1

Viskozimetrinis želatinos izoelektrinio taško nustatymas Laboratorinis darbas Deivis Plaušinaitis

Darbo tikslas Nustatyti biopolimero (želatinos) izoelektrinį tašką pI, matuojant tirpalo klampą. Teorinė dalis

Skysčių klampa, kartais vadinamas vidine trintimi, yra skysčio pasipriešinimas judėjimui, veikiant išorinei jėgai. Vidinę trintį skysčiuose sąlygoja tarpmolekulinės traukos jėgos. Laminariniame judėjime kiekvienas skysčio sluoksnis juda skirtingu greičiu – greičiausiai vidurinis, o lėčiausiai – kraštutiniai (1 paveikslas).

Klampa – būdinga stambiamolekulinių medžiagų (polimerų) tirpalų savybė. Net praskiesti šių medžiagų tirpalai yra mažai takūs palyginti su grynu tirpikliu.

Klampai matuoti naudojami trys pagrindiniai metodai: kapiliarinis, rotacinis ir krintančio rutuliuko. Šiais metodai dažniausiai nustatoma ne absoliuti, o santykinė klampa ηsan, palyginama su tirpiklio, dažniausiai vandens, klampa. Kapiliariniu metodu nustatomas laikas, per kurį išteka standartinio to ir tiriamojo tirpalo tx apibrėžtas kiekis pro siaurą kapiliarą. Taip pat žinant abiejų skysčių tankius, galima apskaičiuoti tiriamo skysčio (ar tirpalo) klampą:

o

x

oo

xx

o

xsan t

ttt

(1)

Specifinė (savitoji) klampa apskaičiuojama iš santykinės atimant 1:

ηsp = ηsan -1 (2)

Tikroji (būdingoji) [η] klampa apskaičiuojam pagal lygtį:

o

x

c

sp

c cc

ln1limlim][00

(3)

čia c – polimero koncentracija g/100 mL tirpale. Toks metodas taikomas labai atskiestoms,

t.y. mažai klampioms sistemoms. 2 paveiksle (A) pateiktas kapiliarinio viskozimetro (Ostwald‘o), kuris dažnai naudojamas tyrimo laboratorijose, vaizdas.

Krentančio rutuliuko viskozimetru (Höppler‘io) (2pav. B), kaip ir kapiliariniu, taip pat nustatomas laikas, per kurį specialus rutuliukas nukrenta gryname tirpiklyje to ir tiriamajame

1 pav.: skysčio, pvz. vandens, „vidinės trinties“ modelis; v1, v2 ir v3 skysčio sluoksnių judėjimo greičiai.

A B

2 pav.: Viskozimetrai

vienas skysčio sluoksnis

v1

kitas skysčio sluoksnis

v2

v3

Kieta medžiaga (pvz. stiklinė indo sienelė)

2

tirpale tx. Tačiau Höppler‘io viskozimetru gali būti nustatoma ir absoliuti dinaminė klampa. Rutuliukas, veikiamas žemės traukos jėga, tam tikru kampus juda tiriamajame skystyje ir tokiu būdu, užfiksavus laiką per kurį jis įveikė fiksuotą atstumą, apskaičiuojama klampa η [mPa∙s]:

η = t (1 - 2) K F (4)

kur t – rutuliuko kritimo (skendimo) laikas tiriamajame skystyje, [s]; 1 – rutuliuko tankis, [g/cm3]; 2 – skysčio tankis, [g/cm3]; K – rutuliuko konstanta [mPa∙ cm3/g]; F – viskozimetro darbinio kampo konstanta (šiame darbe apytikriai lygi 1).

Stambiamolekulinių medžiagų tirpalų klampa skiriasi nuo mažos molekulinės masės tirpalų ir koloidų klampos. Šių sistemų klampa laminarinio judėjimo metu, didėjant slėgiui, iš pradžių mažėja po to, pasiekus tam tikrą ribą, kurį laiką nekinta, o turbulentinio judėjimo srityje vėl auga. Tokias sistemos savybes galima paaiškinti molekulių ir dalelių forma. Praskiestuose tirpaluose didelės molekulės, arba koloidinės dalelės, gali nevienodai priešintis skysčio tėkmei. Tai priklauso nuo to, kaip dalelės yra išsidėsčiusios erdvėje: esančios statmenai tėkmei - sudaro didžiausią pasipriešinimą, išsidėsčiusios išilgai tėkmės – mažiausią pasipriešinimą. Didinant slėgį didėja tirpalo tekėjimo greitis, ilgos molekulės ir dalelės orientuojasi tekėjimo kryptimi ir tirpalo klampa mažėja. Stambiamolekulinių medžiagų tirpaluose molekulės yra siūlo pavidalo ir net praskiestuose tirpaluose jos veikia tarpusavyje sudarydamos agregatus taip pat imobilizuodamos savyje tirpiklio molekules. Dėl to stambiamolekulinių medžiagų tirpalų klampa yra didesnė nei numato Niutono ir Puazelio lygtys, pritaikytos mažamolekuliniams tirpalams. Didėjant ištirpintos medžiagos molekulinei masei, pailgėja molekulės, jos tampa lankstesnės, gali susisukti, susilankstyti ir rodo mažesnį pasipriešinimą tekėjimui.

Polimerų tirpalų klampa visada mažėja, kylant temperatūrai ir tuo labiau esant didesnei tirpalo koncentracijai. Tokia priklausomybė aiškinama tuo, kad kylant temperatūrai suintensyvėja molekulių judėjimas ir pasunkėja struktūrų susidarymas. Kai kada temperatūros pakilimas sukelia polimerų destrukciją. Polimerų tirpalų klampai turi įtakos nedideli kiekiai elektrolitų ir tirpalų pH. Jie pakeičia molekulių tarpusavio veikimą ir molekulių polinių grupių hidrataciją (baltymai, polielektrolitai), dėl to pakinta molekulių forma tirpaluose ir tirpalų klampa.

Želatina – baltyminės prigimties gamtinis polimeras (3 pav. (A)), priskiriamas prie taip vadinamų polielektrolitų klasės. Želatina išgaunama iš gyvūnų jungiamojo audinio baltymo kolageno (3 pav. (B)), vykdant jo hidrolizę (3 pav. (C)). Kadangi želatinos molekulės šoninėse atšakose yra ir bazinių (-NH2) ir rūgštinių (-COOH) funkcinių grupių, ją galima priskirti prie polimerinių amfoterinių junginių (poliamfolitų).

(A)

(B)

(C)

3 pav.: (A) želatinos struktūrinės formulės fragmentas; (B) kolageno molekulės fragmento modelis; (C) kolageno hidrolizės iki želatinos schema.

kolagenas želatina

3

Ištirpinus poliamfolitą vandenyje dalis šių funkcinių grupių jonizuojasi, tokiu atveju, jeigu tarkime molekulėje dominavo -NH2 grupės, tirpale gali susidaryti teigiamo krūvio medžiagos dalelės:

H2N

H2N NH2

C O

OH

CO

OH

+H3N

NH 3+

C O

O -

CO

O-

+H3N

Keičiant želatinos tirpalo terpės pH, keičiai ir želatinos molekulių krūvis. Esant tam tikram

tirpalo pH gali jonizuotis-dejonizuotis tik dalis molekulėje esančių -NH2 (arba -COOH) funkcinių grupių. Tokiu būdu tirpale gali susidaryti neutralios, t.y. turinčios bendrą nulinį krūvį dalelės. Pavyzdžiui, jeigu poliamfolito molekulėje dominavo -NH2 grupės, neutralių dalelių būvį galima pasiekti padidinus tirpalo pH, pridedant OH- jonų:

+H3N

NH 3+

C O

O -

CO

O-

+H3N

H2N

+H3N

NH3+

C O

O -

CO

O-

Tokia poliamfolito tirpalo pH reikšmė vadinama izoelektriniu tašku pI, o medžiagos būsena, kuomet tirpale jos molekulės yra neutralios, vadinama izoelektrine. Yra nustatyta, kad izoelektriniame taške želatinos tirpalo klampa yra mažiausia. Tai paaiškinama tuo: kai dalelė yra neutrali ji tampa labiausiai kompaktiška dėl to, sumažėjus tarpusavio sąveikai tarp želatinos molekulių, sumažėja ir tirpalo „vidinė trintis“. Keičiant tokio tirpalo pH tiek į didesnę tiek ir į mažesnę reikšmę nuo izoelektrinio taško, tirpalo klampa didėja.

Klausimai, ruošiantis atlikti šį darbą.

Paaiškinkite tirpalo klampos sąvoką. Nuo kokių veiksnių priklauso tirpalo klampa? Kokiais būdais galima išmatuoti tirpalų klampą? Kokie yra klampos vienetai? Paaiškinkite kas yra medžiagų amfoteriškumas? Kodėl želatina yra amfoterinė medžiaga? Kas yra tirpalo pH? Kas yra buferinis tirpalas? Paaiškinkite sąvoką „izoelektrinis taškas“. Kokią įtaką želatinos tirpalo klampai daro tirpalo pH kitimas?

Darbo priemonės ir medžiagos. Krentančio rutuliuko (Höppler‘io) viskozimetras, chronometras (arba kitoks laiko matavimo įrenginys), pH-metras, laboratorinis stovas, 9 matavimo kolbutės (50 mL), 200 mL stiklinė, 50 mL stiklinė, dvi 10 mL graduotos pipetės, 5 mL pipetė, piltuvėlis, filtravimo popierius, 0,2 mol/L tirpalas CH3COOH, 0,2 mol/L tirpalas CH3COONa tirpalas, želatina, distiliuotas vanduo. Darbo eiga.

1. Paruošiama 300 mL 1,25 % želatinos tirpalo distiliuotame vandenyje. Atsveriamas želatinos

svėrinys ir brinkinamas 20-30 minučių šaltame vandenyje. Po to šildant vandens vonioje

OH-

H2O

4

maišoma, kol ištirps. Karštas želatinos tirpalas filtruojamas ir atvėsinamas iki kambario temperatūros.

2. Paruošiami 9, skirtingo pH, buferiniai tirpalai. Tuo tikslu devyniose kolbutėse skirtingais santykiais sumaišomi 0,2 mol/L CH3COOH, ir 0,2 mol/L CH3COONa tirpalai:

Kolbutės Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0,2 mol/L CH3COOH tūris, mL

27 24 21 18 15 12 9 6 3

0,2 mol/L CH3COONa tūris, mL

3 6 9 12 15 18 21 24 27

3. Į visus pagamintus buferinius tirpalus įpilama po 15 mL želatinos tirpalo ir atidžiai

išmaišome. 4. Išmatuojamos visų tirpalų pH reikšmės; 5. Eksperimentus atliekame pradedant vandens klampos matavimais; 6. Išplauname viskozimetrą distiliuotu vandeniu (4 pav. pateikta bendra viskozimetro schema):

atsukame viršutinį dangtelį (16) ir nuėmę metalinį kamštelį su tarpine (15) išimame sifoną (12); atsargiai pasukę viskozimetro pagrindinę dalį į šoną, į stiklinę išpilame vandenį; grąžiname viskozimetrą į pradinę padėtį; atsukame apatinį dangtelį (10) ir išimame metalinį kamštuką (8) ir matavimo rutuliuką (2). Rutuliuką su specialiu pincetu atsargiai įdedame į dėžutę. Pastaba: su stikliniu matavimo rutuliuku reikia elgtis labai atsargiai nes jis yra trapus! Nepatartina jį, netgi, liesti pirštai, o perkeliant ar įdedant į viskozimetrą naudojamas specialus pincetas. Perkeliant rutuliuką visuomet stenkitės tai atlikti virš stalo arba iš apačios saugokite ranka. Tokioje padėtyje viskozimetras yra paruoštas praplovimui: pastatę po apatine viskozimetro dalimi tuščią stiklinę, pro viršutinę dalį pildami vandenį praplauname vidinę stiklinio vamzdžio (1) sienelę.

7. Užpildome viskozimetrą tiriamuoju skysčiu: užsukame apatinį dangtelį (10), prieš tai uždėję metalinį kamštuką su tarpine (8); pripilame į viskozimetrą tiriamojo skysčio ~40 mL; Labai atsargiai įdedame matavimo rutuliuką (2); Įstatome metalinį kamštelį (15) su sifonu (12) ir užsukame viršutinį dangtelį (16); Tokiu būdu vidiniame viskozimetro vamzdelyje neturi likti oro! Pastaba: užpylus tiriamąjį skystį ir įstačius matavimo rutuliuką prie jo neturėtų būti prilipusių burbuliukų, nes

4 pav.: krentančio rutuliuko (Höppler) viskozimetro schema.

5

jie iškreips klampos matavimo rezultatus. Jei taip įvyko, rekomenduojama apversti viskozimetro pagrindinę dalį, leidžiant rutuliukui nuskęsti bent vieną kartą žemyn.

8. Patikriname gulsčiuką (7), ar viskozimetras teisingai sureguliuotas pagal horizontą; Jei ne – sukiodami kojeles (11) sureguliuojame viskozimetrą Viskozimetras paruoštas matavimui.

9. Paruošiame chronometrą. Pasukę ir užfiksavę viskozimetro pagrindinę dalį 180o, leidžiame matavimo rutuliukui (2) judėti žemyn. Kuomet rutuliuko apačia pasieks pirmą atžymą (A), pradedame laiko matavimą. Laiko matavimą sustabdome, kai rutuliuko apačia pasieks trečią atžymą (B). Užsirašome išmatuotą laiką.

10. Pakartojame rutuliuko judėjimo laiko matavimą dar du kartus kiekvieną kartą paversdami viskozimetrą 180o; užsirašome gautus rezultatus ir suskaičiuojame vidurkį tH2O.

11. Išmatuojame rutuliuko judėjimo greitį 1-me želatinos tirpale. Tuo tikslu atsargiai išpilame iš viskozimetro vandenį kaip aprašyta 6-me punkte; užpildome ir paruošiame viskozimetrą matavimams kaip aprašyta 7 ir 8 punktuose; atliekame matavimus kaip aprašyt 9 punkte.

12. Tokiu pat būdu išmatuojame likusių želatinos tirpalų ištekėjimo laikus. Pastaba: kiekvieną kartą išpylus iš viskozimetro panaudotą tirpalą, viskozimetrą iš karto būtina praplauti karštu distiliuotu vandeniu. Prieš supilant naują tirpalą, viskozimetrą būtina atvėsinti kambario temperatūros distiliuotu vandeniu (kodėl?).

13. Užsirašome eksperimento vykdymo temperatūrą T. Rezultatų apskaičiavimas ir fazinės diagramos gavimas 14. Iš nustatytų ištekėjimo laikų, pritaikę lygtis (1) ir (2) apskaičiuojame visų želatinos tirpalų

specifines klampas sp; duomenis surašome į lentelę. 15. Braižome grafiką: abscisių ašyje atidedame tirpalo pH, ordinačių ašyje - tirpalo specifinę

klampą sp. 16. Per pažymėtus taškus nubrėžiame labiausiai atitinkančią kreivę. Pirmu priartėjimu dalis šios

kreivės turėtų būti panaši į parabolę. Pastaba: kreivę nubrėžti galima pasinaudojus MsExcell programos komanda „Add Trendline...“, kurią išsikviesti galima kairiuoju pelytės klavišu spustelėjus ant duomenų taško esančio grafike; „Trend/Regression type“ išsirinkite „polynomial order 2“.

17. Surandame gautos kreivės minimumo taško X ir Y koordinates. Šio taško pH reikšmė atitinka želatinos izoelektrinį tašką pI. Pastaba: gautos kreivės minimumo taško X koordinatę (pI) apskaičiuoti galima pasinaudojus parabolės lygtimi.

18. Padarome išvadas apie gautą rezultatą. Sulyginame nustatytą želatinos izoelektrinį tašką su pateikiamu kituose literatūros šaltiniuose. Padarome išvadas apie galimas šio eksperimento paklaidas ir netikslumus.

Literatūra:

1. P.C. Hiemenz. „Principles of Colloid and surface Chemistry“. 3rd edition, Marcel Dekker, Inc., New York, 1997.

2. J.Januševičienė. „Koloidų chemijos laboratoriniai darbai“, Vilnius, 1967 (1982). 3. P.Atkins, J.dePaula. „Physical Chemistry“, 9th edition, W.H.Freeman and comp, New

York, 2010. 4. S.F.Sun. „Physical Chemistry of Macromolecules“, 2nd edition, New York, 2004. 5. N. Smorigaitė – Baderienė. „Fizinė ir koloidų chemija“, Vilnius, 1970.

6

________________________________________________________________ vardas, pavardė, kursas, grupė

_________________________ data

Viskozimetrinis želatinos izoelektrinio taško nustatymas.

Laboratorinio darbo rezultatų juodraštis:

Eksperimentiniai duomenys:

mėginio Nr.

H2O 1 2 3 4 5 6 7 8 9

pH

t1, s

t2, s

rutu

liuko

judė

jimo

laik

as

t3, s

vidutinis rutuliuko judėjimo laikas

t, s

7

Rutuliuko judėjimo laiko t želatinos tirpale priklausomybės nuo pH grafikas (juodraštis)*:

t, s

pH Želatinos izoelektrinis taškas pI _______________ Eksperimento vykdymo temperatūra T (oC)_______________

________________________ ___________________________ laboranto parašas, data

* tirpalo klampumo priklausomybės nuo pH grafikas gali būti sukurtas panaudojus

MsExcell, OriginPro arba panašią elektroninių lentelių apdorojimo kompiuterinę programą.