UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

TATIANE MELINA GUERREIRO

CONTAMINANTES EM ALIMENTOS:

DETERMINAÇÃO DE MARCADORES QUÍMICOS POR

ESPECTROMETRIA DE MASSAS

CONTAMINANTS IN FOOD:

CHEMICAL MARKERS DETERMINATION BY MASS SPECTROMETRY

CAMPINAS

2018

TATIANE MELINA GUERREIRO

CONTAMINANTES EM ALIMENTOS:

DETERMINAÇÃO DE MARCADORES QUÍMICOS POR

ESPECTROMETRIA DE MASSAS

CONTAMINANTS IN FOOD:

CHEMICAL MARKERS DETERMINATION BY MASS SPECTROMETRY

Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade

Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a

obtenção do título de Doutora em Ciências

Thesis presented to the Faculty of Medical Sciences of the University

of Campinas as part of the requirements to obtain the Doctor of

Science degree

ORIENTADOR: RODRIGO RAMOS CATHARINO

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO

FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA

ALUNA TATIANE MELINA GUERREIRO, E ORIENTADA PELO

PROF. DR. RODRIGO RAMOS CATHARINO.

CAMPINAS

2018

BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO

TATIANE MELINA GUERREIRO

ORIENTADOR: PROF. DR. RODRIGO RAMOS CATHARINO

MEMBROS:

1. PROF. DR. RODRIGO RAMOS CATHARINO

2. PROFA. DRA. MÔNICA SIQUEIRA FERREIRA

3. PROF. DR. SEVERINO MATIAS DE ALENCAR

4. PROFA. DRA. CIBELE ZANARDI ESTEVES

5. PROFA. DRA. IZABELA DUTRA ALVIM

Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências

Médicas da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca

examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

Data: 14/08/2018

“Acordar para quem você é requer desapego de quem você imagina ser”

Alan Watts

AGRADECIMENTOS

Esta página é sempre a mais difícil de ser escrita. Não que eu não me sinta grata,

mas pelo fato do quão difícil que é pontuar somente algumas pessoas para se agredecer por

tudo que passou e pelos frutos que ando colhendo hoje em dia. Este trabalho contou com a

participação de muita gente e muitos momentos. Esta tese é o resultado de algo que eu

idealizei há 4 anos atrás e que hoje chega ao fim. Por isso, sou muito grata por todos que

tiveram a oportunidade de viver estes últimos anos comigo.

Nada melhor do que começar os agradecimentos com vocês, amigos do laboratório:

Diogo, Mônica, Cibela, Jeany, Mohamed, Marta, Luisa e Estela muito obrigada por

fazerem meus dias mais alegres, por toda ajuda no que fosse preciso, por me trazer queijo,

por todas as conversas e por todas as risadas fica aqui meu abraço apertado para cada um de

vocês! Por todo apoio e por me (des)orientar em cada etapa deste doutorado, muito

obrigada Prof. Rodrigo! Só alegria, sempre!

Por conviver 24 horas comigo, vivendo todas as minhas emoções, cada alegria, cada

lágrima, cada garrafa de vinho, cada receita que dá errado, cada viagem, cada copo de

cerveja, cada machucado, cada manhã às 4h30, cada reggaeton... Fer, eu não tenho palavras

para descrever o quanto você é importante para mim... Muito obrigada por todo

companheirismo e amor. Eu te amo!

E por último, àqueles que sempre estiveram aqui para me proteger, me ensinar, me

guiar, me motivar e principalmente por sempre acreditar em mim, mesmo quando nem eu

mesma acreditei, muito obrigada Pai e Mãe! Eu tenho muito orgulho de ser sua filha! E não

poderia esquecer da minha companheira de vida, aquela pessoa que a gente briga e mesmo

assim sabe que nunca vai deixar de amar, muito obrigada Bilu! O pai e a mãe não poderiam

ter acertado tanto quando fizeram você!

Muito obrigada por cada oportunidade que pude viver nesses últimos anos e também

por cada momento de angústia, que sempre trouxeram muito aprendizado e crescimento.

Muito obrigado doutorado, por além de ciência ter me ensinado muito sobre a vida!

E que venha a próxima aventura... Valeu!

RESUMO

A qualidade de alimentos é assegurada através dos limites de contaminantes químicos designados

pelas legislações para o emprego de um controle de qualidade eficaz. A busca por métodos

analíticos mais rápidos e com alta eficiência é o que move a pesquisa aplicada à área de ciência de

alimentos. O emprego da espectrometria de massas é destaque na análise de marcadores químicos

em alimentos, por ser uma técnica versátil para o estudo e identificação por análise direta de

possíveis contaminantes. Além disso, a união de técnicas modernas de espectrometria de massas

com a metabolômica, uma plataforma capaz de integrar dados estatísticos e experimentais para

obtenção de resultados analíticos de alta confiabilidade, torna esse segmento extremamente fértil

para a realização de melhorias e desenvolvimento. Para a realização destas análises, os compostos

podem ser previamente escolhidos (target analysis) ou identificados pós-análise (metabolic

fingerprinting). Neste contexto, amostras de diversos alimentos populares e amplamente

consumidos no Brasil, como leite, carne vermelha e a bebida cachaça foram analisados

empregando-se esta combinação com o objetivo de identificar marcadores químicos relacionados

aos possíveis contaminantes destes alimentos.

Palavras chave: Contaminantes. Segurança Alimentar. Metabolômica. Espectrometria de Massas

ABSTRACT

Food quality is ensured through the limits of chemical contaminants designated by legislation for

the use of effective quality control. The search for faster and more efficient analytical methods is

what moves applied research to the area of food science. The use of mass spectrometry is

highlighted in the analysis of chemical markers in foods, being a versatile technique for the study

and identification by direct analysis of possible contaminants. Moreover, the union of modern

techniques of mass spectrometry with metabolomics, a platform capable of integrating statistical

and experimental data to obtain highly reliable analytical results, makes this segment extremely

fertile for improvement and development. For the accomplishment of these analyzes, the

compounds can be previously chosen (target analysis) or identified post-analysis (metabolic

fingerprinting). In this context, samples of several popular and widely consumed foods in Brazil,

such as milk, beef meat and the beverage cachaça were analyzed using this combination in order to

identify chemical markers related to the possible contaminants in these foods.

Palavras chave: Contaminants. Food Safety. Metabolomic. Mass Sepectrometry.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Processo de ionização por spray de elétrons. (adaptado de Cech & Christie,

2001)..................................................................................................................... 21

Figure 1 PLS-DA scores plot showing clustering among adulterated milk samples,

separated from fresh raw milk. (A) Scores plot of sodium hydroxide using

positive mode data. (B) Scores plot of sodium hypochlorite using positive mode

data. (C) Scores plot of hydrogen peroxide using the negative mode data. (D)

Scores plot of the formaldehyde using the negative mode data..................... 41

Figure 2 DI-HRMS fingerprints in the positive mode of adulterated milk samples (A =

fresh raw milk/control; B = milk added 1 % v/v of sodium hydroxide solution; C

= milk added 1 % v/v of sodium hypochlorite solution)................................... 42

Figure 3 DI-HRMS fingerprints in the negative mode of adulterated milk samples (A =

fresh raw milk/control; B = milk added 1 % v/v of hydrogen peroxide solution;

C = milk added 1 % v/v of formaldehyde solution)............................................. 43

Figure 1SM PLS-DA scores plot showing clustering among adulterated milk samples with

concentration of adulterant of 2.5% v/v separated from fresh raw milk. (A =

Scores plot of sodium hydroxide solution using positive mode data; B = Scores

plot of sodium hypochlorite solution using positive mode data; C = Scores plot

of hydrogen peroxide solution using the negative mode data; D = Scores plot of

the formaldehyde solution using the negative mode data)............................... 49

Figure 2SM PLS-DA scores plot showing clustering among adulterated milk samples with

concentration of adulterant of 5% v/v separated from fresh raw milk. (A =

Scores plot of sodium hydroxide solution using positive mode data; B = Scores

plot of sodium hypochlorite solution using positive mode data; C = Scores plot

of hydrogen peroxide solution using the negative mode data; D = Scores plot of

the formaldehyde solution using the negative mode data)............................... 50

Figure 3SM PLS-DA scores plot showing clustering among adulterated milk samples with

concentration of adulterant of 10% v/v separated from fresh raw milk. (A =

Scores plot of sodium hydroxide solution using positive mode data; B = Scores

plot of sodium hypochlorite solution using positive mode data; C = Scores plot

of hydrogen peroxide solution using the negative mode data; D = Scores plot of

the formaldehyde solution using the negative mode data)............................... 51

Figure 1 HRMS spectra of the beef meat samples showing the presence of five

contaminants in all pieces of beef meat that were in contact with the vacuum-

plastic packaging. A: negative control butcher's shop beef meat; B: packaging

spectrum; C: packed beef meat spectrum............................................................. 57

Figure 1 Scheme of the solution preparation for the standard addition method................. 68

Figure 2 Sandwich injection scheme.................................................................................. 68

Figure 3 EIC chromatogram of solutions with 6 and 30 g/L of sugar and MS spectrum of

365 (sucrose).................................................................................................... 70

Figure 4 EIC chromatogram of 6 g/L of sugar (A) and with a sample of cachaça (B)

before and after QuEChERS extraction, injecting only the organic layer for both

samples......................................................................................................... 71

Figure 5 Overlapping chromatogram of standard addition method, which shows the

gradual increase of the peak area of ethyl carbamate........................................... 73

Figure 6 Comparison between the standard addition curve (A) and the external calibration

curve (B) for quantification of the ethyl carbamate............................ 75

LISTA DE TABELAS

Quadro 1 Comparação entre as diferentes tecnologias utilizadas em

metabolômica. (Adaptado de Wishart, 2008)...................................... 19

Table 1 List of compounds found for each of the types of adulterants used.

*METLIN ID....................................................................................... 45

Table 1 Contaminants found in meat samples from plastic package. (a

Presented adducts are in accordance with Keller et al, 2008 (Keller,

Sui, Young, & Whittal, 2008))............................................................ 56

Table 1 Sugar percentage removal by EIC peak area....................................... 69

Table 2 Recovery results by standard addition and external calibration

methods. (n=3)..................................................................................... 74

Table 3 Mean concentration (MC, n=3), absolute error of the measurements

(n=3) and final concentration (FC) of ethyl carbamate in the tested

cachaças samples [commercial (Comm) and craft]............................ 76

LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS

MS Espectrometria de Massas, do inglês Mass Spectrometry

QuEChERS Do inglês Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe

GC Cromatografia Gasosa, do inglês Gas Chromatography

LC Chromatografia Líquida, do inglês Liquid Chromatography

QqQ Triplo quadrupolo

MRM Monitoramento de Reações Múltiplas, do inglês Multiple Reaction Monitoring

EI Ionização por Elétrons, do inglês Electron Ionization

ESI Ionização por Spray de Elétrons, do inglês Electrospray Ionization

NMR Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear, do inglês Nuclear Magnetic

Ressonance Spectroscopy

HRMS Espectrometria de Massas de Alta Resolução, do inglês High-Resolution Mass

Spectrometry

MALDI Ionização e Dessorção a Laser Assistida por Matriz, do inglês Matrix-Assisted Laser

Desorption/Ionization

CID Dissociação Induzida por Colisão, do inglês Collision-Induced Dissociation

DOP Denominação de Origem Protegida

IGP Indicação Geográfica Protegida

EPG Especialidade Tradicional Garantida

PCA Análise de Componente Principal, do inglês Principal Component Analysis

PLS-DA Análise Discriminante por Mínimos Quadrados Parciais, do inglês Partial Least-

Squares Discriminant Analysis

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 13

1.2 Contaminantes em Alimentos ................................................................................................... 14

1.3 Metabolômica em Alimentos .................................................................................................... 15

1.4 Técnicas analíticas para determinação de substâncias em alimentos utilizando a

Metabolômica ................................................................................................................................. 16

1.4.1 Técnicas Cromatográficas .....……………….............……………...………..…................... 17

1.4.2 Curva de Calibração e Adição de Padrão .............................................................................. 17

1.4.3 Espectrometria de Massas ...........…………….....................................................….............. 18

1.4.4 Ionização por Elétrons (EI) ......................................................….......................................... 20

1.4.5 Ionização por Spray de Elétrons (ESI) ................................................................................... 20

1.4.6 Tandem MS (MS/MS) ........................................................................................................... 21

1.4.7 Monitoramento de Reações Múltiplas (MRM)....................................................................... 22

1.4.8 Espectrometria de Massas de Alta Resolução ...............……………………........................ 23

1.5 Produtos Alimentícios ............................................................................................................... 23

1.5.1 Leite ....................................................................................................................................... 23

1.5.2 Carne ...................................................................................................................................... 27

1.5.3 Cachaça ......................................................……...…………….......…….............................. 29

2. OBJETIVOS ............................................................................................................................... 32

2.1 Objetivos Específicos ................................................................................................................ 32

3. METODOLOGIA ....................................................................................................................... 33

3.1 Infraestrutura utilizada no projeto ............................................................................................. 33

3.2 Análise Estatística dos Dados ................................................................................................... 33

3.3 Propostas Estruturais ................................................................................................................. 33

4. RESULTADOS ........................................................................................................................... 34

4.1. Artigo I: Evaluating the Effects of the Adulterants in Milk using Direct-Infusion High-

Resolution Mass Spectrometry......................................................................................................... 34

4.2 Artigo II: Migration from Plastic Packaging into Meat ........................................................... 52

4.3 Artigo III: New Approach of QuEChERS and GC-MS Triple-Quadrupole for the

Determination of Ethyl Carbamate content in Brazilian cachaças ................................................ 62

5. DISCUSSÃO GERAL ................................................................................................................ 80

6. CONCLUSÃO ............................................................................................................................ 82

7. REFERÊNCIAS .......................................................................................................................... 83

8. ANEXOS .................................................................................................................................... 88

13

1. INTRODUÇÃO

Atualmente, existe uma grande tendência no investimento em pesquisas capazes

de realizar análises essenciais que garantam a qualidade e a segurança de alimentos. A

avaliação e o desenvolvimento de métodos analíticos adequados para as necessidades de

um país produtor como o Brasil, bem como a natureza dos seus produtos, requer dados

confiáveis e assertivos sobre os alimentos comercializados ou potencialmente

comercializáveis, tanto internamente quanto no exterior. O desenvolvimento de uma

infraestrutura analítica eficiente garante à população alimentos nutritivos, com altos

níveis de segurança em relação à contaminantes e, portanto, alimentos considerados de

alta qualidade. Além disso, é possível evitar a rejeição de produtos que possuem

potencial para exportação, visto que uma infraestrutura analítica eficiente possibilita a

adequação com os mais altos padrões de qualidade internacionais.

Dessa forma, o uso de técnicas instrumentais rápidas, com alta precisão,

exatidão, versatilidade e simplicidade operacional torna-se extremamente desejável

dentro do escopo da análise de alimentos1,2. Nesse segmento, figuram com grande

destaque as técnicas baseadas em espectrometria de massas (MS, Mass Spectrometry).

O desenvolvimento de novas fontes de ionização, as melhorias em analisadores (como

por exemplo o aumento de sua sensibilidade e especificidade) e a criação de sistemas de

aquisição de dados com grande rapidez qualitativa e quantitativa contribuíram para a

aplicação da MS na análise de diversos compostos encontrados em alimentos3,4.

Neste cenário promissor, a MS tornou-se a principal ferramenta utilizada na

metabolômica de alimentos. Com início no final dos anos 90, a análise do metaboloma e

da impressão digital metabólica (metabolic fingerprinting) conquistaram grande

aplicação em rotinas de análises de alimentos5,6. Agilidade na interpretação de dados e

métodos simplificados para elucidação do perfil químico de amostras são características

que trouxeram grande interesse na última década, tanto por parte da indústria quanto

pela academia, visando incorporar e desenvolver essas metodologias em laboratórios

especializados. Além disso, a exigência de estratégias analíticas altamente refinadas

para garantir a qualidade de produtos que possuem composição nutricional superior

fazem com que a plataforma metabolômica esteja em nível privilegiado, inclusive, nos

próximos anos6,7.

14

1.2 Contaminantes em Alimentos

Os alimentos possuem uma composição complexa que engloba de maneira geral

seus macronutrientes (proteínas, carboidratos e gorduras) e micronutrientes (vitaminas e

minerais). No entanto, esta composição também pode ser uma fonte importante de

compostos com potencial tóxico. Contaminantes podem ser definidos como qualquer

substância indesejável presente nos alimentos, podendo ser classificados como fatores

antinutricionais ou compostos naturalmente presentes na matriz de determinado

alimento (p. ex.: oxalatos em espinafre); compostos adicionados intencionalmente ou

acidentalmente (p. ex.: corpos estranhos, aditivos alimentares, pesticidas, medicamentos

veterinários, componentes da embalagem) e, por fim, compostos originados durante o

processamento (p. ex.: aminas aromáticas heterocíclicas, hidrocarbonetos policíclicos

aromáticos, nitrosaminas, acrilamidas, carbamatos, entre outros)8.

A contaminação alimentar é um assunto de grande preocupação pois pode

acarretar em diversos danos a saúde, o que resulta na aplicação de regulamentações

rigorosas de seus níveis de concentração tanto pelo governo nacional quanto

internacional, através da Comissão do Codex Alimentarius9. Este é um problema

conhecido, que possui registro na história de mais de 8.000 anos atrás e, com o

crescimento do agronegócio e da globalização, tornou-se recorrente em todo o mundo10.

Além disso, a contaminação alimentar tornou-se mais grave nos últimos anos devido ao

desenvolvimento da indústria e à consequente poluição ambiental, o que torna cada vez

mais difícil proteger os consumidores destes possíveis eventos11.

A análise de contaminantes químicos relevantes é uma parte essencial dos

programas de testes de segurança de alimentos para garantir a segurança do consumidor

e a conformidade com os limites regulatórios. Técnicas analíticas modernas podem

determinar contaminantes químicos conhecidos em matrizes alimentares complexas em

níveis de concentração muito baixas. Além disso, eles também podem ser efetivos na

descoberta e identificação de contaminantes químicos novos ou inesperados12,13. Desta

forma, devido a importância global de se manter tanto a segurança quanto a qualidade

alimentar temos que o desenvolvimento de novas técnicas analíticas responsáveis por

auxiliar na identificação de contaminantes em alimentos, são cruciais para que estas

substâncias sejam reguladas de maneira eficiente e concisa pelos órgãos reguladores.

15

1.3 Metabolômica em Alimentos

Durante o final do século 20 e o início do século 21, as metodologias clássicas

de pesquisa biomédica abriram espaço para uma abordagem holística introduzida pela

genômica, proteômica, transcriptômica e metabolômica, que incluíram novas estratégias

analíticas com o objetivo de identificar e quantificar biomarcadores 14,15. De maneira

geral, biomarcadores, ou marcadores químicos, são definidos como moléculas que

traduzem uma característica; indicando um estado ou uma resposta que confere

identidade às amostras analisadas, permitindo traçar correlações entre diferentes

grupos15,16. Assim, a definição mais aceita de metabolômica é a de que este é um ramo

da ciência que trata da pesquisa e análise qualitativa e/ou quantitativa de todos os

metabólitos de um sistema ou processo bioquímico17. Esses metabólitos são intrínsecos

ao nível de atividade bioquímica (ou fisiopatológica) desse organismo, via metabólica

ou processo, facilitando sua correlação com o fenótipo ou resultado desenvolvido. A

expansão da utilização de estratégias metabolômicas é salientada em estudos de

diferentes áreas do conhecimento, como doenças humanas18, toxicologia 19, análise de

plantas 20, nutrição humana 21 e, mais recentemente, controle de qualidade e processo

22,23.

Atualmente a metabolômica em alimentos ocupa um lugar de destaque14,24, pois

a preocupação em relação aos alimentos deixou de ser apenas relacionada com a

prevenção de sua deterioração e extensão de sua vida de prateleira, enfocando hoje em

dia a análise detalhada de seus macro e micronutrientes (água, carboidratos, proteínas,

lipídios, vitaminas e sais minerais). Evidências crescentes demonstram que há uma

estreita relação entre a dieta e algumas doenças, o que fornece grandes investimentos,

tanto governamentais como particulares, para impulsionar as atividades de pesquisa

relacionadas à metabolômica24,25. As propriedades médico-preventivas, além do valor

nutricional dos constituintes naturais dos alimentos, de um lado, e os efeitos tóxicos de

constituintes e contaminantes do outro, tornaram prioritário o conhecimento da total

composição química dos alimentos através do emprego das mais diversas técnicas

instrumentais, utilizando a ferramenta ômica25. Em diversos países, hoje não é mais

permitida a comercialização de alimentos sem que a sua composição seja do

conhecimento do consumidor. Os benefícios decorrentes da redução de problemas

relacionados à saúde, dos gastos com medicamentos e de atendimento hospitalar,

aliados à maior produtividade de uma população sadia, retribuem os investimentos em

pesquisas que visam proporcionar uma dieta adequada e saudável para a população.

16

Estes esforços requerem a busca por novas tecnologias para a análise de alimentos e,

nesse contexto, a aplicação da ferramenta metabolômica vem trazendo diversos

benefícios 24.

A metabolômica é didaticamente dividida em duas estratégias: análise de

moléculas-alvo (“target analysis”) ou análise de identidade amostral (“metabolic

fingerprinting”). Como os próprios nomes sugerem, na primeira deseja-se estabelecer o

foco em uma via metabólica ou molécula em particular, onde métodos bastante

específicos são desenvolvidos para essa finalidade. A segunda, por sua vez, tem por

finalidade estabelecer uma “impressão digital” da amostra, baseando-se em sinais

característicos de um grupo particular de moléculas/classes de compostos presentes na

mesma, estabelecendo um “padrão químico”, muitas vezes mesmo sem a necessidade de

quantificação e/ou elucidação estrutural26. Os compostos identificados através destas

estratégias metabolômicas podem ser validados e, posteriormente, utilizados como

biomarcardores, também chamados de “compostos identificadores”, que conferem à

amostra características importantes do ponto de vista de processamento, controle de

qualidade, segurança e autenticidade de alimentos, sempre mediante à sua presença ou

ausência27.

No Brasil há escassez de dados em pesquisa de metabolômica utilizada como

ferramenta para o controle e rastreabilidade de alimentos28. A análise de constituintes e

marcadores químicos presentes nos alimentos e seus efeitos metabólicos são

desafiadores, uma vez que impactam diretamente nas pesquisas sobre nutrição e na

forma como o alimento é introduzido na sociedade. Desta forma, o acompanhamento

dos marcadores químicos associados aos alimentos desde a matéria-prima até o produto

final, é essencial para garantir qualidade e segurança ao consumidor. O uso da análise

metabolômica suportada por técnicas instrumentais rápidas com alta precisão, exatidão

e versatilidade tornam-se indispensáveis na área de alimentos. As técnicas de MS

ocuparam um papel de destaque na última década, pois preenchem tais requisitos28.

Portanto, aliar a metabolômica à técnicas de MS torna-se uma tarefa de suma

importância tecnológica e econômica para o campo de anáise de alimentos no Brasil.

1.4 Técnicas analíticas para determinação de substâncias em alimentos utilizando a

Metabolômica

A maior parte dos contaminantes químicos conhecidos nos alimentos são

pequenas moléculas orgânicas. Exceto para adulterantes de alto nível, eles estão

17

tipicamente presentes em alimentos em baixas concentrações (partes por milhão, bilhão

ou trilhão). A análise de biomarcadores em matrizes alimentares se mostra tão

desafiadora quanto as análises de amostras de fluidos biológicos e tecidos; visto que em

ambos estão presentes peptídeos, aminoácidos, lipídeos, carboidratos, vitaminas,

polifenóis, contaminantes e aditivos alimentares29. Na análise de alimentos, devido à

sua complexidade, é comum a separação prévia dos analitos de interesse durante o

preparo de amostras, através de protocolos de extração, sendo a mostra final geralmente

analisada por técnicas cromatográficas. A grande ênfase dada ao preparo de amostras

deve-se aos problemas relacionados ao tempo despendido nesse processo, ao grande

consumo de reagentes e solventes e ao custo gerado30. O desenvolvimento do método

QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe) foi um avanço no preparo de

amostras para a detecção de resíduos31. Esse método é utilizado eficientemente para a

limpeza e extração em amostras para a detecção tanto de pesticidas, quanto de outros

contaminantes presentes em alimentos, como micotoxinas e fármacos32, 33.

1.4.1 Técnicas Cromatográficas

A cromatografia gasosa (GC, Gas Chromatography) acoplada à espectrometria

de massas (GC-MS) é uma importante ferramenta na análise de voláteis, principalmente

quando associada aos métodos de clean-up de amostras como a extração em fase sólida,

QuEChERs e uso dos probes para análise em tempo real 32,34. Embora o uso da

cromatografia líquida (LC, Liquid Chromoatography) seja mais comum em estudos de

ciências dos alimentos, sendo a junção LC-MS capaz de permitir a aplicação de

procedimentos genéricos de preparo de amostra, extraindo grande quantidade de

compostos com características físico-químicas distintas, a GC-MS apresenta-se como

uma importante ferramenta na detecção de resíduos químicos em alimentos30.

1.4.2 Curva de Calibração e Adição de Padrão

Em química analítica, uma curva de calibração, também conhecida como curva

padrão, é o método de escolha para determinação de uma substância específica em uma

amostra desconhecida. O procedimento comumente utilizado envolve a comparação da

amostra desconhecida com um conjunto de amostras padrão que possuem concentrações

conhecidas para substância que se quer determinar35. Este tipo de abordagem é um dos

vários tipos que podem ser utilizados para o problema de calibração de instrumentos;

outras abordagens incluem a utilização de um padrão interno ou realizar uma mistura de

18

padrão analítico diretamente à amostra desconhecida, sendo este ultimo método

conhecido como adição de padrão ou spiking 36. Todas estas curvas são comumente

empregadas para análise de compostos químicos em alimentos quando da sua

determinação através de métodos cromatográficos, tais como LC ou GC.

No caso da metodologia de Adição de Padrão, quantidades conhecidas do analito

padrão são adicionadas à amostra de concentração desconhecida e através do aumento

do pico do cromatograma é possível deduzir quanto do analito havia na amostra

originalmente desconhecida. Esta metodologia é especialmente apropriada quando a

amostra em questão possui uma composição complexa, o que pode afetar a resposta

analítica, gerando o efeito de matriz. Pode-se definir como matriz tudo que estiver

presente em uma determinada amostra que for diferente do analito; desta forma, o efeito

de matriz seria definido como uma alteração no sinal analítico causada por qualquer

outro componente na amostra que não seja o analito 35. Este efeito é particularmente

comum no campo da análise de alimentos, visto que estes são considerados amostras

complexas devido a sua composição ser extremamente variada, o que torna o emprego

da curva de Adição de Padrão uma abordagem de destaque para determinação de

substâncias em alimentos.

1.4.3 Espectrometria de Massas

A consolidação da MS como técnica de referência no âmbito da química

analítica (quali e quantitativa) ocorreu nas décadas de 60 e 70. Porém, sua utilização em

alimentos foi, por muito tempo, restrita por impedimentos tecnológicos. O emprego da

MS atualmente é destaque na análise de marcadores químicos em alimentos de forma

targeted e untargeted14. A identificação desses marcadores em metabolômica

geralmente é feita por equipamentos com custo elevado. Entretanto, o ganho maior se

baseia na grande quantidade de amostras que podem ser analisadas por dia ou por

semana, tornando o uso desses equipamentos custo-efetivos16. Para a obtenção de

informações completas sobre as características de cada amostra, diferentes métodos de

ionização foram desenvolvidos ao longo dos anos43, como a ionização por elétrons (EI,

Electron Ionization) e a ionização por spray de elétrons (ESI, Electrospray Ionisation).

As vantagens e desvanatgens das diferentes técnicas utilizadas para determinação de

substâncias em alimentos utilizando a metabolômica estão resumida no Quadro 1.

19

Quadro 1. Comparação entre as diferentes tecnologias utilizadas em metabolômica. (Adaptado de Wishart, 200838).

Tecnologia Vantagens Desvantagens

Cromatografia Gasosa –

Espectrometria de Massas

(GC-MS)

Robustez

Custo mediano

Quantitativo (com calibração)

Necessária pequena quantidade de amostra

Alta sensibilidade

Ampla biblioteca para identificação de metabólitos

Detecta a maioria dos compostos orgânicos e alguns inorgânicos

Excelente reprodutibilidade de separação de compostos

Amostra não recuperável

Necessita demaior preparo de amostra/derivatização

Necessita de separação

Análise longa (20-30 min/amostra)

Não pode ser acoplada à técnicas de imageamento

Difícil identificação de novos compostos (uso de padrões)

Cromatografia Líquida –

Espectrometria de Massas

(LC-MS)

Excelente sensibilidade

Versatilidade

Detecta a maioria dos compostos orgânicos e alguns inorgânicos

Necessária pequena quantidade de amostra

Potencial para detecção de grande parte do metaboloma

Amostra não recuperável

Instrumentação cara

Análise longa (20-30 min/amostra)

Baixa resolução de separação e reprodutibilidade (comparado

a GC)

Menos robusto que a NMR e GC-MS

Limitada biblioteca para identificação de metabólitos

Difícil identificação de novos compostos (uso de padrões ou

alta resolução)

Espectrometria de massas

(MS)

Excelente sensibilidade

Versatilidade

Rapidez

Pode ser usado para imagem (MALDI-Imaging) e alta resolução

(HRMS)

Diversos bancos de dados de metabólitos (p. ex.: HMDB, METLIN,

LIPIDMAPS)

Identificação de compostos

Menor preparo de amostra/injeção direta

Potencial para detecção de grande parte do metaboloma

Seletividade aliada ao experimento MS/MS

Amostra não recuperável

Instrumentação cara

Análise quantitativa depende do equipamento

20

1.4.4. Ionização por Elétrons (EI)

A EI se caracteriza por ser um processo destrutivo, através da fragmentação das

moléculas neutras presentes na amostra pela colisão com elétrons emitidos pela fonte de

ionização. Essa técnica permite a análise de moléculas de baixa e média polaridade com

faixa de massa abrangente39. No processo de ionização, um feixe de elétrons emitido

pela fonte do equipamento colide com moléculas neutras presentes na amostra. A

energia dos elétrons é transferida para as moléculas neutras durante a colisão, podendo

exceder a energia de ionização, o que resulta na ionização por ejeção de elétrons. Além

da ionização das moléculas neutras, durante o processo de transferência de energia

podem ser gerados íons multiplamente carregados, íons rearranjados e fragmentos

moleculares, entre outros, os quais em conjunto auxiliam na identificação e elaboração

da proposta estrutural das moléculas em análise39, conforme representado a seguir:

ABC + 1e- → ABC+. + 2e- (ionização simples) ou

ABC2+. + 3e- (ionização múltipla) ou

AC+ + B. + 2e- ou AC+. + B + 2e- (rearranjo/fragmentação)

Embora a EI tenha sido o primeiro método de ionização desenvolvido para

espectrometria de massas no início do século 20, o uso dessa técnica ainda é relevante

atualmente, principalmente quando combinada como fonte de ionização na GC-MS39,40.

1.4.5 Ionização por Spray de Elétrons (ESI)

O processo de ESI forma moléculas carregadas tanto positiva quanto

negativamente (cátions e ânions, respectivamente), dependendo do tipo de solução na

qual a amostra se encontra. Soluções ácidas favorecem a formação de cátions e soluções

básicas, ânions; em ambos os casos, os íons são formados em solução.

Na Figura 1 encontra-se o processo de ionização por spray de elétrons. Observa-

se que a solução injetada no equipamento é submetida a um spray eletrolítico que oxida

os íons negativos, deixando as gotas produzidas no spray com excesso de íons positivos,

pois neste caso trata-se do modo de análise ESI positivo. Este feixe de íons gerado é

colimado, originando o “Cone de Taylor”. No caso do modo de análise ESI negativo,

ocorre o processo inverso, pois através da redução dos íons positivos da solução, são

geradas gotas com excesso de íons negativos.

Através de uma corrente contrária de nitrogênio, o solvente começa a ser

evaporado e o volume das gotas começa a ser gradativamente reduzido. Ocorre então a

repulsão crescente entre íons de mesma carga, com possível subdivisão das gotas até um

21

limiar no qual ocorre uma explosão coulômbica (coulomb explosion): formação de uma

pluma de cátions isolados em fase gasosa. Desta maneira, estes íons eventualmente

transferidos para a fase gasosa através deste processo brando e eficaz, denominado

dessolvatação, podem ser selecionados e analisados por MS3. O método de ionização

por ESI possui dentre suas vantagens o amplo espectro de massa e de polaridade de

moléculas passíveis de ionização41.

Figura 1. Processo de processo de ionização por spray de elétrons. (adaptado de Cech

& Christie, 200142).

1.4.6 Tandem MS (MS/MS)

O desenvolvimento de novos analisadores e as melhorias nas técnicas e controle

de reações de fragmentação molecular (MSn) permitiram a aplicação da MS altamente

específica para elucidação estrutural de compostos, ampliando ainda mais seu leque na

área de alimentos. Assim, segmentos como segurança alimentar e toxicologia de

alimentos são desafios potencialmente auxiliados por meio desse desenvolvimento

tecnológico.

A técnica de espectrometria de massas em modo tandem, também chamada de

MS/MS ou ainda MS2, utiliza dois ou mais analisadores de massas em sequência, logo

após a fonte de ionização. Os íons precursores são selecionados primeiro por um

analisador de massas e focados na região de colisão, na qual sofrem nova fragmentação,

22

originando produtos iônicos que serão, então, caracterizados por um segundo analisador

de massas43. Um dos equipamentos de MS/MS mais comuns é o do tipo triplo

quadrupolo (QqQ), onde as moléculas são selecionadas pelo primeiro analisador de

massas (quadrupolo, Q1), dissociadas por Dissociação Induzida por Colisão (CID,

Collision-Induced Dissociation) no segundo quadrupolo ou câmera de colisão hexapolar

(q), e por fim os fragmentos são analisados no último quadrupolo (Q2).

A LC e a GC são as técnicas de separação comumente acopladas à MS/MS,

sendo utilizadas para separar os compostos, ionizá-los e introduzi-los no primeiro

analisador de massas44,45. A grande vantagem do uso de MS/MS é o fato de ser uma

técnica confirmatória, pois cada pico/sinal pode ser verificado através de seu espectro

de massas obtidos nos diferentes modos de operação. Portanto, é uma técnica altamente

indicada para a análise e quantificação de moléculas presentes em baixas concentrações

em matrizes complexas, como alimentos46.

1.4.7 Monitoramento de Reações Múltiplas (MRM, Multiple Reaction Monitoring)

O Monitoramento Seletivo de Reações (SRM, Selected Reaction Monitoring) ou

MRM e uma técnica de fragmentação molecular utilizada em MS que permite o

monitoramento de reações específicas por CID. A natureza destas reações dependem

tanto da estrutura molecular quanto da massa de determinado íon47. Como resultado,

melhorias significantes na seletividade analítica podem ser alcançadas utilizando o

método MRM, pois esta ferramenta oferece alta sensibilidade aliada à análises custo-

efetivas para quantificação simultânea de diversos compostos em um único

experimento48.

A implementação de um experimento de MRM convencional envolve o uso de

um espectrômetro de massas com QqQ. O funcionamento detalhado deste tipo de

equipamento envolve um primeiro analisador (Q1) capaz de selecionar íons de uma

determinada razão massa-carga (m/z), correspondente ao íon intacto de um analito alvo;

esses íons são denominados íons precursores. O íon precursor é submetido a uma reação

por CID na célula de colisão (q), que na presença de um gás inerte e pressão apropriada

gera fragmentos iônicos do analito alvo. Os fragmentos com maior intensidade e

especificidade podem ser selecionados para também serem analisados, porém em um

segundo analisador (Q2). Este íons finalmente chegam no detector do equipamento e os

sinais detectados são gravados como um cromatograma iônico para o par de íons

precursor-fragmento49. Desta forma, o sistema QqQ permite uma análise rápida e

23

específica do analito alvo, características que podem ser amplificadas quando se

combina esta técnica com cromatografia, sendo a GC a combinação mais comum para

análise de alimentos46.

1.4.8 Espectrometria de Massas de Alta Resolução

Dada a complexidade das matrizes alimentares, uma resolução de massa limitada

leva à resultados imprecisos. Sistemas de espectrometria de massas com tecnologia

Orbitrap alcançam rotineiramente resolução de até 1.000.000 FWHM com precisão < 1

ppm. Os altos valores de resolução desses equipamentos têm como objetivo a alta

exatidão na determinação de moléculas complexas. Além da alta resolução e exatidão, a

técnica diferencia-se por fornecer informações que atuam na elucidação estrutural de

moléculas desconhecidas, sendo possível atribuir fórmulas moleculares (CcHhNnOoSs)

inequivocamente para medidas de baixa massa molar (< 450 Da) utilizando o princípio

de massas exatas e defeitos de massas37,50.

1.5 Produtos Alimentícios

1.5.1 Leite

O leite é um alimento extremamente complexo. Parte de seus componentes é

produzida pelas células secretoras da glândula mamária dos animais mamíferos e outra

porção é oriunda da corrente sanguínea dos mesmos. O fluido secretado pelas fêmeas

dos mamíferos, cuja principal função é fornecer os requerimentos nutricionais de seus

filhotes, deve suprir as suas necessidades energéticas (lipídios e carboidratos), proteicas

(aminoácidos), vitamínicas e de minerais. A ordenha ininterrupta de bovinos saudáveis

apresenta em média 3,7% de gordura, 3,4% de proteína, 4,8% de lactose, 0,7% de

cinzas e 12,7% de sólidos totais51. Segundo o USDA (United States Department of

Agriculture), a produção brasileira de leite terá um crescimento de 1,8% para o ano de

2018, atingindo 23,98 milhões de toneladas de leite, sendo que um terço dessa produção

é destinada para o mercado interno52.

Os lipídios do leite, comumente chamados de gordura, formam uma emulsão

com a fração aquosa do leite. Os triglicerídeos representam a maior fração dos lipídios

presentes no leite de bovinos, aproximadamente 98%. Diglicerídeos, monoglicerídeos,

ácidos graxos, fosfolipídios e colesterol também estão presentes em menor quantidade.

A lactose, um dissacarídeo formado por uma molécula de galactose e uma de glicose, é

o principal carboidrato do leite. As proteínas do leite estão distribuídas em duas frações

24

distintas: caseínas e proteínas do soro. A caseína corresponde a 80% do total proteico no

leite bovino, e pode ser subdividida em quatro frações principais, s1, s2, e -caseína, que

se agrupam na forma de micelas. As proteínas do soro apresentam formato globular,

sendo que as principais encontradas no leite bovino são: -lactoglobulina, -

lactoalbumina, albumina do soro sanguíneo e imunoglobulinas.

O leite bovino também possui uma quantidade significativa de minerais, dos

quais se destacam o cálcio, o fosfato e o citrato, além de vitaminas dos complexos A e

B53. Também apresenta em sua constituição diversas enzimas naturais. Entre elas

destacam-se a fosfatase alcalina e a lactoperoxidase por serem marcadores de um

adequado processamento térmico. O ponto de inativação da fosfatase alcalina (binômio

tempo-temperatura) é similar ao requerido para a destruição dos microorganismos

patogênicos mais resistentes ao tratamento, sendo assim, sua inativação garante um

produto inócuo para o consumidor. A lactoperoxidase é uma das enzimas mais

termorresistentes encontradas no leite e sua inativação é usada como marcador de

utilização de temperaturas mais elevadas em processos de pasteurização53,54.

Designado para a completa nutrição de bezerros em fase de crescimento, o leite

bovino também é um meio adequado para o crescimento acelerado de ampla variedade

de microorganismos. A abundância de carboidratos, proteínas e gorduras combinados

com o pH próximo da neutralidade favorecem o desenvolvimento da flora microbiana55.

Diversos fatores afetam a qualidade final do leite. Os fatores intrínsecos incluem a raça

do animal, o período de lactação, o número de parições, e a dieta oferecida à vaca. Os

fatores extrínsecos, por sua vez, são aqueles capazes de afetar a qualidade do produto

após sua produção, como por exemplo, o manejo e a higiene da ordenha, a velocidade e

a temperatura de resfriamento, o transporte e o armazenamento do leite antes do seu

processamento.

As raças mais comumente utilizadas para a produção de leite no mundo são:

Holandesa preta e branca, Holandesa marrom e branca, Ayrshire, Guernsey e Jersey56.

Esses animais são da espécie Bos taurus de alta produção, entretanto, por terem sido

selecionados na Europa, estão totalmente adaptados ao clima frio da região57. No Brasil,

devido ao clima quente estes animais sofrem um stress térmico extremamente

acentuado58. Segundo West, Mullinix & Bernard59, os aumentos da temperatura

ambiente, da umidade relativa do ar e da temperatura do animal estão relacionados à

diminuição do consumo de matéria seca pelos animais e consequente diminuição da

produção de leite. Visando amenizar o efeito da temperatura no plantel produtor de leite

25

é muito comum a utilização de raças adaptadas ao clima quente. No Brasil, utiliza-se o

gado Zebu (Bos indicus) isolado, principalmente a raça Gir, ou o cruzamento com a raça

Holandesa, resultando no Girolando60.

A lactação é um processo totalmente dependente da produção hormonal do

animal. Sendo assim, os animais sexualmente maduros são os aptos à produção de leite.

Khan & Shook61 relatam que animais mais velhos tendem a apresentar uma maior

produção em todas as lactações, contudo este efeito tende a diminuir com o avanço das

lactações. A alimentação do animal também interfere na produção de leite. A baixa

ingestão de matéria seca e a baixa ingestão energética diminui a produção de leite62. A

forma de apresentar a ração para os animais também altera a produção de leite63. Isto se

deve ao fato do animal necessitar ingerir uma dieta balanceada. Contudo, alimentos

energéticos, ricos em gordura (silagem), são muito mais palatáveis que aqueles ricos em

fibras (capim). Quando estes são apresentados separadamente, os animais aumentam a

ingestão de silagem e diminuem a ingestão de fibras, tornando suas dietas

desbalanceadas. Sistemas que misturam os ingredientes da dieta antes de apresentá-la no

cocho, conhecidas como Total Mixed Ration (TMR), e que, consequentemente,

dificultam a separação de seus componentes pelos animais são os mais adequados para

animais de alta produção64.

Com relação a qualidade do leite comercializado no país melhorar a qualidade e

a segurança do leite ao longo de todo o sistema produtivo é a proposta de um recente

edital lançado pela Secretaria de Desenvolvimento Agropecuário e Cooperativismo do

Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (SDC/Mapa). Esta tem como

objetivo principal assessorar e capacitar os produtores rurais na estruturação das

unidades de produção, especialmente na implementação de boas práticas

agropecuárias65. Dentro das boas práticas agropecuárias estão incluídos o controle

permanente da qualidade da água da propriedade rural, o registro e o acompanhamento

de dados e dos procedimentos realizados na propriedade, o adequado armazenamento e

transporte de matérias-primas, insumos e alimentos, a garantia da rastreabilidade dos

animais e dos produtos originados na propriedade, a higiene e os procedimentos

adequados de ordenha e pós-ordenha, a higiene, a limpeza, a manutenção e o

dimensionamento adequados dos equipamentos de ordenha e de refrigeração do leite, a

identificação, o registro e a segregação de animais sob tratamento veterinário ou

pastagens sob uso de agrotóxicos, o manejo adequado de bezerras na propriedade rural,

entre outros itens65.

26

Desta forma nota-se que o leite é um alimento que requer uma série de cuidados

durante o seu processamento, sendo um dos alimentos amplamente comercializados

tanto no Brasil quanto no mundo. Devido aos avanços da tecnologia o custo de sua

produção tem aumentado, o que o torna alvo de possíveis adulterações. A autenticidade

de alimentos é um aspecto importante para os consumidores, pois além de ser sinônimo

de qualidade, envolve a confiabilidade no que está sendo comprado. Alguns atributos

estão diretamente ligados à autenticidade de alimentos, como por exemplo: genética,

origem geográfica, tratamentos de colheita e pós-colheita, condições de processamento

e outros ingredientes que podem ser funcionais para a qualidade1. Atualmente, os

consumidores estão cada vez mais exigentes quanto às informações, segurança da

origem e conteúdo dos seus alimentos. Além disso, os fabricantes de alimentos buscam

fornecer e confirmar a autenticidade e denominação de origem dos componentes de seus

produtos alimentícios, uma vez que esta é uma maneira de agregar valor aos produtos

finais, além de atestar sua qualidade.

Determinar a autenticidade de alimentos pode impedir a falsa descrição, a

substituição por ingredientes mais baratos, e a adulteração, bem como a rotulagem de

origem incorreta. As agências reguladoras estão desenvolvendo normas legais e

políticas para determinar formas de identificar e marcar os alimentos utilizando

terminologia adequada. Por exemplo, regulamentações na União Européia66,67 fornecem

rotulagem de Denominação de Origem Protegida (DOP), Indicação Geográfica

Protegida (IGP) e Especialidade Tradicional Garantida (ETG), visando garantir a

autenticidade de produto regionais e alimentos especiais. Essas leis, impostas na União

Européia garantem que apenas os produtos genuinamente originários dessa região

podem ser vendidos como tal, eliminando a concorrência desleal e produtos enganosos

que podem ser de qualidade inferior ou feito de componentes diferentes.

No caso da certificação do leite no Brasil, com o incentivo do novo edital de

boas práticas agropecuárias proposto pela SDC/Mapa65 já existem pecuaristas que

receberam certificação de qualidade no estado de Minas Gerais, e a tendência é que esta

informação se multiplique com o passar do tempo. Desta forma, nota-se a importância

da garantia da qualidade para alimentos como o leite. Outro ponto importante seria o

caso de adulterações, que no caso do leite visam sempre extender a sua vida de

prateleira, controlando o desenvolvimento microbiológico e reduzindo a oxidação de

componentes. Os adulterantes mais comumente utilizados para este fim são o peróxido

de hidrogênio, formoldeído, hipoclorito de sódio e hidróxido de sódio68,69. Neste ponto,

27

a MS apresenta-se mais uma vez como uma grande ferramenta de análise na

identificação de possíveis adulterações de produtos alimentícios70,71, pois é uma técnica

bastante sensível e versátil, que deve ser considerada para utilização com tais fins.

1.5.2 Carne

O Brasil ocupa um dos primeiros lugares em produção agrícola e pecuária no

mundo. A pecuária é uma atividade econômica desenvolvida em áreas rurais que

consiste na criação de animais com o objetivo de comercializá-los, suprindo assim as

necessidades tanto da família como do criador. Fundamentalmente, a atividade em foco

é ligada à criação de gado (bovinos), embora seja considerada também a produção de

suínos, aves, equinos, ovinos e bufalinos. Esse ramo tem como responsabilidade

principal disponibilizar para o mercado alimentos como carne, leite e ovos, produtos

base da dieta humana. Além da carne, no caso dos bovinos são extraídas outras

matérias-primas como o couro (produção de calçados), a pele (vestuário) e os ossos

(produção de botões).

A pecuária exerce uma grande relevância nas exportações brasileiras, além de

abastecer o mercado interno. Cerca de 20% da área do país (174 milhões de hectares)

está atualmente ocupada por pastagens, sendo que a maior parte do rebanho de 215

milhões de cabeças é criada a pasto (estima-se que somente 3% do rebanho esteja em

sistema intensivo)72. A década de 2000 foi marcada pela consolidação do Brasil como

potência na produção e exportação de carne bovina, sendo que o Brasil assumiu a

primeira colocação dentre os exportadores em 200473.

Entre as diversas raças bovinas existentes no Brasil a comumente utilizada é a

raça nelore; uma das raças zebuínas. 80% do gado brasileiro é zebuíno (proveniente da

Índia), os outros 20% são de raças européias. O nelore provou ser o melhor gado para o

Brasil graças a sua adaptabilidade ao clima tropical do país. As raças europeias se

adaptam melhor à região sul e são utilizadas para o que se chama de “cruzamento

industrial”, isto é, cruzamento de gado zebu com gado europeu. Com relação à

segurança da carne comercializada atualmente, os consumidores não estão mais

interessados apenas em aspectos sensoriais, como por exemplo sabor, odor e textura.

Existe agora uma preocupação com relação aos constituintes dos alimentos, visando

principalmente à manutenção da saúde e qualidade de vida do consumidor. Devido a

isso, a segurança alimentar é agora uma preocupação primordial na indústria de

alimentos, e em particular na indústria de carne.

28

A embalagens de alimentos é uma forma importante para armazenar alimentos

em diferentes temperaturas, prolongando a vida de prateleira do produto e protegendo

os alimentos de agentes naturais (p. ex. o ar) que podem reduzir ou alterar a sua

qualidade. Dentre diversos materiais, os plásticos têm surgido como uma solução

prática, segura e confortável para embalagens de alimentos. Existem diferentes tipos de

plástico, cada um com propriedades únicas e diferentes aplicações no setor de alimentos

como, por exemplo, o policarbonato de alta densidade e o polietileno de baixa

densidade, copolímeros de estireno, polipropileno, entre outros. Estes plásticos são

fabricados a partir de vários polímeros e os aditivos são utilizados para alterar sua

elasticidade, flexibilidade, cor, resistência e durabilidade. Tanto o plástico quanto os

seus aditivos podem migrar a partir da embalagem para a comida ou bebida

acondicionada ao longo do tempo, como resultado de um aumento na temperatura ou de

algum choque mecânico74. A presença de componentes de plástico ou de aditivos nos

alimentos, se não for devidamente controlada, pode afetar as propriedades

organolépticas dos alimentos e até mesmo produzir efeitos de desregulação endócrina75,

se os níveis excedem os valores legais ou toxicológicos. Muitos plastificantes e aditivos

são considerados desreguladores endócrinos, e por isso podem afetar o sistema

reprodutivo ou até mesmo agir como agentes cancerígenos. Alguns destes produtos

químicos são os ésteres de ftalato, alquilfenóis, bisfenóis, entre outros74.

A União Europeia regulamenta que materiais em contato direto com alimentos

não devem ser capazes de ceder os seus constituintes aos alimentos em quantidades que

possam colocar em risco a saúde humana ou provocar uma alteração inaceitável da

composição, ou deterioração das características organolépticas do alimento embalado76.

Os materiais plásticos são especificamente regulamentados por uma comissão que

estabelece uma lista positiva de substâncias, incluindo todos os monômeros, outras

substâncias e aditivos que podem ser utilizados para a fabricação de embalagens

plásticas, bem como as restrições para os níveis de migração desses produtos químicos

em alimentos77. O uso de substâncias não incluídas na lista é proibido78. No Brasil

também existe este rígido controle pois recentemente a Agência Nacional de Vigilância

Sanitária (ANVISA) atualizou a norma brasileira que trata de embalagens plásticas,

seguindo os mesmos requisitos apontados anteriormente, com o intuito de aumentar a

segurança dos alimentos embalados no país79.

A carne bovina é amplamente comercializada e consumida no Brasil e nota-se

que a maioria dos cortes apresentam-se em embalagens plásticas. Com o intuito de

29

verificar a segurança destas embalagens e se há passagem de algum de seus

componentes para a carne a MS apresenta-se como uma grande ferramenta de análise,

que pode oferecer resultados rápidos e eficientes, sendo uma técnica bastante versátil

para análise de alimentos22,32,70,80.

1.5.3 Cachaça

A cachaça é uma bebida típica brasileira, sendo esta a denominação exclusiva de

destilados de cana de açúcar produzidos no Brasil. As suas principais características são

apresentar gradação alcoólica de 38% – 48% a uma temperatura de 20 ºC e ser obtida da

destilação do mosto de cana de açúcar fermentado81. O processo de fabricação da

cachaça não é padronizado em vários aspectos. O primeiro seria a matéria-prima

utilizada, neste caso a cana de açúcar, pois existem diversos tipos diferentes porém

similares em sua composição82. Além disso, grãos como milho ou arroz também podem

ser incluídos no mosto com o objetivo de fornecer nutrientes para melhorar o

desenvolvimento das cepas responsáveis pela fermentação83. Finalmente, o equipamento

utilizado pode ser proveniente de diversos tipos de materiais, pois a destilação pode ser

realizada, por exemplo, em colunas de aço inox (no caso de processos industriais) e em

alambiques de cobre (no caso da produçao artesanal)82.

O processo de maturação em barris de madeira é semelhante ao aplicado na

produção de vinho, onde barris de carvalho, bálsamo, jequitibá, jatobá ou amburana

podem ser empregados. Este último processo é opcional e é capaz de fornecer aromas,

sabores e coloração da madeira para a cachaça84. Entretanto, com relação aos aspectos

organolépticos, a cachaça deve preencher alguns parâmetros químicos que asseguram

que o consumo moderado do produto não seja capaz de acarretar riscos para a saúde.

Contaminantes como metanol, sec-butanol, n-butanol, cobre, etil carbamato, assim

como o ácido acético, um composto de off-flavor responsável pela acidez característica

da cachaça, são espécies chave diretamente relacionadas com o comprometimento da

qualidade do destilado final82,85,86.

De acordo com uma avaliação da IARC (International Agency for Research on

Cancer) de 2007, o etil carbamato é considerado carcinogênico para animais de

laboratório e por isso foi listado como uma substância potencialmente carcinogênica

para humanos, pertencendo ao Grupo 2A da Classificação de Substâncias

Carcinogênicas87,88. Este composto é um etil éster do ácido carbâmico que é formado

naturalmente em processos de fermentação, podendo ser derivado de diferentes

30

precursores, como por exemplo ácido hidrociânico, uréia, citrulina, e N-carbamil através

de reação com etanol88. Devido a esta característica, é fácil encontrar este composto em

diversos tipos de comidas e bebidas como destilados, vinho, cerveja, pão, shoyu e

iogurte89. O consumo de etil carbamato apenas de fontes alimentícias é insignificante.

Entretanto, incluindo o consumo de bebidas alcoólicas regularmente, a exposição a este

composto aumenta. Atualmente, a cachaça figura como a terceira bebida destilada mais

consumida no mundo, e no Brasil é a segunda bebida alcoólica mais consumida, depois

da cerveja90. Dado o seu amplo consumo, devem ser tomadas medidas em relação à

redução da concentração de etil carbamato nas bebidas alcoólicas. O Canadá, através do

Health and Welfare Department em 1985, foi o primeiro país a determinar os limites de

concentração de etil carbamato em vinhos, destilados, destilados de frutas e licores. Por

isso, tornou-se referência para os Estados Unidos e União Européia quanto à legislação

sobre o assunto91. Em 1990, o FDA publicou uma nota limitando o teor de etil

carbamato nos uísques americanos para 125 µg L-1 92. Segundo o Ministério da

Agricultura, Pecuária e Abastecimento, o limite para esse contaminante em cachaças no

Braisl é 150 µg L-1 81. A importância do controle dos níveis de etil carbamato, portanto,

deve ser entendida como uma questão não apenas sobre aspectos relacionados à saúde e

segurança, mas também econômicos, pois qualquer resultado fora de especificação pode

representar uma barreira à exportação de cachaça para o mercado internacional.

Muitos métodos diferentes utilizando MS foram desenvolvidos nos últimos anos,

sendo capazes de avaliar uma grande variedade de parâmetros de qualidade da

cachaça93,94,95, assim como muitos protocolos para análise e extração do etil

carbamato88. O uso da GC-MS com quadrupolo único é a técnica amplamente utilizada

para análise deste contaminante, de forma que esta é capaz de promover com grande

eficiência tanto a identificação quanto a quantificação de amostras de alimentos e

bebidas alcoólicas88. Entretanto, existe um procedimento comum de adição de açúcar à

cachaça com o intuito de reduzir o sabor alcoólico desta bebida, padronizando o seu

sabor, melhorando a qualidade sensorial final. No caso da cachaça, a legislação

brasileira permite a adição de até 6 g L-1 de sacarose, como procedimento de

padronização do sabor. Não obstante, se no rótulo estiver descrito “adoçado”, o produto

final pode conter até 30 g L-1 de sacarose em sua composição96. Como a GC-MS é a

técnica de escolha para o controle de qualidade da cachaça, um alto conteúdo de

sacarose pode facilmente contaminar o percurso interno do fluxo do GC, acarretando

numa maior frequência de manutenções de equipamento, além de comprometer a

31

precisão dos resultados. Neste caso, o desenvolvimento de uma nova metodologia capaz

de lidar com as quantidades excessivas de sacarose presentes na cachaça, mantendo a

precisão e exatidão da análise torna-se necessário.

Relacionado com o preparo de amostra, carbamatos usualmente estão presentes

em concentrações muito baixas e em matrizes complexas, como o caso das amostras de

cachaça. Por causa disto, sua análise não pode ser realizada sem alguns tratamentos

preliminares de amostras. Um procedimento de preparação de amostras deve fornecer a

concentração de analitos e também a sua limpeza, melhorando assim a determinação do

analito de interesse. Recentemente, a busca por métodos miniaturizados que são

eficientes e não utilizam grandes quantidades de reagentes e solventes faz com que a

melhoria dos métodos de extração esteja em foco. Assim, diferentes procedimentos de

microextração foram desenvolvidos como alternativas, como a metodologia

QuEChERS, que tem sido amplamente utilizada no pré-tratamento de amostras

complexas. Esta técnica baseia-se num método de dois passos onde é primeiro realizado

a extração, baseada no particionamento que ocorre através do fenômeno de salting-out,

responsável pelo equilíbrio entre as camadas aquosa e orgânica. O segundo passo é uma

extração dispersiva em fase sólida, que envolve a limpeza da amostra usando

combinações de diferentes tipos de sais sorventes ou aminas primárias-secundárias com

o objetivo de remover quaiquer substâncias interferentes 97,98.

Finalmente, nesta tese apresentamos uma nova metodologia para aplicação de

QuEChERS, baseada unicamente na extração salting-out, como uma maneira de

eliminar resíduos de açúcar e água de amostras de cachaça (artesanal e comercial), o

que foi corroborado através de experimentos utilizando LC, sem comprometimento da

identificação e quantificação do etil carbamato. Adicionalmente, realizamos a

comparação desta nova metodologia com a atualmente empregada na análise do etil

carbamato.

32

2. OBJETIVOS

O estudo dos diferentes produtos alimentícios apresentados (leite, carne e

cachaça) abrange grande parte de processos presentes em atividades de grande

importância no país. Desta forma, os objetivos principais deste trabalhao foram:

- Propor novas metodologias de análise de produtos alimentícios utilizando a plataforma

metabolômica em conjunto com novas técnicas de Espectrometria de Massas com

ionização por spray de elétrons (ESI-MS) e Cromatografia a Gás acoplada à

Espectrometria de Massas (GC-MS);

- Minimizar ou eliminar o preparo de amostras nas análises destes produtos, diminuindo

custos, tempo e principalmente o consumo de solventes orgânicos, adequando-se aos

parâmetros de química verde.

2.1 Objetivos Específicos

Desenvolver novas metodologias analíticas para:

- Verificar parâmetros de qualidade do leite através do estudo da interação entre

adulterantes (formol, hidróxido de sódio, peróxido de hidrogênio e hipoclorito de sódio)

com os componentes nutricionais do leite;

- Verificar o fenômeno de migração de componentes advindos da embalagem de carne

vermelha embalada a vácuo;

- Identificar e quantificar o etil carbamato em amostras de cachaças (comerciais e

artesanais) eliminando a interferência da sacarose na análise.

33

3. METODOLOGIA

As metodologias específicas para cada uma das frentes estudadas nesta tese

serão abordadas em detalhes nos artigos apresentados na seção 4. Resultados.

3.1 Infraestrutura utilizada no projeto

O projeto foi desenvolvido no Laboratório Innovare de Biomarcadores, inserido

na Faculdade de Ciências Médicas (FCM) da Universidade Estadual de Campinas

(Unicamp). A coordenação do Laboratório e do projeto está a cargo do professor Dr.

Rodrigo Ramos Catharino, que possui ampla experiência em Análise de Alimentos. O

grupo tem desenvolvido pesquisas de alta qualidade, com cunho relevante na busca de

aplicações inovadoras em áreas como ciência de alimentos e ciências da vida. Os

equipamentos utilizados no desenvolvimento desse projeto de pesquisa foram:

- Cromatógrafo a Gás Agilent GC-MS 7890/7000, com fonte de ionização EI, e

analisador triplo quadrupolo (QqQ). Equipamento equipado com injetor automático, o

que faciltou o desenvolvimento da metodologia .

- Espectrômetro de Massas ESI-LTQ-XL Orbitrap Discovery, Thermo Scientific: com

fonte de ionização ESI, analisadores quadrupolo e armadilha iônica linear (linear ion

trap - LTQ) associado a um analisador Orbitrap de alta resolução (30.000 FWHM) e

precisão < 5 ppm, o que faciltou na identificação de compostos por meio do uso de

banco de dados.

3.2 Análise Estatística de Dados

O emprego de análises multivariadas como a Análise de Componente Principal

(PCA, Principal Component Analysis), a Análise Discriminante por Mínimos

Quadrados Parciais (PLS-DA, Partial Least-Squares Discriminant Analysis) ou de suas

variantes estão comumente presentes para a classificação de amostras29. A análise

multivariada foi realizada utilizando o sistema web MetaboAnalyst 3.099. Com o auxílio

da análise de componentes pretende-se observar as principais diferenças entre as

amostras (antes e após tratamento) visando a descoberta marcadores relacionados aos

contaminantesde alimentos.

3.3 Propostas Estruturais

A identificação dos marcadores químicos foi realizada através da comparação

entre as razões m/z em alta resolução e consulta de bancos de dados (NIST e METLIN).

34

4. RESULTADOS

A seguir estão apresentados os trabalhos desenvolvidos durante este doutorado,

demonstrando a execução e discussões de cada umas das frentes anteriormente

apresentadas.

4.3 ARTIGO I

Evaluating the Effects of the Adulterants in Milk using Direct-Infusion High-

Resolution Mass Spectrometry100

Tatiane Melina Guerreiro1, Diogo Noin de Oliveira1, Carlos Fernando Odir

Rodrigues Melo1, Estela de Oliveira Lima1, Marta Ribeiro da Silva1 and Rodrigo Ramos

Catharino1*

1 Innovare Biomarkers Laboratory, School of Pharmaceutical Sciences, University of

Campinas – UNICAMP, Campinas, SP, Brazil.

*Correspondence: Rodrigo Ramos Catharino (rrc@g.unicamp.br)

Abstract

Milk is an extremely complex food, capable of providing essential nutrients as well as

being an important source of energy, and high-quality proteins and fats. Due to

advances in technology, and to meet the increasing demand, production costs have

increased, turning milk into a target of adulterations. Routine methods usually applied

to certify the quality of the milk are restricted to microbiological tests, and assays that

attest the nutritional composition within the expected values. However, potentially

harmful byproducts generated by adulterating substances in general are not detected

through these methodologies. In this contribution, we simulated the adulteration of

freshly produced milk samples with four adulterants whose use already had reported for

extended shelf life: formaldehyde, hydrogen peroxide, sodium hydroxide, and sodium

hypochlorite. These samples were submitted to direct-infusion high-resolution mass

spectrometry analysis and multivariate statistical analysis. This approach allows the

characterization of a series of molecules modified by the adulterants, whatdemonstrates

how these species affect the nutritious characteristics of this product.

Keywords: Milk. Adulteration. Oxidation. Quality. Adulterants. Shelf life.

35

Introduction

Globally, there are about 7 billion consumers of milk and dairy products, most of

them concentrated in developing countries (FAO, 2016). Within this market, Brazil

figures as the world's fifth largest dairy producer, in a ranking that brings India as the

first, accounting for 18% of global production, followed by the United States, China and

Pakistan (IFCN, 2014). According to the United States Department of Agriculture

(USDA), Brazilian milk production is expected to grow 1.8% in 2018, reaching 23.98

million tons, with a third of this production destined only to the inner market (USDA,

2017).

Milk is an extremely complex food, capable of providing essential nutrients as

well as being an important source of energy, and highquality proteins and fats. Cow's

milk is composed on average of 87% water, 4 to 5% lactose, 3% protein, and 3 to 4%

fat (Pereira, 2014). Although it is a food with high nutritional value, it has a short shelf

life and therefore requires specific processing steps such as pasteurization to work

around this problem. Pasteurization is a process that involves the heating followed by

rapid cooling of the milk, so that the levels of any potential pathogen are reduced,

thereby reducing health risks and resulting in increased shelf life (Kapaj & Deci, 2017).

In addition, regarding the improvement of milk quality and safety, a government

program was created in Brazil to advise and train rural producers in the structuring of

their production units, implementing good agricultural practices. This program

encompasses sanitary control during all stages of milk processing, i.e. from cow rearing,

milking, to storage and proper transport of milk (MAPA, 2016). In this way, it is noted

that milk is a food that requires care in its processing chain.

Due to advances in technology, and to meet the increasing demand, production

costs have increased, turning milk into a target of adulterations (Hemme, Uddin, &

Ndambi, 2014). This activity may generate not only economic losses, but also increased

risk to consumers' health, commonly digestive problems (Tay, Fang, Chia, & Li, 2013).

Milk adulteration involves the dilution and/or addition of lower-quality products at low

concentrations and, in some cases, harmful products with the aim of masking inferior

quality, increasing the volume or even replacing a substance naturally present in milk to

increase the yield of the final product (Nascimento, Santos, Pereira-Filho, & Rocha,

2017). One of the simplest examples of milk adulteration is the addition of water to

increase the final volume. Nonetheless, recent and more sophisticated frauds have been

reported in both media and in scientific documents, and are often more difficult to

36

detect (Nascimento et al., 2017). Some examples of recent adulterations would be the

addition of urea and melamine to increase nitrogen content (Jha, Jaiswal, Borah,

Gautam, & Srivastava, 2015; Lu et al., 2017), the addition of formaldehyde, hydrogen

peroxide, hypochlorite, dichromate, and salicylic acid in order to increase shelf life

(Jeong et al., 2015), and the addition of vegetable oils and surfactants to alter the fat

content (Rani, Sharma, Arora, Lal, & Kumar, 2015).

Regarding these chemical adulterants, regulatory authorities such as the Food

and Drug Administration (FDA) in the United States and the World Health

Organization (WHO) have established maximum residue limits (MRLs) and tolerable

daily intakes (TDI) to maintain food safety and health of consumers (Nascimento et al.,

2017). In this way, certifying and guaranteeing aspects of milk quality is important for

the population health, in addition to also increase the reliability of the products.

Furthermore, consumers are increasingly demanding with respect to information on the

safety, origin and composition of foods. In this way, determining food authenticity is

essential to prevent substitution by cheaper, often harmful, ingredients and,

consequently, adulteration.

Routine methods usually applied to ensure the quality of the milk are restricted

to microbiological tests, and assays that attest the nutritional composition within the

expected values. However, the effects of adulterating substances in general are not

detected through these methodologies, and methods that assess the consequences of

adulterations are scarce. An example of this fact would be the addition of hydrogen

peroxide with the objective of activating the enzyme lactoperoxidase, naturally present

in milk, increasing its antimicrobial activity, which increases the shelf life of

pasteurized milk. The identification methods commonly used in this case are specific

sensors for identification of hydrogen peroxide, but these are not able to evaluate the

effects caused by the adulterant-milk components interaction (Reanpang,

Themsirimongkon, Saipanya, Chailapakul, & Jakmunee, 2015). On the other hand, our

study proposes precisely the identification of the chemical changes that can occur when

the adulterant acts in milk nutrients and not only the presence of adulterant itself.

In this context, strategies have been applied and developed in recent years for

the identification and quantification of adulterants in milk (Nascimento et al., 2017), but

there still remains a need for methods that provide complementary results, where actual

species can be determined and potentially monitored as quality control markers. Along

these lines, mass spectrometry (MS) presents itself as a great analytical tool to identify

37

adulterations in food products (De Oliveira & Catharino, 2015; Guerreiro, de Oliveira,

Ferreira, & Catharino, 2014; Riccio et al., 2011), as it is a very versatile and fast

technique, able to provide results with great accuracy.

MS is often coupled with separation approaches, such as liquid or gas

chromatography, in the identification and quantification of adulterants (Verma &

Ambatipudi, 2016). The use of these techniques, however, often implies specific sample

preparation processes such as extraction and/or derivatization of compounds, which

usually impair the direct analysis of a complex matrix, as in the case of milk. This fact

prevent a performance of untarget high throughput analysis, which could make it more

dynamic to identify the possible components of milk that have been interacted with the

adulterants. High-resolution mass spectrometry (HRMS) is a technique that combines

both selectivity and sensitivity, and could be used to identify a wide range of

compounds in a variety of matrices. In addition, when combined with direct infusion

(DI) of samples, it shows great potential to provide reliable results in just one minute

(Guerreiro et al., 2018; Ibáñez, Simó, García-Cañas, Acunha, & Cifuentes, 2015; Melo

et al., 2017; Vivian, Aoyagui, de Oliveira, & Catharino, 2016).

In this preliminary contribution, we simulated the adulteration of freshly

produced milk samples with four adulterants that already had reported use in Brazil for

extended shelf life: formaldehyde, hydrogen peroxide, sodium hydroxide, and sodium

hypochlorite. These samples were submitted to DI-HRMS and multivariate statistical

analysis in comparison with the unadulterated product, rendering a series of oxidized

molecules that demonstrate how these species affect the nutritious characteristics of the

product. The results are promising and demonstrated the versatility of DI-HRMS in

providing the characterization of the main altered species in milk and, in the future, can

be of great help in the development of a methodology based on direct infusion samples.

Materials and Methods

Sample Preparation

Samples of milk were obtained directly from farmers in the region of Minas

Gerais, Brazil. The milk were from four different producers and a blend was made using

equal amounts of milk from each producer (1:1:1:1), with the intention that the control

samples were as similar to the real conditions. An aliquot of 10 μL of fresh milk

blended sample was diluted in 990 μL of a solution of Methanol:Mili-Q Water (50:50).

38

This mixture was vortexed for one minute and then filtered on PVDC membranes of

0.22 μm. This solution was split into two, each one used in a different mode of analysis,

positive or negative ion mode. For positive ion mode analysis, 1 μL of formic acid (final

concentration = 0.2% v/v) was added to one of these fractions of 500 μL and, for the

negative ion mode analysis, 1 μL of ammonium hydroxide (final concentration = 0.2%

v/v) was added to the other fraction. Methanol, ammonium hydroxide and formic acid

were purchased from J. T. Baker (Xalostoc, Mexico) and used with no further

purification. Deionized water was obtained from a Milli-Q system (Millipore, USA).

Adulterations with formaldehyde (15,512, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO),

hydrogen peroxide (H3410, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO), sodium hydroxide

(1.09137, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) and sodium hypochlorite (425,044, Sigma-

Aldrich, Saint Louis, MO) were performed at the concentrations of 1, 2.5, 5 and 10%

v/v for each of the four adulterants in the fresh milk. The other steps of sample

preparation for DI-HRMS analysis were the same as those used for the analysis of the

milk profile without adulteration (control), described above. All samples were prepared

in triplicates, for the control raw milk and for each different concentration of

adulterants, composing a total of 51 samples: 48 adulterated (12 samples per group),

and 3 controls.

High Resolution Mass Spectrometry (HRMS)

All analyses were performed on the ESI-LTQ-XL Orbitrap Discovery (Thermo

Scientific, San Jose, CA, USA) with a nominal resolution of 30,000 (FWHM).

Acquisitions were carried out in the mass range of 100 to 1000 m/z in both, positive and

negative ion modes. The parameters used were: flow rate of 10 μL min−1, capillary

temperature of 280 °C, 5 kV as spray voltage and sheath gas in 10 arbitrary units. All

acquisitions were obtained in quintuplicates.

Statistical analysis and biomarker identification

The method of choice to evaluate the differences between the groups was Partial

least squares discriminant analysis (PLS-DA) with the variable importance in projection

(VIP) score. PLS-DA is a supervised method that uses multivariate regression

techniques to extract features from each group and show the existence of either

differences or similarities between the analyzed samples. The selection of features that

were characteristic for each sample was carried out considering the impact that each

feature had in the analysis through VIP scores, which consists of the weighted average

39

of the squares of the PLS loadings considering the amount of explained variance on the

two dimension used in the model. As a cutoff threshold, only the features with a VIP

score greater than 3 were analyzed. All statistical analyses were performed using the

online platform MetaboAnalyst 3.0 (Xia, Sinelnikov, Han, & Wishart, 2015). For the

structural elucidation of the markers, mass accuracy was the main parameter, by

comparing the mass values obtained experimentally and those available in online

databases, such as METLIN (Scripps Center for Metabolomics, La Jolla, CA, USA), in

order to guide the choice of potential markers for adulteration in milk, a compound was

elucidated when presented an identification error value of less than 2 ppm.

3. Results and Discussion

The analysis of the score plots generated by PLS-DA allows observing that it

was possible to separate the groups corresponding to the control sample and the

adulterated samples across all adulterants concentrations 1, 2.5, 5 and 10% v/v. This

preliminary screening of samples against the controls group was relevant because it

demonstrates the sensitivity of the technique to identify adulterated milk

(supplementary material). The applied approach, which used VIP score analysis from

each PLS-DA score plot made also possible to verify that the most important features

were the same among all 4 adulterant concentrations. For this reason, the lowest

concentration of adulterant was chosen for a complete chemical analyses and structural

identification of components, i.e. 1% v/v (Figure 1). In Figures 2 and 3 it is possible to

analyze the spectra of the adulterated samples in comparison to the spectral profile of

the control raw milk, which shows that there were evident changes in the mass spectrum

profile when one of the adulterants is used.

To statistically confirm the difference among the mass spectrum samples the

VIP score from de PLS-DA model was used. By this analysis it was possible to verify

that the methodology developed was effective for identification of the footprint left by

potential adulterants in the milk. Regarding the elected markers, the vast majority are

regular constituents of the milk, but they are found in their oxidized form, as presented

in Table 1, which is explainable by the chemical nature of the adulterants chosen (Singh

& Gandhi, 2015). This is a differential to this methodology once it is no longer the

presence of the adulterant itself that is analyzed but the effects of it on the adulterated

matrix, in this case raw milk.

40

Such adulterants as sodium hydroxide, sodium hypochlorite, hydrogen peroxide,

and formaldehyde are important oxidant agents added to fresh milk to increase shelf life

of the final product. Since milk is a highly perishable food, the main issue tackled by

these adulterants is the natural degradation. Thus, by the addition of these compounds,

chemical interactions occur with the milk components that act byneutralizing the

medium and eventually reducing microbial growth, avoiding the appearance of color

changes, odor, taste and viscosity, marked characteristics of a deteriorated product

(Nascimento et al., 2017; Singh & Gandhi, 2015). In a complex matrix such as milk, it

is expected that the molecular classes most affected by oxidation are the lipids and

proteins. The consumption of oxidized lipids and proteins is widely discussed in the

literature regarding hazardous effects, more specifically the increase in systemic

oxidative stress and the generation of reactive oxygen species (ROS) in mammals (Celi

& Gabai, 2015; Sies, Stahl, & Sevanian, 2005). Thus, providing the characterization of

endproducts from oxidative processes in adulterated milk is an important task that

generates useful information for food safety and consumer health maintenance.

41

Figure 1. PLS-DA scores plot showing clustering among adulterated milk samples,

separated from fresh raw milk. (A) Scores plot of sodium hydroxide using positive

mode data. (B) Scores plot of sodium hypochlorite using positive mode data. (C) Scores

plot of hydrogen peroxide using the negative mode data. (D) Scores plot of the

formaldehyde using the negative mode data.

42

Figure 2. DI-HRMS fingerprints in the positive mode of adulterated milk samples (A =

fresh raw milk/control; B = milk added 1 % v/v of sodium hydroxide solution; C = milk

added 1 % v/v of sodium hypochlorite solution).

43

Figure 3. DI-HRMS fingerprints in the negative mode of adulterated milk samples (A =

fresh raw milk/control; B = milk added 1 % v/v of hydrogen peroxide solution; C =

milk added 1 % v/v of formaldehyde solution).

44

Focusing on this new perspective on food adulteration, particularly detailing

each type of adulterant, both sodium hydroxide and sodium hypochlorite presented

mostly oxidized lipids as markers, as presented in Table 1. This can be attributed to the

oxidative characteristic of these adulterants, which were able to interfere in milk

composition even at low concentrations, probably oxidizing lipid double bonds forming

stabilized lipid alcohols. Milk is an important source of lipids (Lindmark Månsson,

2008) and fat-soluble vitamins (A, D, E, K). In addition, these components act to

provide the characteristic flavor of both milk and dairy products and for their

rheological properties as well. Whereas oxidized species may present reduction/absence

of these properties (Fox, Uniacke-Lowe, McSweeney, & O'Mahony, 2015a) or, in the

worstcase scenario, alter biochemical functions leading to deleterious effects, these

oxidized endproducts could act as injurious chemicals that activate inflammatory

responses that affects the circulatory system and also organs such as liver, kidney, lung,

and the gut (Kanner, 2007).

By the mass spectrum data analysis of the sodium hydroxide adulterant (Fig. 2)

four oxidized fatty acids were found and all of them may be attributed to both the

breakdown of larger lipid chains and the oxidation of their own chain. The four markers

found are: 5-hydroxy-4-oxoheptanoic acid, 2-hydroxy-3-oxooctanoic acid, 6,8-

dihydroxy-octanoic acid and 4,7-dioxododecanoic acid. For sodium hypochlorite were

found five oxidized milk compounds: D-galacturonic acid calcium salt, a carboxylic

acid derived from the oxidation of galactose; (E)-2-((9-hydroxy-10-

oxotetradecanoyl)oxy)-3-(phosphonooxy)propyl tetradec-9-enoate which is an oxidized

phosphatidic acid with two myristoleic acid moieties; D-glyceraldehyde-3-

phosphate/(3-hydroxy-2-oxo-propoxy) phosphonic acid/(2S)-2-Phospholactate, isomers

that are oxidized forms of phosphoglycerol, possibly due to the breakdown of complex

lipid chains; and finally, the oxidized phosphatidylcholine (PC) (16:0/5:1) ((E)-2-((5-

oxopent-3-enoyl)oxy)-3-(palmitoyloxy)propyl (2-(trimethylammonio)ethyl) phosphate),

which is a phosphatidylcholine potentially derived from the breakdown of larger PC

pecies and oxidized C16 Sphingosine (2-amino-1,3,4-trihydroxyhexadecan-5-one). As

expected the same behavior was observed for both sodium hydroxide and sodium

hypochlorite adulterants once there are oxidative compounds (Fox et al., 2015a;

O'Callaghan et al., 2016). The markers of these two groups were found in the positive

ion mode, as shown in Fig. 2.

45

Milk also contains a significant amount of polypeptides that act as an important

source of amino acids. The polypeptides is an important issue on the nutritional value of

milk since it is directly related with the growth rate of the offspring, once for mammals,

the milk is the main, when it is not the only, amino acid source in the first stages of life

(Fox,Uniacke-Lowe, McSweeney, & O'Mahony, 2015b). As lipids, the proteins are also

susceptible to oxidants, and may suffer denaturation and/or cleavage depending on the

severity of the oxidizing agent, thereby losing their nutritious properties (Østdal,

Bjerrum, Pedersen, & Andersen, 2000).

For hydrogen peroxide adulterant four markers were found, and for this

adulterant it were oxidized amino acids and small peptides (Table 1), which may be

attributed to the breakdown of proteins present in milk. The markers found were:

Lysinoalanine oxidized (2-amino-6-((2-amino-2-carboxyethyl) (hydroxy)amino)

hexanoic acid), Prolyl- Histidine oxidezed (4-((S)-2-((S)-N-hydroxy-3,4-dihydro-2H-

pyrrole-2- carboxamido)-3-oxopropyl)imidazol−1-ide), N-gamma-L-Glutamyl-L

methionine oxidized (5-((1-carboxy-3-(methylthio)propyl)(hydroxy) amino)-2-imino-5-

oxopentanoic acid) and (16E,18Z)-15-oxotetracosa-16,18-dienoic acid. These markers

demonstrate that oxidation by H2O2 is more severe than the previous two adulterants,

probably acting by radical-forming mechanisms to cause the observed protein oxidation.

The spectrum of the adulterated milk with hydrogen peroxide is present at Fig. 3.

45

Adulterant Compound Adduct Exact Mass Theoretical Mass Error MID*

Sodium

hydroxide

Heptenoic acid [M+Na]+ 183.0631 183.0628 1.64 34705

Octenoic acid [M+K]+ 213.0528 213.0524 1.88 4146

Octanoic acid [M+H-2H2O]+ 141.0919 141.0921 -1.42 74602

Dodecadienoic acid [M+K]+ 267.0989 267.0993 -1.50 45778

Sodium

hypochlorite

D-Galacturonic acid, calcium salt [M+NH4]+ 444.0654 444.0661 -1.58 71721

PA (14:1/14:1) [M+2Na-H]+ 665.3410 665.3401 1.35 82087

D-Glyceraldehyde-3-phosphate /

Dihydroxyacetone phosphate /

2-Phospholactate

[M+2Na-H]+ 214.9689 214.9692 -1.40

3294/

72896/

148

PC (16:0/5:1) [M+2Na-H]+ 638.3395 638.3404 -1.41 39414

C16 Sphingosine [M+K]+ 342.2035 342.2041 -1.75 53900

Hydrogen

peroxide

Lysinoalanine [M+Cl]- 284.1024 284.1019 1.76 86274

Prolyl-Histidine [M-H2O-H]- 249.0984 249.0988 -1.61 85916

N-gamma-L-Glutamyl-L-methionine [M+K-2H]- 331.0377 331.0371 1.81 89878

15-oxo-18Z-tetracosenoic acid [M+K-2H]- 417.2785 417.2777 1.92 74786

Formaldehyde

Indolelactic acid [M+FA-H]- 250.0716 250.0721 -2.00 71

3,6-Dideoxy-L-galactose [M+FA-H]- 193.0715 193.0718 -1.55 65959

Gly-Asp-Ser-Met [M+FA-H]- 453.1289 453.1297 -1.77 144589

Gln-Asp-Tyr-Met [M+FA-H]- 600.1989 600.1981 1.33 208669

His-Asn-Cys [M+FA-H]- 417.1205 417.1198 1.68 15770

Table 1. List of compounds found for each of the types of adulterants used. *METLIN ID

46

Finally, due to formaldehyde characteristic of conjugating with other species, a

series of formylated compounds were found. In total five compounds were identified:

indolelactic acid, 3,6-dideoxy-L-galactose; two tetrapeptides: Gly-Asp-Ser-Met, Gly-

Asp-Tyr-Met and one tripeptide, His-Asn-Cys. These results show that the

formaldehyde is a milder oxidant substance than the others three, however

formaldehyde still causes damages on milk, forming adducts that, similarly to the other

cases, have impaired the nutritional value that can lead to malnutrition on the long term

for those who use milk as a source of amino acids.

In this contribution, it is possible to observe that even though there are different

types of reaction mechanisms by which the adulterants selected herewith act, all of them

yielded similar outcomes in terms of oxidized species that impair the nutritional value

of the milk intended for consumption. In this way, this work was intended to provide a

better understanding of the behavior of milk constituents under a series of different

chemicals used for adulteration. Finally, our findings also support the importance of

chemical analyses of milk, whereas depending on the adulterant, different outcomes

may be expected, i.e. lipid oxidation, protein oxidation, and formation of formylated

species, components that are not declared in the specifications of the product. These

preliminary data will contribute in the development of a robust method based on the use

of DI-HRMS to analyze the effects of adulterants at nutritional components of milk.

Supplementary data to this article can be found online at

https://doi.org/10.1016/j.foodres.2018.03.079

Authors Contributions

TG and MR performed sample collection and experiments. TG, DO and CM performed

data analysis. TG wrote the manuscript. DO and EOL performed manuscript review. RC

idealized all experiments and managed the research group.

Conflict of interest

The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial

or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest.

Acknowledgements and Funding

The authors would like to thank the São Paulo Research Foundation (FAPESP) for the

financial support provided through process Nos.: 2015/06809-1 and 2016/17066-2. The

47

authors would also like to thank the Coordination for the Improvement of Higher

Education Personnel (CAPES) for the fellowships provided through process Nos.

1489740, 1645986, 1578388.

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49

Suplementary Material:

Figure 1SM: PLS-DA scores plot showing clustering among adulterated milk samples

with concentration of adulterant of 2.5% v/v separated from fresh raw milk. (A = Scores

plot of sodium hydroxide solution using positive mode data; B = Scores plot of sodium

hypochlorite solution using positive mode data; C = Scores plot of hydrogen peroxide

solution using the negative mode data; D = Scores plot of the formaldehyde solution

using the negative mode data).

50

Figure 2SM: PLS-DA scores plot showing clustering among adulterated milk samples

with concentration of adulterant of 5% v/v separated from fresh raw milk. (A = Scores

plot of sodium hydroxide solution using positive mode data; B = Scores plot of sodium

hypochlorite solution using positive mode data; C = Scores plot of hydrogen peroxide

solution using the negative mode data; D = Scores plot of the formaldehyde solution

using the negative mode data).

51

Figure 3SM: PLS-DA scores plot showing clustering among adulterated milk samples

with concentration of adulterant of 10% v/v separated from fresh raw milk. (A = Scores

plot of sodium hydroxide solution using positive mode data; B = Scores plot of sodium

hypochlorite solution using positive mode data; C = Scores plot of hydrogen peroxide

solution using the negative mode data; D = Scores plot of the formaldehyde solution

using the negative mode data).

52

4.2 ARTIGO II

Migration from Plastic Packaging into Meat101

Tatiane Melina Guerreiro1, Diogo Noin de Oliveira1, Carlos Fernando Odir Rodrigues

Melo1, Estela de Oliveira Lima1 and Rodrigo Ramos Catharino1*

1 Innovare Biomarkers Laboratory, School of Pharmaceutical Sciences, University of

Campinas – UNICAMP, Campinas, SP, Brazil.

* Correspondence: Prof. Rodrigo Ramos Catharino (rrc@g.unicamp.br)

Abstract

Migration is a known phenomenon defined as the partitioning of chemical compounds

from the packaging into food, and depends on several factors. Migration assays are

generally time-consuming and require specific conditions in order to investigate the

behavior of the packaging in different situations. Furthermore, these tests are often

performed with food simulants, since the determination of migration under real

conditions is highly impaired. Several methodologies have been designed to carry out

this study, but an ideal approach should be capable of assessing the migration of

compounds in real samples, providing fast and reliable results. Within this context, mass

spectrometry can be considered a suitable and versatile technique that shows great

potential to accurately characterize several contaminants in food by migration. Thus, in

this work we present a mass spectrometry-based application for the detection of several

compounds from plastic, directly from vacuum-packed meat samples. This preliminary

and simple workflow can be easily applied in routine analyses for either quality control

purposes or in the prospection of other potential bioactive contaminants in food.

Keywords: migration, plastic, package, meat, contamination, contaminants.

Introduction

The term 'plastic' is used to describe materials based on modified synthetic or

natural polymers, which may be molded using heat and/or pressure. Plastic materials

used in packaging are very diverse in their chemical structure, presenting variable

properties depending on the processing, incorporated additives and combination with

other polymers (Robertson, 2006). For the food industry, with the increasing demand

53

for industrialized products, flexible plastic packaging has been widely used due to their

versatility and also to increase the product’s shelf life (Robertson, 2006).

Flexible plastic packages may be composed of thermoplastic material, which is

molded by increasing temperatures, allowing them to be shaped according to the

product’s size and outline (Jr., Wagner, 2016). The most common example of this class

would be vacuum packages, which are usually employed in the packaging of meat

products (McMillin, 2017). This type of packaging consists of a multilayer film, aimed

at combining the properties of each of the films in its constitution. The main polymer

used in the manufacturing process of such package is polyamide, due to its

characteristics of high abrasion resistance, thermoformability and resistance up to 200ºC

(Robertson, 2006). Additionally, other commonly used polymers are polyethylene

terephthalate (PET), polyvinylidene chloride (PVC), and ethylene vinyl alcohol

(EVOH). These polymers are more expensive, and some of them are sensitive to

moisture or heat sealing. Because of that, low-cost polymers such as polypropylene

(PP), polyethylene (PE) and polyethylene copolymers, are mixed in due to their

capability of being heat-sealed for lamination or coextrusion (K. H. Lee & Sun, 2016).

More recently, mixing other additives with the polymer base has been a common

practice to improve the mechanical behavior of plastic films. Since the technical

requirements for many flexible packaging applications are very demanding, they can

only be achieved by combining layers with different polymeric materials and additives

to form a structure that meets the desired performance needs (K. H. Lee & Sun, 2016).

Within the context of the thermoplastic material technology, the term "additive" or

"process coadjutant" is used to denote an ingredient capable of enhancing the properties

of a polymer without significantly altering its chemical structure, thereby improving

polymer resin transformation through changes in physical properties and mechanical

properties of the final material. Regarding food packaging, all additives used must be

certified by the specific regulatory authority (Robertson, 2006).

Several contributions in the literature show that there is possibility of migration

of components from the packaging to the conditioned product (K. T. Lee, 2010;

Sanches Silva, Cruz, Sendón García, Franz, & Paseiro Losada, 2007). Migration is

defined as the partitioning of chemical compounds by diffusion or absorption from the

packaging into the food (Arvanitoyannis & Kotsanopoulos, 2014; Fasano, Bono-Blay,

Cirillo, Montuori, & Lacorte, 2012; Lau & Wong, 2000; Tehrany & Desobry, 2004).

Contamination of food by migration of monomers or additives is a relevant matter for

54

health legislations due to potential health-related risks. Thus, packaging materials

intended for the packaging of foodstuffs must be registered and approved after assessing

the absence of toxic effects to the consumer and organoleptic changes to the food

(Cherif Lahimer, Ayed, Horriche, & Belgaied, 2017; Mercosul, 2007; Muncke et al.,

2017). However, this is still a subject of much debate due to the lack of information and

more detailed studies on the safety of exposure to these possible contaminants, as well

as assertive determination of the number of allowed compounds and migration limits

(Muncke et al., 2017).

Moreover, this phenomenon depends on several factors such as chemical

composition of the conditioned food, level, time and temperature of contact with the

package, and chemical properties of the packaging material (Arvanitoyannis &

Kotsanopoulos, 2014). Migration tests generally have a long experimental workflow,

and require specific conditions of temperature and humidity in order to mimic

conditions of conservation or to generate stress conditions to investigate the behavior of

the packaging. Furthermore, since food is a complex matrix both chemically and

physically, food simulants are frequently used. These products have defined

composition and characteristics that mimic the composition of food classes, facilitating

the determination of migration, since working under real conditions is an important

methodological challenge (Arvanitoyannis & Kotsanopoulos, 2014; Tehrany &

Desobry, 2004).

For this reason, developing an expeditious and accurate methodology, capable of

being applied to study the migration of compounds in real samples would represent an

important advancement in food analysis. In this context, mass spectrometry has proven

to be a great ally for the identification and characterization of compounds in complex

samples, from biological fluids to food, exhibiting versatility, sensitivity, and accuracy

(Guerreiro et al., 2018; Guerreiro, Oliveira, Ferreira, & Catharino, 2014; Melo et al.,

2017; Vivian, Aoyagui, de Oliveira, & Catharino, 2016). High-resolution mass

spectrometry (HRMS) is a powerful technique that provides reliable information about

the characterization of unknown compounds within any given matrix, with enhanced

accuracy and precision (Rubert, Zachariasova, & Hajslova, 2015). In this way, our work

presents a preliminary and simple methodology for the identification of several

plasticizers migrating from vacuum-packages into meat samples using HRMS as the

main detection technique.

55

Materials and Methods

Sample Preparation

Fifteen pieces of vacuum-packed beef meat from the same batch and brand were

purchased from supermarkets in the city of Campinas, São Paulo, Brazil. From each

package, triplicates of both beef meat and packaging material were sampled and

prepared as described below.

An amount of packaging material equivalent to 2 mg was added to 500 μL of

tetrahydrofuran (THF) (242888, Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA). The mixture was

sonicated at room temperature for 10 minutes, where dissolution of most of the plastic

material occurred. To this solution, 500 μL of methanol (34860, Sigma-Aldrich, Saint

Louis, USA) was added, and the final resulting solution was homogenized in vortex for

1 minute.

For beef meat samples, a piece of approximately 2 mg was cut from different

areas in the surface and 2.5 to 3 cm deep, which underwent the same extraction protocol

as that described for the packaging material. In addition, a negative control was

performed with fifteen beef meat samples purchased directly from a butcher's shop in

the city of Campinas, São Paulo, Brazil, so that these samples were not conditioned in

any type of plastic packaging. All purchased meat was from the same type of beef cut

(Brazilian rump), with similar fat content, to avoid any potential bias in the results.

Prior to HRMS analyses, 1 μL of formic acid (F0507, Sigma-Aldrich, Saint

Louis, USA) was added to 500 μL of the final solution.

High Resolution Mass Spectrometry (HRMS)

Samples were directly injected into an ESI-LTQ-XL Orbitrap Discovery

(Thermo Scientific, USA). Acquisitions were performed in the positive mode, in the

mass range of 70-700 m/z. Instrument parameters were: flow rate of 10 μL.min-1,

capillary temperature of 280 °C, 5 kV spray voltage and sheath gas at 10 arbitrary units.

HRMS analysis were performed in triplicates for each sample and its replicates (i.e. a

total of 540 spectra acquisitions). The online metabolomics database METLIN

(www.metlin.scripps.edu) was consulted to provide the candidate molecules during the

structure elucidation process, employing the value of the exact experimental mass

obtained in comparison with the theoretical mass, so that the error adopted between

these two values was < 2 ppm.

56

Compound Adducta Exact

Mass

Experimental

Mass

Error

(ppm) CAS

Phthalic Anhydride [M+H]+ 149.0233 149,0235 1,34207 85-44-9

Stearamide [M+H]+ 284.2947 284,2952 1,75874 124-26-5

Diisooctyl

phthalate

[M+H]+ 391,2843 391,2850 1,82476 84-69-5

[M+CH3CN+Na]+ 454.2927 454,2921 1,32073

Polyethylene glycol

(PEG)

[A9B+H]+ 415.2537 415,2543 1,44490

25322-68-3 [A9B+Na]+ 437.2357 437,2349 1,82968

[A9B +H]+ 453.2096 453,2088 1,76519

Results and Discussion

The analyses of all resulting survey spectra showed that HRMS was capable of

identifying 5 contaminants in all pieces of beef meat that were in contact with the

vacuum-plastic packaging, as presented in Table 1. The replicates analysis showed that

the methodology maintained the same spectral profile for each of the sample types

analyzed (negative control meat, packed meat and packaging material), which

demonstrates the reproducibility of the method. Their spectral profiles are presented at

Figure 1. Observing and comparing the spectra, no signals related to these compounds

are found in the spectrum from the butcher's shop beef meat (negative control, Figure

1A); instead, they are present at the profile for packaging material spectrum (Figure 1B)

and for packed beef meat spectrum (Figure 1C). In addition, for the spectrum of the

packaging material (Figure 1B) the signal intensity of the identified components is

greater than in the packaged beef meat spectrum (Figure 1C), which corroborates the

fact that these components belong to the analyzed material, and they were able to

migrate into meat. The profiles presented for the samples from superficial and deeper

cuts showed no differences.

Table 1. Contaminants found in meat samples from plastic package. (a Presented

adducts are in accordance with Keller et al, 2008 (Keller, Sui, Young, & Whittal, 2008))

57

Figure 1. HRMS spectra of the beef meat samples showing the presence of five

contaminants in all pieces of beef meat that were in contact with the vacuum-plastic

packaging. A: negative control butcher's shop beef meat; B: packaging spectrum; C:

packed beef meat spectrum.

58

Regarding the elucidated compounds of interest, three are related to the

manufacturing of polymers, providing strong evidence that they came from plastic

packaging, namely phthalic anhydride (149.0235 m/z), which is used in the

manufacturing process of organic polymers (European Commission, 2011); stearamide

(284.2952 m/z), an additive that is incorporated into the polymeric substrate to provide

enhanced stability and performance of the final product (Jr., Wagner, 2016) and

polyethylene glycol (PEG) (415.2542, 437.2349 and 453.2088 m/z), which is used in

combination with other polymers to provide hardness and ductility to the structure of

the material (Chieng, Ibrahim, Then, & Loo, 2016). Complementary with plastic

manufacture, the last compound is the diisooctyl phthalate (DIOP) (391.2850 and

454.2921 m/z), which has plasticizer function.

The migration phenomenon may lead to the contamination of the conditioned

product, due to direct and indirect interactions that may occur with the food product. In

the case of packaging-environment interactions, the interface between food and the

environment may be allowed according to the permeability level of the packaging, and

in the case of packaging-food interaction, the migration of monomers, oligomers and/or

food additives may occur due to the direct contact with the food (Lau & Wong, 2000).

Currently, two migration tests are required to release the use of chemicals in food

packaging: “Quantity in Material”, for carrying out the quantity of a substance which

may be present in the packaging material, and “Specific Migration”, for assessing the

quantity of a determinate substance that may possibly migrate to the food product

(Arvanitoyannis & Bosnea, 2004).

Currently, the majority of tests to identify migrating packaging components to

food are carried out using food simulants. These are needed because of the difficulty of

analyzing the wide range of food matrices and also the actual conditions or stress during

storage (Sanches Silva et al., 2007). Some analytical methods are already standardized,

but official methods are often long, complicated and impractical in a daily routine of

quality control. Releasing or restricting the use of substances in food packaging

involves the analyses of the risks and benefits, and the quality control of packaging

materials is heavily impaired. It is on account of the existence of more than 1,000

additives and monomers that are listed as potential migrants in the regulatory list of

positive substances, many of which are authorized with specific migration restrictions

or limits, and the general objective of the legislation is to ensure consumer safety

(Arvanitoyannis & Bosnea, 2004; Gillet, Vitrac, & Desobry, 2010).

59

In an attempt to control and harmonize the legislation on food packaging, the EU

(European Union) and the FDA (Food and Drugs Administration) created a list of

positive substances, which have their permitted use, and restricted substances, as they

have a potential toxic effect (Simoneau & Hannaert, 1999). However, problems about

this list involve mainly the lack of information on the toxicity of the substances,

especially the absence of studies related to the toxicity of the final product, and not just

of a specific compound, as currently evaluated. Moreover, studies on a mixture of

substances to ascertain potential synergistic effects are required, as well as studies on

the cumulative effects of exposure to these substances (Muncke et al., 2017).

In this context, fast screening methods such as HRMS refer to the agile

identification of possible agents coming from plastic packaging that can lead to

potential health risks to consumers. Research in this area should be guided by

improvements in the current analytical methods for food packaging control, aiming at

minimal prepare os samples, using a minimal quantity of solvents, and the rapid and

effective determination of potential migrants in food. At this work we presented a

preliminary methodology for screening possible migrants from plastic into beef meat

using only HRMS technique, and the results showed the potential of the use of this

technique at food industries for identification of compounds from packaging material.

Conclusions

Through the results obtained it was possible to develop a new, simple and

effective methodology, capable of identifying the phenomenon of migration of

packaging components to the conditioned food, without the need to use food simulants,

since the application was carried out in real samples. HRMS proved to be a reliable tool

in this context, due to its speed and sensitivity, showing an even broader potential for

application in the analysis of food contaminants.

Authors Contributions

TG performed sample collection, experiments and wrote the manuscript. CM, DO and

EL performed manuscript review. RC idealized all experiments and managed the

research group.

Conflict of interest

The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial

or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest.

60

Acknowledgements and Funding

The authors would like to thank the São Paulo Research Foundation (FAPESP) for the

financial support provided through process Nos.: 2015/06809-1 (RC) and 2016/17066-2

(CM). The authors would also like to thank the Coordination for the Improvement of

Higher Education Personnel (CAPES) for the fellowships provided through process

Nos. 1489740, 1645986, 1578388.

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62

4.3 ARTIGO III

New Approach of QuEChERS and GC-MS Triple-Quadrupole for the

Determination of Ethyl Carbamate content in Brazilian cachaças32

Tatiane Melina Guerreiro1‡, Kumi Shiota Ozawa2‡, Estela de Oliveira Lima1, Carlos

Fernando Odir Rodrigues Melo1, Diogo Noin de Oliveira1, Simone Pereira do

Nascimento Triano2, and Rodrigo Ramos Catharino1*

1Innovare Biomarkers Laboratory, School of Pharmaceutical Sciences, University of

Campinas, Campinas, SP, Brazil. 2Agilent Technologies Brasil, São Paulo, SP, Brazil.

* Correspondence: Rodrigo Ramos Catharino (rrc@g.unicamp.br) ‡ These authors contributed equally.

Abstract

Cachaça is a popular spirit produced in Brazil, obtained by distillation of fermented

sugarcane. Among the contaminants arising from production, ethyl carbamate is a

carcinogenic compound that occurs naturally in fermented foods and beverages; in

Brazil, the maximum limit established by current legislation is 150 μg L−1. Quality

control is usually performed using gas chromatography; however, robustness and

reproducibility of quantitative results may be severely impaired, as the addition of 6–30

g L−1 of sucrose is a common procedure for taste standardization, directly interfering in

the results. This work describes the development of a novel method to improve ethyl

carbamate quantification in cachaças using a new approach of QuEChERS extraction

based on salting-out phenomenon, to effectively separate ethanol from sugar-containing

water. Eighteen different brands of cachaça were analyzed. The proposed methodology

was able to eliminate components that contaminate the sample flow path in the gas

chromatography system, while improving precision and accuracy by using a triple-

quadrupole approach, in comparison with the methodology usually employed: direct

analysis of cachaça samples with no sample prep. Results indicate that this approach is

more effective due to the removal of sugar content, with no impact in costs per analysis.

Keywords: alcoholic beverages; cachaça; ethyl carbamate; gas chromatography-mass

spectrometry; QuEChERS

63

Introduction

Cachaça is the typical and exclusive denomination of a sugar cane spirit

produced in Brazil. Characteristics that define this product are the alcohol content

reaching 38–48% ABV (alcohol by volume) at 20°C and obtainment by distillation of

fermented sugar cane juice (1). The manufacturing process of cachaça is not

standardized in several aspects. The first is regarding the type of sugarcane used, since

there are several varieties currently used, which present great similarity in their

composition (2). In addition, grains such as corn or rice may also be added to the must

in order to provide nutrients for better development of yeasts responsible for

fermentation (3). Finally, the equipment used may be different as well, since the

distillation may be carried out in columns of distillation made from stainless steel, in the

case of industrial production, or in copper stills, in the case of artisanal production (4).

The aging process in barrels of wood is similar to that applied in the manufacturing of

wine, where oak, balm, jequitibá, jatobá, or amburana barrels may be used. This last

process is optional and aims to provide aromas, flavors, and colors from the wood to the

cachaça (5). Regarding the sensorial characteristics, it is observed that high-quality

cachaça has a characteristic aromatic bouquet from sugar cane, as well as aromas and

unique flavors. However, in addition to the organoleptic aspects, cachaça must meet

some chemical parameters to assure that, with moderate consumption, the product

causes no health hazards. Contaminants such as methanol, sec-butanol, n-butanol,

copper, and ethyl carbamate, as well as acetic acid, an off-flavor responsible for the

acidity of cachaça, are key species that are directly linked to quality impairment of this

distillate (6, 7).

According to a 2007 assessment by IARC (International Agency for Research on

Cancer), ethyl carbamate was considered carcinogenic in laboratory animals, and

therefore, has been listed as a carcinogen for humans, belonging to Group 2A on the

Classification of Carcinogenic Substances (8, 9). This compound is an ethyl ester of

carbamic acid that is formed naturally in fermentation processes, which may be derived

from several different precursors, such as hydrocyanic acid, urea, citrulline, and N-

carbamyl by reaction with ethanol (4, 9–12). Due to this feature, it is easily found in

various types of food and beverages, such as spirits, wine, beer, bread, shoyu sauce, and

yogurt (13, 14). The consumption of ethyl carbamate only from food sources may be

deemed insignificant. However, by adding the intake of alcoholic beverages on a regular

basis, exposure to this compound increases; for example, cachaça figures as the third

64

most consumed distilled beverage in the world, and in Brazil it is the second most

consumed alcoholic beverage, after beer (15). Given its wide consumption, measures

must be taken regarding the reduction of ethyl carbamate concentration in alcoholic

beverages. Canada, through the “Health and Welfare Department” in 1985, was the first

country to determine concentration limits of ethyl carbamate in wines, distilled

beverages, fruit distillates, and liqueurs. Therefore, this became a reference for the

United States and European Union, regarding the legislation on this subject (16). In

1990, the FDA published a note limiting ethyl carbamate content in American whiskeys

in 125 μg L−1 (17). According to the Brazilian Ministry of Agriculture, Livestock, and

Supply, the limit for this contaminant in cachaças is 150 μg L−1 (1). The importance of

controlling ethyl carbamate levels, therefore, must be understood as an issue concerning

not only health aspects, but also economic ones, as any out-of-specification result may

represent a barrier to exporting Brazilian cachaça to both American and European

markets.

Many different approaches using mass spectrometry (MS) have been developed

in the recent years, assessing a great diversity of quality parameters from cachaça (18–

20), as well as many protocols for ethyl carbamate analysis and extraction (9). The use

of gas chromatography (GC) coupled with single-quadrupole MS is a technique widely

used for the analysis of this contaminant, as it is capable of accurately promoting both

identification and quantification in food and beverage samples (9). However, there is a

common procedure of sucrose addition in sugar cane spirits to reduce the alcoholic

flavor of the beverage and standardize its taste, improving its final sensory quality In the

case of cachaça, the Brazilian legislation allows the addition of up to 6 g L−1, as

procedure of standardization. Nonetheless, if the label states “sweetened,” the product

may contain up to 30 g L−1 of sugar (21). As GC-MS is the method of choice for the

quality control of cachaça, high sucrose content may easily contaminate the GC flow

path, thus making the maintenance of the equipment more frequent, and compromising

the accuracy of results. In this sense, the development of a methodology capable of

coping with exceeding amounts of sucrose present in cachaça, while maintaining the

precision and accuracy of the analysis, became necessary.

Related to the preparation of samples, carbamates usually occur at very low

concentrations and in complex matrices, as the cachaça samples, because of that they

cannot be determined without some preliminary sample pretreatments. A good

procedure of sample preparation should provide the preconcentrating of analytes and

65

also the clean-up, improved in this way the determination of the analyte of interest.

Recently, the search for miniaturized methods that are efficient and do not use large

amounts of toxic solvents to perform the extraction has been in focus. Thus, different

microextraction procedures have been developed as alternatives like the QuEChERS

(quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe) methodology, which has been widely

used in the pretreatment of complex samples. This technique is based on a two-step

method where it is first performed an extraction step based on partitioning via the

salting-out phenomenon, which is responsible for the equilibrium between an aqueous

and an organic layer. The second step is a solid phase dispersive extraction, which

involves the cleanup of the sample using combinations of different kinds of sorbents

salts or primary-secondary amines with the objective to remove interfering substances

(22, 23).

In this work, we present a new approach of QuEChERS, based only on the

salting-out extraction, as a way to eliminate residues of sucrose and water for samples

of several brands of Brazilian cachaça, which was further corroborated by an

experiment using liquid chromatography (LC), without compromising the identification

and quantification of ethyl carbamate. Additionally, we compared this new

methodology developed by our group with the current recommended procedure for the

analysis of ethyl carbamate

Material and Methods

Reagents and standards

The standard of ethyl carbamate (99.0%) was purchased from Sigma Aldrich

(MO, USA). Potassium carbonate (99.6%) was purchased from Neon (Suzano, Brazil).

Cachaças of different Brazilian brands (9 commercial) and common sugar (sucrose)

were purchased from commercial establishments in the city of Campinas, Brazil. The

craft cachaças (9) were purchased from different artisanal producers in the countryside

of the States of São Paulo and Minas Gerais, Brazil. Ethanol was purchased from

Panreac AppliChem (Barcelona, Spain), Acetonitrile was purchased from J.T. Baker

(Xalostoc, Mexico); both were LC grade and were used with no further purification.

Deionized water was obtained with a Milli-Q system (Millipore, USA).

66

Sample preparation – New Approach of QuEChERS

In order to analyze samples of cachaça, a new methodology of QuEChERS was

developed. We performed a salting-out using 5 g of potassium carbonate added to 10

mL of sample and vortexed for 20 s. The tube was left to rest for 2 minutes until phase

separation and, after that, 1 mL of the alcoholic phase was transferred to a vial and

injected into Agilent GC/MS 7890/7000 Triple Quadrupole system. For the analysis

performed into an Agilent LC/MS/MS 6460 Triple Quadrupole system these same

samples were diluted 10 times (in water). All samples were prepared in triplicates.

LC-MS Analysis

In order to check the reduction of sucrose amount, samples were analyzed before

and after the QuEChERS with potassium carbonate. An aliquot of 100 μL of samples,

with or without QuEChERS proceeding, was diluted with 900 μL of deionized water. A

volume of 0.5 μL was injected at 65°C into an Agilent LC/MS/MS 6460 Triple

Quadrupole system. The two mobile phases used were (A). with 90% of water, and (B)

with 10% of acetonitrile. The flow rate was 0.350 mL min−1 and the column used was

an Agilent Hi-Plex Ca (USP L19) 8 μm, 4.0 mm × 250 mm. The mass spectrometer was

set to electrospray ionization mode (ESI) with capillary voltage at 5 kV. All samples

were prepared in triplicates and each of them were analyzed in triplicate

GC-MS Analysis

A stock solution of 2,000 mg L−1 was prepared using ethyl carbamate standard

diluted in ethanol. To build the calibration curve, an aliquot of the stock solution was

diluted in ethanol to yield a calibration solution with concentration of 10 mg L−1 of

ethyl carbamate. From this calibration solution, new dilutions were performed in order

to obtain six concentration points chosen for the construction of the external calibration

curve: 50, 100, 200, 500, 1,000, and 1,500 μg L−1. Concerning matrix interference, an

experiment with internal standard addition was performed, using a sandwich injection.

This experiment was performed in order to verify whether the QuEChERS approach

would clean up the sample by decreasing matrix interference and not impairing the ethyl

carbamate determination in the analyzed samples.

The instrument used was an Agilent GC/MS 7890/7000 Triple Quadrupole

system with Electron Ionization mode (EI). A volume of 2 μL of sample was injected in

split mode 1:5 at 280°C as inlet temperature. Nitrogen was used as collision gas with

67

flow rate of 1.5 mL min−1; Helium was used as carrier gas at flow rate of 1 mL min−1

and as quench gas at a flow rate of 2.25 mL min−1. The oven started at 90°C for 1 min

and the temperature increased at a rate of 10°C min−1 until the final temperature of

185°C, with a total running time of 10.5 min. The column used was Agilent VF-

WAXms 0.25 μm, 30 m × 0.25 mm and the mass spectrometer source temperature was

set to 300°C, while quadrupole Q1 and Q2 at 180°C. The Multiple Reaction Monitoring

transitions used were for the quantifier ion 62 → 44 with collision energy of 15 eV and

qualifier ion 74 → 44 with collision energy of 5 eV. All samples were analyzed in

triplicates

Sandwich Injection applied to GC-MS Analyses

The injection of the sample using the standard addition method was performed

by creating a different acquisition method for each calibration level. The first level was

composed only by the sample volume to be analyzed, thus the injection was 1 μL of

sample in split mode (1:5). The second level was the mixture between the sample and

one aliquot of standard; hence, the injection was performed by programming the

autosampler to take 1 μL of sample and 1 μL of standard. The standard vial was

prepared at concentration of 100 μg mL−1. The third level consisted of taking 1 μL of

sample and 2 μL of standard. Finally, the fourth level took again 1 μL of sample and 3

μL of standard (Figures 1 and 2). The standard was positioned in such a position in the

autosampler that the auto-injector could take the aliquot of standard solution always at

the same place. Upon each injection, the syringe was washed four times with ethanol

(40%) first, and six times with a deionized water: acetonitrile solution (80:20) after the

injection, both at the maximum volume of 10 μL.

68

Figure 1. Scheme of the solution preparation for the standard addition method.

Figure 2. Sandwich injection scheme.

69

Results and Discussion

Part I: Sucrose Content Verification by LC/MS/MS

The sugar present in cachaça, sucrose, is a naturally occurring saccharide found

in sugar cane. The solubility of sucrose in water is 1 g for 0.5 mL, and in ethanol is 1 g

for 170 mL. With the purpose of simulating the amount of sucrose in cachaça samples,

mock solutions of 0.3 and 0.06 g of sucrose in 10 mL of water were prepared, emulating

the maximum concentrations for not labeled (6 g L−1) and labeled (30 g L−1) sugar

addition. Figure 3 shows the Extracted Ion Chromatogram (EIC) 365 of sucrose (24) of

the 6 and 30 g L−1 preparations. Integration of the EIC 365 peak was performed and

compared before and after the QuEChERS extraction. Elimination of most of the sugar

was evident, since the solubility of sucrose in water is higher than in ethanol, as shown

in Figure 4 and in the data available in Table 1. This happened because when a salt is

added to an aqueous solution of a soluble organic solvent, the intermolecular

interactions are affected by the ionization of the salt because of the stronger affinity

between the ions and the water molecules. This reflects in decreased availability of

water molecules for the third component (i.e., organic solvent). Therefore, the organic

solvent is forced to increase its intermo-lecular interactions, and subsequently, at

threshold concentrations of the ionized species, the organic solvent is excluded from the

rest of the solution as a separate phase (25). This phenomenon is known as salting-out

and was applied in the development of this new approach of QuEChERS extraction

described here. In the present case, separation of ethanol from water by the QuEChERS

approach eliminates most of the sucrose due to its solubility, which was verified using

an LC/MS triple quadrupole system.

Area Before

Salting-Out

Area After

Salting-Out

Removal

Percentage

Control 6 g/L 83180455.52 405192.7900 99,51 %

Control 30 g/L 193679686.4 1906989.360 99,01 %

Cachaça Sample 82252299.47 706338.6600 99,10 %

Table 1. Sugar percentage removal by EIC peak area.

70

Figure 3. EIC chromatogram of solutions with 6 and 30 g/L of sugar and MS spectrum

of 365 (sucrose).

71

Figure 4. EIC chromatogram of 6 g/L of sugar (A) and with a sample of cachaça (B)

before and after QuEChERS extraction, injecting only the organic layer for both

samples.

72

Part II: Matrix Interference in GC/MS/MS and Standard Addition

Matrix interference is another issue involved in the analysis of ethyl carbamate

in alcoholic beverages using GC-MS. Even after sample cleanup by a diatomaceous

earth column, the identi-fication of ethyl carbamate often cannot be ascertained with

confidence by the selected ion monitoring (SIM) mode, due to inconsistent ratios of the

SIM ions 62, 74, and 44 m/z, since the qualifier ions are highly susceptible to matrix

interference (26). Therefore, the use of triple-quadrupoles for improved sensitivity and

specificity may clarify this interference.An alternative with the use of mixtures of

ethanol and water might be an option for blank samples, but they cannot compre-hend

all the potential matrix interference to the analysis. Thus, the standard addition method

is suggested to perform a quan-titative analysis approach where the standard is added

directly to the aliquots of the analyzed sample. This approach may be applied in cases

where a suitable blank sample is not available for calibration, as with cachaça samples.

Moreover, the method of standard addition can assist in identifying a target analyte in

any given chromatogram, as only the target peak increases after the addition. Figure 5

shows the overlapping chromatogram of samples added and not added with ethyl

carbamate standard. The only clear disadvantage of this method is the laborious task to

prepare the solution to determine the calibration curve. To per-form standard addition, it

is required to prepare a set of solutions that contains a same volume of sample and

increasing volume of standard solution, as shown in Figure 1. The methodology is based

in the addition of a constant volume (Vunk) of sample to each of the volumetric flasks,

with volume (Vflask), then adding a series of increasing volumes of stock solution

(Vstd). Finally, each flask is made up to the mark with solvent and mixed.

This process was further simplified by the use of sandwich injection (Figure 2)

performed by automatic injector of the GC system. This injection consists of taking an

aliquot of sample vol-ume and standard solution volume at the same time injecting both

the solution together, thus avoiding the preparation of the standard solution with varied

concentrations. Since the solvent is evapo-rated in GC injection port, the calibration

curve is based on mass injected in the column, instead of the concentration established

in the volumetric flask. Results compare the final concentration (FC) obtained by

standard addition and external calibration method.

73

Figure 5. Overlapping chromatogram of standard addition method, which shows the

gradual increase of the peak area of ethyl carbamate

Part III: Quantification of Ethyl Carbamate

The blank samples were prepared with ultrapure water and ethanol, with a FC of

40% ethanol. The samples were spiked with concentrations of 50, 100, and 200 μg L−1

of the standard. As the solubility of ethyl carbamate in ethanol (1.2 g mL−1) is higher

than in water (0.1 g mL−1), the FC in ethanol, after the QuEChERS extraction step, will

be proportional to that volume. For example, when adding 100 μL of a solution with a

concentra-tion of 10 ng μL−1 of ethyl carbamate, it is in the same proportion as 1,000

ng of ethyl carbamate in 10 mL of sample solution. After the QuEChERS extraction

step, 1,000 ng of ethyl carbamate will be present almost exclusively in the ethanol layer.

Thus, the FC in 1 mL of the upper layer (ethanol) will be approximately of 250 ng

μL−1, as shown in equation below. This was corroborated using the calibration curve

prepared in blank matrix:

C = 1000 ng / 4 mL(ethanol) = 250 ng µL-1 or 250 µg L-1

The recovery (Rec) was verified by spiking 50, 100, and 200 μL of intermediate

solution in 10 mL blank samples already cor-rected as per the equation above. For this

reason, the expected concentration for 50, 100, and 200 μg L−1 would be 125, 250, and

500 μg L−1, respectively. Although SD is higher by using the standard addition method,

recuperation results are close to 100% when this method is applied to real sample,

according to Table 2.

74

Table 2. Recovery results by standard addition and external calibration methods. (n=3)

This is because all matrix constituents were considered, including any inherent

interference, in quantitation results. For real cachaça samples, water composition may

vary from 38 to 48%. Considering that, Rec was within the acceptable range of 70–

120% according to document SANTE (27). For quantification of the ethyl carbamate in

the actual samples of cachaça, two calibration curves, the external calibration curve

(related to the current recommended procedure) and the stand-ard addition curve (new

methodology), were used to make it possible to compare and validate the proposed

methodology. The retention time of the analyte was 7.727 min, and remained stable

across all different samples, with a variation coefficient equal 0.02% (Figure 5). A

calibration curve with the standard addition was prepared by the linear regression

method. The amount of the analyte in the sample without addition of ethyl carbamate

was calculated from the calibration curve. A correlation coefficient of at least 0.995

generally indicates acceptable characterization of the curve; the proposed method was

capable to obtain excellent linearity, with typical values for the correlation coefficient

(R2) around 0.999 (Figure 6). As shown in Table 3, out of the 18 samples tested, 9

commercial and 9 craft, only one showed an amount of ethyl carbamate above that

allowed by the Brazilian legislation. In addition, we may observe that there is not a

significant error between the measure-ments among commercials brands. Regarding the

craft products, higher values of error were observed between the measurements

presented, which may be related to the method of manufacturing this type of cachaça;

since this is an artisanal product, it may be expected that there is less homogeneity

among the final products. In this way, it is possible to verify that the developed

methodol-ogy could be applied instead of the usual methodology because, despite the

inclusion of sample preparation, it is simple and fast due to the use of QuEChERS.

Standard Addition External Calibration

Day 1* Day 2* ∑ Day 1* Day 2* ∑

Rec (50 ppb) 124% 116% 120% 98% 91% 94%

RSD 3% 9% 7% 0% 2% 4% Rec (100ppb) 104% 106% 105% 81% 84% 83%

RSD 8% 10% 9% 3% 1% 3% Rec (210ppb) 85% 103% 94% 79% 81% 80%

RSD 1% 1% 9% 2% 0% 2%

75

.

Figure 6. Comparison between the standard addition curve (A) and the external

calibration curve (B) for quantification of the ethyl carbamate.

76

Sample MC (ppb) Error (%) FC (ppb)

Comm1 212,4429 0% 53,1107

Comm2 117,1811 0% 29,2953

Comm3 26,8651 2% 6,7163

Comm4 245,4955 2% 61,3739

Comm5 250,6639 1% 62,6660

Comm6 186,6799 2% 46,6700

Comm7 105,0681 0% 26,2670

Comm8 493,4672 6% 123,3668

Comm9 250,0942 0% 62,5236

Craft1 530,7167 3% 132,6792

Craft2 604,5791 5% 151,1448

Craft3 306,7847 1% 76,6962

Craft4 467,9504 29% 116,9876

Craft5 176,5997 5% 44,1499

Craft6 61,9448 1% 15,4862

Craft7 205,4501 17% 51,3625

Craft8 54,0808 2% 13,5202

Craft9 138,3081 1% 34,5770

Table 3. Mean concentration (MC, n=3), absolute error of the measurements (n=3) and

final concentration (FC) of ethyl carbamate in the tested cachaças samples [commercial

(Comm) and craft].

Conclusions

The issue of ethyl carbamate concentration in beverage led to a required

monitoring during manufacturing process and in the final product. Beverage industries

must analyze each production batch to check if it is in accordance with the maximum

allowed limit. In order to control all the production, the method must be easy and robust

as possible. The presence of sucrose in many cachaças makes this task very

complicated, in addition to other matrix components that may interfere in the analysis.

This study presented a simple and effective methodology for identification and

quantification of ethyl carbamate in cachaças, presenting a new approach of QuEChERS

based on the salting-out phenomenon, with leads to minimal sample preparation, and

setup of standard addition method that may be easily prepared by an automatic injector

system. This new methodology showed an increased level of efficacy, with a cost per

analysis of approximately US$ 1.00, which can be considered a cost-effective approach

when compared to the current recommended methodology. In this way, the dem-

onstrated method can be understood as a valid alternative for the identification and

quantification of ethyl carbamate in cachaças.

77

Authors Contributions

TG, KO and ST performed experiments. TG and KO wrote the manuscript and

performed data analysis. CM, DO and EL performed manuscript review. RC idealized

all experiments and managed the research group.

Conflict of interest

The authors Kumi Shiota Ozawa and Simone Pereira do Nascimento Triano were

employed by company Agilent Technologies. All other authors declare no competing

interests of any kind.

Acknowledgments

Innovare Biomarkers Laboratory would like to thank Agilent Technologies for the

technical support and partnership during the experimental process. We also

acknowledge the São Paulo Research Foundation (FAPESP, Process Nos. 11/50400-0

and 15/06809-1 for RRC). We also thank Coordination for the Improvement of Higher

Level Personnel (CAPES) for the fellowships from TMG (PROEX: 1489740), CFORM

(PROEX: 1645986), EOL (PNPD: 1578388) and DNO (88887.137889/2017-00).

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5. DISCUSSÃO GERAL

A análise de contaminantes químicos é parte essencial dentro da de segurança

alimentar, visto que tem como objetivos garantir a segurança do consumidor e a

conformidade com os limites estipulados pelos órgãos resuladores. Desta forma, o

desenvolvimento de novas técnicas analíticas capazes de auxiliar na identificação de

contaminantes em alimentos é crucial para que estas substâncias sejam reguladas de

maneira eficiente e concisa, garantindo assim a saúde da população.

Ao analisar os resultados apresentados, temos que a proposta de

desenvolvimento de metodologias capazes de realizar a identificação de contaminantes

presentes em diversas matrizes alimentícias se mostrou satisfatória e eficaz. Através da

combinação de técnicas de MS com a metabolômica foi possível identificar marcadores

químicos responsáveis por diferenciar o grupo de amostras contaminadas do grupo de

amostras sem alterações. Além disso, ao observarmos os resultados presentes nas

análises estatísticas temos que foi possível identificarmos diversos tipos de marcadores

químicos relacionados aos alimentos aqui analisados.

Detalhando especificamente alguns pontos sobre cada um dos temas aqui

estudados, começando com o trabalho de adulterantes no leite, é importante mencionar

que a idéia de um novo enfoque sobre o tema de adulteração de alimentos, baseado nos

efeitos que estes adulterantes podem causar aos nutrientes do leite, foi uma maneira

diferente de se conduzir tal estudo. Temos que dentro dessa temática majoritariamente

observamos trabalhos que tratam exclusivamente da identificação dos adulterantes, sem

pensar nas alterações nutricionais advindas da interação nutriente-adulterante. Além

disso, o uso da análise multivariada PLS-DA foi determinante para seleção das razões

m/z que foram investigadas. Com isso, este trabalho foi importante para destacar uma

frente de estudos singular quando se trata de adulterações em alimentos.

Acerca do trabalho de migração de componentes da embalagem para carne

bovina, temos que os métodos analíticos utilizados para este tipo de análise envolvem o

uso de simulantes de alimentos, que são substâncias que possuem a função de

mimetitizar a composição de um determinado alimento. Apesar destes modelos serem

úteis estes não são capazes de se comportar fielmente como a matriz complexa inerente

de um alimento. Desta forma, para o trabalho aqui apresentado buscamos utilizar

amostras reais de carne vermelha. Para consolidar a metodologia final foram feitos

diversos ensaios previamente para o preparo da amostra, onde foram variados o solvente

orgânico utilizado, o tempo de extração, os volumes empregados e o preparo da carne

81

(se macerada ou em pedaços). Desta forma, temos que o desenvolvimento analítico

neste trabalho foi bastante voltado para elaboração de um preparo de amostra sucinto e

eficaz, de maneira que a análise pudesse ser realizada sem o uso de simulantes. Assim,

conseguimos demonstrar o fenômeno de migração através da HRMS destacando-se aqui

a não necessidade de simulantes, visto que trabalhamos com amostras reais de carne

vermelha, sendo este fato de grande relevância para o campo de análise de alimentos.

Referente ao último trabalho, que tratou da determinação de etil carbamato em

cachaças brasileiras, temos que a problemática que delineou todo o estudo foi a

necessidade de eliminação da interferência da sacarose para este tipo de análise. Grande

parte do desenvolvimento desta metodologia envolveu a busca de alternativas para

contornar este problema e a aplicação do conceito de QuEChERS foi o que nos orientou

para definir a metodologia final. Este trabalho é revolucionário para a área, envolvendo

uma grande contribuição aos pesquisadores de bebidas alcoólicas.

Desta forma, o estudo dos diferentes produtos alimentícios apresentados (leite,

carne vermelha e cachaça) abrange grande parte de processos presentes em atividades

de grande importância no país. Por isso, o desenvolvimento e a implementação de

estratégias metabolômicas simples, seletivas e eficazes foram empregados para auxiliar

na identificação de marcadores de qualidade do leite, identificação de contaminantes de

embalagem em carne vermelha e determinação do contaminante etil carbamato em

cachaças. Desta forma, a alta diversidade e a dinâmica das estratégias metabolômicas

nos permite desenvolver projetos de pesquisa que sejam capazes de ser empregados na

rotina de controle de qualidade de alimentos.

82

6. CONCLUSÃO

Os trabalhos apresentados demonstram que o objetivo proposto foi alcançado

pois as metodologias desenvolvidas apresentam muitas vantagens em relação às técnicas

comumente utilizadas. Algumas dessas vantagens são o mínimo preparo de amostra e o

tempo de análise reduzido. Estas características são relevantes quando pensamos no

ramo da ciência aplicada, que busca solucionar as adversidades analíticas rotineiras.

Deste modo, a identificação eficaz de contaminantes apresentada pelas metodologias

desenvolvidas possibilita seu uso tanto para verificação de fraudes ou adulterações

quanto para verificação da qualidade dos alimentos. Além disso, este tipo de estudos

podem inclusive contribuir para que futuramente laboratórios ou órgãos reguladores

possam empregar tais métodos em sua rotina visando atender às necessidades de

segurança dos consumidores, garantindo assim a saúde e segurança alimentar.

83

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88

8. ANEXOS

Os documentos anexados a seguir são referentes à permissão/autorização do uso

dos trabalhos publicados junto às respectivas editoras para a inclusão dos artigos

apresentados nesta tese, em atendimento à legislação que rege o direito autoral.

Conforme apresentado nos documentos a seguir não é necessária permissão para o uso

dos artigos, apenas que os trabalhos sejam citado de acordo, conforme consta na seção

7. Referências.

8.1 Autorização de uso – Artigo do Leite

89

8.2 Autorização de uso – Artigo da Carne

90

8.3 Autorização de uso – Artigo da Cachaça