Producción y aplicación de Trichoderma spp. como antagonista de hongos fitopatógenos.

Dra. Marusia Stefanova Nalimova

Laboratorio de Bacteriología INISAV , Calle 110 y 5taB # 514 Playa, Ciudad de la Habana, Cuba

INTRODUCCION

La problemática de la utilización discriminada de los fungicidas y fumigantes, como el bromuro de metilo, que puede resumirse en fungorresistencia,contaminación ambiental y toxicidad, ha motivado la búsqueda de otros métodos efectivos y no perjudiciales para combatir los patógenos de plantas.

Una respuesta positiva y concreta a la campaña mundial de limpieza del planeta es la utilización de microorganismos antagónicos competitivos para la protección de los cultivos de los patógenos fúngicos del suelo, en particular especies del género Trichoderma han merecido la atención máxima como agente biocontrol.

Este hongo hiperparásito actúa por medio de una combinación de competencia por nutrientes, producción de metabolitos antifúngicos y enzimas hidrolíticas, y micoparasitismo, además produce sustancias promotoras de crecimiento de las plantas. El mismo coloniza las semillas y proteje las plántulas en la fase post-emergente de patógenos fúngicos, la aplicación directa al suelo ofrece incluso una protección mayor a los cultivos.

En las condiciones de Cuba varias especies fúngicas de los géneros Phytophthora, Fusarium, Sclerotium, Rhizoctonia y Pythium, entre otros, causan problemas de importancia económica.

En el tabaco la enfermedad "pata prieta" (Phytophthora nicotianae var nicotianae) segunda por su impacto negativo en el cultivo, implica anualmente gastos significativos para la fumigación con bromuro de metilo, aplicación de fungicidas sistémicos y localización de nuevas áreas no contaminadas por el patógeno.

Otra patología fúngica de importancia es el damping off cuyo incremento progresivo en condiciones favorables provoca serias afectaciones en los semilleros de tomate y otras hortalizas, otros numerosos cultivos sufren en diversas fases de su desarrollo ataque por Sclerotium rolfsii, hongo de amplio rango de acción.

La reducción de la incidencia de estos patógenos y la protección adecuada a los cultivos se logró mediante uso de biopreparados de cepas nativas de Trichoderma, reproducidas por métodos alternativos con subproductos nacionales y parámetros controlados, aplicadas siguiendo metodologías y dosis establecidas de acuerdo a los resultados obtenidos en los ensayos de laboratorio, semicontrolados, campo y comprobados en la producción.

La experiencia obtenida en este sentido se expone a continuación.

REPRODUCCION MASIVA Y CONTROL DE CALIDAD DE BIOPREPARADOS DE Trichoderma.

Para la reproducción masiva de las cepas promisorias de Trichoderma para el control de hongos patógenos del suelo se utilizan métodos bifásicos, líquido-líquido y líquido-sólido.

Los medios están compuestos por subproductos agrícolas y de la industria azucarera. Los métodos alternativos se emplean teniendo en cuenta la forma de aplicación y el mecanismo de acción que ejerce la cepa en el control de los patógenos.

La producción se acompaña por un reglamento de control de calidad que incluye verificación de la pureza y la efectividad biológica de cada una de las etapas del proceso y al producto final, el cual está constituído por la biomasa del hongo, metabolitos y residuos del medio de cultivo.

Si se recobra sobre un soporte adecuado su almacenamiento se puede prolongar a 3-4 meses a temperatura ambiente.

Estas producciones se realizan en biolaboratorios mediante un proceso semi-industrial lo cual requiere de un personal bien adiestrado.

Uno de los biopreparados obtenidos (A-34, T. harzianum) se emplea en cultivos hortícolas y otros como arroz, maní, frijol, cucurbitáceas, gladiolos, etc., contra R. solani, P. aphanidermatum, P. parasítica, P. capsici, R. rolfsii y otros.

El biopreparado A-53 (Trichoderma spp.) es destinado fundamentalmente al cultivo de tabaco contra P. nicotianae, R. solani, Pythium spp.

Con la producción líquida se obtienen concentraciones de conidios de 2 - 3 x 108 por ml, y con la sólida de 2 - 3 x 109/g.

Se encuentran en la fase final las investigaciones relativas a la fermentación sumergida y en fase sólida para la producción industrial futura.

La producción anual de biopreparados de Trichoderma depende de la necesidad de los cultivos que se protegerán pero la demanda mayor casi siempre corresponde a la época de siembra y transplante.

A continuación se señala el flujo de producción de un biopreparado de Trichoderma.

 

FLUJO DE PRODUCCION

Cultivo bifásico líquido-líquido y líquido-sólido

Cepa de Trichoderma

(inóculo inicial)0,5 - 2% v/vmedio melaza – levadura(control esterilidad y pH)incubación 4-7 días__________________________1-5 % v/v 5-10 % v/v

medio sólidoigual medio, condicionesy controles

Recobradoincubación 7-15 días

secarcontrol 2 % lote (microscopio, pH envasarbioensayos) almacenarrecobrado (homogenizar)mezclar con materia orgánica aplicar directamente

secarenvasealmacenar

MODO DE UTILIZAR LOS BIOPREPARADOS DE Trichoderma

Tratamiento de las semillas

El empleo de Trichoderma por medio de las semillas es probablemente la forma más económica y extensiva para introducir el biocontrol en la producción, el método sencillamente consiste en tratar las semillas con una suspensión acuosa de esporas o en forma de polvo, con o sin necesidad de adherente. Así la semilla recibe una cubertura protectora cuyo efecto se muestra cuando la misma es plantada en el sustrato correspondiente. Las cepas de Trichoderma verdaderamente competitivas son capaces de colonizar la superficie de la raíz y la rizosfora a partir de la semilla tratada.

El aislamiento A-34 (T. harzianum) recomendado para combatir los patógenos fúngicos en hortalizas es capaz de proliferar en el suelo a partir de las semillas tratadas y colonizar el sustrato antes que desarrolle la raíz del pimiento y el tomate asegurando su protección adecuada.

Entre 10 y 20 días de germinación el tamaño de la raíz del pimiento está de 3,5 - 5 cm y la del tomate entre 1,5 - 3,5 cm mientras que Trichoderma se detecta a 7 cm de profunidad en concentración de 102 con/g.

Se comprobó que la inmersión de las semillas durante 10 minutos en la suspensión del biopreparado A-34 (10 % v/v) garantiza una cobertura de las semillas entre 91 - 100 %, el posterior secado al sol no afecta la cobertura y la viabilidad de los conidios de Trichoderma.

El bioagente fue recobrado de las semillas tratadas y almacenadas a 10º y 30ºC durante los 45 días del ensayo, lo que demuestra la posibilidad de mantener lotes tratados en almacenaje antes de la siembra, como mínimo por este período de tiempo.

El tratamiento de las semillas reduce los contaminantes externos como Rhizopus stolonifer y otras especies de hongos en cucurbitáceas, col, cebolla, rábano, remolacha, zanahoria, habichuela, tomate y pimiento entre otros; además incrementa el porcentaje de germinación y estimula el crecimiento.

En las pruebas de protección de las semillas contra las infecciones post-emrgentes se registraron coberturas elevadas por el antagonista que reducen a menos de 50 % las infecciones por F. solani y a un 3 % las de R. solani en comparación con un 90 % en el

testigo.

Las semillas tratadas con Trichoderma protegen eficientemente las plántulas en el semillero contra R. solani sin necesidad de tratamiento del suelo previo a la siembra.

Tratamientos combinados semillas-sustrato

Dentro del complejo fúngico damping-off existen patógenos tales como P. parasítica y P. capsici cuya incidencia no puede ser reducida significativamente con el tratamiento de las semillas o el suelo solamente. Para obtener valores efectivos en el control de estas enfermedades es necesario un empleo combinado semillas-suelo.

La combinación semillas - sustrato redujo la incidencia del damping-off en condiciones de hidropónico a menos de 5 % mientras que en el área testigo el nivel de plantas de tomate muertas fue superior al 70 %.

El sustrato de basalto fue tratado por irrigación 48 horas antes de la siembra, el bioagente (cepa H-34) se mantuvo viable en la roca de basalto alrededor de 100 días. El hidropónico tenía antecedentes de pérdidas en la postura entre 70 - 80 % en años anteriores que fueron repetidas en las unidades testigos no tratadas con Trichoderma. La disminución de la mortalidad de plántulas y el aumento del rendimiento demuestran la efectividad del esquema de aplicación semillas - sustrato en la fase pre- y post- emergente en semilleros.

Para semillas muy pequeñas como es el caso del tabaco, el tratamiento de las mismas con Trichoderma no resulta efectivo. Para este cultivo la aplicación del biopreparado se dirige al suelo, en el momento de la siembra las semillas se mezclan con el biopreparado y se riegan en la superficie de los canteros.

La cepa (A-53 (Trichoderma sp) efectiva para patógenos en tabaco coloniza el suelo de forma progresivamente superior al desarrollo del sistema radical y brinda una cobertura adecuada a las plántulas en el semillero.

A los 12 días la raíz apenas tiene un 0,3 cm de largo mientras que la cepa de Trichoderma aplicada se detecta a 5 cm de profundidad, a los 24 días alcanza 17,2 cm.

La efectividad de esta forma de introducir el biopreparado se comprobó en la provincia Pinar del Río, en la zona tabacalera más importante del país, en un área aproximada de 15000 canteros. En los suelos tratados con el bioagente con nivel de infección por P. nicotianae bajo y muy bajo no se registraron afectaciones por el patógeno, efecto comparable con el obtenido por el propamocarb en áreas de condiciones similares.

Se comprobó que la cachaza y la turba son soportes y vehículos eficientes para Trichoderma donde puede permanecer viable por más de 30 días en condiciones ambientales sin que se altere la concentración inicial del inóculo. Aunque la aplicación del biopreparado al suelo puede ser directa, la introducción de una enmienda orgánica en los canteros previa a la siembra favorecerá el establecimiento del bioagente y el desarrollo posterior de las plantas.

Tratamiento posturas - plantación

En la fase de transplante de las hortalizas (tomate y pimiento) y el tabaco por la tecnología habitual surge la necesidad de proteger la postura sana en la plantación. El tratamiento de la radícula de las plántulas por 10 minutos en el biopreparado al 10 % permite la transportación del bioagente a la plantación que registra un efecto favorable cuando la incidencia en el suelo de patógenos fúngicos es reducida. Posturas de pimiento tratadas y transplantadas a microparcelas altamente infectadas por P. capsici disminuyó la muerte de las mismas a pesar de las declinaciones drásticas hasta los 35 días.

En el caso del tabaco el efecto del tratamiento de la postura se reduce por el hecho de transplantar en surcos con agua abundante. La introducción del biopreparado directamente en el surco reduce la incidencia de la pata prieta pero requiere de una mayor cantidad de biopreparado por lo que su utilización de esta forma debe ser analizada para algunos campos de mayor riesgo.

Es evidente que la presencia de Trichoderma en la plantación es necesaria, la forma más eficiente sin duda es la transportación del bioagente junto con el sustrato donde el mismo se encuentra previamente establecido como micobiota normal de la rizosfora. Esto sin duda se logra con la

tecnología de producción de postura en sepellones, Trichoderma se establece muy bien en el estiércol, casting y biotierra que se utilizan como sustrato.

La micropropagación también ofrece la posibilidad de introducir la protección por Trichoderma en múltiples cultivos que se extienden por esta vía.

ESTUDIOS EPIDEMIOLOGICOS DE LOS PATOGENOS Y EL PAPEL DE LA PLANTA EN EL BIOCONTROL POR Trichoderma

Es bien conocida la definición de la enfermedad como resultado de una interacción entre la planta - hospedante y el patógeno, y organismos antagónicos que limitan la actividad del patógeno y/o elevan la resistencia de la planta.

La importancia del hombre en esta relación radica en saber manejar las especificidades de cada uno para lograr que prevalezca la interacción a favor de la planta y el antagonista.

Esto no es posible sin conocimientos de la etiología de la enfermedad que se desea controlar, el hábito del hongo fitopatógeno, su forma de propagarse y permanecer en el campo. Trichoderma siendo un microorganismo competitivo ofrece una protección biológica a la planta, destruye el inóculo patógeno presente y contribuye a prevenir su formación.

Se confirmó mediante un estudio epidemiológico que la marchitez del pimiento (P. capsici) aparece en el período floración - fructificación y con una propagación rápida entre 7 - 10 días. En los campos con incidencia de la enfermedad se detectó entre 5 y 35 propágulos/g de suelo.

Desde luego no es posible esperar un buen control por Trichoderma en campos con antecedentes a favor del patógeno fúngico. Esto fue claramente demostrado también en el cultivo del tabaco, las aplicaciones biológicas dirigidas a suelos con infección media y alta por P. nicotianae solamente reducen el índice de infección a un 30 % y a un 60 % respectivamente.

El análisis riguroso de los antecedentes y el nivel de inóculo en el suelo ayuda a la toma de decisiones con vistas a proporcionar un control eficiente y optimizar la efectividad de Trichoderma.

Tampoco se puede obtener el control deseado con el uso de Trichoderma cuando el material de siembra de hecho está contaminado con hongos nocivos y mucho menos de crecimiento rápido como S. rolfsii, p. ej. No se logró reducir el daño por este patógeno en topinambur, debido a que los bulbos tratados con el biopreparado resultaron ser portadores asintomáticos del hongo, en este caso el tratamiento con benomyl resultó igualmente inefectivo.

La incidencia de la marchitez del pimiento fue registrada fundamentalmente en terrenos encharcados, además donde el cultivo fue doblado, todas las plantas con el llamado "cuello de ganso" resultaron afectadas, lo cual está acorde con el hábito del patógeno e indica la necesidad imperiosa de que los tratamientos con el biopreparado sean acompañados de prácticas culturales adecuadas para elevar su efectividad.

El manejo de las plantas mediante la rotación de cultivos favorece a Trichoderma a librar el suelo de los propágulos del patógeno, vulnerables durante su latencia en ausencia del hospedante, por esta razón la utilización del biopreparado en los cultivos a rotar en las áreas altamente infectadas por P. nicotianae será una forma a contribuir en la reducción de la población del patógeno en un menor plazo de tiempo.

Además la preparación adecuada del terreno, la mejor fecha de plantación, fertilización y riego actúan a favor de la combinación planta-Trichoderma asociadas.

La introducción del biocontrol por Trichoderma en el manejo integrado de plagas por cultivo es la forma óptima de explotar las posibilidades que brinda el microorganismo como antagonista de suelo.

COMPATIBILIDAD CON BIOFERTILIZANTES, BIOESTIMULANTES Y PLAGUICIDAS

Desde luego para integrar hay que conocer entre otros aspectos la compatibilidad entre Trichoderma y los agroquímicos, así como la interacción que existe con los biofertilizantes y bioestimulantes.

Resulta que el tratamiento combinado con el bioestimulante Biozyne incrementa la germinación y el crecimiento de las plantas de tomate, también existe compatibilidad con el biofertilizante a base de Azotobacter chroococcum , por tanto una combinación entre ellos es factible incluso en tratamiento de semillas.

El conjunto Trichoderma - Micorrizas favorece el desarrollo de las plantas del tabaco y no afecta el hiperparasitismo sobre P. nicotiane por lo que se pueden aplicar los bioagentes de forma conjunta.

De los plaguicidas el mancozeb y thiram no deben emplearsse el mismo día con el biopreparado de Trichoderma por ser ligeramente a moderadamente tóxicos. El oxicloruro de cobre, metalaxyl, zineb, dimethomorph, mancozeb, dimethoato, lambdacihalotrina, difenamida, trifluralin y napropamida son compatibles con las cepas de Trichoderma.

En el caso de desinfección de las semillas con hipoclorito de sodio y ácido clorhídrico contra bacterias y virus, el posterior tratamiento con Trichoderma no se ve afectado, sin embargo no ocurre así cuando los mismos son tratados con hidróxido de calcio que prácticamente inactiva la accióon del bioagente; algo similar sucede con el benomyl catalogado de tóxico en las pruebas de laboratorio.

Los tratamientos de las semillas con Promec contra mosca blanca pueden efectuarse después del tratamiento con el biopreparado de Trichoderma sin ejercer efecto negativo.

 

6. REFERENCIAS

Fernández-Larrea, O., Calderón, A., Fraga, M. 1992. Metodología de reproducción de cepas de Trichoderma spp. para el biocontrol de hongos fitopatógenos. Informe técnico de investigación, INISAV, 8 p.

García, D., Sandoval, I. 1994. Tiempo óptimo de tratamiento de semillas de tomate con Trichoderma harzianum (Resúmenes) 90 Aniversario INIFAT, VII Jornada Científica. La Habana, abril 5, 6 y 7, p. 74.

Muiño, B., Fernández, A., Stefanova, M. 1994. Sistemas de control para el manejo de la pata prieta en función del nivel de infección del suelo. Resumen IX Forum de Ciencia y Técnica II Encuentro Nacional de Bioplaguicidas, II Expo-CREE, La Habana, 25 - 27 oct. p. 74

 

Muiño, B., Saenz, M. Efecto de los plaguicidas sobre Trichoderma spp. Resúmenes 90 Aniversario INIFAT; VII Jornada Científica, La Habana, 5-7 abril, p. 70-71, 1994.

Neyra, M. 1992. Evaluación técnica de Trichoderma spp. en el cultivo de tomate contra damping - off bajo condiciones de producción en hidropónico. Informe técnico de investigación, Unidad Toxicología, Prueba de productos, INISAV, 6 p.

Saenz, M., Sandoval, I., Martínez, M.L., 1994. Uso de la materia orgánica en semillero de tabaco como vehículo de Trichoderma spp para el biocontrol de Phytophthora nicotianae. (Resúmenes) 90 Aniversario del INIFAT, VII Jornada Científica, La Habana, abril 5, 6 y 7, p. 72.

Sandoval, I., López, Ma., García, D., Mendoz, I. 1994. Trichoderma harzianum (cepa A-34): Un biopreparado de amplio espectro para micopatologías del tomate y pimiento. Resúmenes IX Forum de Ciencia y Técnica. II Encuentro Nacional de Bioplaguicidas. II EXPO-CREE, p. INISAV

Sandoval, I., Saenz, M. 1992. Estudio preliminar del biocontrol de Phytophthora nicotianae var nicotianae y Rhizoctonia solani en tabaco mediante Trichoderma spp. ResúmenesBiotecnología Habana '92, La Habana. Junio 8-12

Sandoval, I., Stefanova, M., López, M.O., Neyra, M., García, D. 1995. Utilización de un biopreparado de Trichoderma para el control de enfermedades en tomate y pimiento. (Resúmenes) Earth Conference on Biomass for Energy, Development and the Environment, La Habana Cuba, enero 10-15, p. 136-137.

Stefanova, M., Muiño, B., Martínez, M.L., Cruz, R., Díaz, I. 1995. Efectividad de Trichoderma sp. sobre Phytophthora nicotianae Breda de Haan var nicotianae en el cultivo de tabaco. Informe técnico de investigación, INISAV, 5 p.

Stefanova, M., Sandoval, I., Fernández, A. 1995. Compatibilidad entre cepas de Trichoderma spp. y agentes biopesticidas, biofertilizantes y bioestimulantes. Informe técnico de investigación, INISAV, 8 p.

Stefanova, M., Sandoval, I., Fernández-Larrea, O. 1993. Empleo de biopreparados de Trichoderma en el control de hongos fitopatógenos de suelo en tabaco, pimiento y tomate de hidropónico. I Encuentro Nacional de Bioplaguicidas, VIII Forum Nacional de Ciencia y Técnica, Palacio de Convenciones, dic 16-18, La Habana.

Stefanova, M., Sandoval, I., Fernández, A. Compatibilidad entre cepas de Trichoderma spp. y agentes biopesticidas, biofertilizantes y bioestimulantes. Informe técnico de investigación, INISAV, 10 p., 1995 (en vía de publicación).