Enzyme degradation Trichoderma

8/15/2019 Enzyme degradation Trichoderma

1/30

Надежда Василева Даскалова

АВТОРЕФЕРАТ

на дисертация

на тема: “КРИОКОНСЕРВИРАНЕ НА -ГЛЮКАНАЗИ”

за присъждане на образователна и научна степен “Доктор”по научна специалност 01.03.20 “Топлофизика и хидродинамика (вкл.

термични и криогенни процеси и явления; процеси на пренасяне във флуиди;физика на свиваемите и несвиваемите флуиди)”

Научен ръководител: Акад. Цветан Цветков

София, 2013 г.

С Е Л С К О С Т О П А Н С К А А К А Д Е М И Я

ИНСТИТУТ ПО КРИОБИОЛОГИЯ И ХРАНИТЕЛНИ ТЕХНОЛОГИИ – СОФИЯ

бул. „Черни връх” № 53, София 1407, тел: 8681363, факс: 8683373, e-mail: [email protected], www.ikht.bg

******************************************************************************************


2/302

Дисертационният труд е написан на 112 страници и съдържа 31 таблици и 36фигури. Цитираната литература включва 158 източника, от които 16 на кирилица и142 на латиница.

Дисертационният труд е обсъден и насрочен за защита от разширен съвет насекция: “Криобиология и лиофилизация” при ИКХТ, София.

Използваната номерация на таблиците и фигурите не съответства на номера-цията в дисертацията.

Публичната защита на дисертационния труд ще се състои на ............2013г. от...............ч. в Заседателната зала на ИКХТ, София 1407, бул.”Черни връх” 53.

ИЗПОЛЗВАНИ СИМВОЛИ И СЪКРАЩЕНИЯ

А260- абсорбция при дължина на вълната 260 nmА280- абсорбция при дължина на вълната 280 nmБДС- Български държавен стандарт

ЕДТА- етилендиаминтетраоцетна киселинаКДА- картофено-декстрозен агарНБПМКК- Национална банка за промишлени микроорганизми и клетъчни културиНЦЗПБ- Национален център по заразни и паразитни болестиТВЧ- токове с висока честотаХЕН- хидроксиетил нишестеCFU- колоно-образуващи единициСМС- карбоксиметилцелулозаISO- Международна организация за стандартизацияkDа- килодалтонаMw- молекулна масаOD- оптическа плътностPAGE- полиакриламидна гел-електрофорезаSDS- натриев додецилсулфат- дължина на вълната


3/303

ВЪВЕДЕНИЕ

В последните десетилетия се наблюдава бързо развитие на биотехнологиите.Основно тяхно направление е производството и приложението на микробиалнитеензимни препарати. Използването на микробиалните ензими в индустрията сеувеличава и поради това е необходимо да се осигурят надежни методи за запазване на

тяхната активност за дълъг период от време.Широко индустриално приложение намират ензимите, катализиращи

разграждането на хемицелулозите. Към тях се отнасят и -1,3/1,4-глюканазите. Те саензими, които се синтезират от различни таксономични групи микроорганизми-главно бактерии и гъби, като част от техния екстрацелуларен ензимен комплекс.Повечето от техните продуценти спадат към групата на микромицетите.

Ензимите се продуцират най-често под формата на разтвор и могат да сеинактивират, когато се съхраняват при неподходящи условия. Един от начините заполучаване на стабилен ензимен продукт с висока активност и дълъг период на

съхранение е вакуум-сублимационното сушене.

Все още обаче не е напълно изучено влиянието на процеса лиофилизация върхукаталитичната активност на ензимите. Поради това настоящата дисертация енасочена към изучаване влиянието на нискотемпературното третиране върхукаталитичната активност на -1,3/1,4-глюканази, продуцирани от Trichoderma sp.НБПМКК 405.

I. ЦЕЛ И ЗАДАЧИ:

Целта на настоящата работа е: изследване възможностите закриоконсервиране на продуцираните от Trichoderma sp. НБПМКК 405 -глюканазниензими, установяване на най-ефективния метод за тяхното съхранение и получаванена ензимен препарат, продуциран от работния щам.

Реализирането на поставената цел се постига чрез изпълнението на следнитенаучно- изследователски задачи:

1. Изследване динамиката на биосинтез на -глюканази (ламинариназаЕ.С.3.2.1.39 и лихеназа Е.С.3.2.1.73) при дълбочинно култивиране на Trichoderma sp.

НБПМКК 405.2. Изследване на активността на продуцираните от Trichoderma sp. НБПМКК 405-глюканази- ламинариназа (Е.С.3.2.1.39) и лихеназа (Е.С.3.2.1.73).

3. Нискотемпературно третиране и криоконсервиране на продуцираните отTrichoderma sp. НБПМКК 405 -глюканази (ламинариназа Е.С.3.2.1.39 и лихеназаЕ.С.3.2.1.73), без добавяне на криопротектори.

4. Изследване на остатъчната активност на анализираните ензими след процесана криоконсервиране и определяне на оптималните условия за продължителното имсъхранение.

5. Създаване на технологична схема за получаване на ензимен препарат,съдържащ -глюканази (ламинариназа Е.С.3.2.1.39 и лихеназа Е.С.3.2.1.73) ипроучване на неговото приложение в пивопроизводството.


4/304

II. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

1. Щам- продуцент- за провеждането на изследванията е използван щамTrichoderma sp. НБПМКК 405, закупен от Националната банка за промишленимикроорганизми и клетъчни култури (НБПМКК).

2. Посевна и ферментационна хранителни среди за култивиране наизследвания щам-продуцент- използвани са следните хранителни среди: Посевна хранителна среда- хранителна среда на Манделс (Mandels et al., 1974). Ферментационна хранителна среда- хранителна среда на Манделс за култивиранена Trichoderma sp. (Mandels et al., 1974).

3. Посевен материал:

Получаване на споров посевен материал- при култивиране на щам-продуцентавърху полегат КДА в продължение на 10-12 денонощия при температура 28оС. Получаване на вегетативен посевен материал- на клатачен апарат Inkubations-Schüttelschrank BS-4 B.Braun (220 об./мин.) в продължение на 18-20 часа притемпература 28оС.

4. Дълбочинно култивиране на щам-продуцента- провежда се на клатачен апаратInkubations-Schüttelschrank BS-4 B.Braun (220 об./мин.) при температура 28оС впродължение на 168 часа (фиг. 1).

Фиг. 1. Схема на дълбочинно култивиране на Trichoderma sp. НБПМКК 405

5. Контрол на ферментационния процес:

Микроскопски контрол- приготвят се микроскопски препарати с цел

проследяване развитието на щама. Контрол на концентрацията на водородни йони в хранителната среда и в

културалната течност- измерва се с рН-метър. Определяне съдържанието на белтък в културалната течност в mg/ml по

време на култивирането чрез спектрофотометричен метод (OD280/OD260) (Йотова икол., 2000).

Количествено определяне на активността на изследваните ензими- съгласнометодиките, приложени в т.7 .

6. Методика за построяване на стандартна крива- приготвят се изходни разтвори на глюкоза (D(+) Glucose monohydrate- Sigma- Aldrich) с концентрации

съответно 0,01 mg/ml; 0,02 mg/ml; 0,03 mg/ml; 0,04 mg/ml; 0,05 mg/ml; 0,06 mg/ml;0,07 mg/ml; 0,08 mg/ml и 0,09 mg/ml. Приготвят се съответните проби от всеки разтвор и една контрола, както е посочено:

Така подготвените проби се поставят за 20 минути на кипяща водна баня. Следохлаждане към всяка епруветка се добавя по 1 ml реактив на Нелсон, хомогенизира сеи се долива до 25 ml с дестилирана вода. Абсорбцията се измерва наспектрофотометър Unicam SP1800 Ultraviolet Spectrophotometer при дължина на

вълната =660 nm и червен филтър.7. Методики за определяне на изследваните ензимни активности:

7.1. Определяне на ламинариназна активност- по метода на “Somogyi-Nelson”(Nelson, 1944; Somogyi, 1952; Nelson, 1957).

7.2. Определяне на лихеназна активност- по метода на “Somogyi-Nelson”

Проба: Контрола:

1ml разтвор на глюкоза 1ml дестилирана вода1ml разтвор на Шомоги 1ml разтвор на Шомоги

Рехидрати- ране на

лиофилизи- рания щам

Развитие на щамавърху полегатКДА (споров

посевен материал)

Получаване навегетативен

посевенматериал

Култивиране нащама в колбина клатачен

апарат


5/30


6/30


7/307

пивото и напитките" на ИКХТ. Получените лабораторни пивни мъсти са анализиранипо следните методи, утвърдени в Аналитиката на Европейската пивоварна конвенция(EBC Analysis Committee, 1998):1) време на озахаряване- проверява се с разтвор на йод (Moštek, 1973);2) скорост на изцеждане- отчитат се изтеклите милилитри пивна мъст за определенпериод от време (Moštek, 1973);3) рандеман на екстракт- изчислява се количеството на екстрахираните вещества от100 g малц в резултат на процеса на майшуване (Moštek, 1973);4) определяне на екстракта на пивна мъст- определя се в зависимост от измеренатаотносителна маса на определено количество пивна мъст и по официална таблица сеотчита екстракта като g екстракт в 100 g пивна мъст (EBC Analysis Committee, 1998);5) определяне на рН- с рН-метър (EBC Analysis Committee, 1998);6) определяне на цвят- спектрофотометрично при дължина на вълната =430 nm (EBCAnalysis Committee, 1998);7) определяне на вискозитет- с вискозиметър на Höppler (EBC Analysis Committee,1998);8) определяне на разтворим азот- спектрофотометрично при дължини на вълните =

215 nm и = 225 nm (Маринова и кол., 2005);9) определяне на β-глюкани по метода на Erdal (Erdal et al., 1967).17. Статистическа обработка на резултатите- извършен е вариационен и

дисперсионен анализ на резултатите чрез компютърна програма SPSS Statistics версия17.0 и Excel версия 2007.

III. РЕЗУЛТАТИ И ОБСЪЖДАНЕ

1. Култивиране на щам-продуцента

Щамовете от род Trichoderma са продуценти главно на целулазни ензими споредEl-Bondkly и кол. (2011). В Националната банка за промишлени микроорганизми и

клетъчни култури Trichoderma sp. НБПМКК 405 е депозиран като продуцент нацелулази и хемицелулази. Информационните източници за продуцирането нахемицелулазите ламинариназа и лихеназа от подбрания от нас щам са малко. Порадитова настоящата дисертация е насочена към изследване продуцирането на тези двахемицелулазни ензима.

Проучено е дълбочинното култивиране на Trichoderma sp. НБПМКК 405 наклатачен апарат в продължение на 168 часа при 28оС. На фиг. 3 е представенначалният етап от развитието на работния щам върху КДА. След култивиране впродължение на 10-12 денонощия върху КДА при температура 28оС Trichoderma sp.НБПМКК 405 образува пелена и се формират синьозелени спори (фиг. 4).

Фиг. 3. Начален етап от развитието на Фиг. 4. Формиране на синьозелениTrichoderma sp. НБПМКК 405 върху КДА спори при развитието на

Trichoderma sp. НБПМКК 405върху КДА

Направени са микроскопски снимки на посевния и ферментационния материал(фиг. 5 и 6). В процеса на култивиране на щам-продуцента са приготвени


8/30


9/309

Фиг. 9. Trichoderma sp. НБПМКК 405 на 144-тия час от култивирането

1.1. Съдържание на белтък в културалната течност по време на култивирането

на Trichoderma sp. НБПМКК 405При култивирането на Trichoderma sp. НБПМКК 405 в течна хранителна среда е

проследена диманиката на биосинтез на белтък в културалната течност (табл. 2).Получените резултати показват, че в хода на ферментацията съдържанието на белтъкв културалната течност нараства и достига своя максимум на 144-тия час отферментационния процес. На 72-рия час то се увеличава приблизително 1,3 пъти, на

120-тия- приблизително 1,5 пъти, а на 144-тия час- приблизително 1,6 пъти всравнение със съдържанието на белтък в културалната течност на 24-тия час отферментацията.

Таблица 2. Съдържание на белтък в културалната течност по време на ферментациятана Trichoderma sp. НБПМКК 405

Час на пробовземанеБелтъчно съдържание

в културалната

течност, mg/ml24-ти 48-ми 72-ри 96-ти 120-ти 144-ти 168-ми

Средна стойност, X 4,395 5,505 5,708 6,000 6,435 6,938 6,938

Стандартно отклонение , SD0,289 0,081 0,107 0,174 0,408 0,586 0,586Стандартна грешка , Sх 0,129 0,036 0,048 0,078 0,182 0,262 0,262

Брой анализирани проби (n) = 10

На фиг. 10 е представена кинетиката на продуциране на белтъци придълбочинното култивиране на Trichoderma sp. НБПМКК 405. От графиката се вижда рязко покачване на количеството на продуцираните белтъци в културалната течностот 24-тия до 48-мия час. След 48-мия час се наблюдава равномерно натрупване набелтъци до 144-тия час, след което културата навлиза в стационарната фаза на развитие.

0.000

1.000

2.000

3.000

4.000

5.000

6.000

7.000

8.000

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Час на пробовземане

Б е л т ъ ч н о с ъ д ъ р ж а н и е , m g / m l

Фиг. 10. Кинетика на продуциране на белтъци при дълбочинно култивиране наTrichoderma sp. НБПМКК 405


10/3010

1.2. Динамиката на биосинтез на ламинариназа и лихеназа при дълбочинно

култивиране на Trichoderma sp. НБПМКК 405

Проучена е способността на продуцента Trichoderma sp. НБПМКК 405 дасинтезира ламинариназа и лихеназа (табл. 3). При проследяване динамиката накултивационния процес се вижда, че активността на двата ензима в хода накултивирането на работния щам нараства. Установено е, че двата ензима показватнай-високи активности на 144-тия час от култивирането. Ламинариназната активностна 72-рия час е над 2 пъти по-висока, а на 144-тия час нараства 4 пъти в сравнение с24-тия час. Лихеназната активност на 96-тия час е приблизително 2 пъти по-висока, ана 144-тия час е приблизително 2,5 пъти по-висока, отколкото на 24-тия час.

Таблица 3. Ламинариназна и лихеназна активности, определени по време наферментацията на Trichoderma sp. НБПМКК 405

Час на

пробовземане

Лaминариназна активност, IU/ml

по време на култивирането

Лихеназна активност, IU/ml

по време на култивирането

24-ти 0,127 0,017 0,043 0,001

48-ми 0,248 0,016 0,061 0,002

72-ри 0,300 0,003 0,070 0,00296-ти 0,343 0,021 0,085 0,002

120-ти 0,456 0,013 0,096 0,002

144-ти 0,520 0,027 0,107 0,003

168-ми 0,458 0,009 0,095 0,001


Статистическата обработка на резултатите, получени за ламинариназната илихеназната активности чрез дисперсионен еднофакторен анализ показвастатистически значима зависимост на двете ензимни активности по отношение нафактора време на култивиране (табл. 4).

Таблица 4. Критерий на Фишер за ламинариназната и лихеназната активности поотношение на фактора време на култивиране

=0,05

В хода на култивирането проучваният продуцент показва по-висока

ламинариназна, отколкото лихеназна активност. Ламинариназната активност на щамав началото на ферментационния процес е приблизително 3 пъти по-висока, на 48-мия,72-рия и 96-тия час- около 4 пъти по-висока, на 120-тия- 4,75 пъти по-висока, а на144-тия час- над 4,85 пъти по-висока от лихеназната. В литературата има данни заизследване продуцирането само на единия ензим (ламинариназа) или само на другияензим (лихеназа) от представители на род Trichoderma (Sun et al., 2001; Nobe et al.,2003; Burtseva et al., 2006), а няма данни за проучване продуцирането на двата ензимаот един щам- продуцент. Поради това би било трудно да се направи сравнение наполучените резултати за продуцираните ламинариназа и лихеназа от Trichoderma sp.НБПМКК 405 с резултатите, получени за други представители на род Trichoderma, за

които е изследвана продукцията само на ламинариназа или само на лихеназа.Кинетиката на двете ензимни активности по време на ферментацията наTrichoderma sp. НБПМКК 405 е представена на фиг. 11. От нея се вижда, челаминариназната активност нараства рязко до 144-тия час от култивирането, следкоето със застаряване на културата и изчерпване на хранителните вещества в средата

Критерий на Фишер, определен

за ламинариназната активност


за лихеназната активност

Таблична стойност на

Критерия на Фишер

66,765 126,928 2,445


11/3011

започва да намалява. Наблюдава се постепенно и пропорционално покачване налихеназната активност до 144-тия час, след което със застаряване на културата иизчерпване на хранителните вещества в средата, също започва да намалява.

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

Час на пробовземане

Е н з и м н и а к т и в н о

с т и , I U / m l

Ламинариназна активност, IU/ml Лихеназна активност, IU/ml

Фиг. 11. Кинетика на ламинариназната и лихеназната активности при дълбочиннокултивиране на Trichoderma sp. НБПМКК 405

По-ниските активности на ламинариназата и лихеназата, продуцирани от работния щам се обясняват с това, че те са съпътстващи ензими и се синтезират отизследвания щам в минимални количества, като по този начин допълват ензимниякомплекс, синтезиран от Trichoderma sp. НБПМКК 405. Макар и анализиранитеензими да се продуцират от проучения щам като съпътстващи ензими, те показватстабилна активност. Важна особеност е, че работният щам не е патогенен и не егенно-модифициран. Това позволява ензимите, продуцирани от него да намерятприложение в процесите на вино и пивопроизводството за по-пълно разграждане наглюканите, а също биха могли да се използват и като добавка към храната наживотните.

Изчислени са специфичните ламинариназна и лихеназна активности по време напроцеса на култивирането на Trichoderma sp. НБПМКК 405. Резултатите сапредставени в таблица 5.

Таблица 5. Специфични ламинариназна и лихеназна активности, определени по времена ферментацията на Trichoderma sp. НБПМКК 405

Час на пробовземане 24-ти 48-ми 72-ри 96-ти 120-ти 144-ти 168-ми

Cпецифична ламинариназна

активност, IU/g белтък28,90 45,05 52,56 57,17 70,86 74,95 66,01

Специфична лихеназна

активност, IU/g белтък9,78 11,08 12,26 14,17 14,92 15,42 13,69


Oт таблицата се вижда, че специфичната ламинариназна активност на 120-тиячас от култивирането на работния щам е 4,75 пъти, а на 144-тия час- над 4,85 пъти по-голяма от специфичната лихеназна активност.

2. Съхранение на пробите от културалната течностЗапазването на ензимната активност е основният критерий доколко използванитеметоди са подходящи за дълготрайно съхранение на даден ензим. Основно значениеза запазването на структурата и функциите на белтъчните молекули имат условиятана тяхното съхранение.


12/3012

2.1. Съхранение в хладилник (4-8оС) непосредствено след взимане на пробите

Проучени са остатъчните ламинариназна и лихеназна активности следсъхранение при 4-8оС съответно 7, 21 и 35 дни. Резултатите показват, че при тезиусловия с течение на времето двете ензимни активности започват да намаляват. Втаблица 6 са представени резултатите за ламинариназната активност, определени повреме на съхранението на пробите в хладилник (4-8оС).

Таблица 6. Ламинариназна активност на пробите при съхранение в хладилник

непосредствено след взимането имЛaминариназна активност, IU/ml

Етап от

култивирането

Веднага след

култивиране

(преди поставяне

за съхранение)

След 7 дни

съхранение

при 4-8оС

След 21 дни


при 4-8оС

След 35 дни


при 4-8оС

24-ти час 0,127 0,017 0,124 0,008 0,122 0,011 0,121 0,00848-ми час 0,248 0,016 0,241 0,012 0,239 0,013 0,235 0,01072-ри час 0,300 0,003 0,292 0,008 0,289 0,013 0,284 0,01196-ти час 0,343 0,021 0,335 0,013 0,329 0,011 0,326 0,011

120-ти час 0,456 0,013 0,445 0,020 0,439 0,018 0,433 0,010144-ти час 0,520 0,027 0,510 0,009 0,500 0,011 0,493 0,027168-ми час 0,458 0,009 0,445 0,012 0,441 0,015 0,436 0,008


На фиг. 12 са представени процентите на запазване на ламинариназнатаактивност при съхранение в хладилник. От резултатите се вижда, че на седмия ден отсъхранението ламинариназната активност се запазва между 97,16% и 98,08%.Следователно намалява приблизително с 2 до 3% в сравнение с активността,определена непосредствено след взимане на пробите по време на ферментацията.

След съхранение 21 дни при 4-8о

С ламинариназната активност на пробите намаляваприблизително с 4%, а на 35-тия ден- намалява приблизително с 5%, но на 35-тия денот съхранението на пробите в хладилник (4-8оС) е установено помътняване напробите и поява на неприятна миризма. Това показва, че този температурен режим засъхранение е подходящ само за краткотрайно съхранение на изследвания ензим- отедин ден до няколко седмици.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

24-ти 48-ми 72-ри 96-ти 120-ти 144-ти 168-ми

Eтап от култивирането [ h ]

З а п а з в а н е н а л а м и н а р и н а з н а т а

а к т и в н о с т п р и с ъ х р а

н е н и е

в х л а д и л н и к , %

след 7 дни

съхранение в

хладилник

след 21 дни


хладилник

след 35 дни


хладилник

Фиг. 12. Запазване на ламинариназната активност при съхранение на пробите вхладилник

Резултатите за изменението на лихеназната активност при съхранението напробите при 4-8оС са представени в таблица 7. Процентите на запазване налихеназната активност при съхранение на пробите при 4-8оС са представени на фиг.


13/3013

13. От нея се вижда, че на седмия ден от съхранението при 4-8оС лихеназнатаактивност се запазва до 93,44%- 95,35%, т.е. тя намалява приблизително с 5 до 7% всравнение с активността, определена непосредствено след взимане на пробите повреме на ферментацията.

Таблица 7. Лихеназна активност на пробите при тяхното съхранение в хладилникнепосредствено след взимането им


След съхранение на пробите 21 дни при 4-8оС лихеназната активност намаляваприблизително с 9 до 10%, а на 35-тия ден от съхранението на пробите-приблизително с 13 до 14%, но на 35-тия ден от съхранението на пробите в хладилник(4-8оС) е установена поява на неприятна миризма и помътняване на пробите, коетопоказва, че този температурен режим за съхранение е подходящ само за краткотрайносъхранение на изследвания ензим- от един ден до няколко седмици.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

24-ти 48-ми 72-ри 96-ти 120-ти 144-ти 168-ми


З а п а з в а н е н а

л и х е н а з н а т а а к т и в н о с т п р и

с ъ х р а н е н и е в х л а д и л н и к ,

%

след 7 дни


в хладилник

след 21 дни



след 35 дни



Фиг. 13. Запазване на лихеназната активност при съхранение на пробите в хладилник

От фиг. 12 и 13 може да се направи извода, че в хода на съхранението на пробитев хладилник (4-8оС) ламинариназната активност се запазва в по-голям процент всравнение с лихеназната активност. Това се потвърждава и от статистическатаобработка чрез двуфакторен анализ на получените резултати. Обработката на

резултатите, получени за ламинариназната активност след 35-дневно съхранение напробите в хладилник, показва статистически значима зависимост на ензимнатаактивност по отношение на фактора етап на култивирането (табл. 8). При тезиусловия и продължителност на съхранение факторът време на съхранение не оказвавлияние върху ламинариназната активност. По отношение на лихеназната активност


Етап от




(преди поставяне

за съхранение)

След 7 дни


при 4-8оС

След 21 дни


при 4-8оС

След 35 дни


при 4-8оС

24-ти час 0,043 0,001 0,041 0,001 0,039 0,001 0,037 0,00148-ми час 0,061 0,002 0,057 0,001 0,055 0,001 0,053 0,00172-ри час 0,070 0,002 0,066 0,001 0,064 0,001 0,061 0,00196-ти час 0,085 0,002 0,080 0,001 0,077 0,001 0,073 0,001

120-ти час 0,096 0,002 0,091 0,002 0,087 0,002 0,083 0,001

144

-ти

час 0,107 0,003 0,101 0,001 0,096 0,001 0,092 0,001168-ми час 0,095 0,001 0,090 0,001 0,086 0,001 0,083 0,001


14/3014

на пробите, бе установена статистически значима зависимост на тази ензимнаактивност по отношение и на двата фактора: етап на култивирането и време насъхранение (табл. 8).

Таблица 8. Критерий на Фишер за ламинариназната и лихеназната активности поотношение на факторите време на съхранение и етап на култивирането присъхранение на пробите в хладилник, непосредствено след взимането им

Критерий на Фишер,определен за

ламинариназната активност

по отношение на фактор:

Критерий на Фишер,определен за

лихеназната активност





Етап на


Време на


Етап на


Време на


Етап на


Време на


65,938 1,012 158,943 46,543 1,601 3,132

=0,05

2.2. Съхранение в замразено състояние и последващо размразяване на стайна

температура (20±5оС)

Проучени са остатъчните ламинариназна и лихеназна активности един час след размразяването при 20±5оС и след 7 дневно съхранение на пробите при 20±5оС.Анализите показват, че ламинариназната активност намалява рязко, когато пробитесе размразят и съхраняват при 20±5оС (табл. 9).

Таблица 9. Ламинариназна активност на пробите след замразяването им при (-20оС) ÷(-25оС), съхранението им 12 месеца в замразено състояние и последващото им размразяване на стайна температура (20±5оС)


Изчислен е процентът на запазване на ламинариназната активност присъхранението на пробите в замразено състояние и последващото им размразяване при20±5оС. Резултатите са представени на фиг. 14. Един час след размразяването настайна температура (20±5оС) ламинариназната активност намалява приблизително с14 до 15%, а след 7 дни съхранение на стайна температура (20±5оС) – намаляваприблизително с 22 до 24% в сравнение с активността, определена веднага следвзимането на пробите по време на култивирането.

В таблица 10 са обобщени резултатите за изменението на лихеназната активност

след замразяване на пробите при (-20о

С) ÷ (-25о

С), съхранението им 12 месеца взамразено състояние и последващото им размразяване на стайна температура(20±5оС). При лихеназата се наблюдава още по-рязко намаляване на нейнатаактивност в сравнение с ламинариназната.


Етап откултивирането

Веднага след култивиране(преди поставяне за

съхранение)

1 час следсъхранение

при 20±5оС

7 дни следсъхранение

при 20±5оС

24-ти час 0,127 0,017 0,109 0,005 0,097 0,00448-ми час 0,248 0,016 0,210 0,008 0,191 0,00472-ри час 0,300 0,003 0,259 0,006 0,230 0,00496-ти час 0,343 0,021 0,292 0,006 0,265 0,006

120-ти час 0,456 0,013 0,390 0,005 0,354 0,006144-ти час 0,520 0,027 0,446 0,018 0,400 0,005168-ми час 0,458 0,009 0,394 0,011 0,348 0,005


15/3015

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

24-ти 48-ми 72-ри 96-ти 120-ти 144-ти 168-ми


З а п а з в а н е н а л а м и н а р и н а з н а т а а к т и в н о с т

с л е д р а з м р а з я в

а н е и с ъ х р а н е н и е н а с т а й н а

т

е м п е р а т у р а ,

%

1 час след

размразяване

на стайна

температура

7 дни след


на стайнатемпература

Фиг. 14. Запазване на ламинариназната активност след размразяване и съхранение настайна температура (20±5оС)

Един час след размразяването при 20±5оС лихеназната активност намалява

приблизително с 25 до 26%, а след 7 дни съхранение на стайна температура (20±5оС)-намалява приблизително с 28 до 30% в сравнение с активността, определена веднагаслед взимането на пробите по време на култивирането (фиг. 15).

Таблица 10. Лихеназна активност на пробите след замразяването им при (-20оС) ÷(-25оС), съхранението им 12 месеца в замразено състояние и последващото им размразяване на стайна температура (20±5оС)


0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

24-ти 48-ми 72-ри 96-ти 120-ти 144-ти 168-ми


З а п а з в а н е н а л и х е н а з н а т а

а к т и в н о с т с л е д р а з м р а з я в а н е

и

с ъ х р а н е н и е н а с т а

й н а т е м п е р а т у р а ,

1 час след


на стайна


7 дни след


на стайна


Фиг. 15. Запазване на лихеназната активност след размразяване и съхранение настайна температура (20±5оС)


Етап от

култивиранетоВеднага след култивиране

(преди поставяне за


1 час след


при 20±5

о

С

7 дни след


при 20±5

о

С24-ти час 0,043 0,001 0,032 0,001 0,031 0,00148-ми час 0,061 0,002 0,045 0,001 0,044 0,00172-ри час 0,070 0,002 0,052 0,001 0,050 0,00196-ти час 0,085 0,002 0,063 0,001 0,060 0,001

120-ти час 0,096 0,002 0,071 0,001 0,069 0,001144-ти час 0,107 0,003 0,080 0,002 0,076 0,001168-ми час 0,095 0,001 0,070 0,001 0,066 0,002


16/3016

Един час след размразяването при 20±5оС лихеназната активност намалява с по-голям процент в сравнение с ламинариназната активност. След 7 дни съхранение настайна температура (20±5оС) лихеназната активност намалява приблизително с 28 до30% в сравнение с първоначалната активност, определена веднага след взимането напробите по време на ферментацията, докато ламинариназната активност спадаприблизително с 22 до 24%. Следователно може да се направи извода, че размразяване при 20±5оС на замразените при (-20оС) ÷ (-25оС) и съхранявани взамразено състояние 12 месеца проби и последващото им съхранение на стайнатемпература (20±5оС) води до значителна загуба на активността и при двата ензима.При опитите е установено, че съхранението на стайна температура (20±5оС) също есъпроводено с помътняване на пробите и поява на неприятна миризма и следователноне би могло да се използва като начин за съхранение на ензими.

Статистическата обработка чрез двуфакторен анализ на резултатите, получени заламинариназната и лихеназната активности след замразяването на пробите при(-20оС) ÷ (-25оС), съхранението им в замразено състояние 12 месеца и последващотоим размразяване и съхранение на стайна температура (20±5оС) е представенa на табл.11. Анализът показва статистически значима зависимост на двете ензимниактивности по отношение на факторите етап на култивирането и време насъхранение.

Таблица 11. Критерий на Фишер за ламинариназната и лихеназната активности поотношение на факторите време на съхранение и етап на култивирането при размразяване и съхранение на пробите на стайна температура (20±5оС)

=0,05

2.3. Съхранение в замразено състояние и последващо размразяване в хладилник

(4-8оС)

Проучени са остатъчните ламинариназна и лихеназна активности съответно 7,14, 30, 45 и 55 дни след размразяването на пробите при 4-8оС (табл. 12). Резултатите

показват, че ламинариназната активност се запазва в голяма степен след размразяванепри 4-8оС, което води до извода, че продължителното съхранение в замразеносъстояние при (-20оС) ÷ (-25оС) би могло да се използва като начин за съхранение наламинариназата, но при условие, че размразяването на ензимите се извършва при 4-8оС.

Изчислен е процентът на запазване на ламинариназната активност след размразяване и съхранение при 4-8оС (табл. 13). Седем дни след размразяване исъхранение в хладилник (4-8оС) тя намалява приблизително с 3 до 4% в сравнение сактивността, определена непосредствено след взимане на пробите по време наферментацията. На 30-тия ден намалява приблизително с 6 до 7%, а на 55-тия ден -

приблизително с 9 до 10%. Това показва, че този начин на съхранение е подходящ засъхранение на ламинариназата.

Критерий на Фишер,

определен за

ламинариназната активност


Критерий на Фишер,

определен за

лихеназната активност





Етап на


Време на


Етап на


Време на


Етап на


Време на


74,691 54,480 63,113 13,221 1,772 4,130


17/3017

Таблица 12. Ламинариназна активност след замразяване на пробите при (-20оС) ÷(-25оС), съхранението им 12 месеца в замразено състояние и последващото им размразяване при 4-8оС


Таблица 13. Запазване на ламинариназната активност на пробите след замразяванетоим при (-20оС) ÷ (-25оС), съхранението им 12 месеца в замразено състояние ипоследващото им размразяване и продължително съхранение в хладилник (4-8оС)


Изменението на лихеназната активност след замразяване на пробите при (-20оС)÷ (-25оС), съхранението им в продължение на 12 месеца при (-20оС) ÷ (-25оС) ипоследващото им размразяване в хладилник (4-8оС) е представено на таблица 14. От резултатите се вижда, че при този начин на съхранение лихеназната активност спада

по-бързо в сравнение с ламинариназната.Изчислен е процентът на запазване на лихеназната активност на пробите следзамразяването им при (-20оС) ÷ (-25оС), съхранението им в замразено състояние 12месеца и последващото им размразяване и продължително съхранение в хладилник(4-8оС). Резултатите са представени в таблица 15. Лихеназната активност, определенана седмия ден след съхранение на пробите в хладилник (4-8оС) намаляваприблизително с 14 до 16% в сравнение с активността, определена непосредственослед взимане на пробите по време на ферментацията. Това е с около 11 до 12% по-малко в сравнение с процента на запазване на ламинариназната активност на седмияден от съхранението при 4-8оС. На 30-тия ден лихеназната активност намалява

приблизително с 29 до 31%, което е приблизително с 23 до 24% по-малко в сравнениес процента на запазване на ламинариназната активност, определена на 30-тия ден. На55-тия ден лихеназната активност намалява приблизително с 33 до 35%, което еприблизително с 24 до 25% по-малко в сравнение с процента на запазване наламинариназната активност, определена на 55-тия ден от съхранението на пробитепри 4-8оС.


Етап от

култи-

вирането



(преди

поставяне за


След


7 дни при

4-8оС

След


14 дни при

4-8оС

След


30 дни при

4-8оС

След


45 дни при

4-8оС

След


55 дни при

4-8оС

24-ти час 0,127 0,017 0,122 0,005 0,120 0,004 0,119 0,007 0,117 0,010 0,114 0,008

48-ми час 0,248 0,016 0,241 0,005 0,233 0,006 0,231 0,008 0,228 0,009 0,224 0,007

72-ри час 0,300 0,003 0,292 0,005 0,282 0,005 0,278 0,008 0,275 0,006 0,271 0,013

96-ти час 0,343 0,021 0,330 0,003 0,321 0,008 0,318 0,008 0,315 0,008 0,307 0,008

120-ти час 0,456 0,013 0,445 0,006 0,427 0,009 0,422 0,008 0,421 0,017 0,415 0,011

144-ти час 0,520 0,027 0,503 0,007 0,494 0,005 0,484 0,009 0,482 0,017 0,469 0,024

168-ми час 0,458 0,009 0,444 0,006 0,431 0,017 0,426 0,013 0,422 0,012 0,413 0,010

Запазване на лaминариназната активност, %

Етап от

култиви-

рането

След


7 дни при

4-8оС

След


14 дни при

4-8оС

След


30 дни при

4-8оС

След


45 дни при

4-8оС

След


55 дни при

4-8оС

24-ти час 96,06 94,49 93,70 92,13 89,7648-ми час 97,18 93,95 93,15 91,94 90,3272-ри час 97,33 94,00 92,67 91,67 90,3396-ти час 96,21 93,59 92,71 91,84 89,50

120-ти час 97,59 93,64 92,54 92,32 91,01144-ти час 96,73 95,00 93,08 92,69 90,19168-ми час 96,94 94,10 93,01 92,14 90,17


18/3018

Таблица 14. Лихеназна активност след замразяване на пробите при (-20оС) ÷ (-25оС),съхранението им 12 месеца в замразено състояние и последващото им размразяване ипродължително съхранение в хладилник (4-8оС)


Таблица 15. Запазване на лихеназната активност на пробите след замразяването импри (-20оС) ÷ (-25оС), съхранението им 12 месеца в замразено състояние ипоследващото им размразяване и продължително съхранение в хладилник (4-8оС)

Запазване на лихеназната активност, %

Етап от

култиви-

рането

След


7 дни при

4-8оС

След


14 дни при

4-8оС

След


30 дни при

4-8оС

След


45 дни при

4-8оС

След


55 дни при

4-8оС

24-ти час 86,05 81,40 69,77 67,44 65,1248-ми час 85,25 81,97 70,49 68,85 67,2172-ри час 85,71 82,86 70,00 68,57 67,1496-ти час 85,88 82,35 69,41 68,24 67,06

120-ти час 84,38 81,25 70,83 68,75 66,67144-ти час 84,11 82,24 70,09 68,22 67,29168-ми час 85,26 82,11 70,53 68,42 67,37


От получените резултати може да се направи извода, че замразяването при(-20оС) ÷ ( -25оС) е подходящ начин за продължително съхранение на ламинариназатаи лихеназата.

Статистическата обработка чрез двуфакторен анализ на резултатите, получени за

ламинариназната и лихеназната активности при замразяването им при (-20о

С) ÷(-25оС), съхранението им 12 месеца в замразено състояние и последващото им размразяване и продължително съхранение в хладилник (4-8оС) показвастатистически значима зависимост на двете ензимни активности по отношение нафакторите етап на култивирането и време на съхранение (табл. 16).

Таблица 16. Критерий на Фишер за ламинариназната и лихеназната активности поотношение на факторите етап на култивирането и време на съхранение след размразяване и съхранение на пробите в хладилник (4-8оС)


за ламинариназната активностпо отношение на фактор:


за лихеназната активностпо отношение на фактор:


Критерия на Фишерпо отношение на фактор:

Етап на


Време на


Етап на


Време на


Етап на


Време на


184,188 6,595 124,940 152,751 1,516 2,438

=0,05

Лихеназна активност IU/ml

Етап от

култи-

вирането



(преди

поставяне за


След


7 дни при

4-8

о

С

След


14 дни при

4-8

о

С

След


30 дни при

4-8

о

С

След


45 дни при

4-8

о

С

След


55 дни при

4-8

о

С

24-ти час 0,043 0,001 0,037 0,001 0,035 0,001 0,030 0,001 0,029 0,002 0,028 0,00148-ми час 0,061 0,002 0,052 0,001 0,050 0,001 0,043 0,001 0,042 0,001 0,041 0,00172-ри час 0,070 0,002 0,060 0,001 0,058 0,001 0,049 0,001 0,048 0,001 0,047 0,00196-ти час 0,085 0,002 0,073 0,001 0,070 0,001 0,059 0,001 0,058 0,001 0,057 0,001

120-ти час 0,096 0,002 0,081 0,001 0,078 0,001 0,068 0,001 0,066 0,001 0,064 0,001144-ти час 0,107 0,003 0,090 0,001 0,088 0,001 0,075 0,001 0,073 0,001 0,072 0,001168-ми час 0,095 0,001 0,081 0,002 0,078 0,003 0,067 0,002 0,065 0,002 0,064 0,002


19/30


20/3020

9%. Следователно може да се заключи, че обработката на пробите културална течностчрез лиофилизация и последващото им продължително съхранение на стайнатемпература (20 ± 5оС) е подходящ начин за тяхното съхранение по отношение наламинариназната им активност. Резултатите показват, че тя се запазва в голямпроцент.

Запазването на лихеназната активност след лиофилизация и продължителносъхранение на лиофилизатите на стайна температура (20± 5оС) е представено на фиг.17.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

24-ти 48-ми 72-ри 96-ти 120-ти 144-ти 168-ми


З а п а з в а н е н а л и х е н а з н а т а

а к т и в н о с т с л е д п р о д ъ л ж и т е л н о

с ъ х р а н е н и е н а л и о ф и л и з а т и т е

н а с т а й н а т е м п е р а т у р а , %

веднага след

лиофилизация

1 месец след


11 месеца след


Фиг. 17. Запазване на лихеназната активност след продължително съхранение налиофилизатите на стайна температура (20± 5оС)

Лихеназната активност, определена веднага след процеса на лиофилизациянамалява приблизително само с 1 до 2% в сравнение с активността, определенанепосредствено след взимане на пробите по време на ферментацията. Един месец

след съхранение в лиофилизирано състояние тя намалява приблизително с 1 до 3%, аслед 11 месечно съхранение- приблизително с 11,5 до 13%. Следователно илихеназната активност се запазва в голям процент при тези условия на съхранение иобработката на пробите културална течност чрез лиофилизация и последващото импродължително съхранение на стайна температура (20 ± 5оС) е подходящ начин засъхранението им по отношение и на лихеназната активност.

В сравнение с процента на запазване на ламинариназната активност, лихеназнатаактивност се запазва в по-малка степен. Като цяло може да се направи извод, че отописаните до момента начини на съхранение на пробите в най-голяма степен дветеензимни активности се запазват след процеса на лиофилизация.

Така получените резултати за запазването на активността на двата изследваниензима са проследени след лиофилизация на филтрираната културалната течност, безда се добавят криопротектори. С оглед на това, че лиофилизацията е скъп процес заобработка на биообекти и че двете изследвани активности се запазват с много малкиизменения след продължително съхранение в лиофилизирано състояние безизползването на криопротектори, е преценено същите да не бъдат добавянидопълнително към пробите, тъй като това би оскъпило допълнително самия процес, аоттам ще увеличи и цената на крайния лиофилизиран продукт.

Статистическата обработка чрез двуфакторен анализ на резултатите, получени заламинариназната и лихеназната активности след лиофилизация и продължително

съхранение на лиофилизатите на стайна температура, показва статистически значимазависимост на двете ензимни активности по отношение на факторите етап накултивиране и време на съхранение на лиофилизатите на стайна температура (табл.18).


21/3021

Таблица 18. Критерий на Фишер за ламинариназната и лихеназната активности поотношение на факторите време на съхранение и етап на култивиране следлиофилизация и продължително съхранение на лиофилизатите на стайна температура(20± 5oC)

=0,05

Изчислени са ламинариназната и лихеназната активности на лиофилизата в IU/gведнага след процеса на лиофилизация на пробите, 1 месец и 11 месеца след процесана лиофилизация на пробите. Резултатите са обобщени в таблица 19 и показват, челаминариназната активност е приблизително 3, 4 до 5 пъти по-висока от лихеназната.

Taблица 19. Ламинариназна и лихеназна активности, определени веднага, 1 месец и11 месеца след процеса на лиофилизация на пробите, изчислени в IU/g

Ламинариназна активност,

IU/g лиофилизат

Лихеназна активност,

IU/g лиофилизатЕтап от

култи-

виранетоВеднага след












24-ти час 16,03 16,03 14,87 5,38 5,38 4,8748-ми час 31,41 31,28 29,23 7,69 7,56 6,9272-ри час 37,82 37,82 35,38 8,85 8,72 7,8296-ти час 43,08 42,95 40,51 10,77 10,77 9,49

120-ти час 57,69 57,56 53,46 12,05 12,05 10,90

144

-ти

час 65,26 65,13 61,15 13,59 13,59 12,05168-ми час 57,31 57,31 54,62 12,05 11,92 10,77


2.4.2. Замразяване на пробите с течен азот (-196 oC):

A. Съхранение на замразените с течен азот проби при (-20оС) ÷ (-25оС)

Определени са ламинариназната и лихеназната активности на проби от 144-тиячас на култивирането съответно след съхранение 7, 14 и 21 дни при 4-8оС.Резултатите са представени в таблица 20.

Таблица 20. Ламинариназна и лихеназна активности на пробите от 144-тия час накултивирането, замразени с течен азот, размразени в хладилник (4-8оС) и оставени засъхранение при 4-8оС

Период на анализЛaминариназна активност,

IU/ml


IU/ml

Веднага след култивирането

(преди поставяне за съхранение)0,520 0,027 0,107 0,003

След 7 дни съхранение в хладилник

(4-8оС)0,504 0,012 0,093 0,001


(4-8оС)0,466 0,017 0,087 0,002


(4-8оС)0,421 0,017 0,082 0,001











Етап на


Време на


Етап на


Време на


Етап на


Време на


122,826 13,454 110,927 70,188 1,601 3,132


22/3022

На фиг. 18 е представен процентът на запазване на ламинариназната илихеназната активности на замразените с течен азот проби от 144-тия час накултивирането след съхранението им при (-20оС) ÷ (-25оС) и последващото им размразяване и съхранение при 4-8оС. Ламинариназната активност на пробите след 7дневно съхранение в хладилник при 4-8оС намалява приблизително само с 3% всравнение с активността, определена по време на култивирането на работния щам, аслед съхранение 21 дни- приблизително с 19%. Лихеназната активност на пробитеслед 7 дневно съхранение при същите условия намалява приблизително с 13% всравнение с активността, определена по време на култивирането на работния щам, аслед съхранение 21 дни- приблизително с 23%.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

след 7 дни


хладилник

след 14 дни


хладилник

след 21 дни


хладилник

Период на анализ

З а п а

з в а н е н а е н з и м н и т е

а к т и в н о с т и ,

%

ламинариназна

активност

лихеназна

активност

Фиг. 18. Изменение на ламинариназната и лихеназната активности на пробите от144-тия час на култивирането, замразени с течен азот, размразени и оставени за

съхранение при 4-8оС

Установено е, че шоковото замразяването с течен азот и последващотосъхранение при (-20оС) ÷ (-25оС) е друг подходящ начин за съхранение наламинариназата и лихеназата.

Статистическата обработка чрез дисперсионен еднофакторен анализ на резултатите, получени за ламинариназната и лихеназната активности следзамразяването им с течен азот и последващото размразяване и съхранение вхладилник (4-8оС), показва статистически значима зависимост на двете ензимниактивности по отношение на фактора време на съхранение (табл. 21).

Таблица 21. Критерий на Фишер за ламинариназната и лихеназната активности по

отношение на фактора време на съхранение след замразяване на пробите с течен азот

=0,05

Б. Лиофилизация след замразяване на пробите с течен азот (-196оС)

Определени са ензимните активности на лиофилизати от 144-тия час накултивирането в IU/g лиофилизат веднага след лиофилизацията и след 1 месец

съхранение в лиофилизирано състояние. Резултатите са обобщени в таблица 22.Изчислени са и процентите на запазване на ламинариназната и лихеназнатаактивност при съхранение на стайна температура (20± 5оС) на лиофилизатите,получени чрез замразяване с течен азот на пробите културална течност (фиг. 19).







7,384 21,163 3,885


23/3023

Таблица 22. Сравнение на ламинариназната и лихеназната активности налиофилизатите от 144-тия час на култивирането, получени при два режима назамразяване: при (-20оС) ÷ (-25оС) и след третиране с течен азот (-196oC)

Режим на

замразяванеПериод на анализ

Лaминариназна активност,




Веднага след лиофилизация 65,26 13,59При

(-20оС) ÷ (-25оС)След съхранение в

лиофилизирано състояние

1 месец на стайна

температура (20±5оС)65,13 13,59

Веднага след лиофилизация 63,81 13,43Течен азот

(-196oC) След съхранение в

лиофилизирано състояние

1 месец на стайна

температура (20±5оС)

62,89 13,21


0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100






лиофилизация с лед

замразяване с

течен азот


лиофилизация с лед

замразяване с

течен азот

Период на анализ

З а п а з в а н е н а е н з и м н и т е

а к т и в н о с т и ,

%

ламинариназна активност

лихеназна активност

Фиг. 19. Запазване на ламинариназната и лихеназната активности, получени при два режима на замразяване: при (-20оС) ÷ (-25оС) и след третиране с течен азот (-196oC)

След замразяване с течен азот, непосредствена лиофилизация и съхранение влиофилизирано състояние 1 месец на стайна температура (20± 5оС) ламинариназната

активност на лиофилизатите намалява приблизително с 6%, а лихеназната-приблизително с 4%.

3. ЕлектрофорезаПроведена бе електрофореза в полиакриламиден гел (SDS-PAGE) на проби

лиофилизирана културална течност. На фиг. 20 са представени протеиновитефракции от електрофорезата на различни проби лиофилизирана културална течност.

От електрофорезата се вижда, че молекулната маса на ламинариназата е между75 kDa и 70 kDa. Подобни данни за молекулната маса на ламинаринази, продуцираниот представители на род Trichoderma дава Nobe и кол. (2003). Поради това, че

лихеназата се синтезира от работния щам в минимални количества, определянето нанейната молекулна маса не би било точно. По данни на Sun и кол. (2001) и Celestinolи кол. (2006) молекулната маса на лихеназите варира между 33,7 kDa и 35 kDa.


24/3024

1 2 3 4 5 6Фиг. 20. – Електрофореза SDS-PAGE на различни проби лиофилизирана културалнатечност: 1- лиофилизиран говежди серумен албумин (Fluka) 1 mg/ml с Mw 66 кDa; 2-

лиофилизиран говежди серумен албумин (Fluka) 0,5 mg/ml с Mw 66 кDa; 3- протеиновмаркер HMW-SDS Calibration Kit на фирмата Amersham Bioscences (глутамат

дехидригеназа с Mw 53 kDа, трансферин с Mw 76 kDа, -галактозидаза с Mw 116 kDа,2-макроглобулин с Mw 170 kDа и миозин с Mw 212 kDа); 4,5,6- проби от

лиофилизирана културална течност

4. Получаване на ензимен препарат, продуциран от Trichoderma sp. НБПМКК

405 с ламинариназна и лихеназна активностиРазработена е схема за получаване на лиофилизиран ензимен препарат с

ламинариназна и лихеназна активности, продуциран от Trichoderma sp. НБПМКК 405(фиг. 21).

Фиг. 21. Технологична схема за получаване на ензимен препарат с ламинариназна илихеназна активности, получен при култивирането на Trichoderma sp. НБПМКК 405

170 kDa

116 kDa

76 kDa

66 kDa

53 kDa

212 kDa

Получаване на

културална течност при

144- часово култивиране

на Trichoderma sp.

НБПМКК 405

Филтриране на

културалната

течност

Поставяне на

пробите в тави

за сублимационно

сушене с дебелина

на слоя 10 mm

Замразяване

на пробите

при - 35оС ± 2оС

Гама-

облъчване

Микробиологично

чист

лиофилизиранензимен препарат

Лиофилизиран

ензимен препарат

Сублимационно сушене

във вакуумна сублима-

ционна инсталация

„HOCHVAKUUM”

модел TG-16


25/3025

Общият добив след вакуум-сублимационното сушене на 1 l културална течност е7,815 g лиофилизиран ензимен препарат.

Охарактеризирането на получения лиофилизиран ензимен препарат е направенопо следните показатели: външен вид, консистенция и цвят; остатъчновлагосъдържание, ензимна активност, микробна чистота. Характеристиката навъншния вид на ензимния препарат е представен�

Documents

Enzyme degradation Trichoderma