SKUTKI DZIAŁANIA CIĘŻKICH JONÓW NA KOMÓRKI CHO-K1

Joanna Czub

Instytut Fizyki

Uniwersytet Jana Kochanowskiego w Kielcach

Część 1: Badania prowadzone w ramach pracy doktorskiej:

zastosowanie badań dotyczących oddziaływania promieniowania z materią żywą,

cel badań, długoletnią współpracę, układ eksperymentalny, materiał doświadczalny, wyniki otrzymane na podstawie przeprowadzonych

testów biologicznych, Część 2: Kolejne badania: efekt jednoczesnego działania dwóch jonów na

materiał biologiczny, plan na przyszłość. 2

PLAN PREZENTACJI

CZĘŚĆ 1: ZASTOSOWANIE BADAŃ

radioterapia nowotworów (terapia ciężkimi jonami)

ochrona radiologiczna podczas długotrwałych lotów kosmicznych

3

CEL TERAPII I OCHRONY RADIOLOGICZNEJ

wywołanie całkowitej inaktywacji komórek

określenie konsekwencji genetycznych działania promieniowania i podjęcie środków zapobiegających

Terapia ciężkimi jonami Ochrona radiologiczna

4

Główny cel badań to poznanie skutków działania promieniowania o energiach z zakresu piku Bragga na komórki.

Kraft G. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. A 454 (2000)

CEL PRACY

Główny cel to:• przeprowadzenie badań radiobiologicznych

polegających na napromienieniu ciężkimi jonami węgla lub neonu materiału biologicznego,

• określenie biologicznych skutków oddziaływania ciężkich jonów o niskiej energii (tj. o wysokim LET) na materiał biologiczny,

Osiągnięcie tego celu wymagało:• uruchomienia odpowiedniego stanowiska

eksperymentalnego dedykowanego eksperymentom radiobiologicznym z wykorzystaniem ciężkich jonów z cyklotronu warszawskiego,

• przeprowadzenia serii testów biologicznych na napromienionych komórkach. 5

DŁUGOLETNIA WSPÓŁPRACA Środowiskowe Laboratorium Ciężkich Jonów Uniwersytetu

Warszawskiego (ŚLCJ UW):

• J.Choiński, zespół obsługujący cyklotron,J.Choiński, zespół obsługujący cyklotron, Narodowe Centrum Badań Jądrowych (NCBJ) w Świerku:

• M.Jaskóła, A.Korman, M.Jaskóła, A.Korman, Wydział Fizyki Uniwersytetu Warszawskiego (UW):

• Z.Szefliński Z.Szefliński (1) (1) wraz ze współpracownikami, U.Kaźmierczak,wraz ze współpracownikami, U.Kaźmierczak, Uniwersytet Jana Kochanowskiego (UJK) w Kielcach:

• Instytut Fizyki: D.BanaśD.Banaś(2)(2), J.Braziewicz,, J.Braziewicz,

• Instytut Biologii: A.LankoffA.Lankoff(3)(3), H.Lisowska, A.Wójcik, H.Lisowska, A.Wójcik(4)(4),, Instytut Chemii i Techniki Jądrowej (ICHTJ) w Warszawie:

• I.Buraczewska, A.WójcikI.Buraczewska, A.Wójcik(4)(5)(4)(5),, Świętokrzyskie Centrum Onkologii (ŚCO) w Kielcach:

• J.Braziewicz, pracownicy Zakładu Fizyki Medycznej i J.Braziewicz, pracownicy Zakładu Fizyki Medycznej i

Diagnostyki Obrazowej ŚCO. Diagnostyki Obrazowej ŚCO.

(1)ŚLCJ (obecnie), (2)ŚCO ; (3)ICHTJ (obecnie również); (4) GMT Department, Stockholm University, Sweden (obecnie również); (5) w okresie przeprowadzania eksperymentów

6

UKŁAD EKSPERYMENTALNY

wiązka:• wyprowadzenie do atmosfery• jednorodne natężenie w przekroju poprzecznym 95% na powierzchni rzędu 1cm x 1cm

powierzchnia napromieniana (komórki):• napromienianie powierzchni o rozmiarze 6 cm x 6

cm• monitoring on-line dawki deponowanej w materiale

biologicznym

7

UZYSKANIE WIĄZKI 1 CM X 1 CM stosowane rozwiązania - rozmycie wiązki z

akceleratora:• wielokrotne rozproszenia w folii rozpraszającej

8

UKŁAD EKSPERYMENTALNY - REALIZACJA

cyklotron izochroniczny

www.slcj.uw.edu.pl

hala eksperymentalna

www.slcj.uw.edu.pl

wykorzystano do napromieniania komórek jony 12C lub 20Ne

UKŁAD EKSPERYMENTALNY – REALIZACJA

9

stanowisko eksperymentalne - szkic stanowisko eksperymentalne - widok

nr 1. specjalna szalka Petiego z komórkami w pożywcenr 2. stolik pomiarowynr 3. zakończone folią havarową wyjście jonowodunr 4. kamera internetowa nr 5. płytka podtrzymująca nr 6. miejsce na detektor pod kątem 00 względem pierwotnego kierunku padania wiązki

rozkład natężenia jonów określony eksperymentalnie przy użyciu detektorów półprzewodnikowych (200 i 00) – pomiar profilu wiązek

profil wiązki to stosunek liczby zliczeń detektora 00

do liczby zliczeń detektora 200

wyniki pomiarowe przedstawiono na rysunkach

10

108

64

2

108

64

2

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

108

64

2

108

64

2

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

zlic

zen

ia 0

0 / zlic

zeni

a 2

00

x - pozycja (m

m)

12C 438 keV/m

y - pozycja (mm)

24

68

10

1

2

3

4

5

6

7

108

64

2

20Ne 1017 keV/m

zlic

zeni

a 00

/zlic

zeni

a 20

0

x - pozycja (m

m)

y - pozycja (mm)

jednorodność 95%

POMIARY PROFILI WIĄZEK

SPOSÓB NAPROMIENIANIA TARCZY 6 CM X 6 CM

wiązka pozostaje nieruchoma szalka jest przesuwana o

szerokość wiązki aż napromieniony zostanie obszar 6 cm x 6 cm

11

Przesuwanie szalki – stolik pomiarowy xyz, zmienia pozycję w wyniku reakcji na impuls elektryczny generowany po zarejestrowaniu określonej liczby zliczeń przez detektor 200

Schemat układu elektronicznego

PROGRAM STERUJĄCY STOLIKIEM POMIAROWYM

Cel: poruszanie stolikiem zgodnie z wytyczoną trasą

12

Założenia: wiązka

monoenergetyczna (jedna wartość LET)

LET na grubości komórki jest stałe

zmiana LET na grubości komórki

Etap wstępny (dozymetria on-line)

Etap szczegółowy (dozymetria off-line)

13

Dawka zmieniana na podstawie zliczeń detektora 200

'3-9 20 0

' 220

1 1( ) 1.6 10 suma suma

suma

N NdE keV cmD Gy C

dx m g N cm

'20 0

0 '20

suma sumasuma

suma

N NN N

N

9-9

01

1( ) 1.6 10 j

k j j k

dED Gy C N

dx

2

'0

0 0 '0

''020 0

0 ' '20 0

gdzie

(1 )509.6

( 0.5 )

jj suma

suma

jsuma sumaj

suma suma

S cmC

S mm

NN N

N

NN NN

N N

DOZYMETRIA

POMIARY ODNIESIENIA

pomiar zachowania układu biologicznego napromienianego wiązką referencyjną ze źródła 60Co (aparat terapeutyczny Theratron 780C) w ŚCO

dawka określona została zgodnie z procedurami medycznymi tj. IAEA report 277

14

źródło kobaltowe

www.onkol.kielce.pl

MATERIAŁ BIOLOGICZNY

linia komórkowa CHO-K1 (Chinese Hamster Ovary) z jajnika chomika chińskiego

cechy CHO-K1: szybkie tempo wzrostu:

12-14 h cykl komórkowy zdolność do tworzenia

kolonii 22 chromosomy

hodowla komórek w szalkach Petriego ICHTJ (eksperymenty w

Warszawie) IB UJK (eksperymenty w

Kielcach)15

www.atcc.org

ZASTOSOWANE TESTY BIOLOGICZNE

test przeżywalności cel: określenie przeżycia komórek po

zaabsorbowaniu dawki promieniowania test aberracji chromosomowych

cel: określenie poziomu uszkodzeń strukturalnych chromosomów spowodowanych promieniowaniem

test mikrojądrowy: cel: określenie poziomu mikrojąder

spowodowanych promieniowaniem w komórkach dwujądrowych

testy przeprowadzono zgodnie ze standardowymi procedurami 16

TEST PRZEŻYWALNOŚCI WYNIKI – FRAKCJA PRZEŻYWAJĄCA W FUNKCJI DAWKI

mniejsza frakcja komórek przeżywających po zastosowaniu jonów niż promieniowania

model LQ (linear quadratic):

-nienaprawialne uszkodzenia

-naprawialne uszkodzenia

17

Rodzajpromieniowania

Energia na wejściu do komórki(MeV)

LET na wejściu do komórki

(keVm-1)

(Gy-1) (Gy-2) R2 RBEM

12C 33.2 438 0.70.06 0.050.04 0.99 4.0520.3 576 0.610.13 0.010.07 0.97 3.679.1 832 0.520.06 0.94 3.03

20Ne 56.2 1017 0.450.03

0.96 2.62

34.7 1245 0.380.03 0.97 2.2215 1616 0.360.03 0.97 2.05

60Co 0.170.04 0.020.01 0.96 1

SF = exp(-D-D2)

Oldham M. Phys. Educ. 36, 460 (2001)

0 1 2 3 4 5 6 7

0.01

0.1

1

frak

cja

prz

ezyw

ajac

a

dawka (Gy)

60Co 12C 438 keV/m

12C 576 keV/m

12C 832 keV/m

20Ne 1017 keV/m

20Ne 1245 keV/m

20Ne 1616 keV/m

TEST PRZEŻYWALNOŚCI WYNIKI - WZGLĘDNA SKUTECZNOŚĆ BIOLOGICZNA

RBE=f(LET): brak

zróżnicowania na typ jonów (LET: ~400-1600 keV/m)

18

10 100 1000

2

3

4

5

6

7

8

9

171 keV/m

153 keV/m

a)

RB

EM

LET (keV/m)

12C

20Ne

40Ar

56Fe

12C

20Ne

10 100 1000

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

171 keV/m

153 keV/m

b)

12C

20Ne

40Ar

56Fe

12C

20Ne

RB

E10

%

LET (keV/m)

Weyrather W.K. et al. Int. J. Rad. Biol. 75,11 (1999)

Mehnati P. et al. J. Rad. Res. 46 (2005)

TEST ABERRACJI CHROMOSOMOWYCHWYNIKI – LICZBA ABERRACJI W FUNKCJI DAWKI

większa skuteczność indukowania aberracji przez ciężkie jony niż promieniowanie

fit LQ model:

(Evans H.J. Phys.Med.Biol. 17, 1(1972))

c-poziom aberracji spontanicznych

-współczynnik nienaprawialnych uszkodzeń 19

aberracje/komórkę = c + D

0 1 2 3 4 5 6 70.0

0.5

1.0

1.5

calk

ow

ita

liczb

a ab

erra

cji/

kom

ork

edawka (Gy)

12C 9.1 MeV

60Co

TEST MIKROJĄDROWY WYNIKI – MN/BNC W FUNKCJI DAWKI Mikrojądra to małe

struktury widoczne w cytoplazmie

fit LQ model:

-nienaprawialne uszkodzenia

-naprawialne uszkodzenia

MN – mikrojądra BNC – komórki

dwujądrowe 20

MN/BNC = D + D2 (Słonina D. Rad. Environ. Biophys.42 (2003))

Komórka z dwoma jądrami

Komórka z dwoma jądrami i 1 mikrojądrem

PODSUMOWANIE – CZĘŚĆ 1

uruchomiony został układ eksperymentalny przeznaczony do badań radiobiologicznych z użyciem ciężkich jonów z cyklotronu warszawskiego,

przeprowadzono trzy testy biologiczne z użyciem komórek CHO-K1,

otrzymane wyniki pozwoliły na: uszczegółowienie relacji RBE-LET w zakresie LET ~400-

1600 keV/m wskazując na brak zróżnicowania na typ jonów,

21

CZĘŚĆ 2 - PRZEŻYWALNOŚĆ KOMÓREK NAPROMIENIANYCH WIĄZKĄ DWÓCH JONÓW

Cel: określenie efektu jednoczesnego działania dwóch

jonów o różnym LET na komórki Wykorzystywane jony:

Jony węgla Jony tlenu

22

ZASTOSOWANIE BADAŃ

promieniowanie słoneczne (solar flares) protony (80%), jony helu (5-

10%),ciężkie jony i elektrony (1%)

galaktyczne promieniowanie kosmiczne (wybuchy supernowych) protony (85%), jony helu (14%),

cięższe jony (1%) – węgla, żelaza, tlenu, neonu

energia:100 MeV-1020 eV

procesy fragmentacji jonów

Ochrona radiologiczna astronautów

Radioterapia ciężkojonowa

23

Stelzer H. Nucl.Phys. B 61B (1998)

WSPÓŁPRACA Środowiskowe Laboratorium Ciężkich Jonów Uniwersytetu

Warszawskiego (ŚLCJ UW):

• Z.Szefliński wraz ze współpracownikami, zespół obsługujący Z.Szefliński wraz ze współpracownikami, zespół obsługujący cyklotron,cyklotron,

Narodowe Centrum Badań Jądrowych (NCBJ) w Świerku:

• M.Jaskóła, A.Korman, M.Jaskóła, A.Korman, Wydział Fizyki Uniwersytetu Warszawskiego (UW):

• U.Kaźmierczak,U.Kaźmierczak, Uniwersytet Jana Kochanowskiego (UJK) w Kielcach:

• Instytut Fizyki: D.BanaśD.Banaś(1)(1), J.Braziewicz, , J.Braziewicz,

• Instytut Biologii: A.LankoffA.Lankoff(2)(2), H.Lisowska, A.Wójcik,, H.Lisowska, A.Wójcik, Instytut Chemii i Techniki Jądrowej (ICHTJ) w Warszawie:

• M.Kruszewski, M.Wojewódzka,M.Kruszewski, M.Wojewódzka, Świętokrzyskie Centrum Onkologii (ŚCO) w Kielcach:

• J.Braziewicz, pracownicy Zakładu Medycyny NuklearnejJ.Braziewicz, pracownicy Zakładu Medycyny Nuklearnej GMT Department, Stockholm University, Sweden:

• A.Wójcik.A.Wójcik.

(1)ŚCO ; (2)ICHTJ;

24

WIĄZKA DWUJONOWA - OTRZYMYWANIE

Wiązka dwujonowa dostarczana jest przez cyklotron ŚLCJ

Zasada działania cyklotronu: wykorzystanie zachowania naładowanej cząstki w polu

elektrycznym i magnetycznym zapewnienie spełnienia warunku synchroniczności

pomiędzy częstością cyrkulacji cząstki w polu magnetycznym (częstością cyklotronową), a częstością oscylacji pola elektrycznego

Częstość cyklotronowa (fc): fc =

Odpowiednio dobierając stosunek q/m dla jonów węgla i tlenu przyspieszamy jednocześnie dwa jony w cyklotronie:

25

2mqB q – ładunek

B – indukcja magnetycznam - masa

jony węgla jony tlenu

q= 3 m=12 u q = 4 m=16 u

q/m = 1/4 q/m=1/4

źródło jonówpodłączone do zbiorników

z 12C i 16O

WIĄZKA DWUJONOWA – 1-SZY TEST

Po raz pierwszy wiązkę dwujonową otrzymaliśmy w 2006 r.

Widmo energetyczne:

26

Dane z pracy magisterskiej T. Adamus, UW, 2007

WIĄZKA DWUJONOWA – KOLEJNE EKSPERYMENTY

Wiązkę dwujonową po raz kolejny otrzymaliśmy i wykorzystaliśmy do napromieniania materiału biologicznego w 2012 r. i 2013 r.

Wykorzystywane jony: Jony węgla:

energia = 68 MeV (na wejściu do komórek), LET= 265 keV/m.

Jony tlenu: energia = 91 MeV (na wejściu do komórek), LET= 456 keV/m.

Profil wiązki – jednorodność 95%

27

komórki CHO-K1 – Chinese Hamster Ovary

UKŁAD EKSPERYMENTALNY I MATERIAŁ DOŚWIADCZALNY

standardowy układ eksperymentalny materiał doświadczalny

28 www.atcc.org

ww

w.slcj.u

w.e

du

.pl

DOZYMETRIA

Dawka zmieniana na podstawie sumy zliczeń detektora pod kątem 200

Etap wstępny (dozymetria on-line)

29

Założenie: wiązka dla pojedynczych jonów jest monoenergetyczna LET na grubości komórki jest stałe oraz

DOZYMETRIA

Dawka jest obliczana na podstawie:

Etap szczegółowy (dozymetria off-line)

30

zmiana LET na grubości komórki

WIĄZKA DWUJONOWA – TEST BIOLOGICZNY

Po napromienieniu komórek skutki są badane używając testu przeżywalności.

Celem tego rodzaju testu jest określenie frakcji komórek przeżywających po zaabsorbowaniu dawki promieniowania.

Na podstawie tych danych wykreślana jest krzywa przeżywalności będąca relacją między frakcją komórek przeżywających napromienianie a dawką promieniowania zaabsorbowanego.

31

ADDYTYWNOŚĆ CZY SYNERGIA Znając krzywe przeżywalności dla wiązki mieszanej

oraz osobno dla wiązki węgla i tlenu określimy czy uzyskany efekt jest rezultatem addytywnym czy synergicznym.

Efekt addytywny Efekt addytywny występuje wtedy, gdy liczba uszkodzeń powstałych przy jednoczesnym działaniu dwóch czynników (A – 12C3+, B – 16O4+) jest równa sumie uszkodzeń spowodowanych oddzielnie przez czynnik A i B.

Efekt synergiczny Efekt synergiczny występuje wtedy, gdy liczba uszkodzeń powstałych przy jednoczesnym działaniu dwóch czynników (A i B) jest większa niż suma ich oddzielnego działania.

Efekt antagonistyczny Efekt antagonistyczny występuje wtedy, gdy liczba uszkodzeń powstałych przy jednoczesnym działaniu dwóch czynników (A i B) jest mniejsza niż suma ich oddzielnego działania.

32

(Berek S. et al. Gynecologic oncology 2009)

(Jeremic B. Advances in Radiation Oncology in Lung Cancer 2012)

(Jeremic B. Advances in Radiation Oncology in Lung Cancer 2012)

ADDYTYWNOŚĆ CZY SYNERGIA - IZOBOLOGRAM

Opierając się na otrzymanych krzywych przeżywalności dla czynnika A – węgiel i czynnika B – tlen rysujemy izobologram (podpunkt (b))

33

Streffer C. et al. IJRB 1987

Tannock I. et al. The basic science of oncology 2004

ADDYTYWNOŚĆ CZY SYNERGIA - IZOBOLOGRAM

IzobologramIzobologram (rys. (b)) łączy dawki dwóch czynników A i B, przy których oczekuje się, że dadzą ten sam efekt biologiczny (np. przeżywalność 20%), kiedy używane są razem.

Dawki odczytywane są z krzywych przeżywalności dla czynnika A i B, przy danym poziomie przeżycia.

Z powodu rozważań dotyczących nałożenia lub nienałożenia na siebie uszkodzeń powstają dwie krzywe I i II, które zakreślają otoczkę addytywności (envelope of additivity).

Dane eksperymentalne (tj. po napromienieniu komórek wiązką mieszaną) ulokowane wewnątrz otoczki addytywności wskazują na efekt addytywny.

Dane poza otoczką na efekt synergiczny lub antagonistyczny.

34Streffer C. et al. IJRB 1987

PRZEGLĄD LITERATURY W literaturze efekt addytywny i synergiczny jest badany od dawna. W

większości badań wykorzystywano promieniowanie rtg, neutrony. A – addytywność, S - synergia

35

Reference Agent A Agent B Result

Barendsen et al. 1960

X-rays 210Po (α) A

Raju & Jett 1974 X-rays 239Pu (α) A

Railton et al. 1975 60Co n S

Durand & Olive 1976 X-rays n S

Ngo et al. 1977 X-rays n S

Ngo et al. 1981 X-rays 10Ne S

Bird et al. 1983 X-rays 2H, 3He S

Higgins et al. 1983 60Co n S

Higgins et al. 1984 60Co n S

Joiner et al. 1984 X-rays n S

McNally et al. 1984 X-rays n S

McNally et al. 1988

X-rays 239Pu (α) A

Reference Agent A

Agent B Result

Ngo et al. 1988 X-rays 10Ne, 18Ar SBrooks et al. 1990 X-rays 238Pu (α) SSuzuki 1993 60Co n SKanai et al. 1997Kanai et al. 1997 33HeHe,,44HeHe 1212CC AAWuttke et al. 1998

X-rays n A

Furusawa et al.2002

X-rays 18Ar, 4Si,56Fe A

Demizu et al. 2004

X-rays 12C A

Sutherland et al. Sutherland et al.

20052005pp 2828SiSi AA

Zhou et al. 2006Zhou et al. 2006 pp 5656Fe, Fe, 4848TiTi SSBennett et al. Bennett et al. 20072007

pp 5656Fe, Fe, 4848TiTi SS

Hada et al. 2007Hada et al. 2007 pp 5656FeFe SSPhoenix et al. 2009

60Co 238Pu (α) A

Elmore et al. 2011Elmore et al. 2011 pp 5656FeFe AA

Tabela od Staff E., Szwecja

PODSUMOWANIE – CZĘŚĆ 2

Planujemy: Napromienianie komórek wiązką węgla i osobno wiązką

tlenu Wykreślenie krzywych przeżywalności Określenie rezultatu: addytywność czy synergizm

36

DZIĘKUJĘ ZA UWAGĘ

37