UNIVERSITATEA DE VEST VASILE GOLDI ARAD

FACULTATEA DE MEDICIN GENERAL, FARMACIE I MEDICINA

DENTAR

Rezumat tez de doctorat

CERCETRI PRIVIND SIGURANA ALIMENTAR A

UTILIZRII ORGANISMELOR MODIFICATE

GENETIC N HRANA PUILOR DE CARNE

Coordonator:

Prof. univ. dr Afilon Jompan

Doctorand:

As. univ. drd. Du (Crnau) I. Daniela

Arad,

2012

1

Partea general

Tez Rezu

mat

Introducere....... 4 2

Scurt istoric al plantelor modificate genetic........................ 6 3

Capitolul 1. Stadiul actual al cunotinelor n domeniul organismelor

modificate genetic

1.1. Metode de obinere a organismelor modificate genetic..................................... 11 4

1.2 Detecia alimentelor derivate din organisme modificate genetic...................... 23 6

Capitolul 2. Potenialele riscuri pentru sntatea uman i pentru mediul

nconjurtor prezentate de organismele modificate genetic 39 7

Capitolul 3. Soia modificat genetic. Evaluarea siguranei alimentelor

modificate genetic

51 8

Partea special

Capitolul 4. Cercetri personale

4.1. Scop. Obiective. Metodologie. Descrierea experimentului............................... 59 9

4.1.3. Obiectivele generale ale studiului................................................................... 61 10

4.1.4. Metodologia cercetrii. Plan experimental general......................................... 61 10

4.1.5. Descrierea experimentului.............................................................................. 63 11

4.2. Seria I de analize organoleptice, fizice i chimice............................ 68 11

4.3. Seria a II-a de analize morfopatologice............................................. 98 19

4.4. Seria a III-a de analize utiliznd tehnici de biologie molecular.... 118 21

Capitolul 5. Concluzii

5.1. Concluzii specifice............................................................................................. 139 23

5.2. Concluzii generale............................................................................................ 143 26

5.3. Semnificaia teoretic a lucrrii.Valoare practic............................................ 144 27

2

PARTEA GENERAL

1. Introducere

Omul este un sistem deschis informaional, cu autoreglare, autoreproducere i evoluie

antientropic, ce prelucreaz informaii exogene i endogene. n fapt, alimentul este un

principal factor epigenetic, purttor de informaie preluat din mediul nconjurtor, care

interacioneaz cu propria noastr informaie genetic, condiie absolut necesar bunei

funcionri a entitii biologice om.

n cazul alimentelor procesate, compozite, profilele nutriionale sunt complet

modificate i diferite fa de profilele nutriionale ale alimentelor naturale integrale. Profilele

nutriionale antropizate ale alimentelor procesate moderne, ofer metabolismului uman

(neschimbat de milioane de ani) informaie, nutrieni, aditivi, contaminani cu care acesta nu

este obinuit, producnd dezechilibre metabolice puternice (stress metabolic) care se

constituie ca factori de declanare a tabloului patologic alarmant ntlnit astzi n sntatea

public i individual.

Stabilirea profilului nutriional al alimentelor provenite din structuri modificate

genetic reprezint o adevarat provocare. Exist studii n care, pentru stabilirea profilului

nutriional, alimentele modificate genetic sunt comparate cu contrapartida lor natural (soia

modificat genetic este comparat cu soia nemodificat genetic).

Alimentele n care se pot regsi evenimente modificate genetic pot fi:

produse pe baz de porumb: mlai i gri de porumb, ulei de porumb, chips de

porumb, fulgi de porumb pentru micul dejun,

produse pe baz de soia : ulei de soia, creme-desert pe baza de soia, lapte de soia,

branz de soia,

cartofi i subproduse de cartofi,

ingrediente:

- fain de porumb utilizat la producerea pinii, cerealelor pentru micul dejun, biscuii

aperitiv,

- griul de porumb n : biscuii aperitiv, pesmet, bere, cereale pentru micul dejun,

3

- amidonul de porumb: n sosuri, mezeluri, creme pentru deserturi, preparate pentru deserturi

deshidratate, ciorbe, mncare pentru nou-nscui, produse de patiserie,

- siropul de glucoz, dextroz, maltodextrinele n : sosuri, biscuii, batoane de cereale, bere,

ciorbe, biscuii pentru aperitiv, fructe cu zahar ncorporate n iaurturi i diferite deserturi,

ngheate,

- aditivi din soia (lecitina) sau din porumb (amidon oxidat, amidon acetilat, arome).

Scopurile agriculturii OMG, aa cum au fost rezumate la conferina despre

biotehnologia viitorului (Suedia, septembrie 2001) de ctre organizaia ONU pentru alimente

i agricultur (FAO) sunt urmtoarele: creterea rezistenei la duntori i virui, amplificarea

toleranei la ierbicide, ncetinirea procesului coacerii i mrirea durabilitii produselor pe

raftul magazinelor. Pe lng cele patru culturi MG extensive - soia, porumb, bumbac i trestie

de zahr- au fost fcute experimente i pentru introducerea unor caracteristici noi, prin

tehnici de recombinare genetic, n legume i fructe.

Scurt istoric al plantelor modificate genetic

Primele plante modificate genetic au fost cultivate n Romania n anul 1998. Soia a

fost autorizat pentru cultivare comercial n anul 1998. Oficial, n Romania au fost

nregistrate 14 varieti de soia modificat genetic - GTS 40-3-2 - (anii 2004, 2005, 2006)

pentru cultivare comercial. Evoluia suprafeelor cultivate cu soia n Romania pentru

perioada 2004-2006, conform datelor publicate de Ministerul Agriculturii, Pdurii i

Dezvoltrii Rurale din Romnia este prezentat n figura 1 a.

ncepnd cu data de 1 ianuarie 2007, n Romnia cultivarea comercial a soiei

modificate genetic a fost interzis. n ceea ce privete alte plante modificate genetic, pn n

anul 2007, n Romania au existat numai cmpuri de testare a mai multor varieti de porumb

i cartof modificate genetic. n privina porumbului modificat genetic MON810, n perioada

2007-2010 suprafeele au fost cultivate au variat de la 332,4 ha n 2007 la 822,6 ha n 2010 cu

un maxim de 6130,44 ha n 2008 , conform datelor furnizate de Ministerul Agriculturii,

Pdurii i Dezvoltrii Rurale din Romnia, fig 1b.

4

Figura n.1 a. Suprafaa cultivat cu soia modificat genetic n Romnia perioada 2004-2006

1b. Suprafaa cultivat cu porumb modificat genetic n Romania perioada 2007-

2010

1.1. Metode de obinere a organismelor modificate genetic

Pentru o just apreciere a efectelor pe care alimentele modificate genetic le pot avea

asupra strii de sntate, este necesar cunoaterea modului n care sunt obinute aceste

organisme i apoi studierea potenialelor efecte.

Problema metodelor utilizate pentru transformarea genetic a plantelor, respectiv a

mecanismelor care permit transferul i integrarea unui fragment de ADN strin ntr-o celul

vegetal-int, rmne a fi una actual. Metodele utilizate pentru transferul eficace al

alogenelor n organisme vegetale receptoare au cunoscut, de asemenea, un progres nu mai

puin spectaculos, de la metode simple pn la adevrate metode rzboinice, de mpucare

direct a ADN n esuturile int. Odat cu dezvoltarea metodologiei de izolare i clonare a

genelor, respectiv a metodelor de transfer n celulele vegetale, un numr tot mai mare de

plante au fost supuse transgenozei, incluznd grupele cu o mare importan economic:

cerealele, leguminoasele, solanaceele, speciile pomicole sau forestiere.

5

Figura nr.2 Prezentare schematic a metodelor de obinere a OMG-urilor

Metode directe

Metoda biolistic

Tratamente chimice cu ageni

Electroporarea

Electroforeza

Ultrasunetele(sonicarea)

Microinjectarea

Fuziunea cu lipozomi

Utilizarea fibrelor de carbur de siliciu

METODE INDIRECTE

TRANSFORMAREA MEDIAT

Transformarea mediat de bacterii: Agrobacterium

tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes

Transformarea mediat de virusuri

6

Metode de detecie a organismelor modificate genetic

Pentru analiza calitativ i cantitativ a materialului modificat genetic n produsele

alimentare, au fost elaborate i implementate numeroase metode analitice. Concomitent cu

metodele clasice, ca PCR i ELISA, sunt utilizate i alte procedee de analiz precum

cromatografia i spectroscopia infraroie.

Figura nr.3 Prezentare schematic a metodelor de detecie , identificare i cuantificare

a OMG-urilor

Organismele transgenice n afar de genele de interes, conin i gene de selecie,

necesare pentru detectarea fenotipic a acestora. Detectarea OMG se bazeaz pe prezena

elementelor genetice strine incluse n genomul vegetal (Figura nr. 4), care conin:

promotorul (regiunea ce controleaz expresia transgenelor),

regiunea codificatoare a genei de interes,

gena marker i/sau raportoare (cu ajutorul crora OMG sunt selectate) i,

terminatorul (ce stopeaz procesul transcripiei)

7

Figura nr.4 Structura schematic a elementelor genetice utilizate n transgenez

Comform legislaiei in vigoare, este obligatorie etichetarea produselor alimentare care

conin mai mult de 0,9% MG, dnd astfel posibilitatea consumatorului s aleaga dac dorete

s consume sau nu un astfel de produs. n ceea ce priveste, OMG-urile utilizate n hrana

animalelor, nu exist nicio prevedere privind informarea consumatorului. Cea mai mare parte

din proteina folosit n raia furajer de ctre fermierii romni provine din soia MG din

import, n condiiile n care interesul agricultorilor romni pentru cultura de soia

convenional a sczut semnificativ.

Capitolul 2. Potenialele riscuri pentru sntatea uman i pentru mediul nconjurtor

prezentate de organismele modificate genetic

Pe de o parte, aceste organisme sunt promovate ca fiind sigure i necesare societii

umane, n timp ce opozanii le consider neeseniale i potenial cauzatoare de efecte negative

asupra sntii i mediului. Niciuna dintre aceste opinii nu poate fi ns corect, din simplu

considerent c OMG-urile nu reprezint o categorie omogen, punerea n balan a

beneficiilor i riscurilor trebuind fcut pentru fiecare caz n parte.

Analiza impactului potenial al introducerii i utilizrii OMG-urilor are n vedere o

serie de factori ca: implicaiile tehnice pentru practica agricol, inputurile din agricultur,

fluxul de gene, biodiversitatea, impactul economic, avantajele pentru sistemul sanitar,

riscurile pentru sntatea consumatorilor i organismele non-int, asigurarea securitii

alimentare, implicaiile de natur etic sau cultural.

8

Figura 4. Aspecte cu impact pe sntatea public date de utilizarea OMG n hrana puilor de

carne

Capitolul 3. Soia modificat genetic. Evaluarea siguranei alimentelor modificate

genetic

Evenimentul de transformare la soia (Glycine max) GTS 40-3-2, comercializat sub

denumirea Roundup Ready(RR), a fost creat de Monsanto n scopul utilizrii erbicidelor

totale pe baz de glifosat pentru controlul buruienilor n culturile comerciale. Simplitatea

acestui sistem a reprezentat unul dintre motivele succesului rapid pe care la avut n rndul

cultivatorilor. Soia Roundup Ready este cultivat pentru boabe destinate alimentaiei umane

(n special sub form de ulei, fraciuni proteice i fibre) i a animalelor (n special sub form

de rot) GTS 40-3-2 a fost obinut prin introducerea n varietatea comercial A5403 (Asgrow

Seed Company) a genei epsps, izolat din linia CP4 a speciei Agrobacterium tumefaciens.

Gena introdus codific o protein EPSPS insensibil, n general, la aciunea glifosatului,

care poate astfel metaboliza aminoacizii aromatici necesari plantei, chiar i n cazul aplicrii

erbicidului Roundup .

n Romnia, soia transgenic a fost introdus n mediu ncepnd cu anul 1997 n

absena legislaiei restrictive, a mijloacelor de control necesare, dar mai ales n lipsa unei

evaluri credibile a riscului pentru mediul nconjurtor i pentru sntatea uman.

9

PARTEA SPECIAL

CAPITOLUL 4.Cercetri personale

1. Motivaia cercetrii

Avnd n vedere proporia pe care carnea de pui o reprezint n raia alimentar a

omului contemporan modificrile induse de furajele care conin organisme modificate genetic

n structura histochimica i imunologica se pot constitui n riscuri pentru sntatea public.

Pornind de la aceast premis, acest studiu are ca obiectiv investigarea efectelor pe care

administrarea de hran coninnd organisme modificate genetic le poate induce asupra carnii

provenite de la pui broiler. n Romnia, pn n prezent nu s-au cercetat i nu s-au publicat

de ctre ali autori studii privind implicaiile n sntatea public a alimentelor coninnd

organisme modificate genetic. n special, studierea efectelor soiei modificate genetic este cu

att mai important cu ct utilizarea acesteia ca aliment i ca ingredient a luat amploare n

ultimii ani.

Principalele preocupri referitoare la sigurana alimentelor care conin derivate MG se

concentreaz asupra urmtoarelor aspecte:

testele analitice existente i bazele de date, coninnd substanele toxice naturale sau

nutrienii prezeni n alimentele convenionale, nu sunt adecvate pentru a testa

modificrile neintenionate ale derivatelor MG;

ingineria genetic poate afecta n mare msur toxinele, alergenii sau nutrienii din

alimente. Alergiile asociate alimentelor pot fi exacerbate prin inginerie genetic;

folosirea genelor-marker, care confer rezisten la antibiotice n unele alimente MG,

ridic probleme de sntate.

Cercetarile n domeniu indic urmtoarele:

riscurile i beneficiile OMG nu sunt complet clare ori universale;

capacitatea de a prezice impactul ecologic al speciilor noi este scazut, din cauza

incertitudinii datelor disponibile;

cantitatea i calitatea OMG-urilor, care pot fi eliberate merit atenie special n

privina estimrii riscurilor, evaluarea minuioas a beneficiilor poteniale poate ajuta

specialitii privind determinare echilibrului ntre beneficii i riscuri;

elaborarea msurilor privind prevenirea transferului de gene ctre plantele slbatice

poate reduce impactul asupra mediului i contribui la generarea beneficiilor.

10

2.Scopul lucrrii l reprezint studierea efectelor organoleptice, fizico chimice,

biologice, morfopatologice induse de utilizarea hranei coninnd organisme modificate

genetic asupra puilor de carne cu impact n sntatea public

3.Obiectivele studiului

1. Studiul modificarilor fizico chimice induse n structura carnii de pasare de utilizarea n

hrana puilor de carne a soiei MG

2. Utilizarea tehnicilor de biologie moleculara n studierea efectelor hranei coninnd soia

MG asupra crnii de pasre

3. Studiul modificrilor morfopatologice induse de soia MG asupra puilor broiler

4.Metodologia cercetrii

Plan experimental general genetic n hrana puilor de carne

Indicatori urmariti:

1.identificarea prezentei

lectinei

2.identificarea secventei

modificate genetic

utilizand tehnici PCR

3. cuantificarea ADN

modificat in cazul prbelor

positive prin PCR real time

Studiul modificrilor

morfopatologice

induse de soia MG

asupra puilor broiler

Studiul modificarilor

organoleptice, fizice i

chimice induse in

structura carnii de

pasare de utilizarea in

hrana puilor de carne a

soiei MG

Utilizarea tehnicilor de

biologie moleculara in

studierea efectelor

hranei coninnd soia

MG asupra crnii de

pasre

Indicatori urmariti prin

examinarea

morfopatologica a pieselor

anatomice proventricol,

ficat, rinchi, intestin subtire,

muschi striat

1.coloratie hematoxilina

eozina

2. coloratie Tricrom Masson

Indicatori urmariti:

1. indicatori

organoleptici

2. indicatori fizici ai

carnii

3. indicatori chimici

4 loturi experimentale de pui broiler rasa Ross -308 n hrana carora a fost introdus n procente

crescande ( 25, 50, 75, 100) proteina din soia GTS 40-3-2, 1 lot experimental fr soia MG

11

Ca animale de studiu au fost folosii pui broiler din rasa comercial Ross crescui n

sistem intensiv pe aternut permanent. n studiu au fost luai un numr de 130 pui selectai

randomizat dintr-un lot de 14000 pui de 1 zi utiliznd ca i criterii de includere starea de

sntate, greutatea i sexul. Cei 130 subieci, cu greuti de 40-42g, sex ratio 1:1 au fost

mprii n 5 loturi crora li s-a administrat hrana n care proteina a provenit din rot de soia

modificat genetic achiziionat din comer cu documente care atest faptul c este modificat

genetic, n proporii de 25%, 50%, 75%, 100% i un lot martor n hrana cruia nu s-a utilizat

soia modificat genetic. Creterea subiecilor s-a fcut n sistem industrial respectnd

recomandarile pentru bunastarea animalelor de studiu. Psrile care ajung n ziua 42 au fost

eutanasiate prin dislocare cervicala. Au fost prelevate probe pentru analize organoleptice,

fizico-chimice, morfopatologice i determinri prin biologie moleculara.

Seria I de analize organoleptice, fizice i chimice

1. Aprecierea cantitativ a greutii carcaselor i diferitelor pri anatomice

Prelucrnd datele brute prin metoda ANOVA nu au fost observate diferente

semnificative statistic n ceea ce priveste greutatea carcaselor sau a prilor de carcasa si a

organelor interne.De asemenea, nu s-au identificat efecte semnificative ale consumului de

soia modificat genetic asupra greutii carcaselor - F(4,25)=1,89, p>.05 - a prilor de

carcas cntarite : F (4,25)=2.4, p>.05 pentru aripi, F(4,25)=1.89, p>.05- pentru pulpe, F

(4,25)=1.53, p>.05 pentru piept sau aspura organelor interne cntrite F (4,25)=0.16, p>.05

pentru inima si F (4,25)=2.9, p>.05 pentru ficat.

2.Caracteristicile organoleptice ale crnii de pasre studiate

nsuirile organoleptice ale probelor analizate, au fost n limite normale. De

asemenea, nu au fost constatate diferene semnificative ntre probele provenite de la cele 5

loturi.

3. Determinri ale proprietilor chimice

n figura 2 sunt prezentate, comparativ, valorile medii obinute pentru cei ase

parametrii chimici urmrii la fiecare dintre loturile luate in studiu. Aa cum se poate observa

din grafic, nu exist diferene semnificative pentru niciun parametru urmrit. Rezultatele

obinute, sunt n concordan cu datele obinute i n alte studii care au abordat tematici

asemntoare, publicate publicate n reviste recenzate.

12

Figura 5. Comparaie sintetic ntre valorile medii obinute pentru pH, AUH, umiditate,

grsimi i protein.

4.Aprecierea valorii energetice a crnii

Analiznd rezultatele obinute putem aprecia c nu exist diferente semnificative ntre

loturile studiate.Cele mai mari valoari au fost obinute pentru carnea provenit de la subiecii

din lotul III, n a crui hran a fost introdus n att protein din rot de soia convenional n

procent de 75% ct i din soia modificat genetic n procent de 25% la care s-a nregistrat i

cea mai mare medie a grsimilor dar i cel mai redus nivel al proteinelor.Valorile cele mai

mici au fost obinute la subiecii din lotul IV a crui hran a coninut doar protein din rot

de soia convenional la care a fost obinut i cel mai sczut coninut n grsimi.

5. Identificarea continuului crnii n aminoacizi, (cromatografie gazoas/lichid)

Profilul aminoacidic al proteinei din carnea de pasre analizat se prezint tipic pentru

acest aliment. Merit remarcate nivelurile unor aminoacizi eseniali, precum: valina,

treonina, fenilalanin, leucina, tirozin, histidin i izoleucina pentru care se observ, n

majoritatea cazurilor, valori mai crescute n cazul crnii provenite de la puii din lotul IV, fr

13

a exista ns diferene semnificative statistic.Valori mai mici comparativ cu lotul V au fost

obinute pentru subiecii din lotul IV pentru urmtorii aminoacizi: lizin, metionin, glicin i

serin.

4. Studiul corelaiilor dintre parametri investigai

Pentru a identifica modul n care se asociaz dimensiunile i parametri testai

am recurs la calcularea indicilor de corelaie. Deoarece nu toate distribuiile rezultatelor au

urmat o curba gaussian, am calculat indicii de corelaie neparametrici rho Spearman. Tabele

I-III prezint toi indicii de corelaie obtinui, pragul de semnificaie i numrul de subieci. n

prezentarea acestor rezultate le vom sublinia pe acelea care sunt semnificative statistic, i care

n tabel sunt marcate cu caractere ngroate.

4. 1. Indici de corelaie

Tabel nr. I

Indicii de corelaie dintre greutile msurate

pulpe aripi piept ficat inim

rho 1,000 ,808 ,760 ,726 ,405

p . ,000 ,000 ,000 ,004

pulpe

N 50 50 50 50 50

rho ,808 1,000 ,598 ,640 ,417

p ,000 . ,000 ,000 ,003

aripi

N 50 50 50 50 50

rho ,760 ,598 1,000 ,470 ,291

p ,000 ,000 ,001 ,040

piept

N 50 50 50 50 50

rho ,726 ,640 ,470 1,000 ,376

p ,000 ,000 ,001 . ,007

ficat

N 50 50 50 50 50

rho ,405 ,417 ,291 ,376 1,000

p ,004 ,003 ,040 ,007 .

inim

N 50 50 50 50 50

Dup cum se poate observa din tabelul XXII, toate cele cinci greuti msurate

(greutatea pulpelor, aripilor, pieptului, ficatului i a inimii) coreleaz pozitiv semnificativ.

Constatm c pentru cele cinci grupuri de subieci incluse n studiu, nu exist o asociere

14

semnificativ ntre dezvoltarea greutii i caracteristicile organoleptice. n urma calculrii

indicilor de corelaie am obinut corelaii semnificative doar n ceea ce privete greutatea

ficatului. Astfel, greutatea ficatului coreleaz pozitiv semnificativ cu: Ph-ul, umiditatea i

azotul uor hidrolizabil. Prin urmare, cu ct este mai mare greutatea ficatului, ne ateptm s

fie mai mari i aceste valori. De asemenea, greutatea ficatului coreleaz negativ semnificativ

cu substana uscat cu ct mai mare va fi ficatul, cu att mai redus va fi cantitatea de

substan uscat.

Tabel nr. II

Indicii de corelaie dintre caracteristicile fizico-chimice

p

ph umiditate

substan uscat

protein

grsime AUH

valoare energetic

rrho

1,000 ,211 -,334 ,173 -,192 ,295 -,182

p . ,141 ,018 ,229 ,181 ,038 ,207

ph

N 50 50 50 50 50 50 50

rrho

,211 1,000 -,694 ,128 -,462 ,171 -,583

p ,141 . ,000 ,374 ,001 ,235 ,000

umiditate

N 50 50 50 50 50 50 50 rr

ho -,334 -,694 1,000 -,312 ,556 -,114 ,688

p ,018 ,000 . ,028 ,000 ,431 ,000

substan uscat

N 50 50 50 50 50 50 50 rr

ho ,173 ,128 -,312 1,000 -,551 -,099 -,236

p ,229

,374 ,028 ,000 ,496 ,099

protein

N 50 50 50 50 50 50 50

rrho

-,192

-,462 ,556 -,551 1,000 ,163

,910

p ,181

,001 ,000 ,000 . ,259 ,000

grsime

N 50 50 50 50 50 50 50 rr

ho ,2

95 ,171 -,114 -,099 ,163 1,000 ,079

p ,038

,235 ,431 ,496 ,259 . ,587

auh

N 50 50 50 50 50 50 50 valoare energeti

rrho

-,182 -,583 ,688 -,236 ,910 ,079 1,000

15

p 207 ,000 ,000 ,099 ,000 ,587 . c N 50 50 50 50 50 50 5

0 n ceea ce privete relaiile dintre caracteristicile fizico-chimice ale crnii de pui,

avem un tablou mai nuanat (menionm doar corelaiile semnificative statistic):

Ph-ul coreleaz pozitiv cu AUH i negativ cu cantitatea de substan uscat;

Umiditatea coreleaz negativ cu substana uscat, grsimea i valoarea energetic;

Substana uscat coreleaz pozitiv cu grsimea i valoarea energetic; de asemenea,

coreleaz negativ cu Ph-ul, umiditatea i proteina;

Cantitatea de protein coreleaz negativ cu cantitatea de substan uscat i cu

grsimea;

Grsimea coreleaz negativ cu umiditatea i cu proteina, i coreleaz pozitiv cu

substana uscat i cu valoarea energetic;

Azotul uor hidrolizabil coreleaz pozitiv doar cu Ph-ul;

Valoarea energetic coreleaz negativ cu umiditatea i pozitiv cu substana uscat i

grsimea.

4.2. Analiza de regresie

Pe baza corelaiilor analizate anterior am ncercat s stabilim un model de ecuaie de

regresie pentru a prezice anumite caracteristici organoleptice: grsimea, umiditatea i

valoarea energetic. Pentru fiecare dintre acestea am realizat o analiz de regresie multiliniar

simultan. Predictorii inclui n ecuaie au fost variabilele cu care variabila criteriu a corelat

semnificativ, pozitiv sau negativ.

a.Predicia cantitii de grsime

n ceea ce privete analiza de regresie pentru care variabila criteriu a fost

grsimea, am introdus n ecuaie ca predictori umiditatea, substana uscat, proteina i

valoarea energetic. Valoarea testului ANOVA, F(3,46)=15,430 la p=.000, ne arat c

modelul rezultat n urma ecuaiei de regresie este semnificativ mai bun dect cel bazat pe

valorile mediilor. Coeficientul de determinare multipl obinut: R2=0,469 sugereaz c

aproape 50% din variana datelor poate fi explicat pe baza modelului de regresie.

n urma analizei de regresie multiliniar am obinut o serie de coeficieni de

regresie, care sunt prezentai n tabelul IV alturi de valoarea testului de semnificaie pentru

predictibilitatea variabilei criteriu. n urma studierii acestor rezultate putem spune c sunt

semnificative pentru prezicerea cantitii de grsime substana uscat i cantitatea de protein.

Acestea au un prag de semnificaie p

16

Tabel nr. IV

Coeficienii de regresie

Coeficienii

nestandardizai

Coeficienii

standardizai

B Std. Error Beta

t p

(Constanta) 20,021 19,434 1,030 ,308

umiditatea -,223 ,195 -,158 -1,142 ,259

substana uscat ,541 ,220 ,354 2,458 ,018

proteina -,648 ,174 -,408 -3,714 ,001

a. Variabila dependent: grsimea

b.Predicia umiditii

n acelai mod am procedat pentru a stabili o ecuaie de regresie pe baza creia

s prezicem umiditatea. i n acest caz modelul regresiei este semnificativ: F(4,45)=9,345 la

p=.000 i R2 ajustat=0,405. Din tabelul coeficienilor de regresie putem observa c doar

substana uscat are valoare predictiv semnificativ pentru umiditate. Desigur, coeficienii

fiind negativi, valoarea umiditii va fi cu att mai redus cu ct substana uscat are valori

mai ridicate. Tabel nr.IV

Coeficienii de regresie

Coeficienii

nestandardizai

Coeficienii

standardizai

B Std. Error Beta

t p

(Constant) 93,024 5,209 17,860 ,000

ficat ,002 ,007 ,044 ,361 ,719

substan uscat -,519 ,196 -,479 -2,648 ,011

grsime ,104 ,218 ,147 ,477 ,636

valoarea

energetic

-,024 ,026 -,341 -,942 ,351

a. variabila dependent: umiditatea

17

c.Predicia valorii energetice

i pentru predicia valorii energetice, modelul de regresie propus este

semnificativ: F(3,46)=153,439 la p=.000, iar coeficientul de determinare este R2 ajustat =

0,903. Din tabelul coeficienilor de regresie (Tabelul V) se poate observa c au valoare

predictiv pentru stabilirea valorii energetice: constanta, substana uscat i cantitatea de

grsime.

Tabel nr. V

Coeficienii de regresie

Coeficienii

nestandardizai

Coeficienii

standardizai

Model

B Std. Error Beta

t p

(Constant) 190,459 78,217 2,435 ,019

umiditate -,783 ,830 -,056 -,944 ,350

substana

uscat

3,745 ,988 ,248 3,791 ,000

grsime 7,469 ,547 ,754 13,661 ,000

a. variabila dependent: valoare energetic

n urma calculrii coeficienilor de corelaie i a realizrii analizelor de

regresie multipl, putem spune c dei exist corelaii semnificative ntre variabilele

msurate, nu toate au valoare predictiv semnificativ. n cele prezentate anterior am ncercat

s evideniem ce indici msurai n studiul realizat au valoare predictiv pentru anumite

caracteristici fizico-chimice.

Seria a II-a de determinri histopatologice

1 Examinarea histopatologic a ficatului

La nivelul tesutului hepatic au fost identificate la subiectii din lotul I urmatoarele

modificari: nuclei hepatocitari veziculosi, sinusoide largite, infiltrat limfoplasmocitar portal

redus. La lotul II, se remarca mici zone de poelioza hepatica, granuloame inflamatorii

intralobulare si un inceput de fibroza porto portala ( imag 1 A, B).La subiectii din lotul III se

adauga la aceste leziuni hepatita de interfata (Imaginea 1 C,D).Tesuturile provenite de la

18

subiectii din lotul IV prezinta leziuni de hepatosteatoza, mici depozite de glicogen, grupuri de

limfocite portal si intralobular, venule dilatate,nuclei cu forma neregulata si de dimensiuni

reduse.Intalnim de asemenea focare de necroza si necrobioza, hepatocite anucleate si chiar

proliferare de canalicule biliare (imaginea 1 -

E,F).

Imagine nr.1 Examinarea histopatologic a ficatului - A hepatit de interfa - infiltrat

limfocitar intralobular, coloraie Tricrom Masson. Obiectiv 2x 50%.

B Ficat- granulom inflamator intralobular - sinusoide lrgite - zone de pelioz coloraie

hematoxilin eozin, obiectiv 4x 50%

C Ficat - infiltrat limfo-plasmocitar venule dilatate, coloraie Tricrom Masson, obiectiv 2x

75%.

D Ficat - Fibroza, proliferare de neocanalicule biliare, coloraie Tricrom Masson obiectiv 4x

75%.

E Ficat - hepatit de interfa - pelioz - fibroz - coloraie Tricrom Masson obiectiv 2x 100%

19

F Ficat fibroza - leziuni epiteliale ale canaliculelor biliare infiltrat inflamator limfo-

plasmocitar, coloraie Tricrom Masson obiectiv 2x 100%

2 Examinarea histopatologic a intestinului subire

esutul intestinal prezint leziuni necrotice sau ulceraii superficiale la baza sacilor

cecali, i la nivelul intestinului gros. La subieci din lotul I s-a observat hiperplazia mucoasei

intestinale,uneori chiar cu aspect polipos, cu ax conjunctivo vascular, inflamaie mixt

limfoplasmocitar i granulocitar, disecant, (imaginea 2 A, B,C,D,E,F).

Imagine nr.2 Examinarea histopatologic a intestinului subire

A. Eroziuni superficiale - material inflamator necrotic n lumen - coloraie Tricrom Masson

ob 2x 100 %

B. inflamaie, fibroz hiperplazia mucoasei intestinale - coloraie Tricrom Masson, obiectiv

2x 100%

C. ulceraie, inflamatie - coloraie Tricrom Masson, obiectiv 2x 100 %

D. zone extinse de ulceraie i material inflamator-necrotic - coloraie T.M. ob 2x 100%

E. ulceraii extinse i necroze ale mucoasei intestinale- coloraie H.E. ob 2x 100%

20

F. Idem fig 15, obiectiv 4x 100%

3 Examinarea histopatologic a proventricolului

La nivelul bursei , se ramrca prezenta unei pelicule albicioase, a unor ulceratii

superficiale, a focarelor hemoragice sau necroticohemoragice (imaginea 3 A,B,C)

Imagine nr.4. Examinarea histopatologic a proventricolului

A. ulceratii superficiale- zone necrotico-hemoragice si inflamatorii proventriculita -

coloraie Tricrom Mason, obiectiv2x100%

B.eroziuni superficiale ale mucoasei si infiltrat inflamator mixt in lumen - coloraie

Tricrom Masson, Ob 2x 200%

4 Examinarea histopatologic a rinichiului

Leziunile esutului renal identificate se rezuma la necroze tubulare focale (Imaginile 5 A

i B).

Imagine nr.4 Examinarea histopatologic a rinichiului

21

A. hiperemie i necroze tubulare focale, coloraie Tricrom Masson ob 2x100%,

B. Idem imag 25 - detaliu col HE Ob 10x 100%

5. Examinarea histopatologic a estului muscular

Tesutul muscular striat prelevat din piept i pulpa provenit de la subieci n hrana

carora au fost introduse organisme modificate genetic, prezinta hipertrofia i fragmentarea

unor fibre musculare (Imaginea 5 A, B, C)

Imagine nr.5 A.Piept de pui- fibroz, hipertrofie muscular coloraie Tricrom Masson,

obiectiv 2x 100%

B.Muchi pulp fragmentarea fibrelor musculare, coloraie Tricrom Masson ob 2x 100%

C. Muchi- hipertrofie muscular, coloraie Tricrom Masson, obiectiv 4x 100%

Seria III de analize utiliznd tehnici de biologie molecular

Identificarea i cuantificarea genomului specific pentru soia modificat genetic din

probele analizate s-a facut utiliznd o adaptare a metodei oficiale pentru supraveghere i

control n domeniul siguranei alimentelor. Metoda de identificare a organismelor modificate

genetic se bazeaz pe izolarea i purificarea ADN, controlul integritii i puritii acizilor

22

nucleici extrai, urmnd ca prin reacia PCR s fie amplificate: un fragment al genei lectin

(Le 1) - specific soiei, promotorul 35S i terminatorul nos. Detecia promotorului 35S i a

terminatorului nos constituie metode de screening pentru identificarea plantelor modificate

genetic .n niciuna dintre probele analizate nu a fost identificat prezena secvenei 35S.

Imaginea nr 6 A Determinarea lectinei , migrare la 40 minute

B. Determinarea prezenei secvenei 35 S

1 proba pui hranit cu protein 25% soia conventionala

2 proba pui hranit cu protein 50% soia conventionala

3 proba pui hranit cu protein 75% soia conventionala

4,5 proba pui hranit cu protein 100% soia conventionala

6-10 proba pui hranit cu protein 100% modificata genetic

11 proba de control negativa 14 standard 5%

12 standard 1% 15 martor extractie

13 standard 2% 16 proba de control pozitiv

23

Capitolul V. Concluzii

Concluzii specifice

1. Analiznd, din punct de vedere organoleptic, probele de carne de la subiecii din

loturile studiate, am constatat c, toate determinrile se ncadreaz limite normale,

dei exist diferene ntre loturi.

2. Intoducerea hranei modificate genetic n alimentaia puilor de carne a dus la diferene

semnificative statistic n ceea ce priveste greutatea carcasei. Analiznd valorile

medii, se constat c greutatea cea mai mare se obine pentru grupul de control

(m=255,800; sd=29,28). Acesta este urmat, n ordinea descresctoare a mediilor de

grupul cruia i s-a administrat 25% soia MG, grupul cruia i s-a administrat 75% soia

MG, cea mai mic medie avnd-o grupul care a primit 50% soia MG (m=183,800;

sd=66,198).

3. Determinarea pH-ului, ca indicator de calitate, a relevat faptul c, toate determinrile

se ncadreaz n limitele aprobate prin Standardul Romn 7031 din ianuarie 2008

referitor la carnea de pasre n carcase, semicarcase i porionat, livrat n scopul

comercializrii. Valorile cele mai ridicate pentru pH au fost obinute de ctre

grupurile extreme: grupul de control (m=5,933; sd=0,021) i grupul care a primit

100% soia MG (m=5,932; sd=0,018). Valorile pH cele mai reduse au fost obinute de

subiecii din grupul care a primit 50% soia MG (m=5,865; sd=0,123).

4. La determinarea coninutului de ap, s-au obinut valori apropiate de cele indicate n

literatura de specialitate consultat. Valorile cele mai mici s-au obinut pentru grupul

cruia i s-a administrat soia modificat genetic n proporie de 25% (m=72,432;

sd=0,523). Diferenele constatate ntre mediile grupurilor incluse n studiu sunt

semnifcative statistic, dup cum arat rezultatele testului de inferen Kruskal Wallis:

2(4)=17,143 la p=.002.

5. Analiznd valorile obinute, putem aprecia c nu exist diferene n ceea ce priveste

coninutul n substan uscat pentru loturile luate n studiu, toate valorile

determinate fiind intre limtele stabilite de standardele n vigoare. Cele mai mici valori

au fost obinute pentru carnea provenit de la subiecii din lotul martor a crui hran

24

a coninut doar protein din rot de soia convenional. Valorile cele mai mari au fost

obinute la subiecii din lotul IV, n a crui hran a fost introdus n att protein din

rot de soia convenional n procent de 75% ct i din soia modificat genetic n

procent de 25%. Prelucrrile infereniale evideniaz diferene semnificative statistic:

2(4)=19,769 la p=.001.

6. Apreciind valorile obinute pentru coninutul n proteine s-a observat c cele mai mici

valori au fost obinute pentru carnea provenit de la subiecii din lotul I n a carui

hrana a fost doar protein din rot de soia modificat genetic. Valorile cele mai mari

au fost obinute la subiecii din lotul martor. n cazul coninutului n protein,

administrarea rotului de soia n proporii diferte a avut un impact semnificativ.

Astfel, n urma prelucrrilor infereniale s-a obinut: 2(4)=9,893 la p=.042

7. Valorile determinate pentru parametrul grsime, cuprinse ntre 5,63 %-6,63%, au fost

apropiate de cele minime indicate n literatura de specialitate consultat. Cele mai

mici valori au fost obinute pentru carnea provenit de la subiecii din lotul martor a

crui hran a coninut doar protein din rot de soia convenional.Valorile cele mai

mari au fost obinute la subiecii din loturile II;III i IV, n a cror hrana a fost

introdus att protein din rot de soia convenional ct i din soia modificat

genetic. n urma testrii semnificativitii diferenelor, putem spune c avem diferene

semnificative statistic la un prag p

25

comparativ cu lotul I au fost obinute pentru subiecii din lotul martor pentru urmtorii

aminoacizi: lizin, metionin, glicin i serin.

10. Histopatologic se constata leziuni minime la nivelul ficatului, intestinului, a

pancreasului, rinichilor si a esutului muscular striat chiar i la subiecii provenii din

lotul cu protein din soia MG n procent de 25%.

11. esutul hepatic prelevat de la subieci n hrana crora s-a introdus proteina MG,

prezint leziuni de fibroza, pelioza, necroz, hepatosteatoz, proliferare de canalicule

biliare, modificri identificate n stadiu incipient sau avansat fr a se putea stabili o

corelaie ntre procentul de protein modificat din raie i gravitatea leziunii

identificate.

12. La nivelul bursei prelevate de la subieci n hrana crora s-a introdus proteina MG se

remarc prezena unei pelicule albicioase, a unor ulceraii superficiale i a focarelor

hemoragice.Nici la acest nivel nu s-a putut stabili o corelaie ntre procentul de

protein neconvenional i gravitatea modificrilor histopatologice.

13. La subiecii din lotul cu proteina MG 100%, s-a observat hiperplazia mucoasei

intestinale, uneori chiar cu aspect polipos, cu ax conjunctivo vascular, inflamaie

mixt limfoplasmocitar i granulocitar, disecant.

14. esutul muscular striat prelevat din piept i pulp provenit de la subieci n hrana

crora au fost introduse organisme modificate genetic , prezint hipertrofia i

fragmentarea unor fibre musculare.

15. Diferitele tipuri de leziuni inflamatorii ntlnite n studiul nostru ar putea fi datorate i

altor cauze suprapuse (parazitare, virale, toxice) dar prezena acestora n exclusivitate

la subiecii hrnii cu organisme modificate genetic ridic serioase semne de ntrebare

cu privire la utilizarea acestora n furajare.

16. Comparnd metodele analitice utilizate pentru detectarea materialului modificat

genetic, pentru matricea carne de pui, a fost selectat ca fiind cea mai fiabil, tehnic

PCR

17. n cazul matricei care face obiectul studiului, conform datelor din literatura de

specialitate, la eantionare s-au folosit att probe medii (pentru loturile martor; II, III,

i IV) ct i probe individuale - pentru lotul I.

18. n etapa de pregtire a probelor pentru analiz se impune reducerea riscului de

nclzire prin umectarea eantioanelor pentru facilitarea procesului de extracie i

pentru prevenirea activrii DNazelor.

26

19. Ca urmare a cuantificrii spectrofotometrice, a evalurii strii de fragmentare a

moleculelor de ADN i a confirmrii absenei substanelor inhibitoare , metoda de

extracie utilizat s-a dovedit a fi eficient.

20. Identificarea genei lectin n toate eantioanele analizate confirm faptul c metoda de

extracie s-a dovedit eficient i s-a verificat capacitatea acesteia de a recupera o

cantitate suficient de ADN amplificabil i de a elimina substanele inhibitoare.

21. n niciuna dintre probe nu a fost identificat secvena 35s, marker al evenimentului

modificat genetic.

Concluzii generale

1. Abordarea cea mai pertinent pentru aprecierea riscurilor pentru starea de sntate

generate de organismele modificate genetic, este aceea a fiecrui eveniment n parte.

2. Determinrile fizico-chimice au identificat diferene semnificative statistic ntre

subiecii din cele cinci loturi luate n studiu, dar toi parametrii se ncadreaz n

valorile normale pentru puii broiler.

3. Modificrile histopatologice identificate la nivelul esutului hepatic, a intestinului

subire, proventricolului i esutului muscular nu pot fi atribuite n totalitate efectelor

furajelor MG n absena unor studii chimice i toxicologice ale boabelor de soia MG.

4. Prin tehnicile de biologie molecular folosite nu au fost identificai primerii specifici

secvenei modificate genetic ai soiei GTS 40-3-2, ceea ce infirm ipoteza transmiterii

pe orizontal a modificrii genetice din hran la consumator.

5. Utilizarea OMG-urilor n obinerea produselor alimentare, ca n cazul oricrei alte

tehnologii, prezint o serie de avantaje, dar poate genera i riscuri pentru mediu i

sntate, de aceea trebuie acionat n sensul identificrii i eliminrii riscurilor pentru

ndeplinirea celor dou deziderate principale ale Organizaiei Mondiale a Sntii

privind alimentaia: securitatea i sigurana.

6. Nivelul actual de apreciere a riscurilor, care pornete de la conceptual echivalenei

substaniale, pare s nu acopere toate riscurile pentru sntate, fiind necesare studii

suplimentare.

27

Semnificaia teoretic a lucrrii. Valoarea practic

Studiul se alatur cercetarilor n plan internaional privind efectele alimentelor

modificate genetic i potenialul efect asupra sntii umane, avnd n vedere ponderea pe

care carnea de pui o ocup n dieta omului contemporan. n plan naional, gradul de noutate

este dat de analizarea pentru prima dat ntr-un laborator de biologie molecular a unei

matrici reprezentate de carne de pui, pn n prezent fiind analizate doar matrici de origine

non animal, fie ele materii prime sau produse alimentare procesate. n consecin, cercetrile

efectuate n cadrul tezei de doctorat au fost orientate n direcia dezvoltrii de metode de

identificare a OMG-urilor n alimente de origine animal

Contribuiile originale, care sunt evideniate n teza de doctorat constituie elementul

de baz n realizarea unor obiective poteniale referitoare la optimizarea managementului

riscurilor privind sntatea public pe care le prezint alimentele coninnd organisme

modificate genetic.

De asemenea, lucrarea a sintetizat datele publicate n literatura de specialitate

prelucnd informaiile prin prisma specialistului n igiena alimentaiei i implicit n sntate

public, abordare mai puin ntlnit n plan naional. Din acest punct de vedere, studiul poate

reprezenta un instrument de lucru util att medicilor din asistena medical primar mai puin

familiarizai cu problematica organismelor modificate genetic dar care sunt prima instan de

informare pentru pacieni dar i medicilor din structurile de sntate public.