Upload
keilah
View
81
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Hodowle tkankowe, komórki macierzyste. Typy hodowli. Pierwszorzędowe = pierwotne Wtórne Linie komórkowe Linie unieśmiertelnione telomeraza onkogeny onkowirusy nowotworowe. Pojęcia. Medium = pożywka Zdefiniowane Niezdefiniowane Bezsurowicze Skład: - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Hodowle tkankowe,komórki macierzyste
Typy hodowli
Pierwszorzędowe = pierwotneWtórneLinie komórkoweLinie unieśmiertelnione telomerazaonkogenyonkowirusy nowotworowe
PojęciaMedium = pożywka Zdefiniowane Niezdefiniowane Bezsurowicze
Skład: Aminokwasy – 9 egzogennych (His, Ile, Leu, Liz, Met, Phe,
Thr, Trp, Val); dodatkowo Cys, Gln, Tyr Witaminy Sole,glukoza Surowica – zawiera insulinę, transferynę Czerwień fenolowa Dodatki: IL-2 dla limfocytów T, erytropoetyna dla erytrocytów
Warunki hodowli
Temperatura
Tlen, dwutlenek węgla
pH
Wilgotność powietrza
Laboratorium
Hodowle imitujące warunki fizjologiczne
• ko-kultury
• hodowle podtrzymujące z ang. „feeder layers”
• hodowle 3D na odpowiednich matrycach
• hodowle uniemożliwiające adhezję
Izolacja komórekOddzielenie od macierzy międzykomórkowej i rozbicie
na pojedyncze komórki
rozdrobnienie mechaniczne tkanki
trawienie enzymami proteolitycznymi
traktowanie EDTA –wiąże jony wapnia potrzebne do kontaktu komórka-komórka
Rozbicie komórek
szok osmotyczny
ultradźwięki
przecieranie przez sita
homogenizacja
Rozdział frakcji
Cytometr przepływowy z sorterem
Chemotaksja
Adhezja
Wirowanie
Obecność markerów – antygenów powierzchniowych
Tworzenie CFU
Cytofluorymetria przepływowa z sorterem
MACS – rozdział immunomagnetyczny
Schemat izolacji immunomagnetycznej
Selekcja pozytywna
Selekcja negatywna
Komórki jednojądrowe ze szpiku kostnego
Medium HGF
Izolacja chemotaktyczna
SDF-1 LIF
Wirowanie
W gradiencie gęstości: frakcje wędrują w zależności
od rozmiaru i kształtu gdy użyje się niskiego gradientu cukru (5-20%);
w zależności od gęstości frakcji, gdy użyje się wysokiego gradientu cukru (20-70%)
W gradiencie prędkości: frakcje wędrują w zależności
od ciężaru – im mniejsza frakcja tym większej prędkości trzeba użyć
Liczenie komórek
cytometr
Komora Burkera
Średnia ze zliczeń
Gęstość komórek /cm3: C=n* 105
n- ilość zliczonych komórek
Określenie żywotności
Błękit trypanu – martwe-niebieskie jądraBromek etydyny – martwe-jądra czerwoneJodek propydyny- martwe – jądro czerwoneDwuoctan fluoresceiny – żywe – zielona fluorescencja cytoplazmy
Komórki macierzyste
TypyEmbrionalne ESCSomatyczne Z krwi pępowinowej
Cechy komórki macierzystej
Nieograniczona ilość podziałów
Zdolność do różnicowania
Zdolność samoodnawiania
Świat nauki 05/2002
Podziały
Bardzo rzadkie
Symetryczne
Asymetryczne
Regulacja
Świat nauki 07/1999
Typy komórek macierzystych
Totipotencjalne
Pluripotencjalne
Multipotencjalne
Unipotencjalne
www.wi.mit.edu
Blastocysta
Blastocysta =
trofoblast + węzeł zarodkowy
Trofoblast tworzy łożysko
Komórki węzła zarodkowego tworzą 3 listki zarodkowe
www.kumc.edu
Blastocysta
0,1 –0,2 mm średnicy
100 –150 komórek
www.kumc.edu
Hodowla
Komórki węzła zarodkowego
Warstwa odżywcza z inaktywowanych fibroblastów mysich
Surowica bydlęca
Świat nauki 06/1999
Różnicowanie mezenchymalnych komórek macierzystych
MSC Osteoblasty Osteoklasty
zwiększenie aktywnościalkalicznej fosfatazy
tworzenie ognisk mineralizacji
zmiana morfologii i gromadzenie kropli tłuszczu
zmiana morfologii i odkładanie proteoglikanów
ESC
ZALETY:
Pluripotencjalne
Zgodność antygenowa – brak odrzutu
WADY:
Trudna hodowla Nieprzewidywalny
kierunek różnicowania
Potworniaki 20% Problemy etyczne
Klonowanie terapeutyczne
Jądro komórki somatycznej wprowadzane do pozbawionego jądra oocytuCytoplazma oocytu „odmładza” jądroEmbrion hodowany do stadium blastocysty
www.biochem18.stanford.edu
Problemy
Źródło oocytów
Nieznana wydajność tej techniki
Wydajność 14% -na 1 linię 280 oocytów
Oocyty zwierzęce
www.lef.org
Partenogeneza
Niezapłodniony oocyt pobudzany do rozwoju
Podwójny zestaw chromosomów dawcy oocytu
Komórki pluripotencjalne
www.bedfordresearch.org
Odróżnicowanie
Izolacja enzymów oocytu „odmładzających” jądro
Iniekcja do komórki hematopoetycznej
Komórki odzyskują pluripotencjalność
www.ohsu.edu
Płodowe komórki macierzyste FSC
5-9 tygodniowe płody
Izolacja komórek linii płciowej
Pierwotne komórki zarodkowe EG
www.molbio.princeton.edu
Migracja ESC do organizmu matki
Zaostrzenie chorób autoimmunolo – gicznych
Migracja do miejsca uszkodzenia i regeneracja tkanek – ochrona matki
Świat nauki 12/2005
Krew pępowinowa
Alternatywne źródło krwiotwórczych SC
Przeszczepy autogeniczne i allogeniczne
Możliwość bankowania
130 tys. porcji zbankowanych
3500 przeszczepów
www.hemastem.com
Krew pępowinowa
ZALETY:Dostępność i czas
Bezpieczna metoda pobrania
Większa pula dostępnych dawców
Młode SC
Mniej nasilone GvH
Minimalne ryzyko zakażenia CMV
Brak dylematów moralnych
WADY:Porcja 100 ml bezpieczna dla biorcy 30 kg
Opóźnione zasiedlanie szpiku
Ryzyko obciążeń genetycznych
Nieznany wpływ bankowania
Mniej SC niż w szpiku i krwi mobilizowanej
Możliwości zastosowania krwi pępowinowej
Leczenie białaczek
Leczenie pacjentów po chemioterapii lub radioterapii
Uzyskanie komórek nerwowych
Uzyskanie komórek mezenchymalnych, trzustkowych i hepatocytów
www.waisman.wisc.edu
Banki krwi pępowinowej
PUBLICZNE:
Krew sklasyfikowana pod względem HLA
Przeszczepy allogeniczne
Ponoszą wszystkie koszty
Ogólnodostępny rejestr dawców
Dowolny biorca
KOMERCYJNE:
Przeszczepy autogeniczne lub w obrębie rodziny
Nie ponosi kosztów
Ryzyko zakończenia działalności i zniszczenia komórek
Somatyczne komórki macierzyste
Niezróżnicowane
Ograniczona proliferacja
Liczba z wiekiem maleje
Efekt starzenia
Dostosowanie do niszy tkankowej
Nie tworzą potworniaków
Stan uśpienia
www.rsna.org
Występowanie somatycznych SC
szpik
mięśnie – komórki satelitarne
skóra
jelito
wątroba
mózg
Wykorzystanie somatycznych SC
ZALETY:
Brak dylematów etycznych
Nie tworzą się potworniaki
WADY:
Trudność pozyskania
Brak zgodności tkankowej
Efekt starzenia
W stanach chorobowych lub martwicy mniejsza liczba
Przeszczepy
Autologiczne
Allogeniczne
Ksenogeniczne
Narządów
Tkanek
komórek
Możliwości wykorzystania
Badania embriogenezy
Badania nieprawidłowego rozwoju
Badania działania genów
Testowanie leków
Badanie teratogenów
Zastosowania medyczne
www.kumc.edu
Ograniczenia
Możliwość odrzutu przeszczepu allogenicznegoLinie hodowane na mysich fibroblastach i surowicy cielęcej – możliwość transmisji patogenów SC pobierają mysie białko i prezentują je na swojej powierzchni – odrzucenie przeszczepuTrudności uzyskania, hodowli i różnicowaniaKontrowersje etyczne
www.zaman.com
Oparzenia
Skóra wyhodowana in vitro dostępna komercyjnie
Przeszczep odtwarza włosy i gruczoły łojowe
Prawidłowy układ strefy wzrostu
www.times.hankooki.com
Zawał serca
W Polsce 100 tys. rocznie
Nekroza kardiomiocytów
Blizna łącznotkankowa
Przebudowa ściany
Świat nauki 12/2004
SSC w terapii pozawałowej -próby przedkliniczne
Myszy, szczury, owce, świnie
Poprawa kurczliwości
Indukcja angiogenezy
Prawidłowe ułożenie
Ochrona przed dalszą degeneracją
Po miesiącu 38% blizny zastąpione tkanką mięśniową
www.worldhealthspecialists.org
Badania kliniczne
Poznań i Paryż
Podanie podczas bypassów lub przezskórnie
Makrofagi + SC
Większość komórek nie przeżywa
Zwiększenie frakcji wyrzutowej z 35% do 42%
www.dir.nhlbi.nih.gov
Cukrzyca typu ISSC trzustkowe
Różnicowanie ESC w komórki wysepek trzuskowych
Produkcja insuliny
Możliwy przeszczep w nie fizjologicznej lokalizacji – pod torebkę nerki
www.stemcells.nih.gov
Uszkodzenia wzroku
Stosowana terapia
SSC z rąbka rogówki
In vitro hodowana błonka wszczepiana w miejsce uszkodzenia
Oparzenia rogówki
www.stemcell.umn.edu
Choroba Parkinsona
ok. 300 pacjentów
ESC lub SSC
Tworzyły połączenia neuronalne, produkcja dopaminy
50% redukcja objawów
Efekt utrzymywał sięprzez 5-10 lat
90-95% komórek zamiera po przeszczepie
Na 1 pacjenta potrzeba 6 płodów
www.stemcells.nih.gov
Udar mózgu oraz uszkodzenia rdzenia
kręgowegoPodanie dożylne
Angiogeneza, neurogeneza, regeneracja funkcjonalna
Wydzielają czynniki neuropoezy www.rsna.org
Zęby
Badania na myszach
SC z miazgi zębów mądrości
15 – 20% miało prawidłowy układ tkanek
Ograniczenia: Źródło Rozwój w szczęce
dorosłego Tworzenie korzeni Przewidywalna wielkość
i kształt
Świat nauki 9/2005
Hodowla narządów
Nerka: Autologiczna Na kolagenowym
rusztowaniu Po 12 tygodniach
produkowała mocz
Wątroba
Pęcherz moczowy
www.obgyn.net
CD34+ 2,5% marker SCCD133+ 1,1% marker SCCD33+ 45% marker komórek
hematopoetycznychCD71+ 6% marker limfocytówCD105+ 0,7% marker komórek
szpikuCD19+ 24% marker limfocytów BCD14+ 7,8% marker monocytówCD3+ 34% marker limfocytów T