of 24/24
31 V. HASIL DAN PEMBAHASAN 5.1. Pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus oryzae, Xanthomonas campestris dan Bacillus natto Jumlah inokulum dari 1 ose Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus oryzae, Xanthomonas campestris, dan Bacillus natto dapat dilihat pada tabel 1. Berdasarkan tabel 1 Xanthomonas campestris mempunyai jumlah inokulum terbesar yaitu sebanyak 4,9 x 10 7 dan A. oryzae mempunyai inokulum terkecil yaitu 4,3 x 10 2 . Tabel 1. Jumlah Inokulum Awal Mikroorganisme Kurva pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus oryzae, Xanthomonas campestris, dan Bacillus natto hasil penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 8 yang diperoleh berdasarkan nilai Optical Density (OD) yang didapatkan. Setiap mikroorganisme mempunyai fase pertumbuhannnya dan nilai absorbansi berbeda yang cukup signifikan. Nilai absorbansi ini merepresentasikan jumlah sel mikroorganisme (Benson, 2001). Semakin tinggi jumlah sel mikroorganisme yang diperoleh semakin banyak jumlah beta-glukan yang didapat (Goldmann, 2008). Pertumbuhan mikrobial ditandai dengan peningkatan jumlah dan massa sel, sedangkan kecepatan pertumbuhan tergantung pada lingkungan fisik dan kimianya (Reed dan Rehm, 1983). Kecepatan pertumbuhan merefleksikan perkembangbiakan mikroorganisme yang ditunjukkan oleh kenaikan konsentrasi Mikroorganisme Jumlah inokulum (cfu/ml) S. cerevisiae 1,28 x 10 7 X. campestris 4,9 x 10 7 B. natto 7,0 x 10 6 A. oryzae 4,3 x 10 2

V. HASIL DAN PEMBAHASAN 5.1. Pertumbuhan ...media.unpad.ac.id/thesis/240210/2014/240210140078_5_8469.pdf35 yang mungkin beracun atau dapat menghambat pertumbuhan mikroba (Hamdiyati,

  • View
    223

  • Download
    0

Embed Size (px)

Text of V. HASIL DAN PEMBAHASAN 5.1. Pertumbuhan...

  • 31

    V. HASIL DAN PEMBAHASAN

    5.1. Pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus oryzae,

    Xanthomonas campestris dan Bacillus natto

    Jumlah inokulum dari 1 ose Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus oryzae,

    Xanthomonas campestris, dan Bacillus natto dapat dilihat pada tabel 1. Berdasarkan

    tabel 1 Xanthomonas campestris mempunyai jumlah inokulum terbesar yaitu

    sebanyak 4,9 x 107 dan A. oryzae mempunyai inokulum terkecil yaitu 4,3 x 102.

    Tabel 1. Jumlah Inokulum Awal Mikroorganisme

    Kurva pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus oryzae,

    Xanthomonas campestris, dan Bacillus natto hasil penelitian ini dapat dilihat pada

    Gambar 8 yang diperoleh berdasarkan nilai Optical Density (OD) yang didapatkan.

    Setiap mikroorganisme mempunyai fase pertumbuhannnya dan nilai absorbansi

    berbeda yang cukup signifikan. Nilai absorbansi ini merepresentasikan jumlah sel

    mikroorganisme (Benson, 2001). Semakin tinggi jumlah sel mikroorganisme yang

    diperoleh semakin banyak jumlah beta-glukan yang didapat (Goldmann, 2008).

    Pertumbuhan mikrobial ditandai dengan peningkatan jumlah dan massa sel,

    sedangkan kecepatan pertumbuhan tergantung pada lingkungan fisik dan kimianya

    (Reed dan Rehm, 1983). Kecepatan pertumbuhan merefleksikan

    perkembangbiakan mikroorganisme yang ditunjukkan oleh kenaikan konsentrasi

    Mikroorganisme Jumlah inokulum (cfu/ml)

    S. cerevisiae 1,28 x 107

    X. campestris 4,9 x 107

    B. natto 7,0 x 106

    A. oryzae 4,3 x 102

  • 32

    biomassa karena konsumsi substrat. Pada saat yang bersamaan dihasilkan produk

    berupa metabolit primer maupun sekunder (Mangunwidjaja dan Suryani, 1994).

    Gambar 8. Kurva Pertumbuhan Mikroorganisme

    Ketika mikroorganisme dipindahkan ke dalam suatu medium, mula-mula

    akan mengalami fase adaptasi atau fase lag untuk menyesuaikan dengan kondisi

    lingkungan di sekitarnya (Middelbeek et al., 1992; Mangunwidjaja dan Suryani,

    1994). Pada fase ini peningkatan sel belum tampak dan melibatkan sintesis

    komponen struktur sel. Berdasarkan gambar 8, lamanya fase adaptasi dari setiap

    mikroorganimse berbeda.

    S. cerevisiae mengalami fase adaptasi sampai jam 72 dengan adanya

    kenaikan dan penurunan nilai kerapatan optik dapat disebabkan adanya perbedaan

    tekanan osmotik antara cairan di dalam S. cerevisiae dengan suspensi media.

    Menurut Tortora et al (2002), bila khamir berada pada larutan yang hipertonis (kaya

    akan solute) maka akan terjadi plasmolisis yaitu cairan di dalam sel akan keluar dari

    dalam sel menembus membran plasma menuju ke cairan yang memiliki kadar

    solute lebih tinggi sehingga sel akan mati. X. campestris juga mengalami fase

    adaptasi sampai jam 72 namun tidak ada penurunan nilai kerapatan optik selama

    0.0

    0.2

    0.4

    0.6

    0.8

    1.0

    1.2

    0 24 48 72 96 120

    Ab

    sorb

    ansi

    (6

    00

    nm

    )

    Jam

    S. cerevisiae X. campestris B. natto A. oryzae

  • 33

    fase ini. B. natto mengalami fase lag tersingkat yaitu sampai jam 24. Sedangkan

    kapang A. oryzae juga mengalami fase lag sampai jam 72.

    Perbedaan waktu fase lag secara umum ditentukan oleh jumlah sel yang

    diinokulasikan, kondisi fisiologis dan morfologis yang sesuai serta media kultivasi

    yang dibutuhkan (Scragg, 1991; Middelbeek et al., 1992; Fardiaz, 1987). Faktor

    lainnya fase lag tergantung pada ukuran dan fase inokulum awal yang diinokulasi,

    ketika inokulum yang diambil dari fase stasioner, maka fase lag yang dialami akan

    lebih lama (Maier, 2009). Fase lag umumnya berbeda dengan bakteri, khamir dan

    kapang. Bakteri mengalami fase lag yang lebih cepat dibandingkan dengan khamir

    dan kapang yang dapat disebabkan oleh waktu membelah dirinya yang lebih cepat

    yaitu sekitar 20 menit, khamir sekitar 90 menit dan kapang bisa sampai 8 jam

    (Wibowo, 2016 ).

    S. cerevisiae dan A. oryzae mengalami fase lag yang cukup lama dapat

    diseebabkan inokulum S. cerevisiae dan A. oryzae sebelumnya ditumbuhkan di

    Potato Dextrose Agar (PDA) yang terdiri dari dextrose dan potato extract yang

    selanjutnya ditumbuhkan di YG Broth yang terdiri dari glukosa, K2HPO4, KH2PO4,

    MgSO4, yeast Extract dan NH4Cl. Sedangkan bakteri ditumbuhkan di Nutrient

    Agar(NA) yang terdiri dari Peptone, yeast extract dan NaCl dimana medium ini

    mempunyai komponen yang lebih serupa dengan medium barunya. Hal ini dapat

    menyebabkan bakteri lebih cepat menyesuaikan diri di lingkungan barunya.

    Hamdiyati (2014) mengatakan jika medium dan lingkungan pertumbuhan sama

    seperti medium dan lingkungan sebelumnya, mungkin tidak diperlukan waktu

    adaptasi. Tetapi jika nutrien yang tersedia dan kondisi lingkungan yang baru

  • 34

    berbeda dengan sebelumnya, diperlukan waktu penyesuaian untuk mensintesa

    enzim-enzim.

    A. oryzae mempunyai nilai kerapatan optik terkecil karena mempunyai

    jumlah inokulum terkecil (dari Tabel 1). Jumlah inokulum yang sedikit akan

    membuat fase adaptasi yang lebih lama. Disisi lain fase lag akan lebih cepat jika

    jumlah inokulum awalnya lebih banyak. Akibatnya populasi sel akan mencapai fase

    eksponensial dengan sangat cepat (Asaduzzaman, 2007). Jumlah populasi sel akhir

    yang lebih banyak akan berpengaruh pada jumlah -glukan yang diproduksi.

    B. natto mengalami fase lag tercepat dapat dikarenakan pertumbuhan

    optimum untuk B. natto adalah 20 jam sehingga setelah jam 20 B. natto akan

    mengalami fase stasioner (Tuan, 2015). Menurut Ruissen (1993), kurva

    pertumbuhan X. campestris terus mengalami kenaikan sampai di jam 60, sehingga

    sel X. campestris masih dapat naik setelah jam 60.

    S. cerevisiae, X. campestris dan A. oryzae selanjutnya mengalami fase

    logaritmik (log) atau pertumbuhan eksponensial pada jam 96 dimana terjadi

    peningkatan sel secara pesat. Sedangkan B. natto mengalami fase ini di jam 24.

    Pada fase ini mikroba membelah dengan cepat dan konstan mengikuti kurva log.

    Kecepatan pertumbuhan sangat dipengaruhi oleh medium tempat tumbuhnya

    seperti pH dan kandungan nutrien, juga kondisi lingkungan termasuk suhu dan

    kelembaban udara. Pada fase ini mikroba membutuhkan energi lebih banyak dari

    pada fase lainnya. Fase ini merupakan fase yang paling sensitif terhadap keadaan

    lingkungan. Pada akhir fase logaritmik, kecepatan pertumbuhan populasi menurun

    dikarenakan nutrien di dalam medium sudah berkurang serta ada hasil metabolisme

  • 35

    yang mungkin beracun atau dapat menghambat pertumbuhan mikroba (Hamdiyati,

    2014).

    Waktu terjadinya fase log dipengaruhi oleh fase sebelumnya. Fase lag

    adalah fase dimana bakteri mempersiapkan untuk fase eksponensial (Rolfe et al,

    2012) sehingga secara tidak langsung semakin lama fase lag akan semakin lama

    terjadinya fase log. Faktor lain yang mempengaruhi kecepatan pertumbuhan adalah

    kondisi lingkungan mediumnya seperti suhu, waktu inkubasi, kandungan substrat

    dan pH (Fardiaz, 1993). Setiap kultur diinkubasikan pada suhu 30oC di medium

    yang konsentrasi substratnya sama. Suhu ini merupakan suhu yang cukup optimal

    untuk semua kultur. S. cerevisiae tumbuh optimum di suhu ini, namun fase log baru

    dialami dijam 96 dapat diakibatkan karena fase lag yang dialami cukup lama. S.

    cerevisiae baru sesuai lingkungan barunya dan dapat memproduksi asam dengan

    optimal untuk pertumbuhannya. Pada jam ini juga terjadi fase logaritmik pada X.

    campestris, fase ini baru terjadi dapat disebabkan karena suhu optimum untuk X.

    campestris adalah 26oC (ATCC, 2018). Lima et al (1997) dan Rajeshwarl et al

    (1995) juga mengatakan pertumbuhan X. campestris mencapai fase stasioner

    setelah jam 72. B. natto memasuki fase logaritmik di jam 24. Britannica (2019)

    mengatakan bakteri Bacillus mempunyai karakter dengan kecepatan pembelahan

    diri dengan cepat dan didapatkan fase logaritmik umumnya di jam 18-24.

    A. oryzae mempunyai jumlah inokulum awal yang paling sedikit

    dibandingkan dengan mikroorganisme lainnya. Hal ini menyebabkan

    pertumbuhannnya menjadi lambat dan baru memasuki fase logaritimiknya di jam

    96 (Asaduzzaman, 2007). Shah et al (2014) juga mengatakan kondisi optimum

    fermentasi A. oryzae didapatkan di jam 72. Selain itu A. oryzae dapat memproduksi

  • 36

    enzim -amilase yang digunakan untuk pertumbuhannya. Puri (2013) mengatakan

    amilase dapat diproduksi maksimal di jam 120. Suhu optimum A. oryzae untuk

    memproduski -amilase yang merupakan enzim yang berkaitan untuk

    pertumbuhannya adalah 45oC (Sivaramakrishnan et al, 2006).

    Setelah fase logartimik, mikroorganisme akan memasuki fase stasioner dan

    kematian. Fase stasioner dialami oleh S. cerevisiae di jam 120 dan B. natto di jam

    24 dimana fase ini akan terjadi laju pertumbuhan bakteri sama dengan laju

    kematiannya, sehingga jumlah bakteri keseluruhan akan tetap. Keseimbangan

    jumlah keseluruhan bakteri ini terjadi karena adanya pengurangan derajat

    pembelahan sel (Volk dan Wheeler, 1993). Nilai kerapatan optik B. natto setelah

    jam 24 mengalami penurunan dan kenaikan. Hal ini dapat dikarenakan suhu

    inokulasi B. natto membutuhkan temperatur yang cukup tinggi yaitu sekitar 50oC.

    Didalam suhu ini B. natto dapat memperbanyak sebanyak 1091010 cfu per gram

    (Nout, 2015).

    X. campestris dan A. oryzae memasuki fase kematian pada jam 120 dimana

    terjadi penurunan jumlah sel karena beberapa nutrien di dalam medium sudah habis

    dan energi cadangan di dalam sel habis. Kecepatan kematian bergantung pada

    kondisi nutrien, lingkungan, dan jenis mikroba. Selain itu dapat diakibatkan adanya

    akumulasi produk toksik sehingga mengganggu pembelahan hasil fermentasi yang

    bersifat racun bagi mikroorganisme (Kavanagh, 2005). Di jam ini enzim A. oryzae

    yang diproduksi akan berkurang karena kekurangan nutrien dan akumulasi senyawa

    beracun (Shafique, 2009).

    Fase logaritmik merupakan fase optimum dalam memproduksi -glukan

    pada khamir dan kapang seperti S. cerevisiae dan A. oryzae (Lipke, 1998). Hal ini

  • 37

    terjadi karena pada fase logaritmik jumlah S. cerevisiae dan A. oryzae yang

    dihasilkan tinggi sehingga dapat memproduksi -glukan dalam jumlah yang tinggi

    pula. Semakin banyak jumlah S.cerevisiae dan A. oryzae diartikan semakin banyak

    jumlah -glukan yang diproduksi (Kusmiati, 2009) yang disebabkan -glukan pada

    S.cerevisiae dan A. oryzae ditemukan di dinding selnya.

    Bakteri mempunyai fase optimum yang berbeda untuk memproduksi -

    glukan. Sintesis -glukan di bakteri terjadi selama fase post-stationer ketika

    nitrogen mulai habis atau media fermentasi mengandung sumber karbon berlebih

    (Phillips dan Lawford 1983; Lawford dan Rousseau 1992; Lee 2002). Sehingga

    produksi -glukan dari X. campestris dan B. natto lebih optimum pada jam 120.

    Meskipun begitu ekstraksi -glukan dari dinding sel .cerevisiae dan A. Oryzae akan

    didapat meskipun sel mati maupun hidup (Zhu et al., 2016). Oleh karena itu

    ekstraksi dilakukan pada jam 120 untuk memperoleh bobot -glukan maksimum.

    5.2. Kadar Glukosa pada Media Pertumbuhan Saccharomyces cerevisiae,

    Aspergillus oryzae, Xanthomonas campestris dan Bacillus natto

    Glukosa merupakan sumber nutrisi untuk pertumbuhan mikroorganisme.

    Glukosa yang dikonsumsi oleh mikroorganisme akan dikonversi menjadi metabolit

    seperti asam dan karbohidrat sederhana (Said, 1987). Khamir dan kapang akan

    menggunakan glukosa sebagai penyusun dinding selnya yang terdiri dari -glukan

    (Appeldoorn,2002 ; Beauvais et al, 2001). Metabolisme pembentukan beta-glukan

    pada bakteri juga sangat bergantung pada kandungan glukosa (Zekovic et al, 2005)

    Kadar glukosa dalam medium setiap kultur selama 120 jam dapat dilihat di Gambar

    9.

  • 38

    Berdasarkan Gambar 9, kadar glukosa S. cerevisiae mengalami

    penurunan sampai di jam 72. Glukosa sebagai sumber karbon utama diserap melalui

    proses transfer aktif yang kemudian dimetabolisme untuk menghasilkan energi dan

    mensintesis bahan pembentuk sel, serta sintesis metabolit (Priest dan Campbell,

    1996). Penurunan kadar glukosa dalam medium mengindikasikan adanya

    penyerapan glukosa oleh S. cerevisiae untuk metabolisme dan pembentukan

    makromolekul seperti -glukan (Thontowi, 2007). Kadar glukosa di jam 72 juga

    mencapai titik terendah karena semakin besar konsumsi gula yang ditandai dengan

    penurunan konsentrasi gula yang signifikan, maka pertumbuhan sel juga semakin

    tinggi yang ditandai dengan nilai OD yang meningkat secara signifikan (Wardani,

    2013). Nutrien lain seperti nitrogen digunakan untuk sintesis protein di dalam sel.

    Protein yang terbentuk dapat merupakan enzim yang berperan dalam pembentukan

    -glukan (Thontowi, 2007)

    0

    500

    1000

    1500

    2000

    2500

    0 24 48 72 96 120

    Kad

    ar G

    luko

    sa (

    pp

    m)

    Jam

    S. cerevisiae X. campestris B. natto A. oryzae

    Gambar 9. Kadar glukosa pada medium

  • 39

    Kenaikan kadar glukosa setelah jam ini dapat disebabkan S. cerevisiae

    memasuki fase kriptik , dimana fase ini terjadi setelah fase stasioner dan terjadi lisis

    pada sel yang telah mati, menyebabkan keluarnya isi sel. Isi sel yang lisis dapat

    menjadi nutrisi bagi sebagian sel yang masih hidup sehingga memungkinkan

    terjadinya pertumbuhan baru (Wibowo, 2016). Nutrisi ini mungkin dapat berupa

    gula sehingga kadar glukosa dalam medium naik kembali.

    A. oryzae mengalami penurunan glukosa terbesar dibandingkan dengan

    mikroorganisme lainnya. Hal ini berarti A. oryzae sangat bergantung pada sumber

    karbon untuk pertumbuhannya. Beauvais et al (1993, 2001) mengatakan -1,3-

    glukan dari Aspergillus Fumigatus disintesis oleh kompleks glukan yang terikat

    membran plasma, yang menggunakan UDP-glukosa sebagai substrat dan

    mengekstraksi rantai -1,3-glukan linear melalui membran ke dalam ruang

    periplasmik. -glukan merupakan komponen yang ditemukan di dinding sel

    Aspergillus sehingga banyaknya sel akan mempengaruhi jumlah -glukan akhir

    (Ishibashi et al, 2010).

    Yuliana (2008) mengatakan semakin tinggi laju pertumbuhan bakteri maka

    semakin rendah gula reduksi yang tersisa. Sumber karbon yang paling optimum

    untuk X. campestris adalah sukrosa, yang diikuti oleh glukosa, piruvat dan

    frukotosa. Karbon akan berdisimilasi melaui glikolisis dan membentuk gula-gula

    nukleotida dan mendukung pertumbuhan yang baik serta menghasilkan

    eksopolisakarida dalam jumlah yang tinggi (Lin & Tseng, 1979). Hal ini dapat

    dilihat dari fase logaritmik X. campestris di jam 96 dengan kadar glukosa

    mediumnya yang rendah. Setelah jam 96, kadar glukosa X. campestris terjadi

    sedikit kenaikan yang dapat disebabkan X. campestris metabolit lain seperti xanthan.

  • 40

    Xanthan merupakan senyawa polisakarida yang disintensis oleh X. campestris

    melalui jalur Entner-Doudoroff dengan memanfaatkan glukosa. Jalur ini

    mengkatabolis glukosa menjadi asam 2-keto-3-dioksi-6-fosfoglukonat, lalu diubah

    menjadi fosfoenopiruvat dan asam piruvat menggunakan enzim dari X. campestris

    (Hsu & Martin, 2003 ; Lu et al, 2009). Senyawa ini selanjutnya akan dimanfaatkan

    untuk membentuk xanthan. Sehingga total gula dalam medium naik kembali.

    Kadar glukosa B. natto mengalami penurunan sampai ke jam di jam 24.

    Setelah jam ini kadar glukosa tidak terlalu berubah. Jam 24 merupakan jam

    terjadinya fase logaritmik, sehingga setelah jam ini B. natto sudah tidak ada

    pertumbuhan dan kadar glukosa menjadi tetap. Glukosa disintesis oleh bakteri

    untuk dijadikan metabolit sekunder berupa -glukan (Dhivya,2014). Selain itu Tuan

    et al, (2015) mengatakan Bacillus subtilis memanfaatkan glukosa untuk

    memproduksi asam asetat dan membangun pembentukan sel dan mengambil bagian

    dalam metabolisme zat.

    Selain daripada glukosa, Yeast Extract merupakan sumber nitrogen yang

    dimanfaatkan oleh X. campestris untuk pertumbuhan serta produksi

    eksopolisakarida diantaranya xanthan (Lo et al, 1997). Kondisi nitrogen yang

    sedikit akan mendukung pembentukan metabolit-metabolit seperti xanthan (De

    Yust & Vermeire, 1994). Membatasi jumlah nitrogen adalah cara paling efisien

    untuk mendorong biosintesis -glukan dan akan hanya diproduksi ketika kadar

    nitrogen dalam medium mencapai nilai rendah (Lee, 1997). Lalu Gummadi (2015)

    mengatakan dalam kondisi nitrogen yang tinggi -glukan yang diproduksi hanya

    sedikit dan nilai biomassanya yang tinggi. Faktor lain seperti MgSO4 dibutuhkan

    untuk mendukung pertumbuhan dan produksi eksopolisakarida (Ashour, 2000).

  • 41

    5.3. Derajat Keasaman pada Media Pertumbuhan Saccharomyces

    cerevisiae, Aspergillus oryzae, Xanthomonas campestris dan Bacillus natto

    Derajat keasaman atau pH merupakan salah satu faktor yang sangat penting

    dalam produksi -glukan karena berpengaruh signifikan terhadap pertumbuhan sel

    maupun pembentukan -glukan (Saudagar, 2004). Glukosa yang dikonsumsi oleh

    mikroorganisme akan dikonversi menjadi metabolit seperti asam dan karbohidrat

    sederhana (Said, 1987). pH mempunyai peranan penting dalam proses perbanyakan

    massa sel mikroorganisme yang mengakibatkan peningkatan produksi -glukan

    (Zhu et al, 2016). Beberapa studi mengatakan pH optimal produksi -glukan untuk

    bakteri di pH 5,5-7,0. (Lee et al. ,1999 ; Kalyanasundaram et al. 1980). Kadar pH

    hasil fermentasi selama 120 jam oleh setiap mikroorganisme dapat dilihat di

    Gambar 10.

    Penurunan nilai pH pada S. cerevisiae disebabkan karena dalam keadaan

    aerobik S. cerevisiae akan mengubah glukosa menjadi asam organik yang akan

    membuat media fermentasi ke kondisi asam (Williamson, 1980). Menurut Reed dan

    Peppler (1993), asam-asam yang terbentuk seperti asam asetat, asam piruvat, dan

    asam laktat dapat menurunkan pH, sedangkan asam-asam lainnya seperti asam

    butirat dan asam lemak lainnya hanya sedikit berpengaruh dalam penurunan pH

    cairan.

  • 42

    Kecenderungan media fermentasi semakin asam disebabkan amonia

    yang digunakan sel khamir sebagai sumber nitrogen diubah menjadi NH4+.

    Molekul NH4+ akan menggabungkan diri ke dalam sel sebagai R-NH3. Dalam

    proses ini H+ ditinggalkan dalam media, sehingga semakin lama waktu fermentasi

    semakin rendah pH media (Judoamidjojo dkk.,1989).

    Setelah jam 72, pH medium S. cerevisiae cenderung naik yang dapat

    disebabkan oleh keadaan oksigen didalam medium sangat sedikit dan S. cerevisiae

    memasuki kondisi anaerobik dimana asam piruvat yang diproduksi sebelumnya

    akan diubah menjadi etanol dan karbondioksida (Nelson, 2005). Etanol yang

    diproduksi bersifat basa yaitu 7,33 sehingga kadar pH medium menjadi naik

    (Anonim, 2000).

    Bakteri X. campestris mengalami penurunan pH terbesar dibandingkan

    dengan mikroorganisme lainnya. pH terendah didapatkan di jam ke 72 yaitu sebesar

    3,61. D.J Robeson (1985) mengatakan X. campestris dapat memproduksi asam-

    asam karboksilat dengan memanfaatkan glukosa seperti asam tiglik, asam

    3.0

    3.5

    4.0

    4.5

    5.0

    5.5

    6.0

    6.5

    7.0

    7.5

    0 24 48 72 96 120

    pH

    Jam

    S. cerevisiae X. campestris B. natto A. oryzae

    Gambar 10. Kadar pH media dari Setiap Mikroorganisme

  • 43

    phenilacetik, asam isovalerik, 3-metiltiopropionik dan asam trans-3-metiltiakrilat

    yang diproduksi sampai di jam 72. Produksi asam ini ditandai oleh penurunan kadar

    glukosa medium yang terus menurun sampai jam 96 dan residu glukosanya tersisa

    263 ppm. Namun X. campestris akan tumbuh optimum di pH 6.0-7.5 (Esalhado et

    al, 1995), sehingga pH kadar medium perlu dikontrol agar beta-glukan yang

    diperoleh dapat optimal.

    B. natto mengalami penurunan pH sampai di jam 48. Tuan et al, (2015)

    mengatakan Bacillus subtilis memanfaatkan glukosa untuk memproduksi asam

    asetat. Selain asam asetat, hasil metabolit dari B. natto berupa zat lendir berwarna

    putih yang merupakan hasil pembentukan asam poli- -glutamat selama fermentasi

    (Hu et al., 2010 ; Ho et al., 2006 ). Kenaikan pH kembali setelah jam 48 terjadi

    dapat dikarenakan oleh fermentasi yang berkepanjangan. Hal ini dapat membuat

    kenaikan konsentrasi amonia dalam medium (Guo, 2015). Nitrogen organik lebih

    mudah dimanfaatkan oleh bakteri untuk meningkatkan metabolisme enzimnya.

    Selain itu sumber kalsium seperti NH4Cl merupakan faktor pendorong untuk

    pembentukan enzim dan nutrisi lainnya melibatkan reaksi biokimia sel bakteri.

    (Kwon et al, 2011 ; Cho et al, 2010). Adanya sedikit kenaikan pH dapat disebabkan

    B. subtillis natto dapat memproduksi poliamin yang merupakan senyawa yang

    pHnya mendekati netral (Kim, 2012 ; Karsten, 2005).

    Lee et al (2016) mengatakan gula yang dikonsumsi oleh A. oryzae akan

    menyebabkan produksi asam amino dan asam organik selama fermentasi terutama

    asam sitrat dan asam glukonat, mempengaruhi keasaman lingkungan medium dan

    membuat pH turun. A. oryzae dapat mentolerir kondisi asam dan bisa hidup dalam

    pH rentang 3-7. Namun pH yang optimum untuk pembentukan enzim terdapat di

  • 44

    pH 7. Pada pH yang lebih rendah atau lebih tingi akan mempengaruhi stabilitas

    enzim ekstraseluler dan menyebabkan denaturasi yang cepat (Sindhu et al, 1986).

    Metabolit lain yang dibuat oleh A. oryzae berupa asam koji (Terabayashi et al,

    2010).

    Kenaikan pH kembali setelah jam 72 dapat disebabkan gula dalam substrat

    dipecah menjadi gula-gula sederhana dengan bantuan enzim -amilase sehingga

    terbentuknya gula alkohol (Baek et al, 2010). Gula akohol yang terbentuk membuat

    kadar glukosa pada medium dan pH naik kembali. Yeast extract merupakan sumber

    nitrogen organik yang cocok digunakan untuk memproduksi enzim -amilase.

    Metabolit primer yang diproduksi sangat dipengaruhi oleh pertumbuhannya yang

    dipengaruhi oleh nutrien yang tersedia (Shah, 2014).

    Metabolisme sekunder pada A. oryzae menggunakan senyawa asam untuk

    menekan jalur metabolisme. Metabolit ini akan memberikan A. oryzae kemampuan

    untuk memodifikasi diri mereka sendiri sesuai dengan lingkungan mereka saat ini

    - mereka dapat meningkatkan atau menurunkan efisiensi metabolisme yang optimal.

    Hal ini membuat A. oryzae mampu beradaptasi dengan berbagai lingkungan

    (Brown, 1996).

    5.4. Produksi -glukan dari Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus oryzae,

    Xanthomonas campestris, dan Bacillus natto

    Tabel 2. Hasil Jumlah Massa Sel dan Massa - Glukan dari Setiap Mikroorganisme

    Mikroorganisme Berat glukan (mg) Berat biomassa sel (mg)

    Saccharomyces

    Cerevisiae 3,945 29,445

    Xanthomonas

    Campestris 0,785 4,445

    Bacillus Natto 1,345 6,6

    Aspergillus Oryzae 82,5 590,65

  • 45

    Hasil fermentasi berupa massa sel dan massa -glukan dari Saccharomyces

    cerevisiae, Aspergillus oryzae, Xanthomonas campestris, dan Bacillus natto dapat

    dilihat pada tabel 2. A. oryzae memperoleh jumlah -glukan dan biomassa sel

    terbesar yaitu 82,5 mg dan 590,65 mg secara berturut. dan X. campestris

    memperoleh jumlah biomassa dan berat -glukan terkecil yaitu 0,785 mg dan 4,445

    mg secara berturut.

    Jumlah -glukan terbesar yang didapat pada A. oryzae dapat disebabkan

    karena mempunyai -glukan ikatan (1-3) dan (1-6), yang diperoleh dinding sel baik

    pada konidia maupun miseliumnya (Beauvais, 2014). Sedangkan pada X.

    campestris dan B. natto didapatkan hanya dari metabolit sekundernya dan S.

    cerevisiae dari dinding selnya (Dhivya, 2014). A. oryzae mengonsumsi glukosa

    terbesar dibandingkan dengan mikroorganisme lainnya. Glukosa dikonversi

    menjadi asam organik dan disintesis untuk dinding selnya (Lee, 2016 & Farkas,

    1979). Namun pH pada media tumbuhnya tidak terjadi penurunan secara signifikan

    sehingga sebagian besar glukosanya dimanfaatkan untuk pembentukan dinding

    selnya.

    Selain itu ukuran miselium dan konidia A. oryzae lebih besar dibandingkan

    dari sel S. cerevisiae. A.oryzae mempunyai partikel sebesar 37.6 Megabases (Mb)

    mempunyai ukuran yang lebih besar dibandingkan dengan genus Aspergillus

    lainnya (Machida, 2008). Xanthomonas mempunyai ukuran partikel lebar 0,4 1,0

    mdan panjangnya sebesar 1,2 3,0 m. S. cerevisiae mempunyai ukuran partikel

    sebesar 5-6 m dan besar genomnya sekitar 12 Mb. Sedangkan Bacillus biasanya

    berbentuk batang, dengan panjang sekitar 4-10 m dan diameter 0,25-1,0 m, (Yu

    et al, 2014) dengan ukuran genom 4,1-Mb (Tan, 2016).

  • 46

    Berdasarkan gambar 10, A. oryzae mengkonversi glukosa dengan cepat dan

    sebagian besar dari glukosa yang dikonversi untuk membentuk dinding sel

    miselium dan konidianya. Pada Aspergillus, -1,3-glukan disintesis oleh kompleks

    glukan sintase plasma membran-terikat, yang menggunakan uridin difosfat (UDP)

    -glucose sebagai donor-substrat dan ekstrusi rantai -1,3-glukan melalui membran

    ke ruang periplasmik (Beauvais et al., 2001).

    Metabolisme pembentukan -glukan adalah dengan adanya glukosa yang

    diubah menjadi glukosa -6- fosfat dimana kemudian adanya enzim

    phosphoglucomutase diperoleh glukosa-1-fosfat dan diurai menjadi UDP- Glukosa

    yang merupakan komponen penyusun dinding sel khamir. Salah satu penyusun

    dinding sel tersebut adalah -glukan (Appeldoorn, 2002). Sedangkan pada bakteri

    Uridin difosfat (UDP) glukosa dan Uridin monofosfat (UMP) dapat menjadi

    prekursor dalam produksi glukan. Penurunan pH dapat meningkatkan konsentrasi

    enzim intra-seluler seperti -1,3-glukanase, Uridin Trifosfat (UTP) glukosa-1-

    fosfat uridilitransferase dan fosfoglukosamutase yang merupakan enzim yang

    terlibat dalam metabolisme dan sinstesis -glukan (Dhivya et al, 2014).

    Dalam proses pembentukan dinding sel fungi dipengaruhi oleh unsur

    nitrogen yang diperoleh dari media fermentasi dalam bentuk asam amino maupun

    peptida yang dapat menjadi pendukung dalam metabolisme pertumbuhan rantai

    penyusun dinding sel (Walker, 2016). Bakteri menghasilkan metabolit sekunder

    dengan mengkonversi glukosa menjadi -glukan dan pada S. cerevisiae dan A.

    oryzae ditemukan didinding selnya (Zekovi et al, 2005). Dengan demikian,

    semakin tinggi kandungan glukosa akan semakin tinggi nutrisi yang tersedia untuk

    pertumbuhan sel dan produk akhir -glukan.

  • 47

    Biomassa sel yang didapat kemudian dilakukan autolisis sel atau

    pemecahan sel guna memperoleh -glukan (Pengkumsri, 2016). Bakteri

    menghasilkan metabolit selama fermentasi, Meskipun jumlah biomassa sel tinggi

    namun -glukan yang didapat dari biomassa sel belum tentu sebanding dengan

    biomassanya karena -glukan yang didapat dari bakteri merupakan hasil metabolit

    sekunder sedangkan kapang dan khamir hanya sebagian dari dinding selnya

    (Dhivya et al, 2014 ; Lipke, 1998 ; Beauvais et al, 2014). Sehingga biomassa sel

    hanya terdiri dari sebagian kecil -glukan yang selanjutnya perlu dilakukan

    ekstraksi lanjutan untuk mengetahui yield atau persentase -glukan yang didapat

    dari biomassa selnya (Young, 2004).

    Hasil massa -glukan dan massa sel yang diperoleh dapat digunakan

    untuk mencari persentase/yield -glukan yang dihasilkan berdasarkan massa sel

    yang diperoleh. Persentase -glukan yang dihasilkan dapat dilihat pada Gambar 11.

    Persentase tertinggi ada pada persentase -glukan dihasilkan oleh B.

    natto yaitu 20,37%. Hal ini dapat dikarenakan metabolit sekunder yang dihasilkan

    13.40

    17.66

    20.38

    13.97

    0

    5

    10

    15

    20

    25

    Saccharomyces

    cerevisiae

    Xanthomonas

    campestris

    Bacillus natto Aspergillus oryzae

    Yie

    ld (

    %)

    Mikroorganisme

    Gambar 11. Yield -glucan Dari Setiap Mikroorganisme

  • 48

    oleh B. natto berupa -1,3 glukan yang tidak larut air (Gummadi, 2015). Sedangkan

    X. campestris menghasilkan metabolit sekunder terbesar berupa xanthan gum yang

    merupakan polisakarida dibandingkan dengan -1,2 glukan (Robeson, 1985).

    B. natto mempunyai nilai OD yang lebih besar dibandingakan dengan X.

    campestris, sehingga jumlah beta-glukan yang didapat sedikit lebih besar

    dibandingkan dengan X. campestris. Selain dari jumlah populasi, B. natto

    mempunyai nilai yield yang lebih tinggi dibandingkan dengan X. campestris dapat

    disebabkan karena X. campestris baru memasuki fase stasioner di jam 120, dimana

    di jam ini dilakukan ekstraksi dan X. campestris baru menghasilkan metabolit-

    metabolit sekunder di fase ini. Sedangkan pada B. natto memasuki fase logaritimik

    di jam 24 dan setelah jam ini nutrien di kultur B. natto sudah mengalami penurunan

    dan dimanfaatkan oleh B. natto untuk memproduksi metabolit sekunder berupa -

    glukan. Sehingga B. natto lebih mempunyai waktu untuk memproduksi -glukan

    dibandingkan dengan X. campestris.

    Bakteri B. natto dan X. campestris mempunyai nilai kerapatan optik yang

    jauh lebih kecil dibandingkan dengan khamir S. cerevisiae dan kapang A. oryzae

    yang berarti jumlah populasinya yang tidak banyak, namun bakteri B. natto dan X.

    campestris mempunyai nilai yield yang lebih tinggi dibandingkan dengan khamir S.

    cerevisiae maupun kapang A. oryzae. Maka bakteri ini tidak bergantung penuh pada

    jumlah populasinya, melainkan pada metabolit sekunder yang dihasilkan. Sehingga

    optimalisasi untuk produksi metabolit sekundernya lebih penting dibandingkan dari

    jumlah populasinya untuk membuat -glukan.

    A. oryzae mempunyai jumlah populasi tertinggi dibandingkan dengan

    mikroorganisme lainnya, yang diikuti oleh S. cerevisiae. Namun kedua

  • 49

    mikroorganisme ini mempunyai nilai yield yang rendah. Berdasarkan gambar 11,

    yield yang dihasilkan oleh A. oryzae didapat sekitar 13.96% dan S. cerevisiae

    didapat 13.39%. Lalu berdasarkan gambar 8 nilai kerapatan optik di jam 120 A.

    oryzae didapatkan hanya 0.1246 dan S. cerevisiae mencapai nilai kerapatan optik

    sebesar 1.0841. Hal ini dapat terjadi karena ikatan -glukan yang didapat pada

    dinding sel S. cerevisiae jauh lebih besar dibandingkan di dinding sel A. oryzae.

    Kapteyn (1996) mengatakan setengah lebih dinding sel S. cerevisiae terdiri dari -

    1,3-glukan (50-55%) dan -1,6-glukan (5-10%). Sedangkan A. oryzae hanya

    mempunyai -1,3-glukan sekitar 20-35% dan -1,6-glukan sekitar 4% (Beavuais,

    2014). Oleh karena itu khamir dan kapang sangat bergantung terhadap jumlah

    populasinya, karena -glukannya ditemukan di dinding selnya.

    Yield -glukan yang dihasilkan oleh bakteri secara umum seperti

    Agrobacterium didapatkan sekitar 6-7% (Kalyanasundaram, et al, 2012). Khamir

    yang umum digunakan yaitu S. cerevisiae dapat memperoleh yield beta-glukan

    sekitar 6-12% (Suphantharika et al, 2003 ; Khalel, 2002; Zechner-Krpanet et al

    2010). Lalu kapang Aspergillus niger dapat memperoleh yield sebesar 9-11%

    (Paulraj, 2012).

    Namun -glukan yang didapat di penelitian ini masih tidak murni

    sehingga dibutuhkan penelitian lebih lanjut untuk pemurniannya. -glukan yang

    tidak murni dapat mempengaruhi sifat fisika-kimianya dan mempersulit

    kemampuannya untuk larut dalam air yang nantinya dapat tidak cocok untuk

    industri pangan (Jamas et al, 1991).

  • 50

    5.5. Mikrostruktur -Glukan dengan Scanning Electron Microscope

    Hasil pengujian mikrostrukstur dengan menggunakan Scanning Electron

    Microscope (SEM) yang dapat dilihat pada Gambar 12. Berdasarkan penampilan

    panorama sampel menunjukkan -glukan yang diekstrak memiliki distribusi ukuran

    partikel yang tidak teratur dan lebih kecil.

    Adanya perbedaan struktur antara sampel dapat terjadi karena dari setiap

    mikroorganisme mempunyai ikatan -glukan yang berbeda. (Zhu, du & Xu, 2016).

    Berdasarkan gambar 12, Pada perbesaran 30x ukuran partikel -glukan rata-rata

    dari S. cerevisiae didapatkan sebesar 500 m, 1300 m dari A. oryzae , 550 m dari

    X. campestris, dan 400 m dari B. natto, sedangkan untuk pengukuran globular -

    glukan diperoleh perbesaran yang berbeda dari tiap medium fermentasi. Globular

    -glukan S. cerevisiae memiliki diameter sebesar 500 m yang diukur pada

    perbesaran 250x. Globular -glukan A. oryzae diperoleh diameter sebesar 1400 m

    dengan menggunakan perbesaran 70x. -glukan X. campestris diperoleh globular

    dengan diameter 305 m pada perbesaran 400x. dan -glukan B. natto diperoleh

    globular dengan diameter 600 m pada perbesaran 200x. A. oryzae mempunyai

    ukuran sel yang lebih besar disebabkan karena bentuk dari selnya yang terdiri dari

    miselium dan spora, Miselium merupakan kumpulan beberapa filamen yang

    dinamakan hifa. Setiap hifa lebarnya 5-10 m, dibandingkan dengan sel bakteri

    yang biasanya (Coyne dan Mark, 1999). Sedangkan Dwidjoseputro (2005)

    mengatakan ukuran sel khamir mempunyai lebarnya berkisar antara 1-5 m dan

    panjangnya berkisar dari 5-30 m atau lebih.

  • 51

    D

    Gambar 12. Hasil Scanning Electron Microscope -glukan S. cerevisiae

    (A&B), A. oryzae (C&D), X. campestris (E&F), B. Natto (G&H) dan

    komersil dari barley (I&J) yang diperoleh Limberger-Bayer (2014)

    A B

    C

    F E

    H G

    J I

  • 52

    Perbedaan ukuran partikel ini akan berpengaruh terhadap aktivitas

    biologisnya. Wang (2017) dan Methacanon (2011) mengatakan mikrostruktur

    terkecil diartikan memiliki kelarutan tertinggi sehingga dihasilkan aktivitas biologis

    yang tinggi. -glukan dari X. campestris memiliki ukuran mikrostruktur terkecil

    yang iikuti oleh S. cerevisiae lalu B. natto dan aktifitas biologis terendah terdapat

    pada A. oryzae.

    Hasil tersebut memperlihatkan bahwa diameter -glukan dari tiap medium

    fermentasi memiliki ukuran yang berbeda, dimana globular -glukan komersil

    memiliki diameter 5 m hingga 100 m perbedaan ini dapat terjadi dikarenakan

    perbedaan substrat yang digunakan untuk memproduksi -glukan serta perbedaan

    kemurnian (Hunter et al, 2002; Piotrowska, 2015).

    Keempat mikroorganisme meskipun mempunyai ukuran partikel dan bentuk

    yang berbeda, mereka mempunyai kesamaan yaitu penampilannya yang seperti

    bunga karang, berpori dan teksturnya yang kasar serta struktur dinding selnya tidak

    terlihat. -glukan komersil (I&J) mempunyai tekstur yang serupa, cluster yang

    lebih homogen serta bentuknya lebih bulat dan spongy (Limberger-bayer, 2014).

    Singh (2018), Vasanthan and Temelli (2008) dan Liu et al (2015) juga

    menunjukkan mikrostruktur -glukan yang diekstraksi dengan asam basa

    mempunyai karakteristik yang serupa dengan apa yang didapat. Partikel yang

    berpori dapat disebabkan oleh pengeringan seperti spray atau freeze drying. Salah

    satu manfaat partikel yang berpori adalah peningkatan atau memperkaya -glukan

    dengan obat seperti nano-drug precipitate atau nanocrystals (Upadhyay et al, 2017).

    Pada pengamatan tiap globular dihasilkan karakteristik yang serupa antar

    masing masing -glukan, namun jika dilihat secara meluas bentuk dari partikel

  • 53

    masing masing -glukan memiliki ukuran yang berbeda beda. Perbedaan ini

    juga ditunjukkan dari penggunaan perbesaran yang berbeda untuk tiap -glukan dari

    masing masing media fermentasi. Perbedaan ukuran mikrostruktur dari tiap -

    glukan ini dikarenakan adanya perbedaan ikatan antar mikroorgansime (Uscanga,

    2003).

    Jumlah unsur karbon dan nitrogen yang berbeda pada setiap

    mikroorganisme akan mempengaruhi pembentukan ukuran komponen dinding sel,

    terutama terbentuknya -glukan (Parrou, 1999). Semakin tinggi ketersediaan unsur

    karbon dan nitrogen pada media fermentasi yang digunakan maka semakin besar

    ukuran partikel dari -glukan yang dihasilkan (Lipke, 1998). Konversi glukosa dan

    nitrogen akan berbeda sehingga ukuran partikel dapat bervariasi karena setiap

    mikroorganisme mempunyai proses metabolisme yang berbeda.

  • 54

    VI. PENUTUP

    6.1. Kesimpulan

    S. cerevisiae, X. campestris, B. natto dan A. oryzae dapat tumbuh

    dan memproduksi -glukan di media cair selama 120 jam dengan total

    populasi di nilai kerapatan optik (0,1246-1,0841). Produksi -glukan

    tertinggi didapat dari A. oryzae yaitu sebesar 82,5 miligram dengan total

    populasi A. oryzae di nilai kerapatan optik 0,1246, kadar glukosa akhir 769

    ppm dan kadar pH medium akhir 6,67. Lalu produsen paling efektif dalam

    menghasilkan -glukan adalah B. natto yang menghasilkan yield sebesar

    20,38 %.

    6.2. Saran

    -glukan yang dihasilkan dapat dikaji lebih lanjut sebagai bahan

    tambahan makanan yang memiliki sifat fungsional. Pengujian lebih lanjut

    mengenai kemurnian, struktur dan karakteristik -glukan secara lengkap

    juga perlu dilakukan.