1

Raport stiintific

Proiect : 137/2014 (CTC-Videoscope) Codu proiect: PN-II-PT-PCCA-2013-4-2289 Faza Proiect : 1

Perioada raportare : 01.07.2014 – 31.12.2014

Responsabil proiect : Dr Rares Potcoava BUIGA

Cuprins :

1. Rezumat proiect

2. Activitate I.1 Elaborare protocoale si documente generale

3. Activitate I.2 Elaborare protocoale de realizare a culturilor celulare si probelor de sange

4. Activitate I.3 Elaborare lista specificatii model experimental

5. Activitate I.4 Elaborarea metodologiei de proiectare si testare a sistemului informatic

6. Activitate I.5 Elaborare metodologie de testare si validare a performantelor modelului experimental

7. Activitate I.6 Realizarea site-ului web

8. Activitate I.7 Realizarea dispozitivului simplificat pt. imagini statice

9. Activitate I.8 Realizarea si crioconsevarea culturilor celulare

10. Activitate I.9 Obtinerea primelor imagini statice cu ajutorul dispozitivului

11. Activitate I.10 Proiectarea si implementarea sistemului informatic pentru procesarea imaginilor statice

12. ANEXE*

*Din cauza spatiului limitat anexele se vor posta pe site-ul proiectului http://ctcvideoscope.utcluj.ro

2

1.Rezumat proiect

Acest raport isi propune sa trateze urmatoarele activitati prevazute pentru prima faza a proiectului si

anume:

A I.1 Elaborare protocoale si documente generale

A I.2 Elaborare protocoale de realizare a culturilor celulare si probelor de sange

A I.3 Elaborare lista specificatii model experimental

A I.4 Elaborarea metodologiei de proiectare si testare a sistemului informatic

A I.5 Elaborare metodologie de testare si validare a performantelor modelului experimental

A I.6 Realizarea site-ului web

A I.7 Realizarea dispozitivului simplificat pt. imagini statice

A I.8 Realizarea si crioconsevarea culturilor celulare

A I.9 Obtinerea primelor imagini statice cu ajutorul dispozitivului

A I.10 Proiectarea si implementarea sistemului informatic pentru procesarea imaginilor statice

A I.4 Lista de specificaţii pentru metodologia de dezvoltare a sistemului informatic

A I.6 Site web

A I.10 Varianta intermediara a sistemului informatic de procesare a imaginilor statice;

Algoritmi de segmentare CTC.

Continutul raportului este prezentat intr-o ordine logica, iar activitatile prevazute sunt descrise in

urmatoarele sectiuni: activitatea I.1 Elaborare protocoale si documente generale in sectiunea 2, activitate I.2

Elaborare protocoale de realizare a culturilor celulare si probelor de sange in sectiunea 3, activitate I.3 Elaborare

lista specificatii model experimental in sectiunea 4, activitate I.4 Elaborarea metodologiei de proiectare si testare

a sistemului informatic in sectiunea 5, activitate I.5 Elaborare metodologie de testare si validare a performantelor

modelului experimental in sectiunea 6, activitate I.6 Realizarea site-ului web in sectiunea 7, activitate I.7

Realizarea dispozitivului simplificat pt. imagini statice in sectiunea 8, activitate I.8 Realizarea si crioconsevarea

culturilor celulare in sectiunea 9, activitate I.9 Obtinerea primelor imagini statice cu ajutorul dispozitivului in

sectiunea 10, iar activitatea I.10 Proiectarea si implementarea sistemului informatic pentru procesarea imaginilor

statice in sectiunea 11.

2. Activitate I.1 Elaborare protocoale si documente generale

Pentru buna desfasurare a proiectului s-au elaborat urmatoarele protocoale si documente, luand ca model

documente similare folosite in activitatea curenta de Universitatea de Medicina si Farmacie Iuliu Hatieganu,

(UMF) Cluj, astfel : -Protocol pentru aprobarea Comisiei de etică a UMF;-Protocol pentru recoltarea de sânge de

la voluntari; Forma finala a acestor documente, vizibila in Anexele 1-3 a fost discutata cu membrii Comisiei de

Etica a UMF care au solicitat in plus fata de documentele mentionate in planul de lucru urmatoarele formulare :

Formular de consimţământ informat ; Consimţământ informat ; Protocol de desfasurare al proiectului ; Aviz

Comisie de etica.

3. Activitatea I.2 Elaborare protocoale de realizare a culturilor celulare si probelor de sange

In vederea realizarii culturilor celulare s-au elaborat o serie de protocoale dupa care s-a lucrat efectiv in cadrul

Acrivitatii I.8 si respectiv Acrivitatii I.9 (rugam vedeti sectiunile 9. si 10. corespunzatoare acestor activitati, unde

sunt descrise si protocoalele de lucru).

4.Activitate I.3 Elaborare lista specificatii model experimental

4.1 Specificatii pentru dispozitivul simplificat:

3

Proiectul va trebui sa rezolve problemele de circulatie microfluidica a celulelor vii in conditii de mediu si

temperatura controlata si in acelasi timp sa permita preluarea si prelucrarea de imagini microscopice focalizate.

Mai jos se contureaza cateva solutii preconizate de noi pentru dispozitivul simplificat si modelul experimental.

Dimensiunile camerei de cultură, inclusiv dimensiunea totală sunt importante. Adâncimea camerei de cultura

trebuie minimizată pentru a asigura cea mai bună calitate optică pentru lumina transmisă si accesibilitatea la

celule, dar aceasta trebuie să fie, de asemenea, suficient de adânca pentru a asigura un mediu sănătos. Lamele din

plastic ar trebui să fie evitate datorită autofluorescentei lor inerente si birefringentei, care interfera cu anumite

moduri de formare a imaginii. Numai lamele de sticlă de calitate mai buna ar trebui să fie folosite, iar acestea ar

trebui să fie curătate cu un acid tare sau o bază si bine spălate. Camerele de cultura comerciale variază în

fiabilitate, versatilitate, si cost. Acesti factori trebuie să fie luati în considerare la proiectarea experimentelor. În

analiza finală, trebuie recunoscut faptul că nu există o camera de cultura perfecta pentru toate scopurile si sunt

adesea necesare multe compromisuri pentru a atinge succesul in imagini de celule vii.

Camerele de imagistica dezvoltate pe parcursul anilor 1970 si 1980 s-au bazat pe un design standard, care implică

suprapunerea a două lamele, separate de o pereche de cauciuc inelar sau distantiere similare, într-un suport format

din două plăci de metal. Aceasta solutie care suferă o serie de dezavantaje, inclusiv incapacitatea de a schimba

mediul de cultură sau de a adăuga cantitati măsurate de medicamente sau metaboliti, s-a utilizat multi ani.

Camerele de perfuzie mai avansate au fost construite în cele din urmă, prin modificarea acestui model de bază,

pentru a permite adăugarea continuă de mediu de cultură proaspăt si adăugarea intermitentă a altor reactivi.

Dezavantajul major al multora dintre aceste modele a fost lipsa de atentie la curgere laminară, un proces în care

formarea gradientilor chimici este minimizată printr-o tranzitie lină cand mediul este înlocuit. Fluxul laminar

asigură că două solutii nu se amesteca cu turbulentă în timpul procesului de înlocuire, astfel încât să se evite

generarea de gradienti chimici. Dezvoltarea continuă a ambelor camere simple si complexe de imagistica în

ultimii ani a dus la modele excelente care se potrivesc cu cerintele celor mai multe scenarii imagistice.

Cerinte ale sistemului preconizat: Modelul experimental trebuie sa permita curgerea unui flux sanguin laminar cu

viteza reglabila uniforma intr-o camera de imagistica si sa permita extragerea de esantioane (prin devierea

fluxului) ca urmare a analizei imaginii microscopice in timp real.

Pentru realizarea sistemului se va incerca utilizarea unor componente comercial accesibile oriunde acesta este

posibil.

Pentru realizarea camerei de imagistica propunem utilizarea de microslide-uri elaborate pentru studiul celulelor

vii. Firma IBIDI are o oferta de slide-uri foarte variate, adaptate diverselor domenii de cercetare (anexa1).

Dintre acestea am ales: uSLIDE VI 0,1 hydrophobic, uncoated, sterile cod 80661.

2. Conexiuni : S-a ales tube adapter set cod 10831

Pentru pompare IBIDI recomanda utilizarea sistemului de pompare propriu (vezi anexa 2), dar pretul acestui

sistem este prohibitiv pentru prezentul proiect.

Pompele peristaltice nu se pot utiliza, avand in vedere presiunea exercitata asupra celulelor vii.

In cele din urma pentru miscarea fluidului de proba s-au conturat 2 solutii care se vor aplica in 2 faze succesive ale

proiectului:

1. un sistem de miscare alternativa a doua rezervoare (de conceptie si realizare proprie), intr-un sistem de

vase comunicante, care permite deplasarea fluidului de proba si oprirea pentru inregistrarea imaginilor.

Acest sistem se va utiliza in faza de dispozitiv simplificat, in care se reutilizeaza fluidul de proba pentru

achizitionarea de imagini microscopice multiple.

2. un sistem bazat pe pompa de infuzie Fresenius Pilot A2(v.anexa 3 si 4), utilizat in faza de model

experimental, in care fluidul de test este trecut dintr-un rezervor in celalalt printr-o trecere. Aceasta pompa

se poate conecta la calculator, permitand corelarea cu software-ul de achizitie a imaginilor microscopice.

Specificatiile pentru dispozitivul simplificat mai includ urmatoarele elemente :

Sistemul se compune din doua rezervoare fixate pe o curea dintata, un motor pas cu pas, partea de comanda forta

si un PLC care permite programarea unor regimuri de lucru diverse.

Diferenta de nivel intre cele 2 rezervoare este programabila intre 0~+/-20cm, ceea ce corespunde cu o presiune

hidrostatica de 0~+/-20mbar. Rezolutia la deplasarea rezervoarelor este de 0.3mm (0.03cm) adica 0.03mbar.

4

Conectarea rezervoarelor cu microslide-urile de sub microscop se face cu tub Tygon 3350 silicone 1/16x1/8.

Tuburile sunt prevazute la capete cu conectori speciali de tip luer pentru microslide-uri. Dimensiunea canalului

din microslide-uri s-a ales de 1mm x 0.1mm, avand in vedere campul de vizualizare al microscopului si

dimensiunile celulelor vizualizate in asa fel incat sa se pastreze focalizarea microscopului.

In prima faza pentru software-ul de recunoasterea a celulelor CTC se vor achizitiona imagini statice atat pentru

hematii, leucocite cat si pentru celule CTC.

4.2 Specificatii pentru modelul experimental

In faza de model experimental se prevede trecerea sangelui de analizat prin campul unui microscop cu camera

video si in urma analizei efectuate cu ajutorul unui software se ia decizia de separare a celulelor CTC (impreuna

cu o mica cantitate de sange) intr-un rezervor separat iar restul sangelui se colecteaza intr-un alt rezervor.

Sistemul se compune dintr-un rezervor sursa, o pompa de perfuzie programabila de la calculator, tubulatura si

microslide-uri pentru circulatia sangelui, un microscop performant cu camera pentru achizitia formei celulelor, un

ventil comutator comandat prin calculator pentru separarea esantioanelor cu CTC fata de cele normale, si doua

rezervoare pentru sange normal si sange cu CTC.

Intregul proces trebuie sa se desfasoare in conditii sterile microbiologic.

Sistemul trebuie sa aiba o metoda de eliminare automata a bulelor de aer. Sangele trebuie sa curga la o viteza

redusa, precis controlabila. Sangele trebuie sa curga in strat subtire, rectiliniu uniform, in asa fel incat celulele sa-

si pastreze tot timpul pozitia lor relativa in coloana de lichid. Toate celulele ce trec prin aparat trebuie sa fie

analizate. Analiza nu trebuie sa necesite coloratii sau alte marcari specifice ale CTC sau ale sangelui. Analiza si

decizia trebuie sa fie in timp real. Sistemul trebuie sa salveze in memorie imaginile semnificative (adica cele care

contin CTC recoltate sau orice obiect “neidentificat”. CTC trebuie sa fie extrase fizic din fluxul de sange. CTC

extrase trebuie sa fie pastrate in bune conditii pana la prelucrarea lor ulterioara. Aparatul trebuie sa masoare si sa

inregistreze continuu: viteza de curgere a sangelui, cantitatea totala de sange analizat, timpul de analiza, ora

terminarii analizei, temperatura.

Sistemul trebuie sa genereze alarme in cazul coagularii sangelui, blocajul fluxului sanguin, scapari (depresurizare/

desterilizare), preaplin in recipientul de colectare, viteza prea mica sau prea mare de curgere a sangelui.

Deplasarea lichidului in modelul experimental se va face cu o pompa de perfuzie Fresenius Pilot 2, tubulatura de

legatura, microslide VI VI 0,1 hydrophobic, uncoated, sterile cod 80661, un rezervor (tip siringa luer) sursa si un

rezervor de acumulare la iesirea din sistemul simplificat. Manualul de operare este prezentat in anexa 3. Pompa se

va conecta la un calculator tip PC prin interfata seriala RS-232 si se va sincroniza actionarea pompei cu

achizitionarea imaginilor microscopice si actionarea ventilului comutator printr-un software rezident pe

PC.Protocolul de comunicatie pentru pompa Fresenius Pilot 2 se prezinta in anexa 4. Pentru ventilul de comutare

se va utiliza un ventil tip “pinch” de tip comutator (o linie normal inchisa si o linie normal deschisa), un astfel de

ventil fiind prezentat in anexa 5.

Software-ul instalat pe calculator trebuie sa actioneze pompa, sa faca legatura cu procesul de recunoastere a

imaginilor achizitionate, sa actioneze ventilul de separare, sa masoare parametri procesului (ca temperatura, timpi

de lucru, etc.) si sa stocheze imaginile semnificativa impreuna cu stampila de timp. De asemenea alarmele posibile

se vor semnaliza si inregistra in memorie.

5.Activitate I.4 Elaborarea metodologiei de proiectare si testare a sistemului informatic

5.1.Metodologia de dezvoltare a sistemului informatic

Se doreste realizarea unui sistem complex pentru detectarea CTC-urilor. Acest sistem va fi proiectat modular,

putând fi integrate ulterior în el diferite metode şi algoritmi de extragere de trăsături, alţi algoritmi de segmentare

şi de asemenea sa poata fi adaptat şi la alte tipuri de imagini sau cerinţe.

Pentru detecţia CTC-urilor, sistemul va necesita o prima faza de invatare, in care se implementeaza si valideaza

algoritmi de extragere de trăsături. Pe baza trasaturilor extrase, se vor construi modele imagistice pentru fiecare

tip de celula sangvina in parte. Construirea modelelor imagistice se face offline, si necesita un set special de

5

imagini care sa contina un numar consistent de celule din fiecare categorie (eritrocite, leucocite, trombocite si

CTC de diferite proveniente). Ulterior, pe baza modelelor imagistice se va putea efectua segmentarea si clasifiarea

CTC-urilor online in imagini atat statice cat si dinamice.

Schema bloc a sistemului informatic:

Schema bloc a sistemului informatic este prezentata in Fig. 1 si 2 si contine cele doua faze amintite anterior: 1.

procesarea offline, care are ca si scop identificarea de trasaturi caracteristice discriminatorii celulelor sangvine

care vor contribui la crearea modelelor imagistice; si 2. procesarea online a imaginilor statice folosind modelele

create si validate in faza offline.

Figure 5.1 Procesarea offline a imaginilor : crearea de modele imagistice ale celulelor sangvine + CTC

.

Figure 5.2 Procesarea online a imaginilor statice : identificarea celulelor CTC.

5.2 Lista de specificaţii pentru metodologia de dezvoltare a sistemului informatic (S.I.)

- Date intrare:

o Pentru faza offline:

imagini microscopice statice / pe categorii separate de celule (eritrocite, leucocite,

trombocite si CTC de diferite proveniente) achizitionae in mod independent (lama /

incinta)

imagini microscopice statice (cu sange sanatos la diverse garde de dilutie + CTC de

diferite proveniente) (lama / incinta)

o Pentru faza online

Secvente de imagini imagini statice (cu sange sanatos + CTC)

Secvente de imagini dinamice (in flux)

o Imaginile vor fi achizitionate urmand protocolul de achizitionare a imaginilor descris de UMF si

vor trebui sa respecte urmatoarele cerinte minimale de calitate:

modalitate de achizitie (setari microscop / sistem de achizitie) standardizate conform

protocolului de achizitie

Imagini

statice Segmentare

imagini

Clasificarea celulelor

pe baza modelelor

imagistice

Coordonatele

si nr .celulelor

CTC

Date intrare:

Date iesire:

Imagini microscopice

cu diferite categorii

de celule

Extragerea de

trăsături

discriminatorii

Validarea trasaturilor prin

antrenarea de clasificatori si

maximizarea performantei

acestora

Selectie de

trăsăturilor

Crearea de modele

imagistice pentru

fiecare tip de celula

Cell

segmentation

Etichetarea

celulelor

Date intrare:

Date iesire:

6

protocolul de achizitie se va optimiza in urma experimentarii sistemului de achizitie si a

algoritmilor de procesare de imagini.

rezolutie minima imagini: 1.4 MP

factor de magnificare minim: 40x

coloratie/iluminare/contrast/focalizare standardizate (pt. toate tipurile de imagini)

efecte de voalare de miscare minime la secventele de imagini

regiunile din imagine continand celule de interes (CTC) vor fi fara ocluzii datoarte altor

componente sanguine.

- Date iesire:

o coordonatele celulelor CTC in imagine

o numarul de celule CTC / cadru (imagine);

- Specificatiile sistemului informatic (SI)

o Conditii de rulare in timp real, corespunzand timpului de achizitie dintre doua cadre consecutive;

o S.I. ofera unelte de calcul si extragere de trasaturi relevante care sa descrie caracteristicile

discriminatorii ale CTC-urilor (precum contur slab definit si neregulat, textura etc), pe baza carora

sa se poata construi modele imagistice;

o S.I. trebuie sa permita o segmentarea robusta a celulelor mari din sange (CTC + leucocite);

o S.I. dispune de unelte pentru antrenarea de clasificatori pentru clasificarea celulelor sangvine si

identificarea CTC-urilor segmentate ca in pasul anterior;

o S.I. este testat pe un set larg de date continand diverse tipuri de imagini, atat offline, cat si online,

fiind validat prin compararea rezultatelor cu un standard de aur prestabilit impreuna cu colectivul

medical.

6.Activitate I.5 Elaborare metodologie de testare si validare a performantelor modelului experimental

Testarea şi validarea randamentului identificării şi separării CTC din sânge îmbogăţit artificial cu CTC se

va efectua prin experimente simple de imbogatire a sangelui de la donatori sanatosi cu un numar cunoscute de

celle tumorale disociate din culturi celulare de cancer colorectal, de san si prostatic dupa metodologia descrisa in

Sectiunea 9 (ActivitateaI.8).

Performanta sistemului se va stabili in functie de procentul de celule tumorale separate efectiv de

dispozitivul nostru, comparativ cu numarul cunoscut de celule insamantat la inceputul experimentului. Pentru mai

multa siguranta celulele “ratate” de sistemul experimental vor fi puse in evidenta si numarate la microscop in

sangele efluat printr-o metoda de colorare fluorescenta similara celei descrise la Activitatea I.9 (sectiunea10).

Experimente similare vor fi derulate folosind de data aceasta sânge metastatic natural prin comparare cu

performanţele metodelor clasice de identificare CellSearch (Veridex) si Screencell. Numarul si amploarea

experimentelor se vor stabili in functie de bugetul disponibil.

Se va avea testa de asemenea gradul de prezervare al CTC izolate prin demonstrarea fezabilităţii tehnicilor

de IHC, ISH, Biologie moleculară prin realizarea de tehnici de colorare extracţie de ADN si ARN şi secvenţiere si

rt-PCR, insistându-se pe realizarea tehnicilor de biologie moleculară.

Tinand cont de incertitudinile legate de solutia tehnica care va fi aleasa in urma experimentelor ce se afla

inca in derulare in acest moment, precum si de incertitudinile legate de costurile implicate de construirea

dispozitivului, care vor greva bugetul Etapei a 2-a si respectiv a 3-a (anii 2015 si 2016) elaborarea in detaliu a

metodologiei de testare şi validare a performanţelor modelului experimental se va efectua la inceputul Activitatii

II.5.

7.Activitate I.6 Realizarea site-ului web

S-a proiectat si implementat un site web al prouiectului la adresa: http://ctcvideoscope.utcluj.ro.

Acesta contine pagini multiple pentru: descrierea proiectului; descrierea consortiului implicat in proiect; echipa

componenta pentru fiecare partener; obiectivele proiectului; planul de lucru impartini pe ani si activitati;

diseminarea rezultatelor; si date de contact pentru mentenenta site-ului.

7

Prin intermediul acestui site, rezultatele obtinute in intermediul acestui proiect vor fi facute publice, pentru o

ransparenta si vizibilitate marita, atat in tara, cat si in strainatate.

8.Activitate I.7 Realizarea dispozitivului simplificat pt. imagini statice

Dispozitiv simplificat pentru imagini statice :Dispozitivul se compune dintrun PLC, un motor pas cu pas si

driverul electronic pentru el, partea mecanica si o curea cu dinti pentru deplasarea probelor, precum si dispozitivul

de prindere a rezervoarelor (v.fig.1). De asemenea se utilizeaza o sursa de perete pentru alimentarea cu energie a

dispozitivului.

Fig.8.1

Functia principala a dispozitivului este asigurarea deplasarii lichidului de proba in microslide-uri, astfel ca proba

de sange sa nu adere de peretii tubulaturii si a microslide-ului. Pentru aceasta presiunea lichidului si timpii de

miscare si stationare se pot programa la nivelul PLC (v.fig.2)

Fig.8.2

La conectarea tensiunii se va avea grija ca nivelul lichidului in cele 2 rezervoare sa fie egal. Cu butoanele 5 si 4 se

creaza diferenta de presiune dorita (decalajul dorit). Se apasa butonul 3 care schimba afisajul in TD=0. Cu

butoanele 4 si 5 se stabileste durata in secunde a timpului de mentinere in pozitie decalata a rezervoarelor. Se

1 2 3 4 5

8

apasa inca odata butonul 3 care schimba afisajul in TS=0; Cu butoanele 4 si 5 se stabileste durata in secunde a

timpului de mentinere in pozitie stationara a rezervoarelor. Mentionam ca pozitia decalata corespunde cu starea de

curgere a probelor , iar pozitia stationara cu timpul de stationare, respectiv timpul de analiza. Daca valorile sunt

introduse se apasa butonul 1 care trece dispozitivul in modul de functionare automat care consta in urmatoarele

etape: miscare in dreapta (rezervorul drept sus, rezervorul stang jos), mentinere in aceasta pozitie un timp TD,

miscare in stanga cu amplitudine egala cu cea din dreapta pentru a reveni la pozitia de echilibru a lichidului,

mentinerea in aceasta pozitie un timp TD, dupa care se revine la pozitia zero si se mentin rezervoarele un timp TS.

Ciclul se reia automat.

Schema de principiu

Schema de principiu electrica este prezentata in fig. 8.3.

.

Fig 8..3

Software inclus in PLC : (Listing-ul al programului informatic este prezent in Anexa, deoarece se desfasoara pe 7

pagini, depasind cu mult spatiul alocat raportului ).

9. Activitatea I.8 Realizarea si crioconsevarea culturilor celulare

Pentru realizarea si crioconservarea culturilor celulare s-au folosit linii celulare tumorale stabilizate existente in

depozitele frigorifice ale laboratorului, utilizand urmatoarele protocoale:

1. Dezgheţarea celulelor

Dezghetarea celulelor este necesar sa fie efectuată în timp cât mai scurt ( 2-3 min) pentru a pastra intacta

viabilitatea celulelor.

- Se pregăteşte într-un tub steril 6 ml mediu de cultură in functie de specificul celulelor ce urmeaza sa

fie cultivate, incalzit la temperatura de 37°C.

- Se scoate criotubul cu celule din congelator (-80°C) sau azot lichid(-197°C) şi se ţine în mână până se

desprinde blocul de gheaţă de peretele criotubului.

- Se toarnă conţinutul criotubului în eprubeta cu mediu (se observă topirea instantanee a blocului de

gheaţă).

- Se centrifughează tubul 5 min la 1000 rpm, la 20 °C.

- Se aruncă supernatantul şi se resuspendă sedimentul celular într-o cantitate cunoscută de mediu (ex. 1

sau 2 ml), după care se numără la microscop vcu un hemocitometru Thoma sau Burker.

+ C9100uF

U11

DRV8825

1

2

3

4

5 12

6

7

9

10

11

13

14

15

16

8

VMOT

GND

B2

B1

A1 RSTN

A2

FLTN

DIR

STEP

SLPN

M2

M1

M0

ENN

GNDX

MG1

MOTOR STEPPER

1234

DIR

Ansamblu pompa

A

1 1Wednesday , Nov ember 05, 2014

Title

Size Document Number Rev

Date: Sheet of

230Vca/12Vcc

PAS

+5Vcc

GND

+ C810000uF

9

- Se insamnteaza celulele in 7 ml de mediu complet (care contine de obicei 10% ser fetal bovin-Fetal

Calf Serum, 1% antibiotic si 2mM L-glutamina), in flacoane Cole de 25cm2 si se incubeaza in

atmosfera umidifiata cu 5% CO2, la 37°C. La initierea unei culturi se adauga in plus inca 10% ser fetal

bovin. Mediile folosite sunt uzuale cum sunt DMEM, RPMI, MEM.

2. Urmărirea în timp a evoluţiei culturilor celulare

În zilele următoare dezghetarii celulelor se urmareste aderarea completă şi cresterea celulelor

(multiplicarea) , iar în momentul în care ele ajung la confluenţă se face pasajul lor. Urmarirea se efectueaza zilnic

la un microscop optic in faza inversata.

3. Pasajul celulelor

- Se aruncă mediul vechi şi se spala celulele aderate de 3X cu PBS.

- Se adaugă 0.5-1 ml de tripsină 0.25% cu EDTA (Sigma) care va determina desprinderea celulelor de

la suprafata flascului. Se incubeaza timp de 5 min la incubator la 37°C. Se urmăreşte la microscopul

cu fază inversată desprinderea celulelor de pe flacon.

- Se opreşte efectul tripsinei prin adăugare de mediu proaspăt ce contine 10% ser fetal.

- Se centrifughează 5 minute la 1000 rpm.

- Se aruncă supernatantul, se resuspendă sedimentul cu celule în 1 ml mediu şi se numără celulele.

- Se pune în cultură concentratia dorita de celule, restul se foloseşte în funcţie de scopul urmărit, pentru

experienţe, ori se congelează.

4. Congelarea celulelor

Ingheţarea celulelor se poate efectua în momentul pasajelor. După obţinerea suspensiei celulare după

tripsinizare, o parte din celule sunt resuspendate în 1.5-1.8 ml mediu de îngheţare: mediul complet în care au fost

cultivate celulele cu o concentratie crescuta de ser fetal (intre 60%pana la 90%) la care se adauga 10% DMSO.

Celulele suspendate in mediul de îngheţare (de obicei se ingheata intre 5x105 si 1x106 celule/ criotub) sunt apoi

transferate în criotuburi si plasate în dispozitivul Mr.Frosty, unde vor fi supuse unei îngheţări treptate de 10 C/ min

în congelatorul de -800C. A doua zi criotuburile vor fi imersate în azot lichid.

10. Activitate I.9 Obtinerea primelor imagini statice cu ajutorul dispozitivului

10.1 Vizualizarea celulelor tumorale in contact cu celulele din sangele integral

In vederea achizitiei de imagini s-a folosit o linie de celule tumorale de colon, Colo-320 , adaugate in sange

normal, obtinut de la donator anonim.

Pentru evidentierea celulelor Colo-320, acestea au fost markate cu un marker de membrana viabil PKH26.

Celulele Colo-322 au fost cultivate in mediu RPMI 1640 suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FCS), 1% antibiotic

(penicilina + streptomicina) +2mM L-glutamina. Aceste celule sunt in suspensie, deci pasajele nu au necesitat

tripsinizarea.

Marcarea fluorescenta cu PKH 26. Celulele tumorale Colo 322 au fost marcate fluorescent folosind un kit PKH

26 (Sigma), un colorant membranar ce nu influenteaza viabilitatea celulelor si care pastreaza fluorescenta

celulelor pentru o perioada mai lunga de timp. Celulele tumorale in suspensie au fost cemtrifugate la 1000 rpm 5

min, iar peletul celular a mai fost spalat de 2X cu PBS. Celulele au fost apoi numarate si resuspendate in diluentul

kit-ului (106 celule/ml) la care s-a adaugat apoi colorantul PKH 26 diluat in 1ml diluent (4μ/ml). Celulele au fost

expuse la colorant timp de 5 min, iar colorarea a fost stopata prin adaugarea a 10 ml de mediu complet (ce contine

10% ser fetal). Au urmat inca doua spalari in 10 ml mediu complet RPMI cu 10% FCS. Fluorescenta celulelor a

fost verificata in prealabil. (Fig. 2)

10

Fig. 10.1. Celulele Colo 322 marcate cu linker-ul de membrana fluorescent PKH26. Imagine in contrast de

faza in lumina alba si corespondentul imaginii in fluorescenta la 546nm (magnificatie de 400X)

10.2 Protocol de separare a celulelor nucleate din sângele periferic

Pentru recunoasterea elementelor figurate din sange s-au recoltat 6 ml sange de la un donator anonim, de

la nivelul venei antecubitale, 3 ml pe anticoagulant (heparina), pentru separarea limfocitelor, celulelor

polimorfonucleate si a monocitelor, iar 3ml au fost recoltati pe EDTA, urmand liza eritrocitelor (Fig. 1)

Fig. 10.2 Diagrama etapelor de studiu a recunoasterii celulelor tumorale Colo 322 marcate cu un linker de

membrana fluorescent (PKH26), in contact cu principalele categorii de elemente nucleate din sangele periferic

1. s-a realizat separarea limfocitelor in gradient de osmolaritate, dupa urmatorul protocol :

- Sangele se dilueaza de 2-4 ori cu PBS (2mM EDTA). Cu cat dilutia sangelui este mai mare cu atat se

obtine o puritate mai mare a celulelor.

- Din suspensia rezultata se preling foarte incet cate 6-7 ml peste 3ml Ficoll-Paque (densitatea 1.077),

intr-un tub de 14 ml si se centrifugheaza 15min la 2000rpm, turatie 5, deturare 0.

- se indeparteaza supernatantul apoi se aspira stratul (inelul) cu celulele mononucleate. (Fig. 4)

- Aceste celule (limfocite si monocite) vor fi transferate cu grija intr-un alt tub de 14 ml.

- Se adauga PBS (2mM EDTA) si se centrifugeaza 15 min la 20°C (1300rpm). Se indeparteaza

supernatantul si se resuspenda butonul de celule in 1ml mediu RPMI cu 10%FCS.

- Se determina numarul total de celule

2. Pentru izolarea monocitelor, s-a utilizat urmatorul procedeu:

- Separarea celulelor mononucleare din sângele integral prin protocolul de mai sus

- Suspensia de celule mononucleate este resuspendata in 10 ml mediu RPMI 1640 cu 10% FCS si se

insamnteaza pe plăci Petri cu diametrul de 10 cm

- Incubare 1 oră la 37° C cu 5% CO2.

- Se aruncă mediul şi se spală de monocitele aderate cu mediu rece pentru îndepărtarea limfocitelor (aflate

în suspensie). Pentru desprinderea monocitelor

11

- Se adaugă mediu proaspăt.

.

Fig. 10.3 Separarea inelului de celule mononucleate(Ly-limfocite; Mo-monocite;PMN-polimorfonucleate)

3. Hemoliza hematiilor: proba de sange recoltata pe EDTA a fost hemolizata, pentru indepartarea eritrocitelor,

dupa protocolul:

- sangele se divide in 2 tuburi de centrifuga,cu capac. Se lucrează pe gheaţă!

- în fiecare tub se adaugă sol RBC de lucru[o1], rece (4˚C)

- se incubează 10 min pe gheaţă

- prima spălare: centrifugare 5min/2000 rpm cu răcire la 4˚C

- peletele se resuspendă în câte 3ml PBS rece

- a doua spalare: centrifugare 10min/1200rpm cu răcire la 4˚C

- Peletele se resuspendă în câte 1ml mediu rece si se numara

10.3 Vizualizarea in microscopia optica si de fluorescenta a celulelor tumorale marcate

Celulele marcate au fost adaugate intr-un numar cunoscut (1X104) la 1 ml din suspensiile de sange integral sau

suspensiile de limfocite, monocite si PMN (polimorfonucleate) la care s-a efectuat liza hematiilor.

Fiecare suspensie celulara a fost incarcata in camerele de flux. (Fig.5)

Fig.10.4 Incararea camerelor de flux cu suspensiile celulare

La microscopul in faza invesata Zeiss Axiovert D1 s-au realizat imagini statice cu ajutorul unor camere CCD,

Axiocam MRC 5 (camera color) si Axiocam MRM (monocrom) folosind un soft de analiza morfometrica

Axiovision Release 4.6.3.

Rezultate:

12

Visualizarea celulelor mononucleate din sangele periferic

[C2]

Pentru inceput au fost captate imagini ale camerei de flux cu masurarea dimensiunilor pe sectiune folosind un

obiectiv cu marire de 10X. (Fig. 6)

Fig. 10.5 Dimensiunile pe sectiune ale camerei de flux

Cele mai bune imagini ale celulelor studiate au fost obtinute cu obiectiv Plan-Neofluar la o marire de 40X si

condensator tip PlasDIC (DIC-Diffrential Interference Contrast).

Vizualizarea limfocitelor in contrast de faza, modalitate care nu ofera multe informatii despre morfologia acestora,

a fost verificata prin intinderea de frotiuri si colorare May-Grunwald-Giemsa[C3]. (Fig. 7)

Fig.10.6 Imagini in contrast de faza a suspensiei de limfocite (A) (magnificatie de 400X) si verificarea puritatii

suspensiei prin coloratie May-Grunwald-Giemsa. (B[C4])

Suspensia de monocite si polimorfonucalte a fost de asemenea vizualizata in aceleasi conditii: Figura 8 si 9

Fig. 10.7 Imagini in contrast de faza a suspensiei de monocite A: monocite aderate la suprafata placii de

plastic B: suspensia de monocite dupa tripsinizare si incarcare in camera de flux (magnificatie de 400X)[o5]

13

Fig. 10.8 Imagini in contrast de faza a suspensiei de limfocite[C6] (A) (magnificatie de 400X) si verificarea

morfologiei celulare a suspensiei prin coloratie May-Grunwald-Giemsa. (B[C7])

10.4 Visualizarea celulelor tumorale Colo322 din amestecul cu sangele periferic

Celulele tumorale marcate fluorescent au fost suspendate intr-un numar cunoscut (1x104) in 1ml de sange integral

si incarcate in camerelel de flux. Vizualizarea la microscopul in faza inversata cu obiectiv de 40X, au aratat ca

aceste celule pot fi diferentate de restul celulelor sanguine (hematii si celule mononucleate) prin dimensiunea mai

mare si modul de dispersie a luminii albe. (Fig. 10)

Fig. 10.9 Imagini in contrast de faza in lumina alba (A) a celulelor tumorale Colo 322 suspendate in sangele

integral. Confirmarea imaginii s-a efectuat in fluorescenta unde se observa dimensiunea si localizarea celulei

tumorale. (B)

Similar, s-a procedat si cu suspensia de celule tumorale amestecata cu celulele nucleate obtinute prin hemoliza. In

imaginea 11 se remarca existenta si unor celule tumorale de dimensiuni mai mici care pot fi confundate cu celulele

sanguine.

14

Fig. 10.10 Imagini in contrast de faza in lumina alba (A) a celulelor tumorale Colo 322 suspendate in

suspensia de celulele nucleate obtinute prin hemoliza sangelui. In fluorescenta unde se observa dimensiunile si

localizarea celulelor tumorale. (B)

11.Activitate I.10 Proiectarea si implementarea sistemului informatic pentru procesarea imaginilor statice

11.1.Detectia CTC din imagini statice

Pentru scopul nostru trebuie stabilite criteriile citomorfologice de clasificare a CTC, în scopul de a le

diferenția de celule hematologice și de rarele celule non-hematologice cu caracteristici benigne.

A. Studiu bibliografic

Analiza morfometrică a fost făcută până acum pe diverse linii de celule tumorale de ficat,

prostata, sân, col uterin și alte carcinoame umane și au confirmat dimensiunea semnificativ mai mare a

acestor celule tumorale față de leucocitele din sângele periferic. Aria celulară totală medie a variat între

796 mm2 (Hep3B) şi 396 mm2 (MCF-7), iar raportul mediu al ariilor celulelor tumorale / ariile

leucocitelor a variat intre 5,7 pentru Hep3B și 2,8 pentru MCF- 7. Aceasta sugerează că abordările

bazate pe analiza de imagine permit separea celulelor carcinomatoase pe baza dimensiunii lor, poate cu

excepţia CTC derivate din carcinoamele neuroendocrine cu celule mici, unde ar putea fi necesari factori

suplimentari.

Analiza automată a imaginilor de celule a fost descrisă prima data în 1966i. În ultimele decenii, s-

au făcut eforturi pentru a dezvolta sistemele automate de analiza morfologică, deoarece examinarea

frotiurilor de sânge periferic este consumatoare de timp, necesită personal bine instruit și rămâne

subiectiva.ii O aplicaţie practică în laboratorul de hematologie a fost propusa in 1990iii. Până acum

aceste aparate nu sunt utilizate pentru diagnosticul de rutină, deși şi-au dovedit robustețea. Unul dintre

sistemele comerciale disponibile recunoaște următoarele categorii: neutrofile segmentate, neutrofile în

bandă, eozinofile, bazofile, limfocite, monocite, blasti, promielocite, mielocite, metamielocite, celule

neidentificate, eritroblaști, trombocite, celule gigant, artefacte. Un alt sistem recunoaşte în plus,

diversele clase de limfocite, plasmocitele şi agregatele de trombocite. Pentru unul dintre sisteme

precizia analizei a fost de 90,3%.

Segmentarea celulelor în imagini microscopice a fost încercată în microscopia în câmp luminosiv,

microscopia în câmp întunecatv; microscopia de contrast de fază (PCM) vi, vii, viii , microscopia în

contrast interferenţial de fază (DIC)ix, de fluorescenţăx, microscopia holografică digitalăxi sau

microscopia electronicăcu baleiajxii. La fel ca microscopia holografică digitală, PCM si DIC permit

vizulalizarea probelor transparente, necolorate. PCM se bazează pe conversia variațiilor de fază ale

luminii în amplitudine, iar cele DIC pe separarea sursei de lumină polarizată și recombinarea fasciculelor

înainte de observare diferența dintre căile optice făcând ca specimenele să devină observabilevi. DIC şi

PCM sunt utilizate extensiv la studiul celulelor vii în cultură şi la observarea deplasării acestora. Studiul

deplasării presupune observarea îndelungată a probei pe un fundal fix, singurele modificări în imagini

fiind generate de deplasarea celulelor. Procedura de monitorizare are un prim pas de identificare a

celulelor de studiat printr-o segmentare 2D a primei imagini din secvență, şi un al doilea pas de urmărire

a traiectoriei fiecărei celule de-a lungul secvenței studiatexiii,xiv,xv. În proiect este vorba tot de o urmărire

în timp, dar cu materialul în mișcare, fundalul imaginilor fiind diferit de la un cadru la altul al secvenței.

Din câte stim, aceasta este prima data când se încearcă o astfel de abordare. Proiectul va încerca

segmentarea imaginilor microscopice în timp real cu scopul de a separa celulele canceroase de cele

sănătoase şi de fundal.

Metodele de segmentare cele mai comune sunt binarizarea, watershed sau detecția muchiilor.

Deşi aceste metode sunt foarte uzuale, atunci când sunt aplicate individual au limitări serioase. De

exemplu, metodele de binarizare nu funcționează corect dacă în imagine există două celule care se ating,

15

și nu pot diferenția între celule și fundal dacă acestea au intensități apropiate. Algoritmul watershed

poate rezolva problema celulelor ce se ating, însă doar dacă punctele de pornire sunt poziționate corect,

făcând ca algoritmul să fie puternic dependent de inițializarea lui. Metodele de detecție a muchiilor au la

bază informația dată de gradientul intensității, informație care este sensibilă la artefactele din imaginile

microscopice. Pentru rezultate mai bune aceste metode sunt aplicate în combinație cu alte tehnici de

segmentare și/sau tehnici avansate de extragere a trăsăturilor, de exemplu binarizarea prin histereză

urmată de rafinarea conturului prin operații morfologicexvi, detecția muchiilor rafinată prin operatori

morfologicixiii,viii binarizare urmată de aplicarea algoritmului watershedxvii, clasificatori Bayessieni în

combinație cu trăsăturilor date de histogramele localexviii, filtrare Hessiană urmată de transformata axei

medianexix.

Segmentarea imaginilor microscopice în contrast de fază a fost aplicată la studiul de celule

stemxviii, celule HeLaxix, celule epiteliale și fibroblasteviii, celulele endoteliale vasculare și celule stem ale

sistemului nervos centralxviii etc. Există foarte puţine date despre studiul celulelor sanguine în preparate

necolorate. Yi et al. abordează segmentarea celulelor sanguine în imagini microscopice holograficexi

folosind un algoritm hibrid cu binarizarea imaginii urmată de aplicarea transformatei de distanță și a

algoritmului watershed. Chen et alix. au propus o nouă segmentare a celulelor sanguine pe imagini

microscopice DIC bazată pe algoritmul level set ce folosește ca descriptori texturali faza locală

complexă.

11.2.Metoda propusa

In aceasta prima faza ne-am propus dezvoltarea unei metode de identificare a celulelor CTC din imagini

statice, corespunzand la modulul de segmentare a imaginilor microscopice din faza 2 (online). Acest

lucru presupune in primul rând o metoda de segmentare robusta care sa reușească sa separe celulele mari

(CTC-uri si leucocite) de restul componentelor din imagine (eritrocite si fundal), urmata de un pas de

clasificare care sa clasifice obiectele detectate in CTC si leucocite pe baza de trasaturi caracteristice.

Segmentarea imaginilor

In acest raport descriem metoda de segmentare propusa pentru segmentarea imaginilor microscopice

sangvine. Ca si date de intrare experimentale s-au folosit imagini achizitionate prin microscopia în

contrast interferenţial de fază (DIC) continand hematii si CTC achizitionate in-vitro (metoda de achizitie

offline / lama). Imaginile folosite in teste prezinta eritrocite si CTC fara ocluzii.

Diagrama bloc a metodei propuse este ilustrata in Fig. 11.1.

Fie IRGB imaginea de intrare. Primul pas este de conversie a imaginii din spatiul RGB in spatiul HSI. Se proceseaza

in continuare imaginea S de saturatie pe care se aplica o binarizare cu prag adaptiv, rezultand o imagine binara

BW, si se aplica o filtrare in functie de deviatia standard, care rezulta in imaginea masca Imask. Pe imaginea

rezultata din produsul scalar BW*Imask se realizeaza o operatie de etichetare, care va atribui o eticheta unica

fiecarui obiect detectat. Setul de obiecte obtinute se valideaza apoi pe baza proprietatilor geometrice si statistice

ale acestora.

Pasii mentionati vor fi detaliati in paragrafele care urmeaza.

16

Figure 11.1 Diagrama bloc a metodei de segmentare

Conversia din spatiul RGB in HSI

Componentele spatiului de culoare sunt:

H= Hue (culoare), S=Saturation (saturare), I = Intensity (intensitate) si pot fi vizualizate in Fig. 11.2.

Figure 11.2. Conversie din RGB (stanga) in HSI (H- mijloc si S- dreapta)

Din cauza ca imaginea originala conține nuanțe de albastru atât pentru hematii cat si pentru restul celulelor,

imaginea de culoare (hue) este destul de omogena si nu evidențiază nici un tip de celule. In imaginea de saturație

însă, celulele mari sunt reprezentate cu nivele de intensitate mai mari decât hematiile. Din aceste considerente am

ales ca următoarele procesări sa se efectueze pe imaginea de saturație.

Binarizare cu prag adaptiv

Ca pas premergător etichetării, imaginea de saturație se binarizeza in funcție de un prag dat:

BW = {255, 𝑑𝑎𝑐𝑎 𝑆 > 𝑇𝐻

0, 𝑎𝑙𝑡𝑓𝑒𝑙,

care in cazul nostru a fost ales un prag dinamic, valoarea lui fiind calculata pentru fiecare imagine in parte si este

egala cu media nivelelor de intensitate din imaginea S: 𝑇𝐻 = 𝑚𝑒𝑎𝑛(𝑆).

Filtrare in functie de deviatia standard.

17

Ideea de baza a acestei filtrari este de a elimina fundalul impreuna cu celulele rosii, care statistic au o deviatie

standard ridicata pe o regiune data. Acest lucru se realizează astfel: parcurgem imaginea pixel cu pixel si pentru

fiecare pixel de coordonate (i,j) calculam deviatia standard pe o regiune de interes de 50x50 din imaginea sursa,

iar in pixelului din imaginea destinatie de coordonate (i,j) i se va atribui valoarea calculata. Imaginea rezultata este

apoi binarizata cu un prag fix (TH = 50) ales empiric in urma unor clasificari ale regiunilor de interes. Rezultatul

binarizarii consta intr-o masca care are scopul de a reduce aria de cautare a celulelor de interes (vezi Fig. 11.4 -

mijloc).

Figure 11.3Stanga: Binarizare adaptiva (BW); Mijloc: Filtrare in functie de deviatia standard (Imask); Dreapta: Impultirea scalara dintre

cele doua (BW*Imask)

Etichetare

In continuare se va procesa imaginea binara (BW) peste care s-a aplicat masca Imask.

Iaux = BW .∗ Imask

Pe imaginea binara Iaux se aplica un algoritm de etichetare care atribuie o eticheta unica fiecarui obiect distinct din

imagine (vezi Fig. 11.4- stanga pentru obiecte cu arie mai mare decat un threshold).

Figure 11.4. Etichetarea obiectelor (stanga). Clasificarea obiecteleor etichetate: CTC-rosu, fundal-albastru, altele in verde si galben

(dreapta).

Validarea obiectelor etichetate

Rezultatul etichetarii necesita impunerea unor constrangeri care sa valideze celulele mari din imagine.

Costrangerile propuse sunt urmatoarele:

Proprietati geometrice:

- Aria obiectului in [1000, 6000] – elimina obiectele cu aria mai mica de 1000 si mai mare de 6000

- Factorul de subtiere al obiectului (Thiness ratio):

𝑇 = 4𝜋𝐴𝑟𝑒𝑎

𝑃𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑡𝑒𝑟2 > 0.5

18

Acest descriptor are valoarea maxima 1, care corespunde cercului. Factorul de subtiere este folosit pentru

a verifica cat de rotund este un obiect. Cu cat valoarea lui este mai apropiata de 1, cu atat obiectul este mai

rotund. Aceasta valoare ofera si informatii despre regularitatea obiectului.

Proprietati statistice:

- Deviatia standard a nivelelor de intensitate din interiorul obiectului in intervalul [15, 50]. (Obiectele

detectate ce au o deviatie standard <15 sunt zone de fundal, iar cele cu o deviatie standard >50 sunt

regiuni care contin si hematii)

In Fig. 11.4 (dreapta) se pot observa obiectele detectate. Culorile conturului obiectelor detectate este codificat in

felul urmator:

- Rosu: pentru celulele mari detectate si validate

- Albastru: obiecte invalidate din cauza ca deviatia standard <15

- Verde: obiecte invalidate din cauza ca deviatia standard >50 - Galben: obiecte invalidate din cauza ca factorul de subtiere <0.5 (obiecte puternic “nerotunde”)

11.3.Rezultate intermediare

Setul de date disponibil pana in momentul de față conține două imagini microscopice. Rezultatele segmentării

imaginilor sunt ilustrate in Fig. 11.5.

Figure 11.5. Rezultatul segmentarii: celule mari - rosu si falsuri pozitive: fundal - albastru, obiecte cu factor de subtiere mic – galben,

altele- verde.

11.4.Concluzii si direcții viitoare de dezvoltare a sistemului informatic

Pana in prezent s-a dezvoltat o metoda de segmentare si identificare a celulelor mari (leucocite si CTC) din

imgini statice. Metoda se bazeaza pe o serie de parametrii experimentali (praguri) folositi in procesul de

segmentare. Valoarea acestori praguri este dependenta de tipul/modalitatea de achizitie a imaginilor pe care s-

au realizat experimentele. Metoda propusa va suferii ajustari dupa stabilirea variantei finalei a protocolului de

achizitie a imaginilor si stabilirea unei metode de achizitie standardizate.

Urmatoarele directii de dezvoltare sunt:

- Analiza si identificarea trasaturilor imagistice discriminante intre diferite tipuri de celule sangvine + CTC.

- Crearea si validarea de modele statistice pe aceste tipuri distincte de celule.

- Testarea si validarea modelelor statistice prin antrenare de clasificatoti.

- Adaptarea metodei de segmentare pentru imagini statice si dinamice achizitionate cu dispozitivul propriu.

19

i Prewitt J M, Mendelsohn M L. The analysis of cell images. Ann N Y Acad Sci 1966.1281035–1053.1053. ii Rumke C L. Imprecision of ratio derived differential leukocyte counts. Blood Cells1985. 11311–315.315. iii Bentley S A. Automated differential white cell counts: a critical appraisal. Baillieres Clin Haematol 1990. 3851–869.869. ivM. Tscherepanow, F. Zöllner, M. Hillebrand, F. Kummert, Automatic Segmentation of Unstained Living Cells in Bright-Field Microscope Images, Advances in Mass Data Analysis of Images and Signals in Medicine, Biotechnology, Chemistry and Food Industry, Lecture Notes in Computer Science Volume 5108, 2008, pp 158-172 vS. Burgemeister, T.W. Nattkemper, T. Noll, R. Hoffrogge, E. Flaschel, CellViCAM—Cell viability classification for animal cell cultures using dark field micrographs, Journal of Biotechnology, 149 (2010) 310–316. viZhaozheng Yin, Takeo Kanade, Mei Chen, Understanding the Phase Contrast Optics to Restore Artifact-Free Microscopy Images for Segmentation Medical Image Analysis 16(5): 1047-1062 (2012). viiA. Kuijper, B. Heise, An Automatic Cell Segmentation Method for Differential Interference Contrast Microscopy, 19th International Conference on Pattern Recognition (ICPR2008), December 8-11, 2008, Tampa, Florida, USA, pp. 1-4. viii I. Seroussi & all, Segmentation and tracking of live cells in phase-contrast images using directional gradient vector flow for snakes, Journal of Microscopy, Vol. 247, Pt 2 2012, pp. 137–146. ixT. Chen, Y. Zhang, C. Wang, Z. Qu, F. Wang, T. Syeda-Mahmood, Complex local phase based subjective surfaces (CLAPSS) and its application to DIC red blood cell image segmentation, Neurocomputing 99 (2013) 98–110. xO. Dzyubachyk, W. J. Niessen, E. H. W. Meijering, Advanced level-set based multiple-cell segmentation and tracking in time-lapse fluorescence microscopy images, Proceeding of: Proceedings of the 2008 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro, Paris, France, May 14-17, 2008, pp. 185-188. xiF. Yi, I. Moon, B. Javidi, D. Boss, P. Marquet, Automated segmentation of multiple red blood cells with digital holographic microscopy, Journal of Biomedical Optics 18(2), 2013. xiiR. Wang, Red Blood Cell Surface Segmentation Based on Shape Reconstruction and Statistics Feature Extraction, Journal Of Computers, Vol. 8, No. 4, April 2013, 1083-1089. xiiiLi, K., Miller, E.D., Chen, M., Kanade, T., Weiss, L., Campbell, P.G., 2008.Cellpopulation tracking and lineage construction with spatiotemporal context, Medical Image Analysis 12 (5), pp. 546–566. xivSmith, K., Carleton, A., Lepetit, V., 2008. General Constraints for batch multiple-target tracking applied to large-scale video microscopy. In: Proceedings of IEEE Conference on Computer Vision and Pattern Recognition (CVPR), pp.1-8, 2008. xvS. Huh, S. Eom, R. Bise, Z. Yin, T Kanade,Mitosis detection for stem cell tracking in phase-contrast microscopy images, IEEE International Symposium on Biomedical Imaging (ISBI'11), pp. 2121-2127, 2011. xviT. Ketheesan et al., A Novel Framework for Tracking In-vitro Cells in Time-lapse Phase Contrast Data, BMVC 2010 doi:10.5244/C.24.69. xviiYang, F., Mackey, M.A., Ianzini, F., Gallardo, G., Sonka, M., 2005.Cell segmentation, tracking, and mitosis detection using temporal context. In: Proceedings of the 8th International Conference on Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention (MICCAI), Palm Springs, CA, USA, pp. 302–309, 2005. xviiiZ. Yin, R. Bise,M. Chen, T. Kanade, Cell segmentation in microscopy imagery using a bag of local Bayesian classifiers, IEEE international conference on Biomedical imaging: from nano to Macro, pp.125-128, 2010. xixS. Hadjidemetriou1, B. Gabrielli, T. Pike, F. Stevens, K. Mele, and P. Vallotton Detection and Tracking of Cell Divisions in Phase Contrast Video Microscopy; Procceedings of the 3-rd International Workshop on Microscopic Image Analysis with Applications in Biology, MIAAB 2008, New York, NY, 2008.