

the binding of CWAs to AChE and BuChE. Mil Med Sci Lett 2013; 82(3): 102-114.

45. Tougu V. Acetylcholinesterase: mechanism of catalysis and inhibition. Current Medicinal

Chemistry-Central Nervous System Agents 2001; 1 (2): 155-170.

46. Eddleston M, Szinicz, L, Eyer P & Buckley N. Oximes in acute organophosphorus

pesticide poisoning: a systematic review of clinical trials. Qjm 2002; 95 (5): 275-283.

47. Darvesh S, Hopkins DA, Geula C. Neurobiology of butyrylcholinesterase. Nat Rev

Neurosci 2003; 4: 131-8.

48. Adler M, Manley HA, Purcell AL, Deshpande SS, Hamilton TA, Kan RK, Oyler G,

Lockridge O, Duysen EG, Sheridan RE. Reduced acetylcholine receptor density,

morphological remodeling, and butyrylcholinesterase activity can sustain muscle function

in acetylcholinesterase knockout mice. Muscle Nerve 2004; 33: 317-27.

49. Santarpia L, Grandone I, Contaldo F, Pasanisi F. Butyrylcholinesterase as a prognostic

marker: a review of the literature. J Cachexia Sarcopeni 2013; 4(1): 31–39.

http://pubs.acs.org/author/Zhou%2C+Yanzi

http://pubs.acs.org/author/Wang%2C+Shenglong

http://pubs.acs.org/author/Zhang%2C+Yingkai


120

50. Soliday FK and Conley YP. Richard Henker. Pseudocholinesterase Deficiency: A

Comprehensive Review of Genetic, Acquired, and Drug Influences. AANA Journal

2010; 78 (4): 313-20.

51. Davis L, Britten JJ, Morgan M. Cholinesterase. Its signifiance in anesthetic practice.

Anesthesia 1997; 52: 244-60.

52. Karalliede L and Henry J. The Acute Cholinergic Syndrome. In: Organophosphates and

Health. Imperial College Press, London, 2001: 109-140.

53. Brock A and Brock V. Factors Affecting Inter-individual Variation in Human plasma

Cholinesterase Activity: Body Weight, Height, Sex, Genetic Polymorphysm and Age.

Arch Environ Contam Tixicol 1993; 24: 93-99.

54. Thiermann H, Kehe K, Steinritz D, Mikler J, Hill I, Zilker T et al. Red blood

acetylcholinesterase and plasma butyrylcholinesterase status: important indicators for the

treatment of patients poisoned by organophosphorus compounds. Arh Hig Rada Toksikol

2007a; 58: 359-366.

55. Van der Schans MJ, Polhuijs M, van Dijk C, Degenhardt CE, Pleijsier, K, Langenberg JP

et al. Retrospective detection of exposure to nerve agents: analysis of phosphofluoridates

originating from fluoride-induced reactivation of phosphylated BuChE. Archives of

toxicology 2004; 78 (9): 508-524.

56. Masson P. Evolution of and perspectives on therapeutic approaches to nerve agent

posionig. Toxicol Lett 2011; 206: 5-13.

57. Sidell FR. Soman and sarin: clinical manifestations and treatment of accidental poisoning

byorganophosphates. Clin Toxicol 1974; 7: 1-17.

58. Senanayake N, Karalliedde I. Neurotoxic effects of organophosphate insecticides: an

jntermediate syndrome. N Engl J Med 1987; 316: 761-763.

59. Johnson MK. Organophosphorus esters causing delayed neurotoxic effects: Mechanism of

action and structure/activity studies. Arch Toxicol 1975; 34: 259-288.

60. Johnson MK, Jacobsen D, Meredith JT, Eyer P, Heath JA, Ligteenstein AD et al.

Evaluation of antidotes for poisoning by organophosphorus pesticides. Emerg Med 2000;

12: 22-37.

61. Topalov D, Bošković B. Aktivnost Na-K-ATP-aze u krvi zdravih odraslih osoba i u

trovanju organofosfornim insekticidima. Arh farm 1984; 34: 9-14.


121

62. Suzuki O and Watanabe K. Drugs and poisons in Humans. A handbook of Practical

Analysis. EU: Springer-Verlag Berlin Heidelberg; 2005.

63. Bertholf RL, Winecher RE. Chromatographic Methods in Clinical and Toxicology.

England: John Wiley & Sons Ltd; 2007.

64. Dulaurent S, Saint-Marcoux F, Marquet P, Lachatre G. Simulataneeous determination of

six dialkylphosphates in urine by liquid chromatography tandem masss spectrometry.

Journal of Chrmatography B 2006; 831: 223-29.

65. Katagi M, Tatasuno M, Tsuchihashi H. Determination of Malathion Metabolites in

Biological Samples by LC/MS. Jpn. J.Toxicol.Erviron.Health 1994; 40 (4): 357-64.

66. Inoue S, Saito T, Mase H, Suzuki Y, Takazawa K, Yamamoto I, Inokuchi S. Rapid

simultaneous determination for organophosphorus pesticides in human serum by LC-MS.

J Pharm Biomed Anal 2007; 44 (1): 158-64.

67. Abu-Qare AW, Abou-Donia MB. Determination of diazinon, chlorpyrifos, and their

metabolites in rat plasma and urine by high-performance liquid chromatography. J

Chromatogr Sci 2001; 39 (5): 200-4.

68. Abu-Qare AW, Abou-Donia MB. Simultaneous determination of malathion, permethrin,

DEET (N,N-diethyl-m-toluamide), and their metabolites in rat plasma and urine using

high performance liquid chromatography. J Pharm Biomed Anal 2001; 26 (2): 291-9.

69. Polettini A. Applications of LC-MS in Toxicology. LondonChicago: Pharmaceutical

Press; 2006.

70. Zlatković M, Jovanović M, Đorđević D, Vučinić S. Brzo simultano određivanje

organofosfornih pesticida u humanom serumu i urinu metodom tečne hromatografije sa

masenom spektrometrijom. Vojnosanit Pregl 2010; 67 (9): 717-722.

71. Salma P, Taylora PJ, Roberts D, de Silvad J. Liquid chromatography–tandem mass

spectrometry method for the simultaneous quantitative determination of the

organophosphorus pesticides dimethoate, fenthion, diazinon and chlorpyrifos in human

blood. J Chromatogr B 2009; 877: 568–574.

72. Tarbah FA, Shaheen AM, Benomran FA, Hassan AI, Daldrup T. Distribution of

dimethoate in the body after a fatal organphosphateintoxication. Forensic Science

International 2007; 170: 129–132.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Inoue%20S%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Saito%20T%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Mase%20H%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Suzuki%20Y%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Takazawa%20K%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Yamamoto%20I%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Inokuchi%20S%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://lib.bioinfo.pl/auth:Abu-Qare,AW

http://lib.bioinfo.pl/auth:Abou-Donia,MB

http://lib.bioinfo.pl/pmid:11348030


http://lib.bioinfo.pl/auth:Abu-Qare,AW

http://lib.bioinfo.pl/auth:Abou-Donia,MB





122

73. Dulaurent S, Moesch C, Marquet P, Gaulier JM, Lachâtre G. Screening of pesticides in

blood with liquid chromatography–linear ion trap mass spectrometry. Anal Bioanal Chem

2010; 396: 2235–2249.

74. Garcia-Repetto R, Giménez MP, Repetto M. New Method for Determination of Ten

Pesticides in Human Blood. Journal of AOAC International 2001; 84: 342-349.

75. Yucra S, Steenland K, Chung A, Choque F and Gonzales GF. Dialkyl phosphate

metabolites of organophosphorus in applicators of agricultural pesticides in Majes –

Arequipa (Peru). J Occup Med Toxicol 2006; 1: 27.

76. Tsatsakis AM, Barbounis MG, Kavalakisa M, Kokkinakis M, Terzi I, Tzatzarakis MN.

Determination of dialkyl phosphates in human hair for the biomonitoring of exposure to

organophosphate pesticides. J Chromatogr B 2010; 878: 1246–1252.

77. Aprea C, Sciarra G, Lunghini L. Analitycal Method for the Determination of Urinary

Alkylphosphates in Subjects Occupationall Exposed to Oranophosphorus Pesticides and

in the General Populatipn. Journal of Analytical Toxicology 1996; 20: 559-563.

78. Tarbah FA, Kardel B, Pier S, Temme O, Daldrup T. Acute Poisoning with

Phosphamidon: Determination of Dimethyl Phosphate (DMP) as a Stable Metabolite in a

Case of Organophosphate Insecticide Intoxication. Journal of Analytical Toxicology,

2004; 28: 198-203.

79. Kupfermann N, Schmoldt A, Steinhart H. Rapid and Sensitive Quantitative Analysis of

Alkyl Phosphates in Urine after Organophosphate Poisoning. Journal of Analytical

Toxicology 2004;28: 242-248.

80. Lin WC, Kuei CH, Wu HC, Yang CC, Chang HY. Method for the Determination of

Dialkyl Phosphates in Urine by Strong Anion Exchange Disk Extraction and In-Vial

Derivatization. Journal of Analytical Toxicology 2002; 26: 176-180.

81. Barr DB, Bravo R, Weerasekera G, Caltabiano LM, Whitehead RD, Olsson AO et al.

Concentrations of Dialkyl Phosphate Metabolites of Organophosphorus Pesticides in the

U.S. Population. Environmental Health Perspectives 2004; 112: 186-200.

82. De Alwis GKH, Needham LL, Barr DB. Determination of Dialkyl Phosphate Metabolites

of Organophosphorus Pesticides in Human Urine by Automated Solid-Phase Extraction,

Derivatization, and Gas Chromatography–Mass Spectrometry. Journal of Analytical

Toxicology 2008; 32: 721-727.


123

83. Herna´ndez F, Sancho JV, Pozo OJ. Direct determination of alkyl phosphates in human

urine by liquid chromatography/electrospray tandem mass spectrometry. Rapid Commun

Mass Spectrom 2002; 16: 1766-1773.

84. Odetokun MS, Montesano MA, Weerasekera G, Whitehead RD, Needham LL, Barr DB.

Quantification of dialkylphosphate metabolites of organophosphorus insecticides in

human urine using 96-well plate sample preparation and high-performance liquid

chromatography–electrospray ionization-tandem mass spectrometry. J Chromatogr B

2010; 878: 2567–2574.

85. Wu C, Liu P, Zheng L, Chen J, Zhou Z. GC-FPD measurement of urinary

dialkylphosphate metabolites of organophosphorous pesticides as pentafluorobenzyl

derivatives in occupationally exposed workers and in a general population in Shanghai

(China). J Chromatogr B, 2010; 878: 2575–2581.

86. Gayanga W, Kimberly DS, Larry LN, Dana BB. A Rapid, Cost-Effective Method for

Analyzing Organophosphorus Pesticide Metabolites in Human Urine for Counter-

Terrorism Response. Journal of Analytical Toxicology 2008; 32: 106-115.

87. Heath JA. Antidotes for poisoning by organophosphorus pesticides. Monograph on

Atropine. http://www.intox.org/databank/documents/antidote/atropine.htm, 2002.

88. Aaron CK. Organophosphates and carbamates. In: Clinical toxicology. W.B.Saunders

Company, Philadelphia, 2001: 819-828.

89. Howland AM. Pralidoxime. In: Goldfranks Toxicologic Emergencies. McGraw Hill

Medical, London; 9th Ed, 2011b: 1467-1472.

90. Blain P. Organophosphorus poisoning (acute). Clinical Evidence 2011; 05: 2102, pp. 1-

17.

91. Eyer P, Buckley N. Pralidoxime for organophosphate poisoning. Lancet 2006; 368: 2110-

2111.

92. Worek F, Kirchner T, Backer M, Szinicz L. Reactivation by various oximes of human

erythrocyte acetylcholinesterase inhibited by different organophosphorus compounds.

Arch Toxicol. 1996; 70 (8): 497-503.

93. de Jong LP, Worling GZ. Stereospecific reactivation by some Hagedorn-oximes of

acetlycholinesterases from various species, including man, inhibited by soman. Biochem

Pharmacol 1984; 33: 1119-25.

http://www.intox.org/databank/documents/antidote/atropine.htm


124

94. Sundwall A. Minimum concentrations of N-methylpyridinium-2-aldoxime methane

sulphonate (P2S) which reverse neuromuscular block. Biochem Pharmacol 1961; 8: 413-

417.

95. Worek F, Thiermann H, Szinicz L, Eyer P. Kinetic analysis of interactions between

human acetylcholinesterase, structurally different organophosphorus compounds and

oximes. Biochem Pharmacol 2004; 68 (11): 2237-2248.

96. Eddleston M, Eyer P, Worek F, Jusczczak, Alder N, Mohamed Fet al. Sheriff RHM,

Buckley N. Pralidoxime in Acute Organophosphorus Insecticide Poisoing-A Randomized

Controlled Trial. PLoS Medicine 2009a; 6: 1-12.

97. Victor PJ, Moran JL, Pichamuthu K, Chacko B. Adjuncts and alternatives to oxime

therapy in organophosphate poisoning – is there evidence of benefit in human poisoning?

Anaesth Intensive Care 2008; 36 (3): 339-50.

98. Vale AJ, Scott WG. Organophosphorus poisoning. Guy’s Hospital Rep 1974; 123: 13-25.

99. Okonek S, Kiblinger H. Determination of acetylcholine, nitrostigmine and

acetylcholinesterase activity in four patients with severe nitrostigmine (E 605 forte)

intoxication. Arch Toxicol 1974; 36: 43-51.

100. Coult BD, Howells JD, Smith PA. Cyclic nucleotide concentrations in the brains of mice

treated with the convulsant byciclic organophosphate, 4-isopropyl-2,6,7-troixa-1-

phosphabicyclo (2,2,2) octane. Biochem Pharmacol 1979; 28: 193-196.

101. Garcia-Repetto R, Martinez DE, Repetto M. The influence of pH on the Degradation

Kinetics of Some Organophosphorus Pesticides in Aqueous Solutions. Vet Human

Toxicol 1994; 36: 202-204.

102. Jeevarathinam K, Ghosh KA, Srinivasan A, Das Gupta S. Pharmacokinetics of

pralidoxime chloride and its correlation to therapeutic efficacy against diisopropyl

fluorophosphates intoxication in rats. Pharmazie 1988; 43: 114-115.

103. Stefanović D, Antonijević B, Bokonjić D, Stojiljković PM, Milovanović AZ, Nedeljković

M. Influence of sodium bicarbonate and standard antidotes on acid-base status in rats

poisoned with dichlorvos. Jugoslav Med Bohem 2004; 23: 165-170.

104. Stefanović D, Antonijević B, Bokonjić D, Stojiljković PM, Milovanović AZ, Nedeljković

M. Effect of Sodium Bicarbonate in Rats Acutely Poisoned with Dichlorvos. Basic Clin

Pharmacol Toxicol 2006; 98: 173-180.


125

105. Balali-Mood M, Ayati MH, Ali-Akbarian H. Effect of High Doses of Sodium Bicarbonate

in Acute Organophosphorus Pesticide Poisoning. Clin Toxicol 2005; 43: 571-4.

106. Balali-Mood M, Afshari R, Kahrom M, Ayati MH, Yare G. Use of high doses of sodium

bicarbonate in acute organophosphorus pesticide poisoning is advancing. Letter to the ed.

Clin Toxicol 2007; 45: 92-3.

107. Vučinić S, Ercegović G, Đorđević D, Jovanović M, Vukčević-Perković N, Potrebić O,

Zlatković M. What are the Clinical Significance of Oxime and Sodium Bicarbonate

Therapy for Acute Organophosphate Poisoning. Rad saopšten na: Szmposium on Medical

Management of Chemical and Biological Casualities. Sofia, 27-28 april 2009. Zbornik

radova (Ur.: Tonev S, Kanev K, Dishovsky C). Izdavač IRITA, Sofia 2009: 128-135.

108. Roberts DM, Buckley N. Alkalinisation for organophosphorus pesticide poisoning.

Cohrane Database of Systematic Reviews 2005, Isswue 1. Art No.: CD004897. DOI:

10.1002/14651858.CD00-4897.pub.2

109. Gal J. And Roth E. Spectrophotometric Methods for Determination of Cholinesterase

Activity. Clin Chim Acta 1957; 2: 316-326.

110. Westgard JO, Hund MR, Lahmeyer BL. Estimates of Normal Ranges for 15

Determinations on the Du Pont Pont Automatic Clinical Analyzer, Dept. of Medicine and

Clinical Laboratories, University of Wisconsin Center for Health Science, Madison, WI.

Siemens Healthcare Diagnostics U.S.A, 2003.

111. Roberts D, Karunarathna A, Buckley N et al. Influence of pesticide regulation on acute

poisoning deaths in Sri lanka. Bull World Health Organ 2003; 81: 789-798.

112. Gunnell D, Eddleston M, Phillips MR, Konradsen F. The global distribution of fatal

pesticide self-poisoning: systematic review. BMC Public Health

2007;7:357.DOI:10.1186/1471-2458-7-357.

113. Michel K, Ballinari P, Bille-Brahe U, Bjerke T, CrepetP, De Leo D, Haring C, Hawton C,

Hawton K, Kerkhof A, Lonnquist J, Querejeta I, Salander-Renberg E, Schmidtke A,

Temesvary B, Wasserman D. Methods used for parasuicide:results of the WHO/EURO

Multicentre Study on Parasuicide. Soc Psychiatry Psychiatr Epidemiol 2000; 35: 156-163.

10.1007/s001270050198.

114. Vojnomedicinska akademija, Beograd. Godišnjak Centra za kontrolu trovanja 2014. ISSN

2217-6357.


126

115. Eddleston M, Eyer P, Worek F, Mohamed F. Differences between organophosphorus

insecticides in human self-poisoning: a prospective cohort study. Lancet. Oct 2005; 366

(9495): 1452-9.

116. King AM, Aaron CK. Organophosphate and Carbamate Poisoning. Emerg Med Clin Am

2015;33:133-151.http://dx.doi.org/10.1016/j.emc.2014.09.010

117. Abedin MJ, Sayeed AA, Basher A, Maude RJ, Hogue G, Faiz MA. Open-label

randomized clinical trial of atropine bolus injection versus incremental boluses plus

infusion for organophosphate poisoning in Bangladesh. J Med Toxicol 2012; 8 (2): 108-

117. doi:10.1007/s13181-012-0214-6.

118. Blain PG. Organophosphate poisoning (acute). Clinical Evidence 2011; 05:2102.BMJ

Publishing Group Ltd 2011.

119. Cordoba D, Cadavid S, Angulo D, Ramos I. Organophosphate poisoning: modifications

in acid base equilibrium and use of sodium bicarbonate as an aid in the treatment of

toxicity in dogs. Veterinary and human toxicology 1983; 25 (1): 1-3.

120. Wong A, Sandron CA, Magalhaes AS, Rocha LCS. Comparative efficacy of pralidoxime

vs sodium bicarbonate in rats and humans severely poisoned with OP pesticide. J Toxicol

Clin Toxicol 2000; 38 (5): 554-5.

121. Roberts DM, Buckley N. Alkalinisation for organophosphorus pesticide poisoning.

Cohrane Database of Systematic Reviews 2005, Isswue 1. Art No.: CD004897. DOI:

10.1002/14651858.CD00-4897.pub.2

122. Balali-Mood M, Balali-Mood K, Shirazi FH. Recent Advances in Treatment of Acute

Organophosphorus Nerve Agents Poisoning. Iranian Journal of Pharmaceutical Research

2006; 2:79-87.

123. Young K, Chang JL, Cheng SC. Effect of solution pH on the hydrolysis and photolysis of

diazinon in aqueous solution. Water, Air, and Soil Pollution 1998; 108 (3-4): 445-456.

124. Moffat A, Osselton MD and Widdop B. Clarke´s Analysis of Drugs and Poisons. London

Chiacago: Pharmaceutical Press; 2011

125. Jack L, Taylor H, Ackerman B. A case report of intravenous malathion injection with

determination of serum half-life. Journal of Toxicology: Clinical Toxicology 1987; 25

(3): 243-249.


127

126. Ekwall B, Clemedson C, Löving T, Sandler H, Bondesson I. Malathion, MEIC

Monograph No. 15. 1996.

127. Park MJ, In SW, Lee SK, Choi WK, Park YS, Chung HS. Postmortem blood

concentrations of organophosphorus pesticides. Forensic science international 2009; 184

(1): 28-31.

128. Seth V, Banerjee BD, Ahmed RS, Bhattacharya A, Pasha ST. Alterations in

immunoglobulins and cytokine levels in blood of malathion poisoning cases. Indian

journal of biochemistry & biophysic 2008; 45 (3): 209.

129. Konrad JG, Chesters G, Armstrong DE. Soil degradation of malathion, a

phosphorodithioate insecticide. Soil Science Society of America Journal 1969; 33 (2):

259-262.

130. Wolfe NL, Zepp RG, Gordon JA, Baughman GL, Cline DM. Kinetics of chemical

degradation of malathion in water. Environmental Science & Technology 1977; 11 (1):

88-93.

131. Eddleston M, Gunnell D, von Meyer L, Eyer P. Relationship between blood alcohol

concentration on admission and outcome in dimethoate organophosphorus self-poisoning,

Br J Clin Pharmacol 2009; 68 (6): 916-9.

132. Davies J, Roberts D, Eyer P, Buckley N, Eddleston M. Hypotension in severe dimethoate

self-poisoning. Clinical toxicology 2008; 46 (9): 880-884.

133. Kojima T, Yashiki M, Ohtani M, Chikasue F, Miyazaki T. Determination of dimethoate

in blood and hemoperfusion cartridge following ingestion of formothion: a case

study. Forensic science international 1990; 48 (1): 79-88.

134. Nagler J, Braeckman RA, Willems JL, Verpooten GA, De Broe ME. Combined

hemoperfusion‐hemodialysis in organophosphate poisoning. Journal of Applied

Toxicology 1981; 1 (4): 199-201.

135. Ulrich H, and Papendorf T. Organophosphate poisonings with parathion and dimethoate.

Intensive care medicine 2006; 32 (3): 464-468.

136. Dahlgren JG, Takhar HS, Ruffalo CA, Zwass M. Health Effects of Diazinon on a Family.

Clinical Toxicology 2004; 42 (5): 579-591.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Eddleston%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20002086

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Gunnell%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20002086

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=von%20Meyer%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20002086

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Eyer%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20002086

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20002086


128

137. Dulaurent S, Gaulier JM, Blanc-Lapierre A, Imbert L, Lachâtre G. Urinary determination

of 2-isopropyl-4-methyl-6-hydroxypyrimidine in case of non fatal poisoning with

diazinon. Forensic science international 2013; 228 (1): e20-e24.

138. Garfitt SJ, Jones K, Mason HJ, Cocker J. Exposure to the organophosphate diazinon: data

from a human volunteer study with oral and dermal doses. Toxicol. Lett 2002; 134: 105-

113.

139. Salm P, Taylor PJ, Roberts D, de Silva J. Liquid chromatography–tandem mass

spectrometry method for the simultaneous quantitative determination of the

organophosphorus pesticides dimethoate, fenthion, diazinon and chlorpyrifos in human

blood. J Chromatogr B 2009; 877: 568-574.

140. Poklis A, Kutz FW, Sperling JF, Morgan DP. A fatal diazinon poisoning. Forensic Sci Int

1980; 15: 135-140.

141. Garfitt SJ, Jones K, Mason HJ, Cocker J. Exposure to the organophosphate diazinon: data

from a human volunteer study with oral and dermal doses. Toxicol Lett 2002; 134: 105-

113.

142. Thiermann H, Worek F, Eyer P, Eyer F, Felgenhauer N, Zilker T. Obidoxime in acute

organophosphate poisoning: 2-PK/PD frelationships. Clin Toxicol 2009; 47: 807-813.

143. Thierman H, Zilker T, Eyer F, Felgenhauer N, Eyer P, Worek F. Monitoring of

neuromuscular transmission in organophosphate pesticide-poisoning. Toxicol Lett 2009;

191: 297-304.

144. Thiermann H, Steinritz D, Worek F, Radtke M, Eyer P, Eyer F, Felgenhauer N, Zilker T.

Atropine maintenance dosage in patients with severe organophosphate pesticide

poisoning. Toxicol Lett 2011; 206: 77-83.

145. Coy JM, Barnett GP, Midtling EJ, Velasco RA, Romero P, Clements LC, Rose GT.

Clinical Confirmation of Organophosphate Poisoning by Serial Cholinesterase Analysis.

Arch Intern Med 1987; 147: 438-442.

146. Taylor P. Anticholinesterase Agents. In: Goodman and Gilman’The Pharmacological

Basis of Therapeutics. McGraw Hill Medical, London, 2011: 239-254.

147. Cannard D. The acute treatment of nerve agent exposure. J Neurol Sci 2006; 249: 86-94.


129

148. Cerasoli DM, Griffits EM, Doctor BP, Saxena A, Fedorko JM, Greig NH et al. In vitro

and in vivo characterization of recombinant human butyrylcholinesterase (Protexia) as a

potent nerve agent scavenger. Chem Biol Interact 2005; 157-158: 363-5.

149. Bošković B, Vučinić S. Antidoti u trovanjima organofosfornim insekticidima. U: Antidoti

u kliničkoj praksi, Slavica Vučinić [et al]. Beograd, Čigoja štampa, 2012 Beograd, 341

str. ISBN 978-86-7558-946-4 a) Protivotrovi COBISS.SR-ID 195139852.

150. Sánchez LH, Medina OM, Gómez G, González CI, Flórez-Vargas Ó. Laboratory genetic-

based reference values for cholinesterase activity in a Colombian population: A step

forward in personalized diagnostics. Biomédica 2015; 35 (2): 20-9.

151. Fanzca L, Balabaskaran S, FFarcs A.D, Ong L.H. Blood cholinesterase levels in a group

of Malaysian blood donors. Malaysian J Pathol 1994; 16 (2): 161-164.

152. Lepage L, Schiele F, Gueguen R, and Slest G. Total Cholinesterase in Plasma: Biological

Variations and Reference Limits. Clin Chem 1985; 31(4): 546-550.

153. McKay AC, Hart K, McDonagh J. Potential Utility of Plasma Butyrylcholinesterase and

RBC Acetylcholinesterase as Rule-Out Testing in the Screening of Nerve Agent or

Organophosphate Mass Exposure. Clin Toxicol 2011; 49: 261.

154. Roberts DM, Aaron CK. Managing acute organophosphorus pesticide poisoning. BMJ

2007; 334: 629-634.

155. Zlatković M, Krstić N, Subota V, Bošković B, Vučinić S. Determination of reference

values of acetyl and butyryl cholinesterase activities in Serbian healthy population. Vojno

sanit Pregl 2017; 74 (8): xxx [Article in press].

Documents

Vojnomedicinska akademija · Tioestarski vezani radikali iz ove grupe jedinjenja mogu biti estri ili amidi karboksilnih kiselina, alkil amini, tioetri, supstituisani benzil radikali