Seminario antropologia forense

Técnicas genéticas aplicadas a las ciencias forenses

Víctor Acuña Alonzo Licenciatura de Antropología FísicaEscuela Nacional de Antropología e Historia

‘every contact leaves a trace’

Edmond Locard

Conceptos

Identificación individual y parentesco

Características de ?

Bases de datos poblacionales

Ejemplos

El ADN como evidencia

• Prueba de rutina para identificación humana y disputas de paternidad

• PCR de alta sensibilidad → obtención de evidencia a partir de escaso material biológico

• Bases de datos de perfiles genéticos

→ búsqueda ágil de coincidencia de perfiles genéticos (total o parcial)

→ posibilidad de resolver casos no resueltos (cold cases)

→ asignación de un valor estadístico a la identificación

Conc

epto

s

Jobling MA y Gill P. 2004. Encoded evidence: DNA in forensic analysis. Nature Reviews Genetics. 5: 739752.

El ADN como evidencia Co

ncep

tos


La evidencia genética debe considerarse en el marco de otros datos, el papel del genetista no

es hacer presunciones de inocencia o culpabilidad, sino proveer información objetiva

al juez o jurado

• En la actualidad se usan PCR multiplex para microsatélites autosómicos (amplificación simultánea de varios loci)

• Otros marcadores para usos específicos: SNPs autosómicosMarcadores del cromosoma Y (crY)Marcadores del ADN mitocondrial (mtDNA)

• Además de la determinación de perfiles genéticos para identificación y disputas de paternidad, otras posibles aplicaciones de la genética son:

Deducción del origen (ancestría)Información fenotípicaAnálisis de otras especies

Conc

epto

s


Conc

epto

sGenoma humano

Brown TA. 2002. Genomes. Garland Science.

http

://ww

w.nc

bi.n

lm.n

ih.g

ov/g

enom

e/gu

ide/

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y

23 Pares de Cromosomas + mtDNA

Cromosomassexuales

mtDNA16,569 bp

Autosomas

ADN mitocondrial

ADN nuclear3,200 millones bp

Núcleo de la célula

Mitocondria (múltiples copias)

2 copias por

célula

Varias copias por célula

Butler JM. 2005. Forensic DNA Typing, 2nd Edition. Elsevier Academic Press

Conc

epto

s

Conc

epto

s• STRs autosómicos (microsatélites)

Fuente de variación:Herencia independiente, recombinación y mutación

Ventajas:Poder de discriminación extremadamente alto

Desventajas:Difícil de tipificar en muestras degradadas

> 20 mil STRs

Conc

epto

s• SNPs autosómicos

Fuente de variación:Herencia independiente, recombinación y mutación

Ventajas:Se pueden tipificar en muestras degradadas

Desventajas:Poder de discriminación relativamente bajo (bialélicos)

Frazer KA, et al 2009. Human genetic variation and its contribution to complex traits. Nature Reviews Genetics 10, 241251

> 3 millones de SNPs

Conc

epto

s• STRs crY

Fuente de variación:Sólo mutación

Ventajas:Específico de varones, útil en mezcla de muestras de mujer y varónDistribución filogeográfica bien definida

Desventajas:Poder de discriminación relativamente bajo, se comparte por vía paterna, posibles problemas de estructura de poblaciones

Conc

epto

s• SNPs del ADN mitocondrial

Fuente de variación:Sólo mutación

Ventajas:Mayores probabilidades integridad Distribución filogeográfica bien definida

Desventajas:Heteroplasmia, Poder de discriminación relativamente bajo, se comparte por vía materna, posibles problemas de estructura de poblaciones

A, B, C, D, XAméricaA, B, C, D, G, Y, ZAsia

H, I, J, N1b, T, U, V, W, XEuropaL0, L1, L2, L3.ÁfricaHaplogruposRegión

Variación en el genoma humano Co

ncep

tos Nuestras secuencias son idénticas en un 99.9% (especie “joven”).

En el genoma humano hay más de 10 millones de SNPs y decenas de miles de STRs entre otros polimorfismos

Esta variación se estructura en bloques cromosómicos (haplotipos) de 5 a 200K bp

85 a 90% de la variación genética neutral se atribuye a diferencias entre individuos dentro de las poblaciones

El restante 10 a 15% se distribuye entre grupos

Esta variación es modesta pero influencia las diferencias que existen entre las poblaciones respecto a características fenotípicas

Conc

epto

s

1900

Primer polimorfismo genético, ABO (Landsteiner)

1920

1920s1950s otros polimorfismos de grupos sanguíneos y proteínas (MNSs, Rhesus, Lewis, Kell, haptoglobinas ...)

1984

Multilocus DNA fingerprint, minisatélites (Jeffreys)

1988

PCR

Primer kit forense comercial HLADQA1

1991

Primeros STRs para identificación humana

1992

Primer kit comercial de STRs forenses

Uso de mtDNA y YSTRs en casos forenses

1993

Primer caso de desastre masivo (Waco Texas)

1995

UK National DNA Database

1997

Determinación de perfiles genéticos a partir del contacto con objetos


Pm ∼ 0.010.001 < 1013

pocos loci muchos locipoco polimórficos muy polimórficosalta probabilidad de coincidencia muy baja probabilidad

de coincidencia

Conceptos


Características de X


Ejemplos

Sistema de identificación más usado:

Combined DNA Index System

Iden

tifica

ci

ó n

STRbase http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/

Iden

tifica

ci

ó n

THO1

Multiplex de 2 individuos

Iden

tifica

ci

ó n


• Alta tasa de mutación• Gran número de alelos en cada

población• Alta heterocigosidad• Herencia independiente (no ligados)• Buenos marcadores individuales, no

suelen ser marcadores de ancestría• Neutrales en su mayoría• Tetranucleótidos, fáciles de amplificar• Alto poder de discriminación• Probabilidad muy baja de coincidencia

aleatoria (match)• ¡Muchas bases de datos!

Características de los STRs seleccionados para idId

entif

icaci

ó n


• Sangre• Semen• Saliva• Orina• Cabello• Diente• Hueso• Tejido• Uñas• Objetos x contacto

Fuentes de evidenciaId

entif

icaci

ó n

J.M. Butler. 2005. Forensic DNA Typing, 2nd Edition. Elsevier Academic Press

Muestra de escena del delito o investigación de

paternidad (dubitada)

ExtracciónADN

Cuantificación del ADN

Amplificación de múltiples marcadores

Biología

Separación y detección de los productos de PCR

TecnologíaDeterminación de los

genotipos de la muestra

GenéticaComparación del perfil

genético con otros resultados (muestras de referencia, indubitadas)

Si se da una coincidencia, comparación con bases de datos

poblacionales

Generación de un reporte de caso con la probabilidad de coincidencia al azar (match)


Iden

tifica

ci

ó n

?Prueba de identificación

Resultados posibles de la prueba

• Match – Los perfiles genéticos coinciden. Se reporta la significancia estadística.

• Exclusión (Nonmatch) – La comparación de genotipos muestran diferencias en el perfil genético.

• No concluyente – Los datos no permiten llegar a una conclusión (desacuerdo entre los expertos, falta de datos, etc).

Iden

tifica

ci

ó n


Probabilidad de match (Pm)

• La probabilidad de que dos individuos no relacionados compartan un perfil de DNA

• Se calcula con la regla del producto para la probabilidad conjunta de que ocurra un perfil genético determinado en una población determinada

• Puede aumentar en los siguientes casos:– Perfil de ADN parcial por degradación y reducción del

número de loci informativos– Si el sospechoso y el culpable real tienen parentesco o si se originan de la misma subpoblación

Iden

tifica

ci

ó n

Bases de datos poblacionalesPara una correcta valoración estadística de la prueba de ADN es

necesario disponer de una base de datos lo más extensa posible (N > 200) que sea representativa de la población a la que pertenecen los individuos que se han analizado.

En el caso de que existan subgrupos de población claramente diferenciados es importante que estén incluidos en la base de datos

Iden

tifica

ci

ó n

• Generar datos de la población o las poblaciones deseadas (en caso de poblaciones multiétnicas) N>100

• Determinar las frecuencias alélicas para cada locus

• Usar la frecuencia alélica para estimar la rareza de un perfil genético particular

– Homocigotos (p2), Heterocigotos (2pq)– Usar la regla del producto combinada en varios loci

Iden

tifica

ci

ó n


Tablas de frecuencias alélicas

CaucasianN= 302

0.0017*

0.10270.2616

0.25330.21520.152320.01160

African American

N=258

0.0019*0.08920.30230.0019*0.33530.20540.06010.0039*

20 0.0017* 0.0001*

D3S1358

Butler et al. (2003) JFS 48(4):908911

CaucasianN= 7,636

0.0009

0.12400.2690

0.24300.20000.14600.0125

Einum et al. (2004) JFS 49(6)

Allele 11

131415

15.216171819

12 0.0017* 0.00070.0031

African AmericanN= 7,602

0.0003*

0.00770.09050.29200.00100.33000.20700.06300.0048

0.0045

20

Allele 11

131415

15.216171819

12

Butler J.M. 2005. Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press

Frecuencia del perfil genético con los 13 loci STR CODIS

21.283.50

18.6213.8

31.8530.69

9.2526.1811.3116.2912.35

8.879.171 in

8.37 x 10140.2169 10CSF1PO 3.94 x 10130.5348 8TPOX 1.13 x 10130.2318 6THO1 6.05 x 10110.3212 11 0.1126 9D16S539 4.38 x 10100.17729D7S820 1.38 x 1090.0480 140.3394 11D13S317

44,818,2590.1407 130.384112D5S818 4,845,2170.1391 160.1374 14D18S51

185,0730.2782 30 0.1589 28 D21S11 16,3640.1656 140.1854 12D8S1179

10050.2185220.185421FGA

810.2003 180.2815 17 VWA 9.170.2152 17 0.2533 16D3S1358

Combined value allele value allele Locus

Probabilidad de coincidencia al azar para este perfil en la población eurodescendiente e EUA: 1 en 837 trillones

AmpFlSTR® Identifiler™ (Applied Biosystems)

AMELD3

TH01 TPOX

D2D19FGA

D21 D18

CSFD16

D7D13

D5 VWAD8Perfil

16,1717,1821,2212,1428,3014,1612,1311,14

9,99,116,68,8

10,10

PRODUCT

RULE

Aplicaciones del genotipado para identificación

o Casos forenseso Bases de datos de ADNo Desastres masivoso Desaparecidoso Pruebas de parentescoo Genealogías y casos históricoso Identidad de líneas celulares humanaso Detección de quimeras genéticaso Monitoreo de trasplanteso Detección de tumoreso Mapeo de enfermedades o Estudio de la diversidad humana

Otros• Identificación de especies (conservación)• Identificación de animales domésticos


Iden

tifica

ci

ó n

Límites de las técnicas genéticas

o Cantidad e integridad del material genéticoo Contaminación (mezcla de perfiles genéticos, inhibición PCR)o Bases de datos de referencia (→ estimación probabilística)o Muestras de referencia para el caso (familiares, sospechosos...)o $

Aspectos básicos

o Toma de muestra adecuadao Cadena de custodiao Extracción exitosa del material genéticoo Control de calidad de todos los procesos del laboratorio

→ Laboratorios certificados

Iden

tifica

ci

ó n

Conceptos


Características de ?


Ejemplos

Características

• Cuando el perfil genético de una escena del crimen no coincide con ningún perfil de las bases de datos, cualquier información que se pueda obtener será útil:

• Deducción del origen (ancestría)STRs de uso forense no son marcadores de ancestría individualPor el contrario, mtDNA y crY han sido excelentes marcadores de filogeografía, sin embargo su uso sería problemático en poblaciones mestizas

• Información fenotípica

STRs de uso forense no aportan ninguna información fenotípica.

¿USAR OTRAS VARIABLES GENÉTICAS?

Cara

cter

í stica

s

Cara

cter

í stica

sMarcadores para estimar ancestría

Ancestry Informative Markers

Los AIMs se seleccionan para maximizar las diferencias absolutas en las frecuencias alélicas entre dos poblaciones ancestrales. El AIM ideal está fijado en una población y es muy abundante en otra (>60%). Permiten realizar estimaciones de ancestría individualSólo el 2% de los SNPs autosómicos tiene valores > 60% entre las 3 grandes agrupaciones continentales.

VL MartinezMarignac, et al 2007. Admixture in Mexico City: implications for admixture mapping of type 2 diabetes genetic risk factors. Hum Genet, 120(6): 80719.

El caso excepcional de D9S1120 9AR en amerindios

Wang S, et al. 2007. Genetic Variation and Population Structure in Native Americans. PLoS Genet 3(11): e185.

Cara

cter

í stica

s

Cara

cter

í stica

sMarcadores asociados a variaciones

fenotípicas

No se habían descrito polimorfismos inequívocamente asociados para la gran mayoría de las características fenotípicas que podrían ser de interés para describir al

culpable de un crimen (estatura, color de piel...)

Recientemente se han identificado alelos asociados a fenotipos que eventualmente podrían ser usados estimar

algunas características.

www.hapmap.org

Conceptos




Ejemplos



ENFSI DNA WG Population DatabaseEuropean Network of Forensic Science Instituteshttp://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/

STRBase Short Tandem Repeat DNA Internet DataBaseCreated by John M. Butler and Dennis J. Reeder (NIST Biochemical Science Division) http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/

Revistas especializadas:

Forensic Science International Genetics

Journal of Forensic Sciences

Base

s de

dat

os

http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase/

Tsar Nicholas II profile

Base

s de

dat

os

Base

s de

dat

os

Autosomal SNPs

•70 Loci (Vallone et al. 2005 Forensic Sci. Int. 149: 279286.)• U.S. Caucasian (N=74)• African American (N=71)• U.S. Hispanic (N=44)Ba

ses

de d

atos

Elsevier ScienceElsevier Science

SpringerVerlagASTM and American Academy of Forensic Sciences

J.M. Butler. 2005. Forensic DNA Typing, 2nd Edition © 2005 Elsevier Academic Press

http://www.elsevier.com/locate/issn/13446223

http://www.elsevier.com/locate/issn/03790738

Conceptos




Ejemplos

http://www.innocenceproject.org/

Ejem

plos

¿Qué datos están disponibles en México?

Ejem

plos

American Journal of Human BiologyVolume 20, Issue 5, Date: September/October 2008, Pages: 605613

In the early morning hours of July 17, 1918 the royal family and their staff were led to the cellar of the Ipatiev House where they

were being held and executed.

In the late 1970s, a local geologist, Dr. Alexander Avdonin was able to locate the mass grave containing the remains of five of the seven members of the royal family and their four servants.

In the summer of 2007, a group of amateur archeologists discovered a few bone fragments approximately 70 meters from

the first grave. Following an official archeological excavation conducted by Dr. Sergei Pogorelov, Deputy Director of the

Sverdlovsk Region's Archaeological Institute, a set of 44 bone fragments and teeth were carefully recovered from the site.

(..) the LR of the hypothesis (H1) that samples 146.1 and 147 are the children of Tsar Nicholas II and Tsarina Alexandra (and siblings of the three princesses from grave one) compared to the alternative

hypothesis that these samples are individuals completely unrelated to the Romanov family (H2), we found that the DNA evidence is 4.36

trillion times more likely if sample 147 is a daughter of Tsar Nicholas II and Tsarina Alexandra, and over 80 trillion times more likely if sample 146.1 is a son of Tsar Nicholas II and

Tsarina Alexandra than if these samples were from two unrelated individuals.

‘the little things are infinitely the most important’

Sherlock Holmes

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