SKRIPSI - core.ac.uk · dilaporkan bahwa tanaman kamboja jepang mengandung glikosida jantung dengan kandungan utama berupa oleandrigenin beta-gentiobiosyl-beta-D-thevetoside, neridienone

KANDUNGAN GLIKOSIDA JANTUNG DAN PROFIL PERTUMBUHAN KALUS DAUN KAMBOJA JEPANG

( Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult. ) DALAM MEDIA TUMBUH MURASHIGE - SKOOG

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :

Melissa Wijaya

NIM : 038114112

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2007

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii


iii


The fear of the LORD is the beginning of knowledge,

But fools despise wisdom and instruction.

( Proverbs 1 : 7 )

Trust in the LORD with all your heart,

And lean not on your own understanding.

In all your ways acknowledge HIM,

And He shall direct your paths.

( Proverbs 3 : 5‐6 )

I can do all things through Christ who strengthens me.

( Philippians 4: 13 )

I dedicated this masterpiece to :

My Savior Jesus Christ

My beloved Dad and Mom

My Brother Samuel

My Benny Bear

My Almamater

iv


PRAKATA

Puji syukur kehadirat Allah Bapa di surga, atas limpahan berkat dan

kasih-Nya yang tak terhingga, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang

berjudul “Kandungan Glikosida Jantung dan Profil Pertumbuhan Kalus Daun

Kamboja Jepang ( Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult. ) Dalam Media

Tumbuh Murashige-Skoog”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat

memperoleh gelar sarjana Farmasi (S.Farm) di Fakultas Farmasi, Universitas

Sanata Dharma, Yogyakarta.

Skripsi ini dapat terselesaikan karena bantuan, bimbingan, saran,

dukungan, cinta dan doa yang tulus dari berbagai pihak. Oleh karena itu, dengan

segala kerendahan hati, penulis ingin menyampaikan rasa terima kasih kepada:

1. Kedua orang tua penulis, Kusnadi Widjaja dan Tuti Setiawati, dan kakak

penulis, Samuel Wijaya, terima kasih atas doa, cinta, kasih sayang dan

pengorbanannya.

2. Rita Suhadi M, Si., Apt selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma Yogyakarta.

3. Ign.Y. Kristio Budiasmoro, M.Si selaku dosen pembimbing yang telah

berkenan membimbing, mengarahkan dan memberikan saran kepada penulis

dalam menyelesaikan skripsi ini.

4. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt selaku dosen penguji yang bersedia untuk

menguji dan memberi saran dalam skripsi ini.

5. Christine Patramurti, M.Si., Apt selaku dosen penguji yang bersedia untuk

menguji dan memberikan saran dalam skripsi ini.

v


6. Benny Sugientoro, S.Farm., buat cinta, dukungan, doa, perhatian, semangat

dan kasih sayangnya.

7. Mas Sigit, Mas Wagiran, Mas Andri dan Pak Mukmin yang banyak membantu

penulis selama bekerja di laboratorium.

8. Mbak Christin, Mbak Mina, Mbak Vero, Mas Didit, Donny, Ko Vekeh, Pak

Eko dan Ci Vivien, terima kasih atas semua doa, dukungan dan bantuannya.

9. Teman-teman angkatan 2003 teristimewa kelas C, terima kasih buat kasih

persahabatan dan kebersamaannya selama ini.

10. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah mendukung

dalam penyusunan skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih ada kekurangan yang harus

diperbaiki, oleh karena itu saran dan kritik yang bersifat membangun sangat

diharapkan. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak

Yogyakarta, Februari 2007

Penulis

vi


vii


DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ..................................................................................

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .........................................

HALAMAN PENGESAHAN.....................................................................

HALAMAN PERSEMBAHAN..................................................................

PRAKATA .................................................................................................

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA......................................................

DAFTAR ISI ..............................................................................................

DAFTAR TABEL ......................................................................................

DAFTAR GAMBAR .................................................................................

DAFTAR LAMPIRAN ..............................................................................

INTISARI...................................................................................................

ABSTRACT ..................................................................................................

BAB I PENGANTAR ................................................................................

A. Latar Belakang ..............................................................................

1. Rumusan Permasalahan ..........................................................

2. Keaslian Penelitian ..................................................................

3. Manfaat Penelitian ..................................................................

B. Tujuan Penelitian ............................................................................

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ........................................................

A. Uraian Tanaman Kamboja Jepang ..................................................

i

ii

iii

iv

v

vii

viii

xii

xiii

xiv

xv

xvi

1

1

2

3

3

4

5

5

viii


B. Kultur Jaringan Tanaman .............................................................

1. Eksplan ......................................................................................

2. Media.........................................................................................

3. Lingkungan................................................................................

C. Glikosida Jantung............................................................................

D. Kromatografi Lapis Tipis ................................................................

E. Landasan Teori ...............................................................................

F. Hipotesis..........................................................................................

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ...................................................

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ......................................................

B. Definisi Operasional .......................................................................

C. Alat dan Bahan Penelitian ...............................................................

1. Alat penelitian ...........................................................................

2. Bahan Penelitian........................................................................

D. Tata Cara Penelitian .......................................................................

1. Determinasi tanaman .................................................................

2. Pembuatan stok ..........................................................................

3. Pembuatan media.......................................................................

4. Sterilisasi alat dan ruangan ........................................................

5. Sterilisasi dan penanaman eksplan ...........................................

6. Pengamatan waktu inisiasi kalus ...............................................

7. Subkultur....................................................................................

8. Pemanenan .................................................................................

5

7

9

21

23

25

28

29

30

30

30

31

31

33

35

35

35

37

38

38

39

39

40

ix


9. Analisis pertumbuhan kalus.......................................................

10. Pengeringan dan pembuatan serbuk daun kamboja jepang .......

11. Pembuatan ekstrak kalus daun kamboja jepang ........................

12. Pembuatan ekstrak daun kamboja jepang..................................

13. Uji KLT ekstrak kalus daun kamboja jepang dan ekstrak daun

tanaman asalnya. .........................................................................

E. Analisis Hasil .................................................................................

1. Pembuatan grafik pola pertumbuhan kalus berdasarkan data

penimbangan bobot kalus basah dengan umur kalus ...............


biomassanya .............................................................................

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................

A. Determinasi Tanaman .....................................................................

B. Pemilihan Eksplan, Sterilisasi, dan Penanaman..............................

C. Deskripsi Kalus dan Waktu Inisiasi Kalus ......................................

D. Subkultur dan Panen........................................................................

E. Profil Pertumbuhan Kalus ...............................................................


penimbangan bobot kalus basah dengan umur kalus. ..............

2. Biomassa kalus selama masa pertumbuhan 42 hari. ................

F. Persen Kadar Air Kalus...................................................................

G. Kromatografi Lapis Tipis ................................................................

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .....................................................

41

43

43

44

44

44

45

45

47

47

47

50

52

54

54

58

58

60

64

x


A. Kesimpulan .....................................................................................

B. Saran ...............................................................................................

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................

LAMPIRAN ...............................................................................................

BIOGRAFI PENULIS ................................................................................

64

64

65

68

82

xi


DAFTAR TABEL

I.

II

Waktu inisiasi kalus rata-rata daun kamboja jepang.........................

Hasil pengamatan KLT dengan fase diam silika gel GF254 dan

fase gerak etil asetat : metanol : air ( 81 : 11 : 8 v/v ) ......................

51

61

xii


DAFTAR GAMBAR

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

Strukur glikosida jantung..................................................................

Eksplan dalam bentuk irisan melintang daun ...................................

Inisiasi kalus daun kamboja jepang ..................................................

Profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan

bobot kalus basah..............................................................................

Persen kadar air kalus daun kamboja jepang ....................................

Hasil KLT setelah disemprot dengan pereaksi asam sulfat (97 %) ..

Hasil KLT setelah disemprot dengan pereaksi Kedde......................

Foto tanaman kamboja jepang ( Adenium obesum (Forssk.)

Roem. & Schult.) ..............................................................................

Foto daun kamboja jepang ................................................................

Foto kalus siap subkultur ..................................................................

Foto kalus siap panen........................................................................

Foto kalus basah................................................................................

Foto kalus kering...............................................................................

Foto serbuk kalus ..............................................................................

Foto hasil KLT secara visual ............................................................

Foto hasil KLT dilihat dengan pereaksi asam sulfat ( 97% ) ...........

Foto hasil KLT dilihat dengan pereaksi Kedde ................................

24

49

52

56

59

61

62

69

69

70

70

70

70

70

71

72

73

xiii


DAFTAR LAMPIRAN

1. Surat Determinasi Tumbuhan ..............................................................

2. Foto-foto Hasil Penelitian ....................................................................

3. Komposisi media tumbuh Murashige-Skoog ( MS ) ...........................

4. Data penimbangan bobot kalus basah dan bobot kalus kering dalam

media tumbuh MS................................................................................

5. Profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan bobot

kalus basah ...........................................................................................

6. Profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan bobot

kalus kering ..........................................................................................

7. Data persen kadar air kalus kamboja jepang........................................

68

69

74

76

77

79

81

xiv


INTISARI

Tanaman kamboja jepang ( Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult.) selama ini biasanya digunakan sebagai tanaman hias. Penggunaan kultur jaringan untuk menghasilkan metabolit sekunder dari tanaman bertujuan untuk membuktikan bahwa jaringan dapat menggantikan tanaman asal secara fungsional, termasuk menghasilkan metabolit sekunder. Dalam penelitian ini, metabolit sekunder yang diteliti yaitu glikosida jantung dari kalus daun kamboja jepang.

Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh informasi tentang pertumbuhan in vitro kalus daun tanaman kamboja jepang dengan cara mengukur waktu inisiasi kalus dan profil pertumbuhan kalus serta membandingkan kandungan kimia kalus dengan tanaman asal. Eksplan untuk menghasilkan kalus didapat dari jaringan daun kamboja jepang yang ditanam secara in vitro pada media tumbuh MS (Murashige-Skoog) dengan penambahan zat pengatur tumbuh asam 2,4-Diklorofenoksiasetat (analog auksin). Kalus kemudian diekstrak dengan campuran kloroform-metanol (1 : 10 v/v)

Analisis profil pertumbuhan kalus dilakukan berdasarkan bobot kalus basah dan bobot kalus kering. Uji KLT dilakukan dengan membandingkan harga Rf bercak-bercak hasil pengembangan ekstrak kalus daun kamboja jepang dengan ekstrak daun kamboja jepang dalam fase diam silika gel GF254, fase gerak etil asetat : metanol : aquadest ( 81 :11 : 8 v/v ) dengan jarak pengembangan 10 cm. Deteksi yang digunakan yaitu sinar UV 254 dan 365 nm, serta pereaksi Kedde dan pereaksi asam sulfat berdasarkan acuan (Wagner,1984).

Dari hasil penelitian, diketahui bahwa waktu inisiasi kalus adalah 10,3 hari. Profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang mengikuti pola pertumbuhan sigmoid fase lag, fase eksponensial dan fase stasioner. Hasil KLT yang diperoleh menunjukkan bahwa ekstrak kalus daun kamboja jepang hasil budidaya in vitro tidak mengandung glikosida jantung seperti tanaman asalnya.

Kata kunci : Adenium obesum , kalus, glikosida jantung.

xv


ABSTRACT

Kamboja jepang ( Adenium obesum ( Forssk.) Roem & Schult.) during the time is usually used as decorative plant. Usage of tissue culture to provide secunder metabolit from plant aim to prove that the tissue can act as a complete plant system functionally, including provide secunder metabolit. The experiment’s secunder metabolite is cardiac glycoside from callus of kamboja jepang leaf.

The purpose of this experiment is to get information of growth callus kamboja jepang by in vitro by measuring callus initiation time and profile of callus growth and also compare chemical content of callus with the whole plant leaf. Explan to yield callus got from kamboja jepang leaf planted by in vitro at media growth MS ( Murashige-Skoog) with addition regulator of growth 2,4-Dichlorophenoksiacetate (an auxin analogue). Then, callus be extracted with mixture of chloroform-methanol ( 1 : 10 v / v).

Analysis of growth profile of callus based on wet callus weight and dry callus weight. Test of KLT be done by comparing Rf value of KLT spots of extract callus and the whole plant leaf at silica gel GF254 as stationary phase, ethyl acetate: methanol : aquadest ( 81 : 11 : 8 v / v ) as mobile phase with distance of elution is 10 cm. The detection include UV 254 and 365 light, and Kedde reagent and sulphate acid reagent according to Wagner (1984). From the result of experiment, it be known that callus initiation time is 10,3 days. Callus growth profile follow sigmoid pattern which consist of lag phase, exponensial phase and stasioner phase. From the result of TLC indicate that extract of callus kamboja jepang leaf which conducting by in vitro do not contain cardiac glycoside like its herbs. Keywords: Adenium obesum , callus, cardiac glycoside.

xvi


BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Kamboja jepang ( Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult. ) selama ini

lebih dikenal sebagai tanaman hias ( Soenanto, 2005). Pada penelitian terdahulu

dilaporkan bahwa tanaman kamboja jepang mengandung glikosida jantung

dengan kandungan utama berupa oleandrigenin beta-gentiobiosyl-beta-D-

thevetoside, neridienone A dan 16,17-dihydroneridienone A ( Yamauchi dan Abe,

1990 ). Ekstrak dari daun tanaman kamboja jepang mengandung glikosida jantung

yang memiliki efek sitotoksik yang berpotensi sebagai antikanker ( Nakamura

et.al., 2000). Ekstrak akar dan kulit batang dari kamboja jepang juga berpotensi

sebagai agen terapeutik untuk pengobatan trypanosomiasis ( Atawodi, et al.,

2003; Freiburghaus et al., 1996). Ekstrak kulit batang kamboja jepang juga

berpotensi sebagai acaricidal ( Mgbojikwe dan Okoye, 2001).

Di dalam pencarian metode produksi metabolit sekunder dari tumbuhan

berkhasiat obat, pendekatan bioteknologi, khususnya kultur jaringan, berpotensi

sebagai alternatif di dalam produksi metabolit-metabolit bioaktif tumbuhan untuk

skala industri ( Ramachandra dan Ravishankar, 2002).

Kultur jaringan tanaman merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan

menggunakan potongan kecil jaringan atau sel atau organ, yang dipelihara dalam

suatu medium dan dikerjakan seluruhnya dalam kondisi aseptik. Organ, jaringan

dan sel tanaman yang ditumbuhkan tersebut disebut eksplan ( Katuuk, 1989 ).

1


2

Eksplan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun karena daun lebih

mudah didapat daripada bagian tanaman yang lain dan memiliki jaringan

parenkim yang akan berdediferensiasi serta mudah untuk disterilisasi.

Eksplan yang telah ditumbuhkan dalam media dapat membentuk kalus

yaitu massa amorf yang tersusun atas sel-sel parenkim berdinding sel tipis yang

berkembang dari hasil proliferasi sel-sel jaringan induk ( Yuwono, 2006 ). Ide

memperbanyak tanaman dengan jalan mengkulturkan bagian kecil organ, jaringan

atau sel tersebut dilakukan berdasarkan teori totipotensi sel yaitu : setiap sel

tanaman hidup mempunyai informasi genetik dan perangkat fisiologis yang

lengkap untuk dapat tumbuh dan berkembang menjadi tanaman yang utuh, jika

kondisinya sesuai ( Yusnita, 2003 ). Media yang digunakan dalam penelitian ini

adalah media Murashige-Skoog (MS) karena menurut Hendaryono dan Wijayani

(1994) media tersebut cocok sebagai media kultur untuk membudidayakan

tanaman hias.

Penelitian ini bertujuan untuk mengkulturkan tanaman kamboja jepang

dari bagian daun serta mengidentifikasi metabolit sekunder glikosida jantung yang

dihasilkan oleh kalus yang dibentuk dari hasil budidaya in vitro. Kultur kalus

yang dihasilkan oleh teknik kultur jaringan ini diharapkan memiliki profil

pertumbuhan sigmoidal, dimana pada fase stasionernya menghasilkan kandungan

glikosida jantung yang optimum.

1. Rumusan Permasalahan

Berdasarkan latar belakang yang telah disebutkan di atas, dapat

dirumuskan permasalahan sebagai berikut:


3

a. Apakah eksplan yang berasal dari daun kamboja jepang dapat

menghasilkan kalus jika dikembangkan secara in vitro dalam media

Murashige-Skoog ( MS ) ?

b. Bagaimana pola pertumbuhan kalus daun kamboja jepang yang

dikulturkan?

c. Apakah kalus daun kamboja jepang hasil budidaya in vitro dapat

menghasilkan glikosida jantung seperti tanaman asalnya ?

2. Keaslian Penelitian

Sejauh pengetahuan penulis, penelitian tentang kandungan glikosida

jantung dan profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang ( Adenium obesum

(Forssk.) Roem. & Schult. ) dalam media tumbuh MS belum pernah diteliti.

3. Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan memiliki beberapa manfaat antara lain:

a. Manfaat Teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat dalam mengembangkan bidang

ilmu kefarmasian, khususnya dalam mengeksplorasi kandungan glikosida

jantung dari tanaman kamboja jepang ( Adenium obesum (Forssk.) Roem.

& Schult.) yang ditumbuhkan secara in vitro.

b. Manfaat Praktis

Penelitian ini juga diharapkan dapat membantu para peneliti selanjutnya

untuk mempelajari secara lebih mendalam mengenai kultur jaringan

tanaman sehingga mempermudah dalam produksi metabolit sekundernya.


4

B. Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah :

a. Menumbuhkan kalus dari eksplan daun kamboja jepang.

b. Mengetahui pola pertumbuhan kalus daun kamboja jepang.

c. Membuktikan bahwa ekstrak kalus daun kamboja jepang hasil budidaya in

vitro dapat menghasilkan glikosida jantung seperti tanaman asalnya.


BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Uraian Tanaman Kamboja Jepang

Kamboja jepang dengan nama spesies Adenium obesum (Forssk) Roem &

Schult berasal dari famili Apocynaceae dan memiliki nama sinonim yaitu

Plumeria rubra L.cv. acutifolia.( Anonim, 2006 ).

Secara morfologis tanaman kamboja jepang ( Adenium obesum (Forssk.)

Roem. & Schult. ) memiliki akar yang mampu membesar seperti umbi dan

diselimuti oleh rambut-rambut akar yang sangat banyak; berbatang lunak dan

tidak berkayu; daunnya berbentuk lanset dengan ujung membulat, tebal dan

berserat, berwarna hijau, tampak mengkilap dan licin; bunganya berwarna merah

muda sampai merah tua, memiliki 5 helai mahkota bunga yang bagian tengahnya

berwarna putih; buahnya tumbuh secara berpasangan, terletak di ujung tunas,

berbentuk pipih panjang, berwarna hijau waktu masih muda dan kemudian

berangsur-angsur berubah menjadi cokelat; bijinya berada dalam buah, berwarna

cokelat. Tanaman ini dapat tumbuh hingga dua meter ( Soenanto, 2005).

Tanaman kamboja jepang mengandung glikosida jantung dengan

kandungan utama berupa oleandrigenin beta-gentiobiosyl-beta-D-thevetoside,

neridienone A dan 16,17-dihydroneridienone A ( Yamauchi dan Abe, 1990 ).

B. Kultur Jaringan Tanaman

Kultur jaringan dalam bahasa asing disebut sebagai tissue culture, weefsel

cultuur atau Gewebe kultur. Kultur artinya budidaya dan jaringan artinya

5


6

sekelompok sel yang mempunyai bentuk dan fungsi yang sama. Maka kultur

jaringan berarti membudidayakan suatu jaringan tanaman menjadi tanaman kecil

yang mempunyai sifat yang sama dengan induknya ( Dixon, 1985).

Kultur jaringan in vitro (mikropopagasi) adalah perbanyakan tanaman

dengan menggunakan potongan kecil jaringan atau sel yang dipelihara dalam satu

medium dan dikerjakan seluruhnya dalam kondisi aseptik ( Katuuk, 1989).

Ide memperbanyak tanaman dengan jalan mengkulturkan bagian kecil

jaringan atau organ muncul dari pendapat bahwa tanaman tinggi terdiri dari

sekumpulan sel. Sel-sel yang sama membentuk jaringan yang melakukan tugas

tertentu pada setiap organ dalam tubuh tanaman. Sel-sel ini mempunyai

kemampuan untuk melakukan seluruh proses hidup. Kemampuan sel ini disebut

“totipotency” ( Katuuk, 1989).

Teori totipotensi sel dikemukakan oleh Schwann dan Schleiden pada tahun

1838. Menurut teori ini, setiap sel tanaman hidup mempunyai informasi genetik

dan perangkat fisiologis yang lengkap untuk dapat tumbuh dan berkembang

menjadi tanaman yang utuh, jika kondisinya sesuai ( Yusnita, 2003 ).

Kultur jaringan dalam skala besar ditemukan sebagai pendekatan alternatif

yang menarik terhadap metode penanaman tradisional dimana kultur jaringan

dapat menyediakan metabolit-metabolit sekunder yang terkontrol ( Sajc et al.,

2000 ).

Keuntungan dari sistem kultur jaringan ini sebagai berikut:

a. Kandungan–kandungan zat yang berguna dapat diproduksi di bawah kondisi

yang terkontrol, terbebas dari perubahan iklim dan keadaan tanah.


7

b. Hasil kultur akan terbebas dari mikroba dan serangga.

c. Sel-sel kebanyakan tumbuhan mudah untuk berkembangbiak dalam

menghasilkan metabolit-metabolit yang spesifik.

d. Kontrol automatis dari pertumbuhan sel dan proses pengaturan metabolit yang

rasional dalam bioreaktor akan mengurangi biaya tenaga kerja dan

meningkatkan produktivitas.

e. Substansi organik dapat diekstrak dari kultur kalus. ( Dicosmo dan Misawa,

1995 ).

Faktor-faktor yang menentukan keberhasilan dalam kultur jaringan

tanaman antara lain:

1. Eksplan

Eksplan adalah bagian kecil jaringan atau organ yang dikeluarkan atau

dipisahkan dari tanaman induk kemudian dikulturkan. Berhasil tidaknya

pengkulturan eksplan tergantung pada faktor yang dimiliki oleh eksplan itu

sendiri. Faktor-faktor itu meliputi:

a. Ukuran eksplan.

Ukuran eksplan sangat menentukan proses pengkulturan. Bagian

tanaman yang dikerat masih mengandung suplai makanan serta hormon

untuk potongan itu sendiri, sehingga makin besar keratan, makin besar

kemampuan keratan ini untuk dirangsang tumbuh dan beregenerasi. Namun

dibalik itu harus dipikirkan pula bahwa makin besar eksplan, makin besar

kemungkinan mendapatkan jaringan yang terkontaminasi. Ukuran eksplan

yang paling baik adalah 0,5 sampai 1,0 cm, namun ukuran ini dapat


8

bervariasi, tergantung pada material tanaman yang dipakai serta jenis

tanaman ( Katuuk, 1989).

b.Umur eksplan.

Umur eksplan sangat mempengaruhi tipe serta daya morfogenesis.

Jaringan yang masih muda serta belum banyak berdiferensiasi terdapat pada

bagian meristematik. Dari semua jenis tanaman bagian inilah yang paling

banyak berhasil. Sel atau jaringan yang masih muda yang dinamakan

juvenile akan tetap muda dalam pengkulturan sehingga daya untuk

beregenerasi tetap ada, sedangkan sel-sel tua, kesanggupan untuk

beregenarasi sudah berkurang. Selain dari kandungan jaringan meristematik

yang berkurang, jaringan yang sudah tua ada kemungkinan sudah

mengandung banyak patogen ( Katuuk, 1989 ).

c. Sumber eksplan.

Tanaman yang dijadikan sumber eksplan hendaknya dari tanaman

yang sehat, yang bertumbuh baik / normal. Pengaruh perubahan suhu,

cahaya, musim serta kelembaban terhadap tanaman induk sangat

mempengaruhi perkembangan eksplan. Tanaman induk dituntut untuk

berkecukupan zat hara, lama penyinaran, intensitas cahaya serta hormon

tumbuh. Pendek kata pertumbuhannya harus optimum ( Katuuk, 1989 ).

d.Genotip eksplan.

Genotip adalah faktor endogen yang paling utama mempengaruhi

perkembangan jaringan eksplan, dibandingkan faktor-faktor lain. Perbedaan

kemampuan untuk beregenerasi disebabkan oleh genotip jelas dapat dilihat


9

pada tanaman monokotil, dikotil dan gymnospermae. Dari ketiga kelompok

ini, kemampuan untuk beregenerasi yang paling rendah adalah tanaman

gymnospermae, kemudian diikuti oleh tanaman monokotil, dan terakhir oleh

tanaman dikotil. Selanjutnya dikatakan bahwa apabila satu jenis tanaman

dengan mudah beregenerasi in vivo maka sifat ini berlaku juga pada in vitro

(Katuuk, 1989 ).

2. Media

Media kultur merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan

perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Berbagai komposisi media kultur

telah diformulasikan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan

tanaman yang dikulturkan. Murashige dan Skoog mempublikasikan formulasi

media MS (singkatan dari Murashige dan Skoog) yang sampai sekarang

terbukti cocok untuk kultur jaringan banyak tanaman dan banyak digunakan di

laboratorium kultur jaringan di seluruh dunia ( Yusnita, 2003 ).

Komponen media kultur yang digunakan dalam kultur jaringan adalah

sebagai berikut :

a. Air.

Air memegang peranan penting dalam proses kultur jaringan karena

95% dari media kultur terdiri dari air. Air yang digunakan dalam media

serta dalam seluruh proses kultur jaringan adalah air suling. Hal ini karena

di dalam air ledeng atau air sumur terlarut sejumlah kontaminan yang dapat

merusak proses perkembangan kultur eksplan. Kontaminan yang dimaksud

adalah substansi atau mikroorganisme yang mengganggu kultur. Air suling


10

disimpan dalam kondisi steril dengan tidak memberi peluang pada bakteri

untuk hidup dan berkembang ( Katuuk, 1991 ).

b. Garam anorganik.

Beberapa garam anorganik yang dibutuhkan tanaman dalam jumlah

takaran yang banyak dikenal sebagai unsur makro. Unsur makro adalah

unsur yang dibutuhkan dalam jumlah yang besar. Jenis-jenis yang termasuk

unsur makro adalah nitrogen (N), Fosfor (P), Kalium (K), Sulfur (S),

Kalsium (Ca), dan Magnesium (Mg). Unsur NPK adalah unsur yang mutlak

dibutuhkan oleh tanaman, yang berarti harus selalu tersedia sedangkan

unsur S,Ca, dan Mg boleh ada dan boleh tidak. Namun, karena fungsinya

sangat mendukung pertumbuhan jaringan maka akan lebih baik apabila

unsur-unsur tersebut juga tersedia ( Hendaryono dan Wijayani, 1994 ).

Adapun kegunaan dari unsur makro tersebut adalah unsur N

dipergunakan terutama untuk pertumbuhan vegetatif tanaman dan juga

berperan di dalam pembentukan hijau daun yang mana berguna untuk

proses fotosintesis dalam menghasilkan karbohidrat; unsur P dibutuhkan

tanaman untuk pembentukan karbohidrat; unsur K berfungsi berguna untuk

pembelahan sel, sintesa karbohidrat dan protein, pembuatan klorofil serta

untuk mereduksi nitrat; unsur S berperanan untuk pembentukan beberapa

jenis protein seperti asam amino dan vitamin B1; unsur Ca bertugas

merangsang pembentukan bulu-bulu akar dan bersama-sama dengan Mg

akan memproduksi cadangan makanan sedangkan unsur Mg dapat


11

meningkatkan kandungan fosfat yang berguna untuk pembentukan sejumlah

protein ( Hendaryono dan Wijayani, 1994 ).

Selain unsur makro, ada pula unsur mikro, yaitu unsur yang

dibutuhkan tanaman dalam jumlah sedikit namun harus tersedia. Unsur-

unsur tersebut adalah Besi(Fe), Mangan(Mn), Boron (B), Seng (Zn), Cobalt

(Co), Tembaga(Cu), dan Molibdenum (Mo) ( Hendaryono dan Wijayani,

1994 ).

Kegunaan dari unsur mikro tersebut adalah unsur Fe berfungsi dalam

pembentukan hijau daun (chlorophyl); unsur Mn berguna untuk

pemebentukan membran kloroplas; unsur B memegang peran penting dalam

perombakan gula; unsur Zn berperan dalam pembentukan protoplas; unsur

Co berguna untuk mengikat N dan untuk pembentukan asam inti; unsur Cu

berperan dalam konversi energi; unsur Mo berperan dalam pembentukan

klorofil ( Katuuk, 1989 ).

Unsur-unsur makro biasanya diberikan dalam bentuk NH4NO3, KNO3,

CaCl2.2H20, MgSO4.7H2O dan KH2PO4. Sedangkan unsur-unsur mikro

biasa diberikan dalam bentuk MnSO4.4H2O, ZnSO4.4H2O, H3BO3, KI,

NaMo4.2H2O, CuSO4.5H2O dan CoCl2.6H2O ( Hendaryono dan Wijayani,

1994).

c. Sumber karbon dan energi.

Media kultur jaringan memerlukan bahan sebagai sumber tenaga.

Biasanya yang merupakan sumber tenaga adalah bahan kimia organik yang

mengandung karbon. Karbohidrat adalah kimia karbon yang meliputi gula,


12

pati, dan selulosa. Karbohidrat memiliki 2 fungsi utama yaitu sebagai

sumber energi untuk jaringan dan untuk menjaga keseimbangan tekanan

osmotik potensial minimum dalam media. Ada banyak jenis karbohidrat

yang dipakai dalam kultur jaringan namun yang paling banyak digunakan

adalah sukrosa atau D-glukosa ( Katuuk, 1989).

d. Myo-inositol, Vitamin dan asam amino.

Penambahan myo-inositol pada media bertujuan untuk membantu

diferensiasi dan pertumbuhan sejumlah jaringan. Bila myo-inositol

diberikan bersama dengan auksin, kinetin dan vitamin, maka dapat

mendorong pertumbuhan jaringan kalus ( Hendaryono dan Wijayani, 1994).

Vitamin-vitamin yang sering digunakan dalam media kultur jaringan

antara lain adalah Tiamin (vitamin B1), Piridoksin (vitamin B6), dan asam

nikotinat. Tiamin adalah vitamin yang esensial untuk hampir semua kultur

jaringan tumbuhan. Fungsi tiamin adalah untuk mempercepat pembelahan

sel pada meristem akar, juga berperan sebagai koenzim dalam reaksi yang

menghasilkan energi dari karbohidrat. Asam nikotinat juga penting dalam

reaksi-reaksi enzimatik, di samping berperan sebagai prekursor dari

beberapa alkaloid. Pemberian vitamin C biasanya bertujuan untuk

mencegah terjadinya pencoklatan pada permukaan irisan jaringan

(Hendaryono dan Wijayani, 1994 ). Sedangkan fungsi dari vitamin B6

adalah sebagai ko-enzim yang membantu reaksi kimia dalam proses

metabolisme ( Katuuk, 1989 ).


13

Asam-asam amino berperanan penting untuk pertumbuhan dan

diferensiasi kalus. Kebutuhan asam amino untuk setiap tanaman berbeda-

beda. Asparagin dan Glutamin berperan dalam metabolisme asam amino,

karena dapat menjadi pembawa dan sumber amonia untuk sintesis asam-

asam amino baru dalam jaringan ( Hendaryono dan Wijayani, 1994 ).

e. Hormon dan zat pengatur tumbuh.

Keberadaan hormon dan zat pengatur tumbuh dalam kegiatan kultur

jaringan adalah mutlak karena budidaya kultur jaringan adalah budidaya

terkendali. Proses tumbuh dan berkembangnya eksplan dapat disesuaikan

dengan harapan, menjadi kalus saja, organogenesis ataupun embryogenesis.

Pengaturan ini dapat dilakukan dengan mengatur macam dan konsentrasi zat

pengatur tumbuh sehingga menghasilkan kombinasi yang tepat sesuai

dengan harapan. Macam hormon dan zat pengatur tumbuh yang sudah

dikenal hingga saat ini adalah sebagai berikut :

1) Auksin

Auksin pertama kali ditemukan oleh Went, dan diketahui sebagai

asam indolasetat (IAA). Selanjutnya, nama auksin digunakan untuk

nama kelompok hormon dan zat pengatur tumbuh yang menimbulkan

respons khas IAA. Tumbuhan mengandung tiga senyawa lain yang mirip

dengan IAA baik struktur maupun respon yang diakibatkannya, yaitu :

asam 4-kloroindolasetat (4kloroIAA), asam fenilasetat (PAA), dan asam

indolbutirat (IBA) ( Santoso dan Nursandi, 2001 ).


14

Hormon sintetik atau zat pengatur tumbuh yang digolongkan

sebagai auksin yaitu : asam a-naftalenasetat (NAA), asam 2,4-

diklorofenoksiasetat (2,4-D), asam 2-metil 4-klorofenoksiasetat

(MCPA), asam 2-naftalosiasetat (4-CPA), asam p-klorofenoksiasetat

(PCPA), asam 2,4,5-triklorofenoksiasetat (2,4,5-T), asam 3,6-

dikloroanisik (dikamba), asam 4-amino 3,5,6-trikloropikolinik

(pikloram) ( Santoso dan Nursandi, 2001 ).

Dalam aktivitas kultur jaringan, auksin berperan menginduksi

terjadinya kalus, menghambat kerja sitokinin membentuk klorofil dalam

kalus, mendorong proses morfogenesis kalus membentuk akar atau

tunas, mendorong proses embryogenesis, dan mempengaruhi kestabilan

genetis tanaman ( Santoso dan Nursandi, 2001 ).

2) Sitokinin

Sitokinin merupakan nama kelompok hormon tumbuhan yang

sangat penting sebagai pemacu pertumbuhan dan morfogenesis dalam

kultur jaringan. Seperti auksin, selain sitokinin alami juga terdapat

sintesisnya yang tergolong dalam zat pengatur tumbuh. Sitokinin sintetik

yang umum digunakan dalam kegiatan kultur jaringan adalah FAP (6-

furfurilaminopurin), BAP (Benzylaminopurin), Thidiazuron (N-phenil-

N-1,2,3-thiadiazol-5-penylurea) ( Santoso dan Nursandi, 2001 ).

Dalam kegiatan kultur jaringan sitokinin berperan di dalam

menstimulasi terjadinya pembelahan sel, proliferasi kalus, pembentukan


15

tunas, menghambat pembentukan akar, mendorong pembentukan

klorofil pada kalus ( Santoso dan Nursandi, 2001 ).

3) Gibberilin (GA)

Gibberilin merupakan kelompok lain dari ZPT atau hormon yang

dapat mempengaruhi pemanjangan batang atau ruas batang, mendorong

pembungaan, induksi buah, dan tumbuhnya mata tunas yang dorman.

Secara umum dalam kegiatan kultur jaringan tanaman tanpa penambahan

GA, sesungguhnya kegiatan telah dapat berjalan dan proses induksi serta

diferensiasi dapat dilakukan, meski demikian tidak menutup

kemungkinan bahwa GA endogen dalam eksplan walaupun dalam kadar

yang relatif kecil diduga tetap merupakan komponen yang essensial,

contoh GA sintetik adalah gibberillic acid (Santoso dan Nursandi, 2001).

5) ABA (Abcisic acid)

ABA merupakan hormon tanaman yang secara alamiah disintesis

tanaman bila tanaman berada dalam keadaan stress. ABA tergolong

dalam zat penghambat tanaman atau inhibitor karena kerjanya

berlawanan dengan hormon pendorong seperti auksin, sitokinin, dan

giberelin. Dalam kultur jaringan, ABA dapat menghambat proses inisiasi

dan pertumbuhan sel ( Santoso dan Nursandi, 2001 ).

f. Bahan pemadat media

Media tanam dalam kultur jaringan adalah tempat untuk tumbuh

eksplan. Media tanam tersebut dapat berupa larutan (cair) atau padat. Media

cair berarti campuran komponen-komponen zat kimia dengan air suling,


16

sedangkan media padat adalah media cair tersebut dengan ditambah zat

pemadat ( Hendaryono dan Wijayani, 1994 ).

Zat pemadat yang digunakan untuk membuat media padat adalah

berupa agar-agar. Agar adalah campuran berbagai polisakarida dari

galaktosa yang diekstrak dari ganggang laut, terutama Gellidium amansii

dan ganggang lain dari golongan Rhodophyta. Umumnya agar dapat

membentuk gel pada suhu 40-45°C dengan titik cair 80-90°C. Kemampuan

agar dalam memadatkan media tergantung pada cara pengekstrakannya dari

ganggang dan pH larutan media sebelum diautoklaf. Dalam larutan media

dengan pH rendah (kurang dari 4,5), gel yang terbentuk oleh agar sangat

encer, sedangkan larutan dengan pH tinggi (lebih dari atau sama dengan 5,5)

akan berbentuk padat ( Yusnita, 2003 ).

Media kultur jaringan merupakan sumber makanan yang baik untuk

bakteri dan fungi, semua prosedur in vitro harus memuat pencegahan terhadap

kontaminasi mikroba ( Wetherell, 1982 ). Beberapa teknik sterilisasi yang

lazim digunakan dalam kultur jaringan tanaman, yaitu:

a. Sterilisasi panas basah

Cara sterilisasi panas basah adalah dengan menggunakan uap air. Alat

yang digunakan untuk sterilisasi ini ialah autoklaf. Hampir semua mikroba

mati sesudah diberi uap air dengan suhu 121°C selama 10-15 menit. Cara

sterilisasi ini dapat digunakan untuk mensterilkan media kultur, air, alat /

instrumen, gelas serta peralatan plastik yang tahan akan suhu panas. Lama

sterilisasi ada aturannya, untuk mensterilkan media 20-75 ml dibutuhkan


17

waktu 15-20 menit, media 75-500 ml dibutuhkan waktu 20-25 menit,

media 500-5000 ml dibutuhkan waktu 25-35 menit, yang semuanya

dilakukan pada suhu 121°C; sedangkan untuk mensterilkan peralatan gelas

dibutuhkan waktu 30 menit dengan suhu 130 °C ( Katuuk, 1989 ).

Manfaat dari sterilisasi ini adalah prosesnya cepat, sederhana, dan

sanggup membasmi virus tertentu. Namun autoklaf juga mempunyai

kekurangan, yaitu:

1) Bila pemanasan terlalu tinggi, gula akan membatu sehingga dapat

menjadi racun dalam media.

2) Bila terlalu lama disterilkan, garam akan mengendap sehingga terjadi

dipolimerisasi agar.

3) Dapat menurunkan pH sekitar 0,3 - 0,5 unit.

4) Dapat merusak substansi yang mudah menguap, misalnya ethrel dan

ethylene ( Katuuk, 1989 ).

b. Sterilisasi panas kering

Cara sterilisasi panas kering adalah dengan menggunakan suhu tinggi

dan dalam kondisi kering. Alat yang digunakan untuk sterilisasi ini ialah

oven. Oven digunakan untuk mensterilkan alat- alat yang tidak mudah

terbakar, antara lain: alat-alat gelas dan alat-alat dari logam. Namun dalam

keadaan tertentu dimana suhu tidak terlalu panas, alat dapat dibungkus

dengan kertas kemudian disterilkan. Bukan pula berarti semua alat dari

bahan logam harus disterilkan dengan cara ini. Alat-alat seperti pisau serta


18

skalpel tidak dapat disterilkan dengan cara ini sebab dapat merusak

ketajaman pisau / alat ( Katuuk, 1989 ).

Lama pemanasan tergantung pada suhu. Biasanya sterilisasi untuk

suhu 160°C, memerlukan waktu 45 menit, 170°C-18 menit, 180°C-7,5

menit, dan 190°C selama 1,5 menit. Suhu harus dikontrol, sebab pada suhu

170°C, kertas mulai hancur. Setelah selesai disterilisasi, alat / instrument

dikeluarkan dan dibawa ke ruang transfer, dimana mereka dapat

disterilkan lagi dengan menggunakan sinar ultraviolet ( Katuuk, 1989 ).

c. Sterilisasi dengan pemijaran

Alat / instrument berupa pisau dan skalpel, dikeluarkan dari

bungkusnya, dicelupkan dalam etanol 70% dan dilewatkan pada nyala

lampu spiritus. Setiap beberapa saat instrument harus dicelupkan ke dalam

etanol kemudian dibakar. Perlakuan ini berjalan terus selama kegiatan

inokulasi yang berlangsung di dalam kotak transfer (LAF) ( Katuuk,1989).

d. Sterilisasi dengan bahan kimia

Sterilisasi dengan bahan kimia merupakan pembasmian mikroba

dengan jalan memakai bahan kimia. Biasanya bahan kimia dipakai untuk

mensterilkan permukaan saja, yang meliputi: material tanaman dapat

disterilkan dengan menggunakan natrium hipoklorit, perak nitrat atau air

brom, sedangkan instrumen, tangan pekerja, serta ruang atau kotak transfer

dapat disterilkan dengan menggunakan alkohol 70% ( Katuuk, 1989 ).

Banyak jenis bahan pencuci yang boleh digunakan untuk sterilisasi

material tanaman. Jenis serta lamanya sterilisasi tergantung pada kepekaan


19

material tanaman. Banyak kali terjadi bila terlalu lama dan dengan

konsentrasi bahan pencuci yang tinggi, berakibat bukannya mematikan

mikroba tetapi bahkan merusak jaringan tanaman yang disterilkan. Di

samping itu bahan pencuci hendaknya bersifat lebih mudah larut. Bila

tidak demikian, sisa zat pencuci ini akan tetap pada material tanaman,

yang dapat mengganggu pertumbuhan eksplan ( Katuuk, 1989 ).

e. Sterilisasi dengan sinar ultraviolet

Ruang dan kotak transfer sukar untuk disterilkan hanya dengan

menggosok dengan alkohol atau bahan kimia pada permukaan. Untuk itu

digunakan lampu germisidal dengan sinar ultraviolet. Ada laboratorium

yang sudah memasangnya di langit-langit atau pada tempat lain dengan

maksud agar semua bagian terkena cahaya. Kelemahan menggunakan

sinar ultraviolet adalah pada tempat-tempat yang tidak terkena cahaya,

proses sterilisasi tidak terjadi. Selain itu, sinar ultraviolet hanya mampu

mematikan bentuk fertilisasi bakteri dan jamur, bukan bentuk spora

(Katuuk, 1989 ).

Jika suatu eksplan ditanam pada medium padat atau dalam medium cair

yang sesuai, dalam waktu 2 – 4 minggu, tergantung spesiesnya akan terbentuk

massa kalus yaitu suatu massa amorf yang tersusun atas sel-sel parenkim

berdinding sel tipis yang berkembang dari hasil proliferasi sel-sel jaringan

induk ( Yuwono, 2006 ).


20

Kalus terbentuk melalui 3 tahapan, yaitu : induksi, pembelahan sel dan

diferensiasi. Untuk memelihara kalus, maka perlu dilakukan subkultur secara

berkala, misalnya setiap 30 hari ( Yuwono, 2006 ).

Subkultur adalah usaha mengganti media tanam kultur jaringan dengan

media yang baru, sehingga kebutuhan nutrisi untuk pertumbuhan kalus atau

protokormus dapat terpenuhi. Subkultur pada media padat mudah dilakukan

dengan cara meletakkan kalus yang sudah terbentuk di atas cawan petri,

kemudian membelah-belahnya menjadi bagian-bagian kecil lagi. Setelah

menjadi potongan kecil, kalus dimasukkan kembali dalam media yang

memiliki komposisi sama dengan media lama. Proses ini juga dilakukan

dalam suasana steril ( Hendaryono dan Wijayani, 1994 ).

Ada 3 tahapan perkembangan dan pertumbuhan kalus, mulai dari waktu

subkultur atau penaburan inokulum, yaitu: induksi pembelahan sel,

pembelahan sel aktif dan tahap pembelahan sel lambat atau sel berhenti

membelah. Laju pertumbuhan kalus umumnya ditetapkan secara kuantitatif

dengan parameter indeks pertumbuhan bobot kalus basah. Pertambahan bobot

kalus basah merupakan selisih antara bobot kalus basah pada periode tertentu

dikurangi bobot kalus mula-mula atau bobot inokulum. Selanjutnya dari kurva

pertumbuhan kalus yang menyatakan hubungan antara pertumbuhan bobot

kalus basah dengan umur dapat diketahui fase-fase pertumbuhan kalus antara

lain:

a. Fase lag, yaitu fase dimana belum terjadi pertumbuhan secara nyata,

keadaan ini terjadi selama beberapa waktu setelah kalus disubkultur, serta


21

merupakan waktu adaptasi kalus dengan media yang baru. Pada fase ini

pertambahan bobot kalus hanya sedikit dan terlihat hampir mendatar pada

kurva.

b. Fase eksponensial, yaitu fase dimana mulai terjadi pertumbuhan kalus.

Pertambahan bobot kalus mulai terlihat nyata dan diikuti fase linier

dimana pertumbuhan kalus terus menaik secara eksponensial seperti garis

lurus ke atas dan berhenti.

c. Fase stasioner, yaitu fase dimana pertumbuhan kalus sama dengan

kematian sel-sel kalus. Kalus tidak dapat bertahan hidup pada fase ini

dalam waktu yang lama. Sel-sel mulai mati, media pertumbuhan kelebihan

muatan dan nutrien telah habis digunakan, sehingga kematian sel menjadi

lebih cepat ( George dan Sherrington, 1984 ).

3. Lingkungan

Faktor lingkungan utama yang harus dipenuhi antara lain :

a. Cahaya.

Cahaya berperan dalam pertumbuhan dan perkembangan yang disebut

fotomorfogenenesis. Jenis cahaya yang paling sering digunakan dalam

kultur jaringan adalah cahaya dari lampu neon. Hal ini disebabkan oleh

kemampuannya yang dapat menyebarkan cahaya yang lebih luas dan merata,

serta lebih hemat pemakaian listrik ( Katuuk, 1989 ).


22

b. Suhu.

Pada umumnya kultur jaringan memerlukan suhu sebesar 25-30°C.

Namun untuk pertumbuhan optimum hal ini akan berbeda-beda pada setiap

spesies, serta jenis eksperimen ( Katuuk, 1989 ).

c. pH.

Pada umumnya nilai pH yang paling disukai untuk pertumbuhan sel

antara 5-6. Walaupun pH media akan berubah selama pengkulturan, pH

harus diatur lebih dulu sebelum diautoklaf, yaitu apabila semua komponen

media sudah dicampurkan. Manfaat pH dalam media adalah untuk menjaga

kestabilan membran sel, mengatur garam-garam agar tetap dalam bentuk

terlarut, membantu penyerapan hara dan mengatur sifat gel agar (dalam

media padat) ( Katuuk,1989 ).

d. Kelembaban.

Faktor kelembaban relative humidity (RH) tidak banyak dibahas dalam

kultur jaringan. Hal ini disebabkan oleh kondisi dalam botol kultur yang

selalu lembab karena media. Namun demikian kelembaban di luar botol

kultur juga perlu diperhatikan. Kondisi iklim dalam hal ini sangat

berpengaruh terhadap kelembaban kultur. Untuk itu disarankan agar RH

dalam ruang kultur berkisar 70% ( Katuuk,1989 ).

e. Wadah / botol kultur.

Ukuran wadah kultur biasanya juga mempengaruhi pertumbuhan serta

morfogenesis in vitro. Hal ini mungkin disebabkan oleh perbedaan

konsentrasi CO2 yang tersedia, etilen serta gas lain yang berada dalam ruang


23

wadah. Besar kecilnya wadah tergantung pada jenis serta ukuran eksplan

yang digunakan, dan fase perkembangan eksplan sehingga pemindahan

eksplan ke botol yang lebih besar sangat diperlukan. Biasanya untuk eksplan

yang berukuran kecil, pada permulaan pengkulturan dapat menggunakan

tabung kultur yang berdiameter 1,5 cm, kemudian untuk pertumbuhan akar

maka diameter tabung kultur dapat diganti menjadi 2,5 cm. Wadah kultur

jaringan tidak hanya tergantung pada botol kultur buatan pabrik. Banyak

macam wadah yang boleh dijadikan tempat kultur, antara lain: botol-botol

bekas obat-obatan, jam, atau bekas bahan makanan lainnya. Biasanya

wadah terbuat dari gelas adalah yang paling baik, karena dapat dengan

mudah dicuci untuk digunakan lagi.

C. Glikosida Jantung

Glikosida jantung ditemukan dalam beberapa famili tumbuhan seperti

Apocynaceae, Liliaceae, Moraceae, dan Ranunculaceae. Sumber niaga utama

kardenolida ialah genus Digitalis dan Strophantus. Digitalis mempunyai efek

langsung pada jantung yaitu memberi kekuatan bila jantung melemah. Glikosida

jantung biasanya mempunyai sifat peluruh air seni (diuretik) yang berakibat

menurunkan tekanan darah dan mengobati bengkak. Keberadaan senyawa ini

dalam tumbuhan mungkin memberi perlindungan kepada tumbuhan tersebut dari

gangguan beberapa serangga ( Robinson, 1995 ).

Glikosida jantung merupakan suatu glikosida yang memiliki kepolaran

yang tinggi, oleh karena itu isolasi glikosida jantung murni dalam tanaman sulit


24

dilakukan. Berdasarkan polaritasnya, glikosida jantung dapat diekstrak dengan

menggunakan pelarut yang polar antara lain: etanol, etil asetat, campuran etanol

dan air serta campuran etanol dan kloroform ( Samuelsson, 1999 ).

Glikosida jantung diklasifikasikan sebagai steroid (sterol), karena

memiliki inti cyclopentanoperhydrophenanthrene, sebuah cincin ∝-β-unsaturated

lactone(no. 5 atau 6) pada C17, sebuah β-oriented hydroxyl pada C14, sebuah cis

fusi dari cincin C dan D pada C13-C14 dan tambahan satu atau lebih gula pada C3,

biasanya deoxyhexomethyloses ( Farnsworth, 1966 ).

Gambar 1. Struktur glikosida jantung ( Moffat, 2004 )

Identifikasi glikosida jantung dapat dilakukan dengan menggunakan

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) secara kualitatif. Reaksi identifikasi terhadap

glikosida jantung dapat dilakukan menggunakan uji dengan pereaksi Baljet (2,4,6-

trinitrophenol), uji dengan pereaksi Kedde (3,5-dinitrobenzoic acid), uji dengan

pereaksi Raymond (m-dinitrobenzene), uji dengan pereaksi Legal (sodium

nitroprusside) dimana pereaksi tersebut akan bereaksi dengan grup methylene

aktif yang ditemukan dalam cincin C17-unsaturated lactone. Pereaksi ini akan


25

memberikan warna oranye, ungu, biru, dan violet, yang menunjukkan adanya

glikosida jantung ( Farnsworth, 1966 ).

Di dalam skrining fitokimia untuk glikosida jantung, uji pendahuluan yang

positif pada ekstrak tanaman dengan menggunakan salah satu pereaksi yang

dikonfirmasikan dengan pereaksi yang spesifik untuk tambahan 2 sisi reaktif (vide

supra). Sebagai contoh , sebuah uji pendahuluan yang positif dengan pereaksi

Keller menunjukkan adanya gula deoksi. Ini harus diikuti dengan uji yang ke dua

yaitu uji dengan pereaksi Liebermann, hasil positif, menunjukkan adanya inti

steroid ( Shoppee, 1964 ).

D. Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi merupakan proses diferensiasi komponen-komponen

cuplikan yang ditahan secara selektif oleh fase diam. Pada dasarnya semua

kromatografi menggunakan dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Pemisahan-

pemisahan tergantung pada gerakan relatif dari dua fase ini. Kromatografi dapat

digolongkan berdasarkan sifat-sifat fase diam, yang dapat berupa zat padat atau

zat cair. Apabila fase diam berupa zat padat maka cara tersebut dikenal sebagai

kromatografi serapan, sedangkan untuk fase diam yang berupa cairan dikenal

sebagai kromatografi partisi ( Sastrohamidjojo, 2001 ).

Kromatografi lapis tipis termasuk ke dalam kromatografi serapan. Prinsip

dari kromatografi serapan adalah kecepatan bergerak dari suatu komponen

tergantung pada berapa besarnya komponen tersebut tertahan oleh fase diam

(Sastrohamidjojo, 2001 ).


26

Fase diam yang digunakan dalam kromatografi lapis tipis adalah bahan

penyerap atau adsorben ( Stahl, 1969 ). Zat penyerap merupakan lapisan tipis

serbuk halus yang dilapiskan pada lempeng kaca, plastik atau logam secara

merata, umumnya digunakan lempeng kaca. Dua sifat penting yang perlu

diperhatikan dalam pemilihan bahan penyerap adalah ukuran partikel dan

homogenitas partikel penyerap. Kedua sifat ini sangat berpengaruh pada gaya

adhesi. Besar partikel yang biasa digunakan adalah 1-25 mikron. Fase diam yang

umum dan paling banyak digunakan adalah silika gel yang dicampur dengan

CaSO4 untuk menambah daya lengket partikel silika gel pada pendukung (pelat).

Adsorben lain yang juga biasa digunakan adalah alumina, kieselguhr, celite,

serbuk selulosa, serbuk poliamida, kanji dan sephadex ( Mulja dan Suharman,

1995 ). Fase diam yang digunakan untuk analisis secara kromatografi lapis tipis

untuk glikosida jantung adalah silika gel GF 254 ( Wagner, 1984 ).

Fase gerak adalah medium angkut dan terdiri atas satu atau beberapa

pelarut. Fase ini bergerak dalam fase diam karena adanya gaya kapiler. Fase gerak

yang digunakan adalah pelarut bertingkat mutu analitik dan bila diperlukan sistem

pelarut multi-komponen harus berupa campuran sesederhana mungkin terdiri atas

maksimum tiga komponen ( Stahl, 1969 ). Pemilihan fase gerak untuk glikosida

jantung ada beberapa macam alternatif, yaitu: etil asetat-metanol-air (100:13,5:10

v/v); etil asetat-metanol-etanol-air (81:11:4:8 v/v); metiletil keton-toluena-air-asam

asetat glasial (40:5:3:2,5:1 v/v); kloroform-metanol-air (65:35:10 v/v) ( Wagner,

1984 ).


27

Campuran yang dipisahkan berupa larutan yang ditotolkan berupa bercak.

Setelah itu pelat atau lapisan dimasukkan ke dalam bejana tertutup rapat yang

berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak). Pemisahan terjadi selama

pengembangan. Selanjutnya senyawa yang tidak berwarna harus dideteksi ( Stahl,

1969 ).

Identifikasi dari senyawa yang terpisah (bercak / noda) pada lapisan tipis

dapat dilakukan dengan tanpa pereaksi kimia dan disemprot dengan reagen.

Identifikasi senyawa glikosida jantung dapat dilakukan dengan tanpa pereaksi

kimia yaitu dengan menggunakan sinar ultraviolet 254 dan 365 nm, sedangkan

reagen penyemprot yang digunakan untuk identifikasi senyawa glikosida jantung

adalah reagen Kedde, Legal, Baljet, Raymond, antimony (III) chloride,

chloramine-trichloroacetic acid / CTA, sulphuric acid ( Wagner, 1984 ) dan

vanillin-phosporic acid ( Jork, et al., 1990 ).

Jarak pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan

dengan angka Rf atau hRf. Harga Rf didefinisikan sebagai perbandingan jarak

antara senyawa dari titik awal dengan jarak tepi muka pelarut dari awal.

Rf = anpengembangjarak

anpengembangawaldaribercakjarak

Harga Rf yang diperoleh pada KLT tidak tetap jika dibandingkan dengan

kromatografi kertas. Oleh karena itu, pada lempeng yang sama di samping

kromatogram zat yang akan diuji perlu dibuat kromatogram zat pembanding

kimia, lebih baik dengan kadar yang berbeda-beda. Perkiraan identifikasi

diperoleh dengan pengamatan dua bercak dengan harga Rf dan ukuran yang

hampir sama. Angka Rf berkisar antara 0,01 – 1,00 dan hanya dapat ditentukan


28

dengan dua desimal. hRf adalah angka Rf dikalikan faktor 100 (h), menghasilkan

nilai berkisar antara 0 – 100 ( Stahl, 1969 ).

E. Landasan Teori

Di dalam pencarian metode produksi kandungan obat dari tumbuhan,

pendekatan kultur jaringan, potensial sebagai alternatif di dalam produksi

metabolit-metabolit bioaktif tumbuhan untuk skala industri. Ide memperbanyak

tanaman dengan jalan mengkulturkan bagian kecil jaringan atau organ

berdasarkan teori totipotensi.

Pertumbuhan dan perkembangan tanaman dipengaruhi juga oleh zat

pengatur tumbuh. Zat pengatur tumbuh yang digunakan dalam penelitian ini

adalah 2,4-D (auksin) dengan tujuan untuk merangsang pertumbuhan kalus. Selain

itu, 2,4-D juga berfungsi dalam perkembangan sel dengan menaikkan tekanan

osmotik dan menurunkan tekanan dinding sel sehingga air dapat masuk ke dalam

sel disertai kenaikkan volume sel.

Pada penelitian ini, kalus terbentuk dari daun kamboja jepang yang

mengalami pelukaan pada bagian tepi. Menurut Salisbury dan Ross (1995) bahwa

kurva pertumbuhan dihasilkan dengan memplotkan ukuran atau bobot organisme

terhadap waktu. Kurva tersebut dijelaskan dengan fungsi matematis sederhana,

misalnya garis lurus atau kurva berbentuk-S yang sederhana. Oleh karena itu,

pada penelitian ini diharapkan bahwa profil pertumbuhan kalus daun kamboja

jepang dapat dijelaskan dengan menggunakan kurva sigmoid dengan adanya fase

lag, fase eksponensial dan fase stasioner.


29

Penelitian ini diharapkan dapat membuktikan bahwa daun kamboja jepang

dapat tumbuh secara in vitro untuk menghasilkan kalus yang mengandung

glikosida jantung yang sama dengan glikosida jantung pada daun tanaman

asalnya.

F. Hipotesis

1. Daun tanaman kamboja jepang dapat membentuk kalus dengan penambahan

zat pengatur tumbuh asam 2,4 Diklorofenoksiasetat pada media MS.

2. Kultur kalus yang dihasilkan melalui teknik kultur jaringan ini memiliki profil

pertumbuhan sigmoidal, dimana pada fase stasionernya menghasilkan

kandungan glikosida jantung yang optimum.

3. Ekstrak kalus daun tanaman kamboja jepang memiliki kandungan glikosida

jantung yang sama dengan ekstrak daun kamboja jepang tanaman asalnya.


BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk jenis penelitian non eksperimental dengan

rancangan penelitian deskriptif yaitu tidak ada perlakuan atau manipulasi pada

subyek uji dan penelitian ini hanya bertujuan menunjukkan fakta yang ada.

B. Definisi Operasional

1. Daun yang digunakan sebagai eksplan dalam penelitian ini adalah daun

yang segar dan sehat, terletak pada nomor 3-5 dari ujung batang atau

cabang.

2. Waktu inisiasi adalah waktu yang dibutuhkan oleh eksplan untuk

membentuk kalus dihitung mulai dari saat penanaman eksplan sampai hari

pertama kalus mulai terbentuk berupa bintik putih dari tepi irisan daun

eksplan.

3. Subkultur adalah suatu kegiatan pemeliharaan kalus dengan memindahkan

kalus ke dalam media baru sehingga kalus tidak kekurangan nutrisi.

4. Bobot kalus basah awal adalah hasil pengurangan antara bobot botol +

media + kalus dengan bobot botol + media pada saat subkultur.

5. Bobot kalus basah akhir adalah bobot kalus yang ditimbang pada saat

pemanenan.

30


31

6. Bobot kalus kering adalah bobot kalus pada saat pemanenan dan sesudah

mengalami proses pengeringan dengan menggunakan oven pada suhu 40-

500C, sampai diperoleh kalus dengan bobot konstan yaitu antara

penimbangan yang pertama dan berikutnya selama 1 jam tidak berbeda 0,5

mg.

7. Laju pertumbuhan kalus adalah laju pertumbuhan kalus yang ditandai

adanya pertambahan berat kalus dari waktu ke waktu dengan memanen

setiap 6 hari sekali sebanyak 6 botol selama 42 hari.

8. Profil pertumbuhan kalus adalah rasio antara pertumbuhan kalus ( bobot

kalus basah akhir- bobot kalus basah awal) dengan waktu pemanenan serta

rasio antara bobot kalus kering dengan waktu pemanenan.

9. Persen kadar air adalah rerata bobot kalus basah dikurangi dengan rerata

bobot kalus kering lalu dibagi dengan rerata bobot kalus basah dikali dengan

100%.

10. Konsentrasi zat pengatur tumbuh yaitu asam 2,4-Diklorofenoksiasetat yang

digunakan adalah 4 ppm 2,4-D yang terkandung dalam satu liter media.

C. Alat dan Bahan Penelitian

1. Alat penelitian

a. Alat yang digunakan dalam kultur jaringan tanaman:

1) Alat-alat gelas, Pyrex

2) Autoklaf, YX 400Z Shanghai Sanshen, Medical Inst, Co, LTD.

3) Oven, Marius Instrument, German.


32

4) Pemanas listrik, Ika Combimag, RCT, German.

5) Timbangan analitik, Scaltec.

6) Glassfirn.

7) Magnetic stirrer.

8) Pinset.

9) Skapel.

10) Kertas pH indikator.

11) Kertas saring.

12) Laminar air flow.

13) Lampu UV.

14) Inkubator, Heraeus Tamson, Holland.

15) Botol kultur.

16) Aluminium foil,Heavy-Duty, Diamond-Wrap.

17) Referigerator, Sharp.

18) Sprayer.

19) Mortir & stamper.

b. Alat untuk penyarian : alat gelas (pyrex), kertas saring, dan waterbath

c. Alat untuk Kromatografi Lapis Tipis:

1) Bejana gelas.

2) Lempeng kaca.

3) Lemari asam.

4) Pipa kapiler.

5) Penyemprot bercak.


33

6) Lampu TL Day Light” 20 watt.

7) Lampu UV 254 dan 365 nm.

2. Bahan Penelitian

a. Bahan eksplan : daun yang segar dan sehat terletak no. 3-5 dari ujung

batang atau cabang tanaman kamboja jepang diambil dari Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma, Dusun Paingan, Desa

Maguwohardjo, Kecamatan Depok, Kabupaten Sleman, Yogyakarta.

b. Bahan kimia

Bahan-bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah :

1) Agar, Mkr Chemicals.

2) Garam anorganik (makronutrien) yang terdiri dari :

a) Kalium nitrat, Merck, Germany.

b) Ammonium nitrat, GPR, BDH.

c) Kalsium dikloro dihidrat, Merck, Germany

d) Magnesium sulfat heptahidrat, Merck, Germany

e) Kalium dihigrogen fosfat, Merck, Germany.

3) Garam anorganik mikronutrien yang terdiri dari :

a) Mangan sulfat tetrahidrat, BDH limited Poole, England.

b) Seng sulfat heptahidrat, Merck, Germany.

c) Asam borat, GPR, BDH, Merch, Germany

d) Kalium iodide netral, Merck, Germany

e) Tembaga (II) sulfat pentahidrat, Bratako chemika, Bandung.

f) Natrium molibdat dihidrat, Riedel dehaen, Germany.


34

g) Kobalt (II) klorida heksahidrat, GPR, BDH.

h) Besi (II) sulfat heptahidrat, Merck, Germany

i) Natrium etilen diamin tetra asetat dihidrat, GPR,BDH, Merck,

Germany.

4) Vitamin dan asam amino yang terdiri dari:

a) Myo inositol, Biochemical, BDH, Merck, Germany.

b) Tiamin hidroklorida, Biochemical, BDH, Merck, Germany.

c) Asam nikotinat, BDH, Merck, Germany.

d) Piridoksin hidroklorida, Biochemical, BDH, Merck, Germany.

e) Glisin, Biochemical, BDH, Merck, Germany.

5) Sumber karbon : sukrosa, BDH, Merck, Germany.

6) Zat pengatur tumbuh : Asam 2,4-Diklorofenoksiasetat, GPR, BDH.

7) Desinfektan

a) Natrium hipoklorida, Bayclin, Johnson.

b) Alkohol 70% derajat kemurnian teknis.

c) Tween 80, Merck-Sohuchardt.

8) Akuades

c. Bahan untuk penyarian: Metanol (J.T. Baker, Germany) dan Kloroform

(J.T. Baker, Germany)

d. Kromatografi Lapis Tipis :

a) Metanol, J.T. Baker, Germany

b) Etil asetat, J.T. Baker, Germany.

c) Kedde reagent, Merck, Germany.


35

d) Asam sulfat, Merck, Germany.

e) Silica-Gel GF 254, Merck, Germany.

D. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi tanaman

Determinasi tanaman kamboja jepang dilakukan di laboratorium Biologi

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma berdasarkan pustaka acuan

(Anonim, 2006).

2. Pembuatan stok

a. Pembuatan larutan stok hara mikro

Disiapkan gelas piala dengan volume 500 ml yang telah diisi akuades

300 ml. Mangan (II) sulfat tetrahidrat sebanyak 2,23 g, seng sulfat

heptahidrat sebanyak 0,86 g, asam borat sebanyak 0,62 g, kalium iodida

sebanyak 0,083 g, natrium molibdat dihidrat sebanyak 0,025 g, tembaga

(II) sulfat pentahidrat 0,0025 g, kobalt (II) klorida heksahidrat sebanyak

0,0025 g dimasukkan satu per satu ke dalam gelas piala tersebut, sambil

diaduk dengan menggunakan magnetic stirer hingga jernih. Kemudian

ditambahkan aquades hingga volume 500 ml. Perlu diperhatikan bahwa

tiap 1 liter media membutuhkan 5 ml stok hara mikro.

b. Pembuatan larutan stok besi

Stok untuk bahan ini terpisah dari unsur hara mikro lainnya, karena

komponen natrium etilen diamin tetra asetat dan besi (II) sulfat heptahidrat

sukar larut dalam akuades, maka perlu ditambahkan beberapa tetes HCl,


36

kemudian dipanaskan. Disiapkan gelas piala dengan volume 500 ml yang

telah diisi akuades 300 ml. Besi (II) sulfat heptahidrat sebanyak 0,278 g

dan natrium etilen diamin tetra asetat dihidrat sebanyak 0,373 g

dimasukkan ke dalam gelas piala tersebut, lalu ditambahkan beberapa tetes

HCl sambil diaduk dengan menggunakan magnetis stirer hingga larut dan

agar cepat larut dibantu dengan pemanasan. Kemudian ditambahkan

akuades hingga volume 500 ml. Perlu diperhatikan bahwa satu liter media

dibutuhkan 5 ml larutan stok besi.

c. Pembuatan larutan stok vitamin dan asam amino

Dua ratus milliliter aquades dimasukkan ke dalam gelas piala dengan

volume 500 ml, kemudian asam nikotinat sebanyak 0,05 g, piridoksin

hidroklorida sebanyak 0,05 g, tiamin hidroklorida sebanyak 0,01 g dan

glisin sebanyak 0,2 g dimasukkan satu per satu ke dalam gelas piala

tersebut, sambil diaduk dengan menggunakan magnetic stirer hingga

jernih. Kemudian ditambahkan aquades hingga volume 500 ml. Perlu

diperhatikan bahwa satu liter media dibutuhkan 5 ml larutan stok vitamin

dan asam amino.

d. Pembuatan larutan stok myoinositol

Untuk membuat larutan myoinositol, diperlukan 10 g myoinositol yang

dilarutkan dalam 500 ml aquades dalam gelas piala sampai larut kemudian

akuades ditambahkan sampai volume 1 liter. Dalam membuat satu liter

media dibutuhkan larutan stok myoinositol sebanyak 10 ml.


37

e. Pembuatan larutan stok ZPT

ZPT yang digunakan adalah asam 2,4 Diklorofenoksiasetat. Untuk

membuat larutan stok 2,4-D (4 ppm), larutkan 2,4-D sebanyak 100 mg ke

dalam 2-5 ml etanol, panaskan sebentar lalu tambahkan 100 ml akuades.

Dalam membuat satu liter media dengan konsentrasi 2,4D sebesar 4 ppm

dibutuhkan larutan stok sebanyak 4 ml.

3. Pembuatan media

Media yang digunakan adalah media Murashige-Skoog. Pembuatannya

adalah sebagai berikut : mula-mula 500 ml akuades dipanaskan di dalam gelas

piala 1000 ml. Sambil terus diaduk, dimasukkan bahan-bahan anorganik

makro sesuai dengan komposisi yang ada (daftar terlampir). Setelah semua

hara makro larut, dimasukkan berturut-turut 5 ml larutan stok hara mikro, 5 ml

larutan stok besi-EDTA, 5 ml stok vitamin dan asam amino dan 10 ml stok

myoinositol. Sedikit demi sedikit dimasukkan campuran sukrosa 30 g dan agar

11 g sambil diaduk hingga larut. Sementara itu, ditambahkan juga akuades

sedikit demi sedikit untuk membantu kelarutan hingga volume mencapai 1000

ml. Campuran tersebut dipanaskan hingga mendidih dan berwarna jernih.

Setelah jernih, suhu pemanas diturunkan dan stok zat pengatur tumbuh

dimasukkan sesuai konsentrasi yang diinginkan. Setelah itu, dilakukan

pengaturan pH media 5,2 – 5,6. jika terlalu basa ditambahkan HCl encer dan

jika terlalu asam ditambahkan larutan KOH encer. Penyusutan air karena

pemanasan diatasi dengan penambahan akuades hingga 1000 ml kemudian

media dipindahkan ke dalam botol kultur dengan ketebalan kurang lebih 1 cm.


38

Botol yang berisi media kemudian ditutup menggunakan alumunium foil dan

disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 1210 C selama 15 menit. Media yang

aman digunakan adalah media yang telah disimpan dalam inkubator selama

kurang lebih 1 minggu dan tidak tampak adanya pertumbuhan

mikroorganisme kontaminan seperti : jamur, dan bakteri.

4. Sterilisasi alat dan ruangan

a. Sterilisasi alat

Erlenmeyer yang berisi akuades dan gelas piala kosong ditutup dengan

alumuniumfoil. Cawan petri diisi kertas saring, skalpel, pinset yang

dibungkus dengan kertas payung semuanya dimasukkan dalam autoklaf

dan disterilkan pada temperatur 120 °C selama 20 menit.

b. Sterilisasi ruangan

Dinding- dinding ruangan penanaman eksplan dan Laminar Air Flow

(LAF) disterilkan dengan menggunakan alkohol 70 % atau spiritus.

Selanjutnya lampu UV baik yang ada di ruangan maupun di LAF

dinyalakan selama ± 2 jam.

5. Sterilisasi dan penanaman eksplan

a. Sterilisasi eksplan

Sebelum dimasukkan ke dalam LAF, eksplan berupa daun yang

diambil dari tanaman induk dicuci di bawah air keran yang mengalir

dengan diberi sedikit detergen untuk membersihkan kotoran yang melekat

di permukaan terluar eksplan Eksplan direndam-dikocok dalam larutan

hipoklorit dan Tween-80 selama 5 – 10 menit kemudian dibilas dengan


39

akuades. Di dalam LAF eksplan juga disterilkan dengan direndam-dikocok

dalam larutan hipoklorit-Tween-80 selama 5 menit. Eksplan dibilas 3 kali

dengan air steril (air yang sudah disterilisasi dengan autoklaf). Eksplan

yang sudah dibilas dengan air steril ini sudah siap untuk ditanam.

b. Penanaman eksplan

Potongan eksplan yang akan ditanam yang sudah disterilkan

sebelumnya dimasukkan ke dalam media dengan sedikit ditekan untuk

memperbesar sudut kontak eksplan dengan permukaan media klutur.

Media yang telah ditanami, diinkubasikan dalam ruang inkubator dengan

suhu ruangan 18 °C serta disinari dengan lampu TL ”Day Light” 20 watt

dengan ketinggian 40 cm.

6. Pengamatan waktu inisiasi kalus

Waktu inisiasi kalus dihitung dari saat kalus mulai terbentuk. Karena

pertambahan bobot pertumbuhan kalus tidak dapat diamati, penentuan waktu

inisiasi kalus dilakukan secara visual yaitu mulai terlihatnya bintik putih pada

bagian pelukaan eksplan.

7. Subkultur

Subkultur dilakukan 36 hari setelah penanaman dimana tanaman telah

menampakkan gejala kurang nutrisi (berwarna kecoklatan) atau bobotnya

tidak bertambah. Pada proses subkultur, kalus dipecah menjadi bagian yang

lebih kecil kemudian ditanam lagi ke dalam media baru. Proses subkultur ini

dilakukan sebagai berikut, semua perlengkapan yang digunakan yaitu pinset,

skapel, bunsen, alat-alat gelas, botol berisi alkohol 70% dan botol-botol yang


40

berisi media yang telah diketahui beratnya dimasukkan kedalam laminar air

flow dan disterilkan selama ± 2 jam dengan lampu UV.

Media yang berisi kalus kemudian disemprot dengan alkohol 70%

kemudian dimasukkan ke dalam laminar air flow. Ketika botol akan dibuka

dan ditutup, maka dilakukan proses flambir. Kemudian ambil kalus dengan

pinset dan letakkan di atas cawan petri. Bersihkan kalus dari sisa-sisa eksplan

hingga bersih kemudian belah bagian kalus tersebut dan potong-potong

dengan menggunakan pertolongan skapel dan pinset dengan ukuran kalus

awal, yaitu 3 – 5 mm lalu ditanam dalam media yang baru secara aseptis.

Kalus yang telah ditanam tadi kemudian diinkubasikan di dalam ruang

inkubator dengan suhu ruangan 180C serta disinari dengan lampu TL “Day

Light” 20 watt dengan ketinggian 40 cm. Sub-kultur ini dibuat sebanyak 42

botol. Untuk mengetahui bobot kalus maka dilakukan penimbangan pada

media baru yang berisi kalus, selanjutnya bobot yang diperoleh dikurangkan

dengan bobot media awal sebelum ditanami kalus.

8. Pemanenan

Setelah dilakukan subkultur, tiap 6 (enam) hari sekali dilakukan

pemanenan sebanyak 6 (enam) buah botol yang berisi kalus lalu dibersihkan

dari sisa-sisa agar yang masih melekat. Setelah kalus bersih kemudian

dilakukan penimbangan dan akan mendapatkan bobot kalus basah. Kalus yang

telah dipanen kemudian dikeringkan pada suhu 40-500C hingga didapatkan

perbedaan bobot sebesar 0,5 mg bobot zat dari 2 penimbangan berurutan

berselang 1 jam atau dengan kata lain setelah didapatkan berat kalus kering


41

yang konstan. Catat bobot kering kalus hasil setiap pemanenan. Kalus kering

yang diperoleh kemudian digerus dengan menggunakan mortir dan stamper .

Selanjutnya serbuk kalus yang diperoleh, disimpan di dalam flakon dan

dikumpulkan sebanyak ± 2 gram untuk dibuat ekstrak sehingga dapat

diketahui metabolit sekunder dalam kalus.

9. Analisis pertumbuhan kalus

Analisis pertumbuhan kalus dalam penelitian ini menggunakan dua cara,

yaitu :

a. Pembuatan grafik pola pertumbuhan kalus berdasarkan data penimbangan

bobot kalus basah dengan umur kalus.

Perhitungan bobot kalus basah tiap-tiap waktu tertentu yakni setiap 6

(enam) hari sekali. Pertambahan bobot kalus basah pada tiap-tiap waktu

pemanenan didapatkan dari penjumlahan dari tiap-tiap botol yang dipanen

pada hari yang sama. Analisis pertumbuhan kalus dilakukan dengan

menggunakan kurva sigmoid yang menyatakan hubungan antara umur

kalus dengan pertambahan bobot kalus basah ( pertumbuhan kalus )

sehingga diperoleh gambaran fase-fase pertumbuhan kalus. Rumus regresi

linier menurut Budiasmoro (2003) adalah sebagai berikut :

r = Δp/(Δh.p)

( )( ) ( )( )( )( ) ( )22

2

ppnp.rppr a

Σ−ΣΣΣ−ΣΣ

=

( ) ( )( )( )( ) ( )22 ppn

rpp.rn bΣ−Σ

ΣΣ−Σ=


42

Persamaan kurva sigmoid menurut Budiasmoro (2003) adalah sebagai

berikut :

bebNaaY xta N −+

= −+ )(.

1)/('

Y' = pertumbuhan sebagai fungsi umur kalus pada persamaan sigmoid

a = nilai intercept dari rumus regresi linier

b = nilai slope dari rumus regresi linier

N = data bukan nol yang terukur pertama kali

X = umur kalus

Untuk membuktikan bahwa kurva sigmoid yang dihasilkan dapat

mewakili profil pertumbuhan kalus dilakukan uji t terhadap nilai b dan

nilai pertumbuhan yang diperoleh dari persamaan kurva sigmoid.

Sy.x =2)'( 2

−−

nyy

Sb = ∑ 2xSyx

tb = Sbb

Syx = simpangan relatif data penimbangan dengan hasil perhitungan kurva

sigmoid

Y = nilai pertumbuhan yang didapat dari selisih bobot akhir dan bobot

awal kalus

Y' = nilai pertumbuhan yang didapat dari persamaan sigmoid


43

n = jumlah data

x = simpangan Y terhadap rerata Y

Sb = simpangan b

b = nilai slope persamaan sigmoid yang didapat dari hasil regresi linier

tb = nilai t hitung dari b yang akan dibandingkan dengan t tabel.

b. Pembuatan grafik pola pertumbuhan kalus berdasarkan data biomassanya

Kalus basah yang diperoleh dari setiap pemanenan kemudian

dikeringkan hingga bobotnya konstan dan ditimbang. Pertumbuhan kalus

dihitung berdasarkan persentase pertambahan bobot biomassa kalus.

Kemudian dibuatkan grafik pola pertumbuhan kalus, dengan

menghubungkan antara pertambahan bobot kalus kering dan umur kalus.

10. Pengeringan dan pembuatan serbuk daun kamboja jepang

Daun kamboja jepang dikeringkan di dalam oven pada suhu 40-500C.

Kemudian daun yang telah dikeringkan tersebut, digerus dengan

menggunakan mortir dan stamper. Serbuk daun yang diperoleh, disimpan di

dalam flakon.

11. Pembuatan ekstrak kalus daun kamboja jepang

Satu gram serbuk kalus daun kamboja jepang direfluks menggunakan 10

ml campuran kloroform-metanol (1:10 v/v), selama 10 menit. Larutan

didinginkan dan disaring, filtratnya diuapkan sampai kering. Residu yang

diperoleh dilarutkan dalam 2 ml kloroform-metanol (1:1 v/v) ( Dwiatmaka dan

Wulandari, 2005). Ekstrak yang ditotolkan pada plat KLT 30-50μl ( Wagner,

et al., 1984 ).


44

12. Pembuatan ekstrak daun kamboja jepang

Satu gram serbuk daun kamboja jepang direfluks menggunakan 10 ml

campuran kloroform-metanol (1:10 v/v), selama 10 menit. Larutan didinginkan

dan disaring, filtratnya diuapkan sampai kering. Residu yang diperoleh

dilarutkan dalam 2 ml kloroform-metanol (1:1 v/v) ( Dwiatmaka dan

Wulandari, 2005) . Ekstrak yang ditotolkan pada plat KLT 30-50μl ( Wagner,

et al., 1984 ).

13. Uji KLT ekstrak kalus daun kamboja jepang dan ekstrak daun tanaman

asalnya.

Ekstrak kalus daun kamboja jepang dan ekstrak daun tanaman asalnya

ditotolkan pada lempeng KLT dengan menggunakan fase diam silica gel GF254

dan fase gerak berupa etil asetat – metanol - air (81 : 11 : 8 v/v) dengan jarak

pengembangan 10 cm. Deteksinya menggunakan sinar UV 254 dan 365 nm,

serta disemprot dengan dua macam pereaksi yaitu Kedde ( bercak diamati di

bawah sinar tampak) dan asam sulfat 97% ( lempeng dipanaskan pada suhu

1000C selama 3-5 menit, amati bercak di bawah sinar tampak) ( Wagner, et

al., 1984 ).

E. Analisis Hasil

Analisis waktu inisiasi kalus dilakukan secara visual sebagai munculnya

titik-titik tumbuh kalus yang berwarna putih kekuningan untuk yang pertama

kalinya pada eksplan dengan menggunakan rata-rata waktu inisiasi kalus.

Analisis pertumbuhan kalus di dalam penelitian ini menggunakan dua

cara, yaitu :


45

1. Pembuatan grafik profil pertumbuhan kalus berdasarkan data

penimbangan bobot kalus basah dengan umur kalus.

Pertumbuhan kalus diperoleh berdasarkan pertambahan bobot kalus basah

yakni dengan cara mengurangkan bobot kalus basah akhir dengan bobot kalus

basah awal. Kemudian data yang diperoleh dimasukkan ke dalam rumus

regresi linier untuk memperoleh nilai a ( intercept ) dan b ( slope ). Setelah itu,

nilai a dan b yang diperoleh, dimasukkan ke dalam persamaan kurva sigmoid

dan dibuat grafik pertumbuhan kalus dengan memplotkan umur kalus dengan

pertumbuhan kalus. Untuk mengamati apakah data dapat digambarkan dengan

kurva sigmoid dilakukan uji t dengan membandingkan nilai t hitung dengan t

tabel ( Budiasmoro, 2003 ).

2. Pembuatan grafik profil pertumbuhan kalus berdasarkan data

biomassanya.

Data penimbangan bobot kalus basah yang diperoleh dari setiap

pemanenan kemudian dikeringkan hingga bobotnya konstan dan ditimbang.

Pertumbuhan kalus dihitung berdasarkan persentase pertambahan bobot

biomassa kalus. Kemudian dibuatkan grafik profil pertumbuhan kalus, dengan

menghubungkan antara pertambahan bobot kalus kering dan umur kalus. Data

profil pertumbuhan kalus berdasarkan biomassa kalus tersebut digunakan

sebagai data pendukung bagi profil pertumbuhan kalus berdasarkan

pertambahan bobot kalus basah.

Untuk mengetahui apakah dengan adanya penambahan zat pengatur

tumbuh ( 2,4-D ) selama dilakukannya proses kultur terhadap kadar air yang


46

terkandung di dalam kalus maka diperlukan perhitungan persen kadar air. Persen

kadar air kalus dihitung dengan mengurangkan rerata bobot kalus basah akhir

dengan rerata bobot kalus kering dibagi dengan rerata bobot basah akhir dikali

100%.

Analisis kandungan kimia kalus, dalam hal ini glikosida jantung

dilakukan uji KLT dengan membandingkan bercak kalus kamboja jepang dengan

bercak daun tanaman asalnya.


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman kamboja jepang dilakukan dengan mencocokkan

tanaman kamboja jepang yang digunakan dalam penelitian dengan ciri-ciri

morfologi tanaman kamboja jepang berdasarkan pustaka acuan ( Anonim, 2006 ).

Berdasarkan hasil determinasi, diperoleh keterangan bahwa tanaman yang

digunakan dalam penelitian ini adalah tanaman kamboja jepang ( Adenium

obesum ( Forssk.) Roem & Schult) . Kamboja jepang yang dipergunakan dalam

penelitian ini termasuk dalam familia Apocynaceae ( Anonim, 2006 ).

B. Pemilihan Eksplan, Sterilisasi, dan Penanaman

Eksplan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun tanaman

kamboja jepang. Bagian tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah

daun karena daun lebih mudah didapat daripada bagian tanaman yang lain dan

daun memiliki jaringan parenkim yang akan berdediferensiasi yaitu proses

perkembangan terbalik dari bagian tanaman atau organ tanaman menjadi

sekelompok sel yang terus-menerus membelah berupa kalus dalam media tanam

yang digunakan. Selain itu, di dalam proses pengkulturan mudah untuk

disterilisasi.

Daun yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun yang segar dan

sehat, terletak nomor 3-5 dari ujung batang atau cabang karena pada bagian

47


48

tersebut masih banyak dijumpai jaringan meristem dan parenkim muda yang

mempunyai sifat totipotensi sehingga dapat tumbuh dan berkembang menjadi

kalus. Pada bagian ujung batang atau cabang, sel-sel daun masih terlalu muda dan

tidak tahan terhadap sterilisasi secara kimiawi dengan menggunakan larutan

hipoklorit-Tween 80. Campuran senyawa kimia tersebut menyebabkan kerusakan

banyak jaringan daun sehingga gagal terbentuk kalus bahkan eksplan dapat mati.

Sedangkan pada bagian pangkal batang atau cabang, sel-sel daun sudah tidak aktif

membelah karena pada daun hanya memiliki sedikit jaringan meristem sehingga

pembentukan kalus akan butuh waktu yang sangat lama.

Bagian tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun karena

pada penelitian terdahulu dilaporkan bahwa ekstrak dari daun tanaman Adenium

obesum mengandung glikosida jantung yang memiliki efek sitotoksik yang

berpotensi sebagai antikanker ( Nakamura et.al., 2000 ). Oleh karena itu, pada

penelitian ini diharapkan kalus daun kamboja jepang juga mempunyai kandungan

glikosida jantung yang sama dengan tanaman asalnya.

Media tanam dalam kultur jaringan adalah tempat untuk tumbuh

eksplan. Media yang digunakan adalah Murashige-Skoog. Media tersebut

mengandung berbagai nutrisi sehingga dapat menimbulkan resiko kontaminasi.

Kontaminan yang paling sering dijumpai adalah jamur dan bakteri. Untuk

menghindari kontaminasi, dilakukan sterilisasi pada peralatan, media, eksplan

maupun ruang transfer. Sterilisasi peralatan dan media menggunakan metode uap

panas bertekanan yaitu menggunakan autoklaf dengan suhu 121 °C selama 15-20

menit. Sterilisasi eksplan berlangsung dalam 3 tahap, yaitu pencucian, sterilisasi


49

di luar dan sterilisasi di dalam ruang transfer. Pencucian dilakukan dengan tujuan

menghilangkan kotoran pada daun dengan menggunakan detergen kemudian

dibilas dengan akuades. Sterilisasi di luar dan di dalam ruang transfer dilakukan

secara kimiawi yaitu dengan campuran larutan hipoklorit-Tween 80 kemudian

dibilas menggunakan akuades steril. Ruang transfer disterilisasi dengan disemprot

alkohol 70% dan radiasi sinar UV selama ± 2 jam.

Ukuran eksplan sangat menentukan dalam proses pengkulturan. Bagian

tanaman yang dikerat, masih mengandung suplai makanan serta hormon untuk

potongan tanaman itu sendiri, sehingga makin besar keratan, makin besar

kemampuan keratan ini untuk dirangsang tumbuh dan beregenerasi. Namun

dibalik itu harus dipikirkan pula bahwa makin besar eksplan, makin besar

kemungkinan mendapatkan jaringan yang terkontaminasi (Katuuk,1989). Ukuran

daun yang digunakan adalah 0,5-1 cm. Ukuran tersebut diperoleh dari hasil

orientasi yaitu pada ukuran tersebut mempunyai daya regenerasi yang paling baik.

Gambar 2. Eksplan dalam bentuk irisan melintang daun

Eksplan ditanam dalam bentuk irisan melintang daun. Dengan bentuk

ini, diharapkan permukaan eksplan yang dapat kontak dengan media semakin luas


50

sehingga nutrisi dapat diserap dengan lebih baik oleh eksplan. Pada saat

pengirisan dan pemindahan eksplan ke dalam botol kultur, digunakan pisau dan

pinset yang telah disterilkan dan didinginkan untuk meminimalkan resiko

kematian eksplan karena panas.

C. Deskripsi Kalus dan Waktu Inisiasi Kalus

Kalus adalah suatu massa amorf yang tersusun atas sel-sel parenkim

berdinding sel tipis yang berkembang dari hasil proliferasi sel-sel jaringan induk

( Yuwono, 2006 ). Pada hasil penelitian, kalus dari daun kamboja jepang yang

diperoleh berwarna putih kekuningan dan bersifat “freeable” yaitu antara satu

kumpulan sel dengan sel yang lain mudah dipisahkan.

Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah media Murashige-

Skoog yang mengandung nutrisi yang cukup lengkap untuk mendukung

pertumbuhan kalus. Penambahan zat pengatur tumbuh auksin dalam media juga

merupakan salah satu faktor yang digunakan untuk menumbuhkan kalus. Dalam

aktivitas kultur jaringan tanaman, auksin terkenal dalam berperan sebagai hormon

yang mampu berperan menginduksi terjadinya kalus (George dan Sherrington,

1984). Pada penelitian digunakan ZPT berupa 2,4-D yang termasuk dalam

golongan auksin sehingga 2,4-D berfungsi dalam menginduksi terjadinya kalus.

Pada penelitian, konsentrasi 2,4-D yang ditambahkan ke dalam media adalah 4

ppm. Konsetrasi 2,4-D tersebut diperoleh dari hasil orientasi di mana pada

konsentrasi tersebut ZPT sudah dapat menginduksi terjadinya kalus.


51

Waktu inisiasi kalus adalah waktu yang diperlukan oleh eksplan untuk

menumbuhkan kalus yang dihitung mulai saat penanaman eksplan hingga kalus

teramati pertama kali tumbuh berupa bintik putih pada tepi irisan eksplan atau

pada pelukaan eksplan ( Puspitasari dan Soegihardjo, 2002). Idealnya, waktu

inisiasi kalus ditandai dengan pertambahan bobot eksplan yang telah ditanam dari

bobot awalnya. Namun, pengamatan bobot media dan eksplan dari hari ke hari

menunjukkan terjadinya penurunan bobot eksplan dan media berbanding lurus

dengan umur penanaman. Penurunan bobot tersebut terjadi karena laju

pertumbuhan kalus lebih lambat daripada laju pengurangan kadar air media akibat

penguapan dan penyerapan air oleh eksplan. Oleh karena itu, penentuan waktu

inisiasi kalus tidak dapat diamati dengan cara tersebut.

Pada penelitian ini, inisiasi kalus diamati sebagai munculnya titik-titik

tumbuh kalus yang berwarna putih kekuningan untuk yang pertama kalinya pada

eksplan. Waktu inisiasi kalus rata-rata yang diperoleh dari hasil penelitian adalah

10,3 hari, dapat terlihat pada tabel I.

Tabel I. Waktu inisiasi kalus rata-rata daun kamboja jepang

Jumlah botol sumber inokulum Waktu inisiasi kalus ( hari )

6 9

3 12

1 13

Waktu inisiasi kalus rata – rata ( hari ) 10,3


52

Waktu inisiasi kalus menunjukkan komposisi media yang sesuai untuk

menumbuhkan kalus. Dalam penelitian ini, waktu inisiasi digunakan juga sebagai

parameter waktu pemanenan kalus yang nantinya data pemanenan ini akan

digunakan untuk analisis pola pertumbuhan kalus.

Gambar 3. Inisiasi kalus daun kamboja jepang

Waktu inisiasi kalus ini tidak dapat menggambarkan pertumbuhan kalus.

Karena selama proses orientasi yang dilakukan oleh peneliti menunjukkan bahwa

walaupun eksplan tanaman yang dipilih diperlakukan pada kondisi percobaan

yang sama, namun eksplan tanaman yang satu dan yang lainnya memiliki

kepotensialan yang berbeda untuk tumbuhnya kalus. Maka dari itu diperlukan

analisis pertumbuhan kalus baik secara visual maupun penimbangan berat kalus

selama pemanenan.

D. Subkultur dan Panen

Subkultur dilakukan setelah kalus berumur 36 hari. Hal tersebut

dilakukan untuk menjaga konsistensi pasokan nutrisi. Apabila subkultur terlambat

dilakukan, massa kalus akan mati kehabisan nutrisi. Tanda-tanda kalus kehabisan


53

nutrisi dan harus segera dipindah ke dalam media yang baru adalah warna kalus

menjadi coklat, media retak, dan selanjutnya sedikit demi sedikit kalus akan

mengering. Waktu 36 hari yang digunakan dalam penelitian ini didapat dari hasil

orientasi, di mana pada umur 36 hari kalus telah mulai menunjukkan tanda

kekurangan nutrisi.

Pada penelitian ini, kalus disubkultur cukup 1 kali sebelum dilakukan

pemanenan. Kalus yang dipanen adalah hasil dari subkultur pertama. Hal ini

dilakukan karena pada subkultur yang pertama eksplan sudah membentuk kalus

seluruhnya.

Bagian kalus yang disubkultur adalah bagian yang masih sehat yaitu

bagian kalus yang belum mengalami kecoklatan atau “browning” dan memiliki

titik tumbuh yang baik yaitu di bagian kalus terluar. Kalus yang telah

mengalami“browning” apabila ditanam tidak dapat tumbuh dan berkembang

membentuk kalus baru. Kalus bagian luar merupakan kalus yang masih tersusun

oleh sel-sel meristem sehingga dapat tumbuh dan berkembang membentuk kalus

baru. Dengan pemilihan ini, diharapkan kalus akan cepat berkembang setelah

dipindah ke media baru. Dari hasil orientasi, ditemukan bahwa kalus bagian dalam

terdiri dari sel-sel tua yang memiliki waktu dormansi sebelum mulai tumbuh

apabila dipindahkan ke media baru. Tidak jarang, kalus tua ini justru mati setelah

dipindah karena tidak mampu menyerap nutrisi dari media.

Bobot kalus awal sebelum subkultur tidak dapat ditimbang karena resiko

kontaminasi. Oleh karena itu, jumlah kalus awal dikendalikan dengan

menyamakan ukuran kalus awal, yaitu ± 3 – 5 mm. Ukuran ini ditetapkan dengan


54

cara orientasi. Ukuran kalus awal yang lebih kecil menghasilkan pertumbuhan

yang lebih pesat karena penyerapan nutrisi lebih optimal.

Pemanenan dilakukan pada setiap 6 hari sekali selama 42 hari. Tujuan

pemanenan adalah untuk mengetahui profil pertumbuhan kalus dan untuk

mendapatkan kalus kering untuk dianalisis kandungan kimianya. Pemanenan

dilakukan sampai hari ke-42, karena pada hari ke-36 hingga hari ke-42 kalus

menunjukan fase stasioner, yang mana pada fase tersebut diharapkan kalus

memiliki kandungan metabolit sekunder berupa glikosida jantung yang optimum.

E. Profil Pertumbuhan Kalus

Pertumbuhan kalus tidak dapat diamati dengan penimbangan kalus

setiap periode waktu tertentu karena adanya pengurangan bobot media akibat

penguapan yang akan mengacaukan data. Kadang-kadang, bobot kalus terlihat

berkurang semu karena laju penguapan media lebih besar daripada laju

pertumbuhan kalus. Untuk mengatasi hal tersebut, analisis pertumbuhan kalus di

dalam penelitian ini menggunakan dua cara, yaitu:


penimbangan bobot kalus basah dengan umur kalus.

Pada penelitian, dilakukan panen setiap 6 hari sekali sehingga

didapatkan data bobot kalus awal dan akhir pada hari ke 6, 12, 18, dan seterusnya.

Pertumbuhan dihitung sebagai selisih bobot kalus basah akhir ( n hari setelah

penanaman) dengan bobot kalus basah awal (bobot kalus pada saat ditanam). Pola

pertumbuhan kalus mengikuti persamaan kuva sigmoid dengan adanya fase lag,


55

fase eksponensial, dan fase stasioner. Kurva sigmoid menggambarkan hubungan

antara umur kalus dengan pertambahan bobot kalus basah.

Profil pertumbuhan kalus yang akan digunakan untuk melihat fase-fase

pertumbuhan kalus dibuat dengan menghitung pertumbuhan sebagai fungsi pada

persamaan kurva sigmoid yaitu :

( ) bebNa

aYxta N −⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛ +

=−+1

Y adalah pertumbuhan menurut fungsi sigmoid dan X adalah umur kalus. Nilai a

dan b diperoleh dari persamaan regresi linier pertumbuhan versus umur kalus

sebagai nilai intercept dan slope. Dengan memasukkan nilai a dan b ke dalam

persamaan maka diperoleh persamaan :

( ) 1494,01494,01730,01730,0

11730,0 +⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ −

=−+ xt Ne

N

Y

Hasil dari perhitungan tersebut akan membentuk kurva sigmoid yang

menggambarkan profil pertumbuhan.


56

Profil Pertumbuhan Kalus Berdasarkan Bobot Kalus Basah

00.20.40.60.8

11.21.4

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Umur Kalus (hari)

Pert

amba

han

Bob

otK

alus

Bas

ah (Δg

)

Profil Pertumbuhan Kalus Hasil Penimbangan Profil Pertumbuhan Kalus Menurut Kurva Sigmoid

Gambar 4. Profil pertumbuhan kalus kamboja jepang berdasarkan bobot kalus basah

Berdasarkan hasil plot antara umur kalus dan nilai y’ yang diperoleh dari

persamaan kurva sigmoid, dilakukan uji t terhadap slope untuk menentukan

keterwakilan data dari kurva sigmoid tersebut mampu mewakili pertumbuhan

kalus yang diperoleh dari penimbangan dengan membandingkan antara t hitung

dengan t tabel ( sebagai H1 ).

Sy.x =2)'( 2

−−

nyy = 0,1501 Sb =

∑ 2xSyx = 0,1138 tb =

Sbb = -1,3128

t tabel = ± 1,943

Nilai t hitung yang diperoleh adalah -1,3128 , sedangkan nilai t tabel

adalah ± 1,943. Nilai t hitung lebih besar daripada t tabel pada rentang penerimaan

H0 sebelah kiri sehingga kurva sigmoid berada pada daerah penerimaan (H1

diterima ). Kurva sigmoid ini dapat mewakili pertumbuhan kalus yang diperoleh

dari penimbangan.


57

Berdasarkan hasil plot antara kurva sigmoid dan grafik pertumbuhan

kalus yang diperoleh dari penimbangan dapat menggambarkan profil

pertumbuhan kalus. Fase-fase pertumbuhan kalus daun kamboja jepang dapat

dilihat dari kurva sigmoid tersebut, yaitu:

a. Fase lag. Fase lag yaitu fase penyesuaian dimana laju pertumbuhan kalus

sangat kecil. Pada penelitian ini, fase lag terjadi pada hari ke-0 hingga hari

ke-18. Pada fase lag, terjadi penyesuaian diri daun kamboja jepang dengan

lingkungan sehingga laju pertumbuhan sangat kecil. Pada fase ini, kalus

mulai tumbuh yang ditandai dengan adanya bintik berwarna putih

kekuningan pada bagian pelukaan daun.

b. Fase eksponensial. Fase eksponensial yaitu fase dimana laju pertumbuhan

kalus sangat besar. Pada fase ini kalus dapat menyerap nutrisi dengan baik

yang diperlukan untuk pembelahan sel. Fase eksponensial terjadi setelah

hari ke-18 hingga hari ke-36 .

c. Fase stasioner. Fase stasioner yaitu fase dimana laju pertumbuhan kalus

mulai konstan. Pada fase ini nutrisi dalam media mulai berkurang

sehingga penyerapan nutrisi juga berkurang dan laju pertumbuhan kalus

sebanding dengan laju kematian. Pada penelitian ini fase stasioner dimulai

pada hari ke-36 hingga hari ke-42. Metabolit sekunder diproduksi pada

fase stasioner sehingga untuk memperoleh metabolit sekunder yang

optimum panen perlu dilakukan mulai hari ke-36 hingga hari ke-42.


58

2. Biomassa kalus selama masa pertumbuhan 42 hari.

Kurva sigmoid yang menggambarkan hubungan antara umur kalus dengan

pertambahan bobot kalus basah didukung oleh kurva pertumbuhan kalus daun

kamboja jepang berdasarkan pertambahan bobot biomassa kalus. Data profil

pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan pertambahan bobot

biomassa kalus ditunjukkan pada lampiran 6.

F. Persen Kadar Air Kalus

Persen kadar air adalah nilai persen dari pengurangan rerata bobot kalus

basah dengan rerata bobot kalus kering dibagi dengan rerata bobot kalus basah.

Persen kadar air kalus meningkat secara drastis pada hari ke-0 hingga hari ke-6.

Hal tersebut menunjukkan bahwa kalus menyerap lebih banyak air pada fase awal

pertumbuhan kalus yaitu pada fase lag akibat adanya penambahan ZPT (2,4-D) ke

dalam media yang mana 2,4-D dapat menurunkan tekanan dinding sel sehingga

air dapat masuk ke dalam disertai dengan kenaikan volume sel, sehingga kalus

membesar dan persen susut pengeringanpun mengalami kenaikan. Selanjutnya

persen kadar air kalus mulai konstan pada hari ke-6 hingga hari ke-42. Hal

tersebut menunjukkan bahwa kalus menyerap sedikit air akan tetapi kalus lebih

banyak melakukan aktivitas pembelahan sel. Persen kadar air kalus yang

diperoleh dari hasil penelitian ditunjukkan pada gambar 5.


59

% Kadar Air Kalus Pada Pertumbuhan Kalus Selama 42 Hari Pemanenan

0

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40 5

Umur Kalus (hari)

Pert

amba

han

Kad

ar A

i

0

rK

alus

( %

)

% Kadar Air Kalus

Gambar 5. Persen kadar air kalus daun kamboja jepang

Kaitan antara data persen kadar air dengan data profil pertumbuhan

adalah sebagai berikut:

a. Fase lag ( hari ke 0 - 18 ) . Pada fase lag, kalus memiliki sel yang besar dan

mengandung banyak air.

b. Fase eksponensial ( hari ke 18 – 36 ). Pada fase eksponensial, sel kalus mulai

membelah dengan ukuran sel yang kecil serta memiliki kandungan air yang

banyak.

c. Fase stasioner ( hari ke 36 – 42 ). Pada fase stasioner, kalus memiliki massa

sel yang besar dan kandungan air yang banyak. Pada fase stasioner, apabila

dilakukan pembudidayaan dalam media cair, diduga kalus daun kamboja

jepang akan menghasilkan senyawa metabolit sekunder yang optimal karena

media yang digunakan optimum dalam pertumbuhan.


60

G. Kromatografi Lapis Tipis

Analisis kandungan kimia kalus dilakukan untuk membuktikan bahwa

kalus mampu memproduksi glikosida jantung seperti tanaman asalnya. Dengan

demikian, kalus daun kamboja jepang dapat dikembangkan sebagai penghasil

metabolit sekunder.

Analisis kandungan kimia kalus dalam penelitian ini dilakukan dengan

metode kromatografi lapis tipis (KLT) berdasarkan pada pustaka Wagner (1984).

Fase diam yang digunakan pada penelititan sistem KLT ini yaitu silika gel GF254.

Fase gerak yang digunakan dalam analisis ini adalah campuran etil asetat :

metanol : air dengan perbandingan 81 : 11 : 8 v/v . Karena fase diam lebih polar

daripada fase gerak, maka kromatografi ini merupakan kromatografi fase normal.

Pereaksi semprot yang digunakan dalam penelitian ini adalah pereaksi asam sulfat

97 % dan peraksi Kedde (Wagner et al., 1984).

Glikosida jantung bersifat polar karena memiliki gugus gula (glikon).

Namun kepolaran fase diam yang digunakan dalam penelitian lebih tinggi

dibandingkan dengan glikosida jantung. Berdasarkan sifat fase gerak, fase diam,

dan analit, diperkirakan bercak akan dapat bergerak mengikuti fase gerak. Dari

pengamatan bercak hasil KLT, didapatkan data yang tercantum dalam tabel II.


61

Tabel II. Hasil pengamatan KLT dengan fase diam silika gel GF254 dan fase gerak etil asetat : metanol : air ( 81 : 11 : 8 v/v )

Pereaksi Asam Sulfat (97%) Perekasi Kedde Totolan Ekstrak

No. Bercak

Rf Warna Rf Warna A1 0,09 Kuning-coklat 0,09 Kuning A2 0,40 Hijau muda 0,40 Kuning A3 0,50 Hijau tua 0,50 Kuning A4 - - 0,65 Merah muda A5 0,75 Coklat 0,71 Merah muda A6 0,80 Hijau tua 0,80 Kuning

Daun Kamboja Jepang

A7 0,90 Hijau tua 0,90 Hijau tua B

B1 0,12 Kuning-coklat 0,12 Kuning Kalus Kamboja Jepang

BB2 0,90 Hijau muda 0,90 Hijau muda

Keterangan gambar :

Fase diam : silika gel GF254

Fase gerak: etil asetat : metanol :air

(81 : 11 : 8 v/v)

A : Ekstrak daun kamboja jepang

B : Ekstrak kalus daun kamboja

jepang

Deteksi :asam sulfat 97 %,

pemanasan selama 1000C

selama 3-5 menit

Jarak pengembangan : 10 cm

Gambar 6. Hasil KLT setelah disemprot dengan pereaksi asam sulfat ( 97 % )

Diketahui bahwa larutan penyemprot asam sulfat 97% mempunyai sifat

positif terhadap steroid, glikosida jantung, alkaloid, gibberellin, dan lain-lain (Jork


62

et all, 1990). Wagner (1984) menyatakan bahwa reaksi warna yang terjadi pada

identifikasi senyawa glikosida jantung positif bila timbul gradasi warna dari

merah atau coklat sampai hijau.

Dari hasil penelitian di atas, ekstrak kalus daun kamboja jepang

menghasilkan 2 bercak yaitu B1 dan B2 dengan warna kuning-coklat dan hijau

muda. Kedua bercak tersebut mirip dengan bercak ekstrak daun kamboja jepang

tanaman asalnya yaitu A1 dan A8 dengan warna kuning-coklat dan hijau tua.

Namun bercak-bercak yang diperoleh memiliki warna yang berbeda dari pustaka

acuan. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa tidak dibuktikan ekstrak kalus

daun kamboja jepang mengandung glikosida jantung seperti tanaman asalnya.

Keterangan gambar :

Fase diam : silika gel GF254

Fase gerak: etil asetat : metanol :air

(81 : 11 : 8 v/v)

A : Ekstrak daun kamboja jepang

B : Ekstrak kalus daun kamboja

jepang

Deteksi : pereaksi Kedde

Jarak pengembangan : 10 cm

Gambar 7. Hasil KLT setelah disemprot dengan pereaksi Kedde

Diketahui juga bahwa pereaksi semprot Kedde mempunyai sifat positif

terhadap glikosida jantung (Anonim, 1978). Wagner (1984) menyatakan bahwa


63

reaksi warna yang terjadi pada identifikasi senyawa glikosida jantung positif bila

timbul warna dari biru sampai merah.

Dari hasil KLT dengan pereaksi semprot Kedde, ekstrak kalus daun

kamboja jepang menghasilkan 2 bercak yaitu B1 dan B2 dengan warna kuning dan

hijau muda. Kedua bercak tersebut mirip dengan bercak ekstrak daun kamboja

jepang tanaman asalnya yaitu A1 dan A8 dengan warna kuning dan hijau tua.

Namun bercak-bercak yang diperoleh memiliki warna yang berbeda dari pustaka

acuan. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa tidak dibuktikan ekstrak kalus

daun kamboja jepang mengandung glikosida jantung seperti tanaman asalnya.

Secara morfologi pertumbuhan kalus daun kamboja jepang pada media

Murashige – Skoog menunjukkan hasil yang baik, hal ini ditunjukkan dengan

pertumbuhan kalus mengikuti kurva sigmoid. Namun secara fisiologis kalus yang

dihasilkan pada media MS tidak dapat memproduksi metabolit sekunder berupa

glikosida jantung, hal ini ditunjukkan pada hasil uji KLT. Dengan demikian dapat

disimpulkan bahwa pemilihan media tanam dalam penelitian ini tidak sesuai di

dalam menghasilkan metabolit sekunder berupa glikosida jantung.


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. KESIMPULAN

Berdasarkan data yang dikumpulkan dalam penelitian ini, maka dapat

ditarik kesimpulan :

1. Penanaman eksplan daun kamboja jepang dapat membentuk kalus yang

dapat tumbuh dengan baik dalam media tumbuh Murashige-Skoog dengan

penambahan ZPT berupa 2,4-Diklorofenoksiasetat (2,4-D) dan waktu

inisiasi kalus rata-rata yang diperoleh dari hasil penelitian adalah 10,3 hari.

2. Pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan penimbangan bobot

kalus basah dan kering mengikuti pola pertumbuhan kurva sigmoid : fase

lag, fase eksponensial dan fase stasioner.

3. Hasil KLT dengan menggunakan pereaksi semprot asam sulfat 97% dan

pereaksi semprot Kedde menunjukkan bahwa ekstrak kalus daun kamboja

jepang tidak mengandung glikosida jantung seperti tanaman asalnya.

B. Saran

Dari penelitian ini, perlu dilakukan lanjutan penelitian tentang :

1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai pemilihan media yang

tepat untuk budidaya secara in vitro daun kamboja jepang sehingga dapat

dihasilkan metabolit sekunder berupa glikosida jantung .

64


65

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 1978, Dyeing Reagents for Thin Layer and Paper Chromatography, no.112 dan 305, E. Merck, Darmstadt, Federal Republic of Germany.

Anonim, 2006, Adenium, http://en.wikipedia.org/wiki/Adenium, diakses pada

tanggal 27 November 2006. Atawodi, S.E., Bulus T.I.S., Ameh D.A., Nok Aj., Mamman M., Galadima M.,

2003, In vitro trypanocidal effect of methanolic extract of some Nigerian savannah plants, Afr.J.Biotechnol. 2(9): 317-321.

Backer, C.A. and R.C.Bakhuizen, 1965, Flora of Java (Spermatophytes Only),

Vol.II, 218-221,225, N.V.P.Noordhoff-Groningen-The Netherlands. Dicosmo, F. and M. Misawa, 1995, Plant cell and tissue culture: Alternatives for

metabolit production, Biotechnol, Adv.13(3): 425-453. Dixon, R.A., 1985, Plant Cell Culture, A practical Approach, 3-11, IRL Press,

Oxford, Washington DC. Doods, J.H. dan Roberts, L.W., 1985, Experiments in Plant Tissue Culture,

Cambridge University Press, Cambridge. Farnsworth, N.R., 1966, Biological and Phytochemical Screening of Plants,

Journal Of Pharmaceutical Sciencis, Vol.55, No. 3., p.260-262. Freiburghaus F., Kaminsky R., Nkuna M.H.N., Brun R., 1996, Evaluation of

African medicinal for their in vitro trypanocidal activity, J.Ethnopharmacol. 55: 1-11.

George, E.F., and Sherrington, P.D.., 1984, Plant Propagation by Tissue Culture,

p.301-310, Eastern Press, Reading. Hendaryono, D.P. Sriyanti dan A. Wijayani, 1994, Teknik Kultur Jaringan, 59-

67,69, 89-94, Kanisius, Yogyakarta. Jork,H., W. Funk, W. Fischer and H. Wimmer, 1990, Thin-Layer

Chromatography : Reagent and Detection Methods, Vol. 1a., p.410-415, Trans: Frank & Jennifer A. Hampson, VCH Publishers, New York.

Katuuk, J.R.P., 1989, Tehnik Kultur Jaringan Dalam Mikropropagasi Tanaman,

Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi Proyek Pengembangan Lembaga Pendidikan Tenaga Kependidikan, Jakarta, Hlm:3,37-62,90-109.


66

Mgbojikwe, L.O. and Z.S.C. Okoye, 2001, Acaricidal Efficacy of the Aqueous Stem Bark Extract of Adenium obesum on the Various Life Stages of Cattle Ticks, Nig.J.Exptl.Appl.Biol. Vol. 2, No. 1, pp. 39-43.

Moffat, A.C., 2004, Clarke's Analysis of Drugs and Poisons, http://www.medicinescomplete.com/mc/clarke/current/images/clk0536c001.gif, diakses pada tanggal 12 Februari 2007.

Mulja, H.M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, 223-227, Airlangga

University Press, Surabaya. Nakamura, M., M. Ishibashi, E. Okuyama, T. Koyano, T. Kowithayakorn, M.

Hayashi and K. Komiyama, 2000, Cytotoxic Pregnanes from Leaves of Adenium obesum, Natural Medicines 54(3): 158-159.

Puspitasari, A. dan Soegihardjo, C.J., 2002, Optimasi Media Penumbuh Kalus

Sebagai Langkah Awal Upaya Budidaya In vitro Tanaman Vitex trifolia L., Majalah Farmasi Indonesia, 21-25.

Ramachandra Rao, S. and G.A. Ravishankar, 2002, Plant cell cultures: Chemical

factories of secondary metabolites, Biotechnol, Adv 20:101-153. Robinson, T., 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, 152-158, ITB Press,

Bandung. Sajc, L., D. Grubisic, and G. Vunjak-Novakovic, 2000, Bioreactors for plant

engineering: an outlook for further research, Biochem. Eng. J. 4: 89-99 Salisbury, F.B., and Ross, C.W., 1995, Fisiologi Tumbuhan : Perkembangan

Tumbuhan dan Fisiologi Lingkungan, Jilid III, Edisi IV, hal 14-16, ITB, Bandung.

Samuelsson, G., 1999, Drugs of Natural Origin, 4th Ed., 326, Swedish

Pharmaceutical Press, Sweden. Santoso,U. dan Nursandi,F., 2001, Kultur Jaringan Tanaman, Ed. I, 15 – 139,

UMM Press, Malang. Sastrohamidjojo, H., 2001, Kromatografi, 26-36, Laboratorium Analisis Kimia

Fisika Pusat UGM, Yogyakarta. Shoppee, C.W., 1964, in “ Symposium on Phytochemistry,” Athur, H.R., ed.,

p.86, Hongkong University Press, Hongkong,. Soenanto, H., 2005, Pesona Adenium, 3,10-13, Kanisius, Yogyakarta.


67

Stahl, E. (Ed), 1969, Thin Layer Chromatography : A Laboratory Handbook, 2nd Ed., 6, 341-346 , diterjemahkan oleh M.R.F. Ashworth, Springer-Verlag, New York.

Wagner, H., Bladt, S., Zgainski, E.M., 1984, Plant Drug Analysis: A Thin Layer

Chromatography Atlas, p.195-223, (Transl: Scoot, Th.A.), Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York-Tokyo.

Wetherell, D.F., 1982, Pengantar Propagasi Tanaman Secara In Vitro,

diterjemahkan oleh dra. Koensoemardiyah S. Su., Apt., 39-44, Avery Publishing Group Inc., USA.

Yamauchi T. and Abe F., 1990, Cardiac glycosides and pregnanes from Adenium

obesum (studies on constituents of Adenium. I)., Chem Pharm Bull, 38 (3):669-72.

Yusnita, 2003, Kultur Jaringan: Cara Memperbanyak Tanaman secara Efisien,

5,56-62, PT Agromedia Pustaka: Jakarta. Yuwono, T., 2006, Bioteknologi Pertanian, 169, Gadjah Mada University Press,

Yogyakarta.


68

Lampiran 1. Surat Determinasi Tumbuhan


69

Lampiran 2. Foto-foto Hasil Penelitian

Gambar 8. Foto tanaman kamboja jepang ( Adenium obesum (Forssk.) Roem. & Schult.)

Gambar 9. Foto daun kamboja jepang


70

Gambar 10. Foto kalus siap subkultur Gambar 11. Foto kalus siap panen

Gambar 12. Foto kalus basah Gambar 13. Foto kalus kering

Gambar 14. Foto serbuk kalus


71

Gambar 15. Foto hasil KLT secara visual

Keterangan gambar:

A. Ekstrak daun kamboja jepang.

B. Ekstrak kalus daun kamboja jepang.


72

Gambar 16. Foto hasil KLT dilihat dengan pereaksi asam sulfat ( 97% )

Keterangan gambar:




73

Gambar 17. Foto hasil KLT dilihat dengan pereaksi Kedde.

Keterangan gambar:




74

Lampiran 3. Komposisi media tumbuh Murashige-Skoog ( MS ).

Makronutien mg / L

Kalium nitrat ( KNO3 )

Ammonium nitrat ( NH4NO3 )

Kalsium dikloro dihidrat ( CaCl2.2H2O )

Magnesium sulfat heptahidrat ( MgSO4.7H2O )

Kalium dihigrogen fosfat ( KH2PO4 )

1900

1650

440

370

170

Mikronutien mg / L

Mangan sulfat tetrahidrat ( MnSO4.4H2O )

Seng sulfat heptahidrat ( ZnSO4.7H2O )

Asam borat ( H3BO3 )

Kalium iodide ( KI )

Tembaga (II) sulfat pentahidrat (CuSO4.5H2O )

Natrium molibdat dihidrat ( NaMoO4.2H2O )

Kobalt (II) klorida heksahidrat (CoCl2.6H2O )

Besi (II) sulfat heptahidrat ( FeSO4.7H2O )

Natrium etilen diamin tetra asetat dihidrat ( NaEDTA.2H2O )

22,3

8,6

6,2

0,83

0,025

0,25

0,025

27,8

37,3

Vitamin dan asam amino mg / L

Myo-inositol

Thiamin HCl

Asam nikotinat

Piridoksin HCl

Glisin

100

0,1

0,5

0,5

2

Sumber karbon mg / L

Sukrosa 30000

Zat pengatur tumbuh mg / L

Asam 2,4-Diklorofenoksiasetat 4


75

Zat pemadat dan pelarut mg / L

Agar

Akuades

11000

ad 1 L

pH 5,2 – 5,6


76

Lampiran 4. Data penimbangan bobot kalus basah dan bobot kalus kering dalam media tumbuh MS.

Umur kalus (hari)

No. Botol

Bobot kalus

basah awal (g)

Rata-rata bobot kalus basah awal

(g)

Bobot kalus

basah akhir (g)

Rata-rata bobot kalus basah akhir

(g)

Bobot kalus kering

(g)

Rata-rata bobot kalus

kering (g)

Pertumbuhan (g)

1 0,2275 0,2594 0,0226 7 0,2585 0,3163 0,0277

6 13 0,2459 0,2448 0,3041 0,2959 0,0276 0,0251 0,0511 19 0,1989 0,2832 0,0254 25 0,2565 0,2946 0,0222 31 0,2815 0,3176 0,0248 2 0,1645 0,2648 0,0173 8 0,2649 0,3444 0,0290

12 14 0,3307 0,2598 0,3504 0,3093 0,0292 0,0239 0,0496 20 0,2743 0,3369 0,0256 26 0,2699 0,3024 0,0230 32 0,2543 0,2571 0,0195 3 0,2139 0,2769 0,0211 9 0,3497 0,3702 0,0299

18 15 0,2909 0,2707 0,4903 0,3671 0,0385 0,0295 0,0964 21 0,2269 0,279 0,0197 27 0,2501 0,462 0,0393 33 0,2925 0,3242 0,0284 4 0,2481 0,9372 0,0698 10 0,4097 0,7350 0,0532

24 16 0,3091 0,2992 0,5389 0,6734 0,0437 0,0522 0,3742 22 0,2522 0,5608 0,0469 28 0,3047 0,6888 0,0514 34 0,2715 0,5797 0,0479 5 0,4108 1,4450 0,0892 11 0,3809 1,0869 0,0728

30 17 0,3221 0,3227 0,9751 1,1007 0,0717 0,0735 0,7780 23 0,3279 0,9851 0,0641 29 0,2097 0,9654 0,0694 35 0,2850 1,1467 0,0735 6 0,2332 1,8759 0,1007 12 0,3325 1,4615 0,0901

36 18 0,4520 0,3341 1,5795 1,5965 0,0957 0,0968 1,2624 24 0,3918 1,8697 0,1026 30 0,3345 1,3046 0,0913 36 0,2603 1,4878 0,1007 37 0,3719 1,2136 0,0782 38 0,3296 1,0095 0,0710

42 39 0,3516 0,3094 1,4478 1,3257 0,1049 0,0905 1,0162 40 0,3413 1,7060 0,1059 41 0,2289 1,1165 0,0807 42 0,2334 1,4607 0,1022


77

Lampiran 5. Profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan bobot kalus basah.

Hari Pemanenan p p2 Δp Rs = Δp/(Δh.p) p.Rs Y’

0 0,0000 0,0000 0,0157 0,0511 0,0000 0,0000 6 0,0511 0,0026 0,0433 -0,0015 -0,0049 -0,0003

12 0,0496 0,0025 0,1144 0,0469 0,1576 0,0078

18 0,0964 0,0093 0,2736 0,2778 0,4800 0,0463

24 0,3742 0,1400 0,5399 0,4038 0,1799 0,0673

30 0,7780 0,6052 0,8239 0,4845 0,1038 0,0807

36 1,2625 1,5938 1,0126 -0,2462 -0,0325 -0,0410

42 1,0162 1,0327 1,1020

a = 0,1730 ( nilai intercept dari rumus regresi linier )

b = -0,1494 ( nilai slope dari rumus regresi linier )

( ) 1494,01494,01730,01730,0

11730,0 +⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ −

=−+ xt Ne

N

Y


78

Data Uji t profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan bobot kalus basah. No X Y Y’ ( Y-Y’ ) ( Y-Y’ )² X=Y-Yrata-rata X² 1 0 0,0000 0,0157 -0,0157 0,0002465 -0,4535 0,2057 2 6 0,0511 0,0433 0,0078 6,094E-05 -0,4024 0,1619 3 12 0,0496 0,1144 -0,0648 0,0041984 -0,4039 0,1632 4 18 0,0964 0,2736 -0,1772 0,0313913 -0,3571 0,1275 5 24 0,3742 0,5399 -0,1657 0,027466 -0,0793 0,0063 6 30 0,7780 0,8239 -0,0460 0,0021129 0,3245 0,1053 7 36 1,2625 1,0126 0,2499 0,0624293 0,8090 0,6544 8 42 1,0162 1,1020 -0,0857 0,0073482 0,5627 0,3167

Sy.x =2)'( 2

−−

nyy = 0,1501

Sb = ∑ 2xSyx = 0,1138

tb = Sbb = -1,3128

t tabel = ± 1,943


79

Lampiran 6. Profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan bobot kalus kering.

Hari Pemanenan p p2 Δp Rs = Δp/(Δh.p) p.Rs Y’

0 0,0000 0,0000 0,0193 0,0251 0,0000 0,0000 6 0,0251 0,0006 0,0242 -0,0011 -0,0074 -0,0002

12 0,0239 0,0006 0,0299 0,0056 0,0386 0,0009

18 0,0295 0,0009 0,0363 0,0227 0,1281 0,0038

24 0,0522 0,0027 0,0434 0,0213 0,0681 0,0036

30 0,0735 0,0054 0,0510 0,0234 0,0531 0,0039

36 0,0969 0,0094 0,0587 -0,0064 -0,0110 -0,0011

42 0,0905 0,0082 0,0662

a = 0,0467 ( nilai intercept dari rumus regresi linier )

b = -0,4239 ( nilai slope dari rumus regresi linier )

( ) 04239,04239,00467,00467,0

10467,0 +⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ −

=−+ xtNe

N

Y


80

Data Uji t profil pertumbuhan kalus daun kamboja jepang berdasarkan bobot kalus kering.

No X Y Y’ ( Y-Y’ ) ( Y-Y’ )² X=Y-Yrata-rata X² 1 0 0.0000 0.0193 -0.0193 0.0003721 -0.0489 0.00242 6 0.0251 0.0242 0.0009 7.954E-07 -0.0239 0.00063 12 0.0239 0.0299 -0.0059 3.501E-05 -0.0250 0.00064 18 0.0295 0.0363 -0.0068 4.67E-05 -0.0194 0.00045 24 0.0522 0.0434 0.0087 7.608E-05 0.0032 0.00006 30 0.0735 0.0510 0.0225 0.0005054 0.0245 0.00067 36 0.0969 0.0587 0.0382 0.0014580 0.0479 0.00238 42 0.0905 0.0662 0.0243 0.0005884 0.0416 0.0017

Sy.x =2)'( 2

−−

nyy = 0,0227

Sb = ∑ 2xSyx = 0,2444

tb = Sbb = -1,7344

t tabel = ± 1,943


81

Lampiran 7.Data persen kadar air kalus kamboja jepang

Persen kadar air kalus dihitung dengan rumus:

% Kadar air = rerata bobot kalus basah – rerata bobot kalus kering x 100% rerata bobot kalus basah Hari pemanenan

Rerata bobot kalus

basah (g) Rerata bobot kalus

kering (g) Kadar air

(%) 0 0 0 0 6 0,2959 0,0251 91,5333 12 0,2998 0,0239 92,0178 18 0,3671 0,0295 91,9686 24 0,6734 0,0522 92,2557 30 1,1007 0,0735 93,3270 36 1,5965 0,0969 93,9336 42 1,3257 0,0905 93,1746


82

BIOGRAFI PENULIS

Nama lengkap penulis adalah Melissa Wijaya, dilahirkan

di Cirebon pada tanggal 13 Oktober 1985, anak kedua

dari dua bersaudara pasangan Kusnadi Widjaja dan Tuti

Setiawati. Penulis menyelesaikan pendidikan TK Kristen

BPK Penabur Jamblang tahun 1989-1991, pendidikan

SD Kristen BPK Penabur Jamblang tahun 1991-1997,

kemudian pendidikan SLTP Kristen BPK Penabur

Cirebon tahun 1997-2000, dilanjutkan SMU Kristen BPK Penabur Cirebon tahun

2000-2003, selepas SMU penulis masuk ke perguruan tinggi Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama kuliah di Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma penulis pernah aktif sebagai asisten praktikum, antara

lain adalah praktikum farmakologi dasar dan toksikologi dasar pada tahun

2006/2007. Pada tahun 2005/2006 penulis mengerjakan Program Kreativitas

Mahasiswa Penelitian dengan judul Optimasi Komposisi 2,4 Diklorofenoksi

Asetat dan Furfuryl Amino Purine dalam Penghasilan Glikosida Jantung secara In

Vitro dari Kalus Kamboja Jepang ( Adenium Obesum ). Penulis telah

menyelesaikan skripsi dengan judul “Kandungan Glikosida Jantung dan Profil

Pertumbuhan Kalus Daun Kamboja Jepang ( Adenium obesum (Frossk.) Roem. &

Schult. ) Dalam Media Tumbuh Murashige-Skoog”.


Documents

SKRIPSI - core.ac.uk · dilaporkan bahwa tanaman kamboja jepang mengandung glikosida jantung dengan kandungan utama berupa oleandrigenin beta-gentiobiosyl-beta-D-thevetoside, neridienone